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Biology

Autophagy रिसर्च में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन

Published: September 9, 2017 doi: 10.3791/55881
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Information Center, Sabanci University, 3EFSUN, Center of Excellence for Functional Surfaces and Interfaces for Nano Diagnostics, Sabanci University

Summary

यहां प्रस्तुत है दो एंटीबॉडी आधारित प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन रिसर्च तकनीक: इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoprecipitation । इन तकनीकों सेलुलर संकेत रास्ते के उपंयास घटकों की खोज के लिए और प्रोटीन गतिशीलता को समझने के लिए प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं ।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन सेलुलर संकेत करने वाले कैस्केडिंग को समझने और उपंयास मार्ग घटकों और प्रोटीन गतिशीलता की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । सेलुलर गतिविधियों के बहुमत प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत की आवश्यकता है । इन इंटरैक्शन का विश्लेषण और मैप करने के लिए, विभिंन प्रायोगिक तकनीकों के साथ ही bioinformatics उपकरण विकसित किए गए थे । Autophagy एक सेलुलर रीसाइक्लिंग तंत्र है कि कोशिकाओं को विभिंन तनाव के साथ सामना करने की अनुमति देता है, पोषक तत्व अभाव, रसायन सहित, और हाइपोक्सिया । आदेश में बेहतर autophagy-संबंधित संकेतन घटनाओं को समझने के लिए और उपंयास कारकों है कि autophagy में प्रोटीन परिसरों को विनियमित खोजने के लिए, हम प्रोटीन प्रोटीन संपर्क स्क्रीन प्रदर्शन किया । इन स्क्रीनिंग परिणामों के सत्यापन इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoprecipitation तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता है । इस प्रणाली में, विशिष्ट autophagy से संबंधित प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत है कि हम Neuro2A (N2A) और HEK293T सेल लाइनों में परीक्षण किया गया पता चला । तकनीकी प्रक्रियाओं का विवरण इस दृश्य प्रयोग कागज में समझाया जाता है ।

Introduction

Macroautophagy (autophagy, स्पेसिफिकेशंस) एक सेलुलर तनाव तंत्र है कि थोक कोशिका, प्रोटीन की ज़ब्ती की विशेषता है, और डबल झिल्ली बुलबुले में organelles autophagic बुलबुले कहा जाता है । डबल झिल्ली की बाहरी परत के फ्यूजन के माध्यम से, autophagic बुलबुले और उनके माल lysosomes करने के लिए वितरित कर रहे हैं और उसमें नीचा1. Autophagy सभी कोशिका प्रकार में और सभी जीवों में कम बेसल स्तर पर होता है, ऐसे प्रोटीन क्षरण और organelle के रूप में समस्थिति कार्यों का प्रदर्शन (उदा, mitochondria) कारोबार । ऐसे भुखमरी के रूप में सेलुलर तनाव के लिए अग्रणी शर्तों के तहत, autophagy तेजी से विनियमित है और सेल ऊर्जा का स्तर और बुनियादी चयापचय1,2,3बनाए रखने के लिए अनुमति देता है ।

लगभग 30 autophagy जीन खमीर से क्लोन किया गया है और उनके प्रोटीन उत्पादों को autophagic प्रक्रिया के विभिंन चरणों में एक भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है, पुटिका nucleation, विस्तार, पुटिका फ्यूजन के लिए देर endosome/lysosome, और कार्गो क्षरण सहित 4 , 5. इन जीनों के बहुमत के Orthologs की पहचान की गई है और विभिंन जीवों में अध्ययन अपने सेलुलर कार्यों के संरक्षण की पुष्टि की6। पिछले दशक में अध्ययन से पता चला कि कई autophagy से संबंधित प्रोटीन परिसरों और प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत मौजूद है और है कि वे एक जटिल और नियंत्रित तरीके से autophagy रास्ते नियंत्रित करते हैं । चौराहों, बैकअप, प्रतिक्रिया, और feedforward तंत्र मौजूद है, और वे अंय संबंधित घटनाओं के साथ autophagy समंवय करने के लिए सेल की अनुमति (जैसे vesicular स्राव, lysosome के रूप में, endosomal छंटाई और परिवहन7, आदि.) एक निष्पक्ष खमीर-दो संकर स्क्रीन में एक चारा के रूप में autophagy प्रोटीन ATG5 का उपयोग कर, (ATG5 एक प्रमुख autophagy प्रोटीन conjugating प्रणाली की तरह E2 में शामिल है कि भुखमरी प्रेरित LC3 में autophagy लिपिड मध्यस्थता), हम पहचान लिया है रिसेप्टर सक्रिय C-कळेनासे 1 (RACK1; GNB2L1) के रूप में एक सशक्त और एक उपंयास autophagy घटक8। महत्वपूर्ण बात, स्क्रीन से पता चला है कि ATG5-RACK1 बातचीत शास्त्रीय autophagy उत्प्रेरण (यानी, भुखमरी और mTOR निषेध) द्वारा autophagy प्रेरण के लिए अपरिहार्य था ।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित तरीकों सामांयतः प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है । इन तकनीकों को मुख्य रूप से एंटीबॉडी आधारित हैं, और बातचीत की कल्पना और सेलुलर स्थानीयकरण की पुष्टि करने में मदद । इस तकनीक में, फ्लोरोसेंट टैग संयुग्मित एंटीबॉडी कि ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट है आम तौर पर विशिष्ट धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रत्येक प्रोटीन अलग फ्लोरोसेंट रंगों को युग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है । प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करना, एक संकेत में ओवरलैप जब छवियों को विलय कर रहे हैं, फोकल माइक्रोस्कोप के तहत प्रोटीन के सह स्थानीयकरण इंगित करता है. तकनीक कोशिकाओं या यहां तक कि ऊतकों के लिए लागू है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक संपर्क गतिशीलता के बारे में सुराग प्रदान करते हैं, और मदद के आकार और प्रोटीन परिसरों के वितरण की पहचान, जबकि सेलुलर आकृति विज्ञान में सामान्य परिवर्तन ट्रैकिंग के तहत9. Immunoprecipitation एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी आधारित तकनीक है कि दिया प्रोटीन के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है10। इस तकनीक का प्रयोग, ब्याज की प्रोटीन कोशिकाओं या ऊतक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर निष्कर्षों से अलग कर रहे हैं, प्रोटीन है कि एक परिसर में या ब्याज की एक प्रोटीन के साथ संपर्क में हैं की वर्षण में जिसके परिणामस्वरूप. सह immunoprecipitation, जहां प्रोटीन और उसके सह-संपर्क का पता चला रहे हैं, दो प्रोटीन के बीच न केवल बातचीत से पता चलता है, लेकिन विभिंन परिस्थितियों के तहत बातचीत की अपनी ताकत उपाय कर सकते है11।

इस प्रोटोकॉल की पुष्टि करें और ATG5-RACK1 और RACK1-LC3 बातचीत की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है कि विस्तार से महत्वपूर्ण तकनीकों में वर्णन करता है । ध्यान इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunoprecipitation तकनीक पर है, महत्वपूर्ण कदम और autophagy अनुसंधान के लिए नुकसान के जोर के साथ, साथ ही समस्या निवारण सुझाव ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. HEK293T उच्च ग्लूकोज मध्यम में DMEM मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं को बनाए रखने, और N2A कम ग्लूकोज मध्यम में neuroblast माउस DMEM कोशिकाओं, एक 5% सह में 2 -humidified मशीनी पर ३७ & #176; सी. 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, एंटीबायोटिक दवाओं (५० यू/एमएल पेनिसिलिन, ५० & #181; g/एमएल streptomycin), और एल-glutamine (2 मिमी) के साथ संस्कृति मीडिया के पूरक.
  2. ०.२५% trypsin का उपयोग करके कक्षों को अलग । पहले सेल संस्कृति के मीडिया को हटा दें तो 10 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ कोशिकाओं को धोने और ३७ पर trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ मशीन & #176; ग के लिए 5 min. सूचनाको trypsin को जोड़कर 2 मिलि DMEM मध्यमा.
  3. को pipetting करके प्लेट अच्छी तरह धो लें । निकालें 10 & #181; l सेल सॉल्यूशन का और इसे 10 & #181 के साथ मिलाएं; l of trypan blue. hemocytometer.
    4. का उपयोग करके लाइव कक्षों की संख्या गिनना
  4. दोनों HEK293T और N2A अनुयाई सेल लाइंस हैं, हालांकि, HEK293T कोशिकाओं को प्लेट से आसानी से अलग कर लीजिये. इसलिए, अगर HEK293T सेल लाइन के साथ काम कर रहे, कोट बाँझ के साथ coverslides फ़िल्टर ०.०१% पाली-एल-lysine कोशिकाओं बोने से पहले.
    1. स्थान बाँझो coverslides १० सेमी पेट्री डिश । प्रत्येक coverslide पर पाली-L-lysine समाधान की उपयुक्त मात्रा जोड़ें । 10 min.
      2. के लिए पाली-एल-lysine समाधान के साथ coverslides की मशीन पाली-L-lysine हल
    2. निकालें.
      नोट: पाली-एल-lysine पुनः प्रयोग करने योग्य है; यह आगे के प्रयोगों के लिए इसे इकट्ठा करने और पुन: उपयोग करने के लिए वैकल्पिक है । चूंकि पाली-एल-lysine विषाक्त है, coverslides पर समाधान के सभी जब तक प्रतीक्षा पूरी तरह से लुप्त हो जाता है, और फिर पाली-l-lysine पुनर्प्राप्त ।
    3. coverslides बाँझ पंजाबियों के साथ धो.
  5. एक 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुआं में 1 मिलीलीटर DMEM जोड़ें । प्रत्येक कुआं में एक coverslide लगाएं ।
  6. बीज २०,००० कोशिकाओं/खैर, coverslides पर कोशिकाओं के एक समरूप वितरण के लिए एक ही समय में प्लेट मिलाते हुए ड्रॉप द्वारा ड्रॉप । ३७ & #176 पर कं 2 मशीन में कोशिकाओं रखें, और दवा जोड़ें ताकि कुल मशीन समय ४८ से अधिक नहीं है एच, यानी , 3 एच Torin उपचार के लिए, ४५ एच पोस्ट सीडिंग में दवा जोड़ें. RACK1 के लिए
    1. -LC3 इंटरेक्शन स्टडीज, Torin 1, rapamycin, और भुखमरी autophagy उत्प्रेरण के रूप में इस्तेमाल किया गया । कोशिकाओं 3 (२५० एनएम अंतिम एकाग्रता) एच के लिए 1 Torin के साथ तैयार किया गया; 16 ज (२०० एनएम अंतिम एकाग्रता) के लिए rapamycin के साथ; और अर्ल & #39 के साथ; एस 2 एच के लिए संतुलित नमक समाधान (EBSS) कोशिकाओं को भूखा करने के लिए ।
      नोट: 10% FBS के साथ DMEM में मशीन नियंत्रण शर्त के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
  7. के बाद कुल मशीन समय के ४८ ज, coverslides पर मीडिया को हटाने और उंहें 1 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ धो लो ।
  8. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा बाँझ के साथ कोशिकाओं की मशीन 1x पंजाब (पीएच ७.४) में 4% paraformaldehyde (पीएफए), किसी भी आंदोलन के बिना कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ।
    चूंकि पीएफए प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, गर्मी की अवधि के दौरान अंधेरे में थाली रखना (महत्वपूर्ण); एल्यूमीनियम पंनी के साथ थाली को कवर मदद कर सकते हैं । इसके अलावा, पीएफए विषाक्त है, इसलिए, एक धुएं डाकू के तहत काम करते हुए कोशिकाओं फिक्सिंग ।
    नोट: ध्यान रखें कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों में निर्धारण कदम को ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए, क्योंकि विशिष्ट एंटीबॉडी विभिन्न निर्धारण एजेंटों और शर्तों का उपयोग करके सबसे अच्छा काम कर सकता है.
  9. पीएफए गर्मी के 20 मिनट के बाद, पहले coverslides पर पीएफए समाधान निकालें और फिर 1 मिलीलीटर बाँझ फ़िल्टर पंजाबियों के साथ एक नमूना 3 बार धो लो । इस कदम पर, (महत्वपूर्ण) कुओं को एक-एक करके धो लें ताकि उन्हें सूखा न पड़ने दें । सूखने से बचें क्योंकि यह कोशिकाओं के बाद प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप करेगा, कक्ष आकृति विज्ञान बदल, और गैर विशिष्ट संकेतों को बढ़ा ।
  10. जब धोना पूरा हो जाए, तो नमूनों को बर्फ पर 1 मिलीलीटर पंजाब में रखें ।
  11. ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें: ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और ०.१% saponin.
    12. के साथ पंजाब
  12. आयल फिल्म के साथ एक 6 अच्छी प्लेट कवर । यह सुनिश्चित करें कि तेल फिल्म को कवर करने के बाद प्लेट नीचे चिकनी है । 6-वेल प्लेट को लेबल कर लीजिये.
  13. चिमटी का उपयोग कर, coverslides 12-अच्छी तरह से प्लेटों से 6-अच्छी तरह से तेल फिल्म के साथ कवर प्लेटों हस्तांतरण ।
  14. coverslides पर पंजाबियों को त्यागें और जोड़ें १०० & #181; permeabilization के लिए प्रत्येक coverslide पर समाधान अवरुद्ध का L. 30 min.
    15. के लिए बर्फ पर नमूने की मशीन
  15. समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करते हैं । प्रयोगों से पहले, धुंधला के लिए सबसे अच्छा काम कर सांद्रता को परिभाषित करने के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का अनुकूलन ।
    नोट: उदाहरण के लिए, LC3 एंटीबॉडी समाधान अवरुद्ध में एक 1:100 कमजोर पड़ने पर प्रयोग किया जाता है ।
  16. 30 मिनट की मशीन के बाद, अवरुद्ध समाधान त्यागें और एक बार पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ धीरे से नमूनों को धो लें ।
  17. Add १०० & #181; प्रत्येक coverslide के प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के एल. एक शेखर पर 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों की मशीन ।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन समय अनुकूलित किया जाना चाहिए । एंटीबॉडी पर निर्भर करता है, 4 & #176 पर एक रात की मशीन; सी बेहतर हो सकता है । यह सबसे अच्छा है एक बरतन धीरे (१०० घुमाव/मिनट) पर भी समान रूप से coverslides.
    18. पर एंटीबॉडी वितरित करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ
  18. के बाद, नमूने को व्यक्तिगत रूप से धोएं, 1 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ 3 बार ।
  19. तैयार 1:500 माध्यमिक एंटीबॉडी ब्लॉकिंग समाधान में (माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने का अनुकूलन आवश्यक हो सकता है) । यहां, विरोधी खरगोश आईजीजी Alexa Fluor ५६८ एक माध्यमिक विरोधी खरगोश एंटीबॉडी. के रूप में इस्तेमाल किया गया था
    1. के नमूनों को १०० & #181; के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के एल 1 ज के लिए एक शेखर पर कमरे के तापमान पर । fluorophore के बाद से माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, (महत्वपूर्ण) अंधेरे में समाधान रखें. के दौरान और माध्यमिक एंटीबॉडी मशीन के बाद अंधेरे में नमूनों प्लेस ।
  20. माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन के बाद, पंजाब के साथ 3 बार थाली धो लो ।
    नोट: अनुभव पर Baed, कुछ एंटीबॉडी उच्च पृष्ठभूमि संकेत है कि पंजाबियों बहाकर द्वारा समाप्त नहीं किया जा सकता है । अगर इस तरह के एक एंटीबॉडी से निपटने, १.२१ कदम के बाद, पंजाब में नमूनों में रखते हुए 4 & #176; C 6 ज के लिए मदद कर सकते हैं ।
    1. यदि आवश्यक हो, एक डीएनए के साथ कोशिकाओं दाग बंधन डाई, Hoechst के रूप में, नाभिक के निशान के लिए.
  21. एक से अधिक प्रोटीन दाग करने के लिए, एक ही प्रक्रिया दूसरे प्रोटीन के लिए १.१६ कदम से शुरू लागू होते हैं ।
    1. सुनिश्चित करें कि वहां कोई प्रजाति है एंटीबॉडी के बीच जेट जब एक से अधिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला प्रदर्शन ( जैसे , माउस और खरगोश एंटीबॉडी का उपयोग करें) ।
      नोट: यहां, RACK1 विरोधी का उपयोग करके दूसरा प्रोटीन के रूप में दाग है RACK1 प्राथमिक एंटीबॉडी और विरोधी माउस आईजीजी Alexa Fluor ४८८ माध्यमिक एक ही ऊपर उल्लेख किया सांद्रता का उपयोग कर एंटीबॉडी ।
  22. बढ़ते समाधान तैयार: 1x पंजाब में ५०% ग्लिसरॉल । a 22 & #181 के माध्यम से फ़िल्टर करें; m फ़िल्टर.
  23. एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछ और 10 & #181; एल बढ़ते समाधान प्रत्येक स्लाइड के लिए उपयोग इथेनॉल के साथ स्लाइड पोंछें । एक नोचना का प्रयोग, प्रत्येक dropso पर coverslides जगह है कि कोशिकाओं के साथ पक्ष बढ़ते माध्यम से सीधे संपर्क में है । त्यागें अतिरिक्त बढ़ते समाधान धीरे एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछे का उपयोग कर ।
  24. एक पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ coverslides सील । सबसे पहले, 4 किनारों पर नेल पॉलिश की बूँदें जोड़कर coverslides को स्थिर और फिर उन्हें पूरी तरह से सील.
  25. के रूप में एक फ्लोरोसेंट या फोकल माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों का विश्लेषण संभव के रूप में, फ्लोरोसेंट संकेत कुछ ही घंटों के बाद ब्लीच कर सकते हैं ।
< p class = "जोवe_title "> 2. Immunoprecipitation

  1. अलग करें और चरणों में वर्णित के रूप में कक्षों की गणना १.२ और १.३.
  2. यदि HEK293T कोशिकाओं के साथ काम कर रहे, बीज ४,०००,००० कोशिकाओं में प्रत्येक शर्त के लिए 15-सेमी पेट्री व्यंजन । यदि N2A कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, बीज ५,०००,००० कोशिकाओं में 15 सेमी पेट्री व्यंजन । ३७ & #176 पर एक सह 2 मशीन में कोशिकाओं की मशीन, प्रयोग के अंत तक सी.
  3. एक निर्धारित अवधि के लिए प्रासंगिक दवाओं या शर्तों के साथ कोशिकाओं का इलाज इतना है कि कोशिकाओं की कुल मशीन समय ४८ ज.
    से अधिक नहीं है नोट: इस अध्ययन में immunoprecipitation परीक्षणों के लिए, कोशिकाओं Torin के साथ 3 एच के लिए इलाज किया गया 1 (२५० एनएम), rapamycin के साथ 16 एच (२०० एनएम), और EBSS के साथ 2 एच. DMEM के साथ 10% FBS नियंत्रण के रूप में कक्षों में जोड़ा गया था ।
  4. कुल मशीन समय के ४८ ज के बाद, मीडिया को हटाने और कोशिकाओं फसल । चूंकि HEK293T कोशिकाओं थाली से आसानी से अलग, बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ प्लेट धोने फसल कटाई के लिए पर्याप्त हो सकता है । हालांकि, N2A कोशिकाओं को और अधिक टुकड़ी के लिए प्रतिरोधी रहे हैं; सेल स्क्रैपर का उपयोग करने के लिए फसल की मदद कोशिकाओं.
    1. microcentrifuge ट्यूबों में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा.
  5. के नमूने पर 15 मिनट के लिए १६,००० x g पर 4 & #176; C. supernatant को त्यागें और 1 एमएल पंजाबियों के साथ गोली धो फिर से इसे pipetting द्वारा सस्पैंड ।
  6. दोहराने कदम केंद्रापसारक, लेकिन पर सबसे अधिक केंद्रापसारक गति में 4 & #176; C के लिए 15 min. supernatant.
    7. छोड़ें
  7. प्रयोग शुरू करने से पहले रेडियो bliss-वर्षा परख (RIPA) बफर तैयार करें ।
    नोट: RIPA बफर के 3 प्रकार के होते हैं; जांच की जा रही प्रोटीन की बातचीत की तीव्रता के अनुसार चुनें (नीचे सूत्रों देखें) ।
    1. अगर एक मजबूत प्रोटीन प्रोटीन संपर्क है, नियमित रूप से RIPA बफर चुनें ।
    2. अगर बातचीत कमजोर है, या तो हल्के RIPA या मामूली RIPA चुनें ।
      नोट: इन बफ़र्स के व्यंजनों निम्न चरणों में हैं । immunoprecipitation परीक्षण में उपयोग किए जाने वाले सभी बफ़र्स को छेड़ने वाले अवरोधकों के साथ पूरक होना चाहिए ।
      1. तैयार नियमित RIPA बफर का उपयोग कर 1% NP-४०, १५० mm NaCl, ०.५% सोडियम deoxycholate, और ०.१% सोडियम dodecyl सल्फेट में ५० mm Tris पीएच 8.
      2. 1% NP-४०, १५० mm NaCl, और ०.२५% सोडियम deoxycholate ५० mm Tris pH ७.५ का उपयोग कर हल्के RIPA बफर तैयार करें ।
      3. 1% ट्राइटन-X १००, १३७ mm NaCl, 1% ग्लिसरॉल, और ५० mm orthovanadate पीएच ७.४ में 1 मिमी सोडियम Tris का उपयोग करके मामूली RIPA बफर तैयार करें ।
  8. उपयुक्त RIPA बफ़र को चुनने के बाद, चिढ़ाना अवरोधों (RIPA +) के साथ बफ़र का पूरक है । फिर, 3x के साथ कोशिकाओं RIPA + में सेल गोली की मात्रा लाइसे.
  9. भंवर 15 एस के लिए निलंबन 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें भंवर और टुकड़े 5 बार और फिर १६,००० x g पर 15 मिनट के लिए 4 & #176 में नमूने केंद्रापसारक; C.
  10. एक साफ microcentrifuge ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण और अवशेष कोशिका मलबे को हटाने के लिए केंद्रापसारक । एक साफ ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण supernatant.
  11. प्रोटीन lysates 1:50 पतला और खाली और मानकों के साथ एक ९६ अच्छी तरह से थाली तैयार करते हैं । नमूनों को पतला करना ।
    1. मिश्रण नमूने ब्रैडफोर्ड समाधान 1:20 के साथ । अंधेरे में 15 मिनट के लिए मशीन ।
    2. ५९५ एनएम तरंग दैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व उपाय । प्रत्येक नमूने के लिए अवशोषण मूल्यों का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता की गणना.
  12. दिन की कटाई से पहले कोशिकाओं, जोड़े प्रोटीन एक से अधिक मोती एंटीबॉडी कि ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट है के साथ ।
    1. कट की धार एक २०० & #181; l टिप कैंची का प्रयोग और प्रत्येक शर्त के लिए मनका घोल से 25 & #181; l का उपयोग करें.
    2. 1 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ एक बार मोती धोने, 1 मिलीलीटर RIPA बफर के साथ एक बार, और 1 मिलीलीटर RIPA + के साथ एक बार । 1 min.
      3. के लिए ३,३०० x g, 4 & #176; C पर वाश चरण बाहर ले जाएं
    3. के बाद अंतिम वाश, add ३०० & #181; RIPA + के मोतियों पर और जोड़ १.५ & #181; जी एंटीबॉडी कि प्रोटीन के लिए विशिष्ट है नीचे खींच लिया ।
    4. में रात भर ट्यूबों 4 & #176 पर, एक रोटेटर पर सी (20 घुमाव/
      नोट: यहां, ATG5 विशिष्ट विरोधी ATG5 एंटीबॉडी का उपयोग immunoprecipitated था ।
  13. एंटीबॉडी के साथ मोतियों की रात भर की मशीन के बाद, पंजाबियों के साथ एक बार मोती धोने, RIPA के साथ एक बार, और RIPA के साथ एक बार + के रूप में कदम 2.12.2 में वर्णित है ।
  14. प्रत्येक शर्त के लिए मोतियों पर 2 मिलीग्राम प्रोटीन lysate जोड़ें और कुल मात्रा को पूरा ३०० & #181; L with RIPA + बफर/ 4 पर एक रोटेटर पर रात भर ट्यूबों मशीन & #176; C.
  15. के बाद, पहले वर्णित (चरण 2.12.2) के रूप में मोतियों को धो लें ।
    1. अंतिम धोने के बाद, मोतियों को छूने के बिना सभी supernatant को दूर करने के लिए एक छोटे प्लास्टिक टिप का उपयोग करें ।
    2. Add 10 & #181; 3x लोड करने वाली डाई की एल: 6% एसडीएस, 30% ग्लिसरॉल, 16% & #946;-Mercaptoethanol, और ०.१% Bromophenol नीले 1m Tris में-HCl pH ६.८.
  16. का उपयोग कर इनपुट नियंत्रण तैयार करें १०० & #181; छ प्रोटीन lysate प्रत्येक शर्त के लिए । पानी का उपयोग कर नमूना मात्रा बराबर और 3x लोड डाई की उचित मात्रा में जोड़ें ।
  17. पर फोड़े नमूने ९५ & #176; ग के लिए 10 min.
    नोट: आमतौर पर जब नमूने उबलते, ट्यूबों की टोपियां सहज रूप से खोल सकते हैं और नमूने खो रहे हैं । एक विशिष्ट कैप अवरोधक के साथ बंद टोपियां धारण करके इससे बचें ।
  18. नमूने और एसडीएस-पृष्ठ जैल पर लोड नीचे स्पिन मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर अपने आकार के अनुसार प्रोटीन अलग करने के लिए ।
    नोट: RACK1 और ATG5 पर इस अध्ययन में, नमूने 30 मिनट के लिए ८० वी पर 12% polyacrylamide जैल के माध्यम से चला रहे थे, और फिर १२० v पर लगभग ९० मिनट के लिए । हालांकि, LC3 जैसे छोटे प्रोटीन के लिए, 15% polyacrylamide जैल का उपयोग करना अधिक उपयुक्त है ।
  19. जेल चलने के बाद पूरा हो गया है, या तो गीला या अर्द्ध शुष्क हस्तांतरण तरीकों का उपयोग कर nitrocellulose या PVDF झिल्ली के लिए प्रोटीन स्थानांतरण । फिर, 5% गैर में मशीन द्वारा झिल्ली ब्लॉक-मोटा दूध के साथ पंजाब में ०.०५% के बीच 20 (PBST) कमरे के तापमान पर 1 h. धो झिल्ली के लिए PBST के साथ 3 बार 5 min.
    20. के लिए
  20. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए काम कर सांद्रता में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन । प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए, लाल समाधानों वाले BSA का उपयोग करें (5% BSA Cohn वी अंश, ०.०२% सोडियम azide PBST में, ph ७.५; जोड़ें Phenol लाल एक पीएच मार्कर के रूप में जोड़ा) एंटीबॉडी के पुनः प्रयोग की अनुमति के लिए ।
    नोट: उदाहरण के लिए, लाल समाधान में ATG5 एंटीबॉडी 2, 000x को पतला करें ।
    1. मशीन समय के अंत में, झिल्ली धो PBST के साथ 3 बार ।
  21. एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी कि 5% गैर वसा दूध समाधान में तैयार किया गया था के साथ झिल्ली की मशीन (यहां, विरोधी खरगोश आईजीजी पर 1:10.000 इस्तेमाल किया गया था) । फिर 5 min.
    22. के लिए PBST के साथ 3x झिल्ली धो
  22. मेक ECL सॉल्यूशन: 25 एमएम luminol, 9 एमएम coumaric एसिड, 3 एक्स 10 -4 % एच 2 ओ 2 में ७० एमएम Tris-एचसीएल नं० ८.८ । प्रयोग ताजे एच २ हे २ प्रत्येक प्रयोग.
    नोट: प्रतिक्रिया के बाद शुरू होता है H 2 O 2 इसके अलावा और यह लगभग 20 मिनट के लिए जारी है ।
    1. ECL में 20 मिनट के लिए झिल्ली और एक्स-रे फिल्मों की मशीन । विकास और एक अंधेरे कमरे में उन्हें ठीक ।
  23. बंद या अतिव्यापी आणविक भार के साथ प्रोटीन के सह immunoprecipitation की जांच करने के लिए, यह आवश्यक हो सकता है ६० & #176 पर झिल्ली से दूर एंटीबॉडी पट्टी करने के लिए, अलग करना बफर में 30 मिनट के लिए सी: (25 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 2 और 1% एसडीएस).
  24. चरण २.२० करने के लिए २.२३ अलग एंटीबॉडी का उपयोग सह immunoprecipitation के लिए जाँच करने के लिए दोहराएँ । उदाहरण के लिए, ATG5 पता लगाने और झिल्ली के अलग करना, RACK1 प्रोटीन एक विरोधी RACK1 प्राथमिक एंटीबॉडी (1:1000) और माध्यमिक एंटीबॉडी (1:10000) का उपयोग कर एक ही झिल्ली पर परीक्षण किया गया था । & #946;-Actin लोड नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था; और आईजीजी संकेत immunoprecipitated नमूनों के लिए लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

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Representative Results

चित्रा 1 में इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त एक सह-स्थानीयकरण परिणाम का एक उदाहरण दिखाया गया है । हमारे हाल ही के पेपर से एक आंकड़ा8प्रस्तुत किया है । यहां अंतर्जात RACK1 प्रोटीन का दाग हरे रंग में समा गया, जबकि अंतर्जात LC3 लाल रंग में सना हुआ था । हरे और लाल संकेतों के बीच ओवरलैप की साइटों को मर्ज किए गए चित्रों में स्वीकार्य हैं जो पीले डॉट्स इंगित करते हैं । इस प्रकार पीले डॉट्स आंशिक सह इन दो प्रोटीन के स्थानीयकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस परिणाम. HEK293T कोशिकाओं को coverslides पर कल्चर किया गया. कोशिकाओं का इलाज किया गया या rapamycin के साथ इलाज नहीं (रॅप, २०० एनएम, 16 ज) या Torin 1 (Torin, 250 एनएम, 3 एच), या EBSS में भूखे (Stv, 2 ज) । इसके बाद अंतर्जात प्रोटीन्स एंटी-RACK1 और एंटी-LC3 प्राइमरी एंटीबॉडी का इस्तेमाल करके immunostained गए । कोशिकाओं को एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किया गया । सीएनटी, गैर-उपचारित कक्ष; विलय, greenand redsignals के ओवरले । RACK1 और LC3 सह-स्थानीयकरण के साथ श्वेत arrowsshow yellowcytoplasmic डॉट्स । यह शोध मूल रूप से इरबिल एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था । 8 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2में, एक अंतर्जात immunoprecipitation परिणाम का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है । इस आंकड़े में, ATG5 प्रोटीन और तेज RACK1 सह immunoprecipitation विभिंन परिस्थितियों के तहत पाया गया था । सामांय खरगोश सीरम एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि immunoprecipitation परिणाम. HEK293T कोशिकाओं का इलाज किया गया या rapamycin के साथ इलाज नहीं (रॅप, २०० एनएम, 16 ज) या Torin 1 (Torin, २५० एनएम, 3 एच), या EBSS (2 एच) में भूखे । अंतर्जात ATG5 प्रोटीन सेल निष्कर्षों से immunoprecipitated था विरोधी ATG5 एंटीबॉडी कि प्रोटीन ए प्लस मोतियों के लिए युग्मित थे का उपयोग कर । immunoblotting के लिए एंटी-ATG5 और एंटी-RACK1 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया । सीरम, नियंत्रण खरगोश सीरम । यह शोध मूल रूप से इरबिल एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था । 8. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि RACK1 प्रोटीन autophagy रास्ते में शामिल है । RACK1 प्रोटीन सह autophagy प्रेरण के दौरान autophagosome की तरह संरचनाओं पर LC3 प्रोटीन के साथ स्थानीयकृत । इसके अलावा, सह immunoprecipitation परिणाम से पता चला कि RACK1 और ATG5 प्रोटीन भी बेसल शर्तों पर बातचीत कर रहे थे, और बातचीत के स्तर को सक्रिय autophagy के तहत वृद्धि की स्थिति । हम पहले की उपस्थिति या लाइसोसोमल अवरोधकों (Bafilomycin ए, E64D/Pepstatin एक) कि autophagic प्रवाह प्रयोगात्मक शर्तों के तहत बाधित नहीं था की अनुपस्थिति में p62 क्षरण और LC3 द्वितीय संचय परीक्षण का उपयोग कर पुष्टि की8। इसलिए, यहां और कहीं प्रस्तुत परिणामों से पता चला कि RACK1-ATG5 बातचीत autophagy के आरंभिक चरणों के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Discussion

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए Immunoprecipitation और इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक महत्वपूर्ण हैं । हालांकि इन दो तकनीकों आमतौर पर इस्तेमाल किया और अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, कई मानदंडों को इन तकनीकों का उपयोग करते हुए प्रयोगों की गुणवत्ता को परिभाषित करने पर विचार किया जाना चाहिए ।

सबसे पहले, प्राथमिक एंटीबॉडी कि इन परीक्षणों में उपयोग किया जाता है ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट होना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए, प्रश्न में एंटीबॉडी की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए shRNA knockdowns या नॉकआउट कोशिकाओं का उपयोग करें । इसके अतिरिक्त, सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें, या ब्याज की प्रोटीन के एक ज्ञात उत्प्रेरण के साथ कोशिकाओं का इलाज । बैच के एंटीबॉडी का बैच रूपांतरों के रूप में अच्छी तरह से मौजूद । इसके अलावा, कुछ polyclonal एंटीबॉडी या सीरा उच्च पृष्ठभूमि और गैर विशिष्ट बैंड हो सकता है । हालांकि इन बैंड के कुछ ब्याज के प्रोटीन के वैकल्पिक रूप हो सकता है, सामांय में वे पार से संबंधित प्रोटीन के साथ polyclonal एंटीबॉडी की प्रतिक्रिया से परिणाम या वे गैर विशिष्ट हो सकता है । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सामांय में इस अर्थ में अधिक विशिष्ट हैं, हालांकि उत्पंन संकेतों को कमजोर किया जा सकता है । टैग प्रोटीन और स्थापित विरोधी टैग एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी विशिष्टता की पुष्टि उपयोगी हो सकता है, लेकिन अंतर्जात बातचीत अभी भी अधिक मूल्यवान और आवश्यक हैं ।

सह-स्थानीयकरण या सह-immunoprecipitation परीक्षण निश्चित रूप से स्थापित नहीं होंगे कि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन प्रत्यक्ष हैं या नहीं. यह संभव है कि अतिरिक्त भागीदारों मनाया बातचीत मध्यस्थता कर सकते हैं । दरअसल, चित्रा 1में, RACK1 और LC3 प्रोटीन का एक आंशिक सह स्थानीयकरण देखा गया था, जो उनकी बातचीत का एक संकेत हो सकता है; हालांकि, ऐसे में इन विट्रो पुल नीचे संयोजक प्रोटीन या प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में प्रत्यक्ष बाध्यकारी परीक्षणों को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या मनाया बातचीत या नहीं प्रत्यक्ष रहे हैं । दूसरी ओर, इस तरह के जेल निस्पंदन के रूप में तकनीक जटिल प्रोटीन एक और अधिक समझाने तरीके से अधिक से अधिक प्रोटीन को शामिल बातचीत को उजागर करने में मदद मिलेगी । एक autophagy परिप्रेक्ष्य से इम्यूनोफ्लोरेसेंस परिणामों का एक और अधिक कठोर विश्लेषण के लिए डॉट्स की संख्या है कि हर कोशिका में LC3 autophagy मार्कर के लिए सकारात्मक है गिनती द्वारा autophagy प्रेरण की निगरानी होगी, LC3 की संख्या की वृद्धि के बाद से सकारात्मक डॉट्स autophagosomes की संख्या के साथ संबद्ध । पियरसन के गुणांक का उपयोग, ली की विधि, या Manders ' सहसंबंध परीक्षण प्रयोगात्मक परिणामों के बेहतर मात्रात्मक और तुलनात्मक मूल्यांकन प्रदान करते हैं ।

एक अंय महत्वपूर्ण बात स्वतंत्र तकनीकों और विभिंन सेल लाइनों का उपयोग कर बातचीत के सत्यापन है । कुछ इंटरैक्शन ऐसी कलाकृतियाँ हो सकती हैं जो प्रोटीन या प्रोटीन के चिपचिपाहट से संबंधित होती हैं. यदि ध्यान से धोया न जाए तो ATG5 प्रोटीन से भी immunoprecipitations (दोनों agarose या sepharose मोतियों) में प्रयुक्त होने वाले मोतियों से चिपके रहने का खतरा रहता है. इसके अतिरिक्त, इम्यूनोफ्लोरेसेंस परीक्षणों में, प्रोटीन autophagosomes या autolysosomes की तरह दिखते है कि समुच्चय फार्म कर सकते हैं । इसलिए, जबकि अभिकर्मक प्रभावकारिता नियंत्रण के रूप में सह transfected फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करते हुए क्षणिक transfections प्रदर्शन, immunoblots में, ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर का उपयोग कर निष्कर्षों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के स्तर की तुलना में किया जा सकता विशिष्ट एंटीबॉडी, सामान्यीकरण की एक विधि प्रदान.

इन सभी परीक्षणों में, परिणामों का reproducibility अत्यंत महत्व का है । प्राप्त परिणामों के प्रति आश्वस्त होने के लिए हम प्रत्येक प्रयोग को कम से 3-4 बार दोहराना पसंद करते हैं. हम यह साबित करने के लिए कि हमारी अवलोकन कक्ष प्रकार-विशिष्ट नहीं हैं, कम से दो भिंन कक्ष रेखाओं में भी समान प्रयोग करते हैं । इसके अतिरिक्त, सही सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण (उदा., मोती immunoprecipitation परीक्षणों के लिए अकेले या नियंत्रण एंटीबॉडी प्लस सीरम) सही निष्कर्ष तक पहुंचने के लिए योजना बनाई जानी चाहिए । इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों के अनुकूलन के दौरान, यह एक द्वितीयक एंटीबॉडी केवल नियंत्रण जहां प्राथमिक एंटीबॉडी छोड़ दिया है करने के लिए उपयोगी है । इस नियंत्रण सुनिश्चित करें कि मनाया संकेतों प्राथमिक एंटीबॉडी से ब्याज की प्रोटीन के लिए बाध्यकारी है, और नहीं माध्यमिक एंटीबॉडी के एक गैर विशेष बाध्यकारी से उत्पंन करते हैं ।

autophagy और अन्य जैविक घटनाओं को विनियमित करने वाले प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संख्या की खोज में वृद्धि हो रही है, फिर भी शोध पूरी तस्वीर होने से दूर है । हालांकि उच्च प्रवाह तकनीक जैसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री या bioinformatics आधारित भविष्यवाणियों के लिए कई autophagy के लिए बातचीत के नेटवर्क से संबंधित प्रोटीन प्रकट जारी, इन बातचीत की पुष्टि शास्त्रीय जैव रसायन का उपयोग और सूक्ष्म तरीके इस बुनियादी और महत्वपूर्ण सेलुलर मार्ग के कार्यात्मक और गतिशील गुणों को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम तुर्की के वैज्ञानिक और प्रौद्योगिकीय अनुसंधान परिषद (TUBITAK) १००१ अनुदान 107T153, Sabanci विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था । एसईबी और NMK एक TUBITAK BIDEB २२११ पीएच. डी. अध्ययन के लिए छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin EDTA Solution A Biological Industries  BI03-050-1A
PBS GE Healthcare SH-30256.01
DMEM (high glucose) Sigma  5671
DMEM (low glucose) Sigma 5546
Trypan Blue Sigma T8154
Hemocytometer Sigma Z359629-1EA
coverslides Jena Bioscience CSL-103
slides Isolab I.075.02.005
Poly-L-Lysine Sigma  P8920
Torin Tocris 4247
DMSO Sigma VWRSAD2650
EBSS Biological Industries  BI02-010-1A
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 15812-7
BSA Sigma  A4503
Saponin Sigma 84510
LC3 Antibody Sigma L7543
Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568  Invitrogen A11011
RACK1 Antibody Santa Cruz Biotechnology  sc-17754
Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488  Invitrogen A11001
NP-40 Applichem A16694.0250
Sodium Chloride Applichem A9242.5000
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Biochemika A2572
Trizma Base Sigma T1503
Triton-X  Applichem 4975
Sodium orthovanadate Sigma 450243
ATG5 Antibody Sigma A0856
Glycerol Applichem A4453
β-Mercaptoethanol  Applichem A1108.0250
Bromophenol blue  Applichem A3640.0005
Non-Fat milk Applichem A0830
Tween 20 Sigma P5927
Sodium Azide Riedel de Haen 13412
Phenol red  Sigma 114537-5G
anti-rabbit IgG , HRP conjugated Jackson Immuno.  1110305144
Luminol Fluka 9253
Coumeric Acid Sigma C9008
Hydrogen Peroxide Merck K35522500604
anti mouse IgG, HRP conjugated Jackson Immuno. 115035003
β-Actin Antibody Sigma  A5441
Normal rabbit serum Santa Cruz Biotechnology sc-2027
Rapamycin Sigma  R0395
Protein A-Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2001
fetal bovine serum  Biowest S1810-500
penicillin/streptomycin solution Biological Industries  03-031-1B
L-glutamine  Biological Industries  BI03-020-1B
Bradford Solution Sigma 6916
Nitocellulose membrane GE Healthcare A10083108
X-ray Films Fujifilm 47410 19289
Protease inhibitor Sigma P8340

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References

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Erbil-Bilir, S., Kocaturk, N. M.,… More

Erbil-Bilir, S., Kocaturk, N. M., Yayli, M., Gozuacik, D. Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research. J. Vis. Exp. (127), e55881, doi:10.3791/55881 (2017).

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