Summary
Presenteras här är två antikroppsbaserade protein-protein interaktioner forskningstekniker: immunofluorescens och immunoprecipitation. Dessa tekniker är lämpliga för att studera fysiska interaktioner mellan proteiner för upptäckten av nya komponenter av cellulära signalvägar och förståelse protein dynamics.
Abstract
Protein-protein interaktioner är viktiga för förståelsen cellulär signalering kaskader och identifierande roman väg komponenter och protein dynamics. Majoriteten av cellulära aktiviteter kräver fysiska interaktioner mellan proteiner. För att analysera och kartlägga dessa interaktioner, utvecklades olika experimentella tekniker samt bioinformatiska verktyg. Autofagi är en cellulär återvinning mekanism som gör att cellerna att klara olika stressorer, inklusive näringsämnen deprivation, kemikalier och hypoxi. För att bättre förstå autofagi-relaterade signalering händelser och upptäck nya faktorer som reglerar proteinkomplex i autofagi, utfört vi protein-protein interaktioner skärmar. Validering av dessa screening resultat kräver användning av immunofluorescens och immunoprecipitation tekniker. I detta system, specifika autofagi-relaterade protein-protein interaktioner som vi upptäckte testades i Neuro2A (N2A) och HEK293T cellinjer. Detaljer för tekniska metoderna förklaras i detta visualiseras experiment papper.
Introduction
Macroautophagy (autofagi, häri) är en cellulär stress mekanism som kännetecknas av beslagtagande av bulk cytoplasman, proteiner och organeller i dubbla membran blåsor kallas autophagic blåsor. Genom fusion av det yttre lagret av den dubbla membranen, autophagic blåsor och deras last levereras till lysosomer och förstörd däri1. Autofagi uppstår vid låga basala nivåer i alla celltyper och i alla organismer, utför homeostatiska funktioner såsom proteinnedbrytning och organell (t.ex., mitokondrierna) omsättning. Under förhållanden som leder till cellulär stress, såsom hungersnöd, autofagi är snabbt uppreglerad och tillåter cellen att upprätthålla energinivåer och grundläggande metabolism1,2,3.
Omkring 30 autofagi gener har blivit klonad från jästen och deras proteinprodukter visades att spela en roll i olika stadier av autophagic processen, inklusive vesikler nukleation, expansion, vesikler fusion till sena endosome/lysosomen, och Last nedbrytning 4 , 5. Orthologs av majoriteten av dessa gener har identifierats och studier i olika organismer bekräftat bevarandet av deras cellulära funktioner6. Studier under det senaste decenniet visade att flera autofagi-relaterade proteinkomplex och protein-protein interaktioner finns och att de reglerar autofagi vägar i en intrikat och kontrollerat sätt. Korsningar, säkerhetskopior, feedback och återkoppling mekanismer existerar, och de tillåter cellen att samordna autofagi med andra relaterade händelser (såsom vesikulär sekretion, Lysosomen biogenes, endosomal sortering och transport7, etc.) I en opartisk jäst-två hybrid skärm använder proteinet autofagi ATG5 som ett bete, (ATG5 är en nyckel autofagi protein som deltar i E2-liknande konjugera systemet som medierar LC3 lipidation i svält inducerad autofagi), vi har identifierat receptorn aktiveras C-Kinas 1 (RACK1; GNB2L1) som en stark datadestination och en roman autofagi komponent8. Ännu viktigare, visade skärmen att ATG5-RACK1 interaktionen var oumbärlig för autofagi induktion av klassiskt autofagi inducerare (dvs, svält och mTOR-hämning).
Immunofluorescens-baserade metoder är vanligen används för att övervaka protein-protein interaktioner. Dessa tekniker är främst antikroppsbaserade, och hjälp att visualisera interaktioner och bekräfta cellulära lokaliseringar. I denna teknik, fluorescerande tagga konjugerade antikroppar som är specifika för proteiner av intresse är vanligen används för specifik färgning. Varje protein kan märkas med antikroppar kopplat till olika fluorescerande färgämnen. En överlappning i signalen när bilder sammanfogas med protein-specifika antikroppar, och anger samtidig localizationen av proteiner under konfokalmikroskopi. Tekniken är tillämplig även vävnader eller. Immunofluorescens tekniker ge ledtrådar om interaktion dynamics, och hjälpa till att identifiera storleken och fördelningen av proteinkomplex, medan spåra generella förändringar i cellulära morfologi under olika förhållanden9. Immunoprecipitation är en annan vanligt förekommande antikroppsbaserade teknik som möjliggör analys av interaktioner mellan ges proteiner10. Med denna teknik, proteiner av intresse är isolerade från celler eller vävnad extrakt med specifika antikroppar, vilket resulterar i utfällning av proteiner som är i en komplex eller i kontakt med ett protein av intresse. Co-immunoprecipitation, där proteinet och dess samtidig datadestination upptäcks, avslöjar inte bara samverkan mellan de två proteinerna, men kan mäta sin styrka av interaktion under olika omständigheter11.
Det här protokollet beskriver i detalj viktiga tekniker som användes för att bekräfta och karakterisera ATG5-RACK1 och RACK1-LC3 interaktion. Fokus ligger på immunofluorescens och immunoprecipitation tekniker, med betoning av kritiska moment och fallgropar för autofagi forskning, liksom felsökningsförslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunofluorescens
- hålla HEK293T mänskliga embryonala njure celler DMEM hög glukos medellång och N2A mus neuroblast celler DMEM låg glukos medium, i en 5% CO 2-befuktade inkubator vid 37 ° C. Komplettera kultur media med 10% Värmeinaktiverade fostrets nötkreatur (FBS) serum, antibiotika (50 U/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin) och L-glutamin (2 mM).
- Lossa cellerna med hjälp av 0,25% trypsin. Först ta bort media av cellkulturen och sedan tvätta cellerna med 10 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och inkubera i 1 mL av trypsin vid 37 ° C i 5 min. Inactivate trypsin genom att lägga till 2 mL DMEM medium.
- Tvätta plattan väl av pipettering. Ta bort 10 µL cell lösning och blanda det med 10 µL trypan blå. Räkna antalet levande celler som använder en hemocytometer.
- Både HEK293T och N2A är vidhäftande cellinjer, dock HEK293T celler lossna från plattan lätt. Därför, om arbetar med HEK293T cellinje, filtreras kappa i coverslides med steril 0,01% poly-L-lysin före sådd cellerna.
- Plats sterila coverslides i en 10 cm petriskål. Tillsätt lämplig mängd poly-L-lysin lösning på varje coverslide. Inkubera i coverslides med poly-L-lysin lösning för 10 min.
- Ta bort poly-L-lysin lösningen.
Obs: Poly-L-lysin är re-usable; Det är frivilligt att samla och återanvända det för ytterligare experiment. Eftersom poly-L-lysin är giftiga, vänta tills all lösning på coverslides helt avdunstar och sedan återställa den poly-L-lysin. - Tvätta coverslides med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Tillsätt 1 mL DMEM i varje brunn 12-bra platta. Placera en coverslide i varje brunn.
- Utsäde 20 000 celler per brunn, droppe för droppe under omskakning plattan samtidigt för en homogen fördelning av celler på coverslides. Hålla celler i CO 2 inkubator vid 37 ° C och tillsätt drogen så att den totala inkubationstiden inte överstiger 48 h, dvs för 3 h Torin behandling, lägga drogen på 45 h post sådd.
- För RACK1-LC3 interaktionsstudier, Torin 1, rapamycin och svält användes som autofagi inducerare. Celler inkuberades med Torin 1 för 3 h (250 nM slutlig koncentration); med rapamycin för 16 h (200 nM slutlig koncentration); och med Engdahl ' s balanserad Salt lösning (EBSS) för 2 h för att svälta celler.
Obs: Inkubation i DMEM med 10% FBS användes som kontroll villkoret.
- För RACK1-LC3 interaktionsstudier, Torin 1, rapamycin och svält användes som autofagi inducerare. Celler inkuberades med Torin 1 för 3 h (250 nM slutlig koncentration); med rapamycin för 16 h (200 nM slutlig koncentration); och med Engdahl ' s balanserad Salt lösning (EBSS) för 2 h för att svälta celler.
- Efter 48 h av totala inkubationstiden, ta bort media på coverslides och tvätta dem med 1 mL PBS.
- Fixar cellerna, inkubera cellerna med 1 mL is kallt sterilt filtrerade 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS (pH 7,4), i 20 min i rumstemperatur utan någon agitation.
Eftersom PFA är känsliga för ljus, hålla (viktigt) plattan i mörkret under inkubationstiden; som täcker plattan med aluminiumfolie kan hjälpa. Dessutom, PFA är giftiga, därför, arbeta under ett dragskåp fördriva tiden fästande cellerna.
Obs: Tänk på att fixering steg i immunofluorescens experiment bör optimeras, eftersom specifika antikroppar kanske fungerar bäst med olika fixering agenter och villkor. - Efter 20 min av PFA inkubation, först ta bort PFA lösningen på coverslides och sedan tvätta varje prov 3 gånger med 1 mL steril filtrerade PBS. At detta steg, (viktigt) Tvätta brunnarna en i taget så att inte låt dem torka. Undvika uttorkning eftersom det kommer att störa efterföljande reaktioner i cellerna, ändra cellmorfologi och öka icke-specifika signaler.
- När tvätten är klar, hålla proverna i 1 mL PBS på ice.
- Bereda blockerande lösning: PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) och 0,1% saponin.
- Täcker en 6-well platta med paraffin film. Se till att botten plattan är smidig efter paraffin filma beläggningen. Etikett 6-väl plattan.
- Med pincett, överföring av coverslides från 12-väl plattorna till 6-väl plåtarna täckta av paraffin.
- Kasta PBS på coverslides och tillsätt 100 µL blockerande lösning på varje coverslide för permeabilisering. Inkubera proverna på is för 30 min.
- Förbereda den primära antikroppen blockerar lösning. Innan experimenten, optimera antikropp spädningarna för att definiera de bästa arbetande koncentrationerna för färgning.
Anmärkning: till exempel LC3 antikropp används vid en spädning på 1: 100 i blockerande lösning. - Efter 30 min ruvning, kassera blockerande lösningen och tvätta proverna försiktigt med 1 mL PBS gång.
- Tillsätt 100 µL av primär antikropp lösning till varje coverslide. Inkubera proverna i rumstemperatur i 1 h, på en skakapparat.
Obs: Inkubationstiden med primära antikroppen bör optimeras. Beroende på antikroppen, kan en över natten inkubation vid 4 ° C vara att föredra. Det är bäst att ruva på en shaker försiktigt (100 varv/min) till lika fördela antikroppen på coverslides. - Efter inkubation med den primär antikroppen, tvätta prover individuellt, 3 gånger med 1 mL PBS.
- Förbered 1: 500 sekundära antikroppar blockera lösning (optimeringar av spädningar av sekundär antikropp kan behövas). Här, anti-kanin IgG Alexa Fluor 568 användes som en sekundär anti-kanin-antikropp.
- Inkubera av prov med de 100 µL av sekundär antikropp lösning för 1 h i rumstemperatur på en shaker. Eftersom fluorophore-märkt sekundära antikropparna är ljuskänslig, (viktigt) Förvara lösningen i mörkret. Placera proverna i mörkret under och efter sekundär antikropp ruvning.
- Efter sekundär antikropp ruvning, tvätta plattan 3 gånger med PBS.
Obs: Baed på erfarenhet, vissa antikroppar har hög bakgrund signaler som inte kan undanröjas genom PBS tvättar. Om behandlar sådan en antikropp, efter steg 1.21, kan att hålla proverna i PBS vid 4 ° C i 6 h hjälpa.- Om det behövs, färga cellerna med ett DNA-bindande färgämne, såsom Hoechst, att markera atomkärnor.
- För att färga mer än en protein, tillämpa samma förfarande start från steg 1.16 för andra protein.
- Kontrollera att det finns inga arter reaktivitet mellan antikroppar när du utför färgning med mer än en antikropp (t.ex., använda mus och kanin antikroppar).
Obs: Här, RACK1 är målat som andra protein med hjälp av anti-RACK1 primära antikroppar och antimus IgG Alexa Fluor 488 sekundära antikroppar använder de samma koncentrationer som nämns ovan.
- Kontrollera att det finns inga arter reaktivitet mellan antikroppar när du utför färgning med mer än en antikropp (t.ex., använda mus och kanin antikroppar).
- Bereda montering lösning: 50% Glycerol i 1 x PBS. Filtrera genom ett 22 µm filter.
- Torka bilderna med etanol med en luddfri torka och Lägg till 10 µL montering lösning till varje bild. Med hjälp av en pincett, placera coverslides på varje dropso som sidan med celler är i direkt kontakt med monteringsmedium. Kassera överskott montering lösning försiktigt med luddfria servetter.
- Tätning i coverslides med ett genomskinligt nagellack. Först, stabilisera coverslides genom att lägga till droppar av nagellack på 4 kanterna och sedan skrivskydda dem helt.
- Analysera proverna under ett lysrör eller confocal Mikroskop så snart som möjligt, eftersom den fluorescerande signalen kan bleka efter några timmar.
- Detach och räkna cellerna som beskrivs i steg 1.2 och 1.3.
- Om arbetar med HEK293T celler, utsäde 4 miljoner celler för varje villkor i 15-cm petriskålar. Om arbetar med N2A celler, utsäde 5 miljoner celler i 15 cm petriskålar. Inkubera cellerna i en CO 2 inkubator vid 37 ° C fram till slutet av experimentet.
- Behandla cellerna med den relevanta läkemedel eller villkoren för en angiven varaktighet så att den totala inkubationstiden av cellerna inte överstiger 48 h.
Obs: För den immunoprecipitation för proven i denna studie behandlades celler för 3 h med Torin 1 (250 nM), 16 h med rapamycin (200 nM), och 2 h med EBSS. DMEM med 10% FBS lades till cellerna som kontroll. - Efter 48 h av totala inkubationstiden, ta bort media och skörda cellerna. Eftersom HEK293T celler lossna lätt från plattan, kan tvätta plattan med is kallt PBS vara tillräcklig för att skörda. Dock är N2A celler mer motståndskraftiga mot avlossning; Använd cellen skrapor för att skörda cellerna.
- Samla alla celler i mikrocentrifugrör.
- Centrifug prover vid 16 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 1 mL PBS genom åter att avbryta det genom pipettering.
- Upprepa centrifug, men med högsta centrifug hastighet vid 4 ° C i 15 min. avlägsna supernatanten.
- Förbereda Radio Immuno-nederbörd Assay (RIPA) bufferten innan experimentet.
Obs: Det finns 3 typer av RIPA bufferten; Välj enligt interaktion intensiteten av proteiner utreds (se formler nedan).- Om det finns en stark protein-protein interaktioner, välja vanlig RIPA bufferten.
- Om samspelet är svag, välja mild RIPA eller mildare RIPA.
Obs: Recept av dessa buffertar är i följande steg. Alla buffertar som används i immunoprecipitation tester bör kompletteras med proteashämmare.- Förbereda regelbundna RIPA buffert med 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxikolat och 0,1% sodium dodecyl sulfat i 50 mM Tris pH 8.
- Förbereda mild RIPA buffert med 1% NP-40, 150 mM NaCl och 0,25% natriumdeoxikolat i 50 mM Tris pH 7.5.
- Förbereda mildare RIPA bufferten med 1% Triton-X 100, 137 mM NaCl, 1% glycerol och 1 mM natrium orthovanadate i 50 mM Tris pH 7,4.
- Efter att välja lämpliga RIPA bufferten, komplettera bufferten med proteashämmare (RIPA +). Sedan lysera celler med 3 x volymen av cellpelleten i RIPA +.
- Vortex suspensionen för 15 s. hålla det på isen för 5 min. Upprepa vortex och florsocker 5 gånger och sedan Centrifugera proverna vid 16 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ren mikrocentrifug rör och centrifugera bort kvarleva cellfragment. Överför supernatanten till en ren tube.
- Späd protein lysates 1:50 och förbereda en plattan med 96 brunnar med blank och standarder. Späd ut proverna.
- Blandning prover med Bradford lösning 1:20. Inkubera i 15 min i mörkret.
- Mät den optiska densiteten vid 595 nm våglängd. Beräkna protein koncentrationen med absorptionsvärdena för varje prov.
- Dagen innan skörd cellerna, par protein A Plus pärlor med antikroppar som är specifika för proteinet av intresse.
- Skär kanten av ett 200 µL tips med sax och använda 25 µL från pärla suspensionen för varje villkor.
- Tvätta pärlorna en gång med 1 mL PBS, en gång med 1 mL RIPA bufferten, och en gång med 1 mL RIPA +. Utför tvätt steg vid 3300 x g, 4 ° C i 1 min.
- Efter den sista tvättningen, tillsätt 300 µL av RIPA + på pärlor och 1,5 µg-antikropp som är specifik för proteinet dras.
- Inkubera rören övernattning på 4 ° C på en rotator (20 varv/min).
Obs: Här ATG5 var immunoprecipitated med hjälp av specifika anti-ATG5 antikroppar.
- Efter den natten inkubationen av pärlor med antikroppen, tvätta pärlorna en gång med PBS, en gång med RIPA och en gång med RIPA + som beskrivs i steg 2.12.2.
- Add 2 mg protein lysate på pärlor för varje skick och slutföra den totala volymen till 300 µL med RIPA + buffert/röret. Inkubera rören övernattning på en rotator vid 4 ° C.
- Efter inkubering, tvätta pärlorna som tidigare beskrivits (steg 2.12.2).
- Efter den sista tvättningen, använda ett mindre Pipettera tips att ta bort alla supernatanten utan att vidröra pärlorna.
- Lägg till 10 µL av 3 x laddar färgämne: 6% SDS, 30% Glycerol, 16% β-merkaptoetanol och 0,1% Bromophenol blå i 1M Tris-HCl pH 6,8.
- Förbereda de ingående kontroller med minst 100 µg protein lysate för varje villkor. Utjämna de provvolymer med vatten och Tillsätt lämplig mängd 3 x laddar dye.
- Koka prover vid 95 ° C i 10 min.
Obs: Oftast när kokande proverna, mössor av rören kan öppna spontant och prover går förlorade. Undvika detta genom att hålla locken stängda med en specifik cap blockerare. - Snurra ner prover och belastning på SDS-PAGE geler att separera proteiner enligt deras storlekar använder standardprotokoll.
Obs: I denna studie på RACK1 och ATG5 prover drevs via 12% polyakrylamidgeler vid 80 V för 30 min, och sedan vid 120 V under cirka 90 minuter. Men för mindre proteiner såsom LC3, använder 15% polyakrylamidgeler är lämpligare. - Efter gelen kör är klar, överföra proteinerna till nitrocellulosa eller PVDF membran med antingen blöt eller halvtorr överföringsmetoder. Sedan blockera membran genom inkubation i 5% fettfri mjölk i PBS med 0,05% bland annat Tween 20 (PBST) vid rumstemperatur för 1 h. Tvätta membran 3 gånger med PBST för 5 min.
- Inkubera membran med primära antikroppar vid arbetande koncentrationer för 1 h i rumstemperatur. För primär antikropp utspädningar, använda BSA som innehåller röda lösningar (5% BSA Cohn V bråkdel, 0,02% natriumazid i PBST, pH 7.5; lägga till fenolrött läggs till som en pH markör) att tillåta återanvändning av antikroppar.
Obs: Späd exempelvis ATG5 antikropp 2.000 x i röda lösningen.- i slutet av inkubationstiden, tvätta membranen 3 gånger med PBST.
- Inkubera membran med HRP-konjugerad sekundära antikroppar som utarbetades i 5% fettfri mjölk lösning (här, anti-kanin IgG vid 1:10.000 användes). Tvätta sedan membranen 3 x med PBST för 5 min.
- Göra ECL lösningen: 25 mM urin, 9 mM kumarsyra, 3 x 10 -4% H 2 O 2 i 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Använd färska H 2 O 2 för varje experiment.
Obs: Reaktionen startar efter H 2 < /sub > O 2 tillägg och det fortsätter i ca 20 min.- Inkubera membran och X-ray filmer i 20 min i ECL. Utveckla och sätta fast dem i ett mörkt rum.
- För att kontrollera den co-immunoprecipitation av proteiner med Stäng eller överlappande molekylvikter, kan det krävas att strippa antikropparna av membranen av ruvning membranen vid 60 ° C i 30 min i stripp bufferten: (25 mM Tris-HCl pH 2 och 1% SDS).
- Upprepa steg 2,20 till 2,23 till check för co-immunoprecipitation använder olika antikroppar. Exempelvis testades efter ATG5 upptäckt och skalning av membran, RACK1 protein på samma membran med hjälp av en anti-RACK1 primär antikropp (1:1, 000) och sekundära antikroppar (1:10 000). Β-aktin användes som lastning kontroll; och IgG signal användes som lastning kontroll för immunoprecipitated prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 ett exempel på en samtidig lokalisering visas resultat som erhålls med hjälp av detta protokoll. En bild från vår senaste papper presenteras8. Här, var endogena RACK1 protein färgade i grönt, medan endogena LC3 var målat i rött. Gula prickar som observeras i de sammanslagna bilderna visar platser för överlappning mellan de gröna och röda signalerna. Sålunda representerar de gula prickarna delvis samtidig lokaliseringen av dessa två proteiner.
Figur 1 : Representativa immunofluorescens resultat. HEK293T celler odlades på coverslides. Cellerna var behandlas eller inte behandlas med rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) eller Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h), eller svalt i EBSS (Stv, 2 h). Då var endogena proteiner immunostained med hjälp av anti-RACK1 och anti-LC3 primära antikroppar. Celler analyserades under en confocal Mikroskop. CNT, icke behandlade celler; Merge, överlagring av greenand redsignals. Vit arrowsshow yellowcytoplasmic prickar med RACK1 och LC3 samtidig localization. Denna forskning publicerades ursprungligen av Erbil o.a. 8 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
I figur 2presenteras ett exempel på en endogen immunoprecipitation resultatet. I denna figur, ATG5 protein var fälls ut och RACK1 co-immunoprecipitation upptäcktes under olika förhållanden. Normalt kaninserum användes som en negativ kontroll.
Figur 2: Representant immunoprecipitation resultat. HEK293T celler var behandlas inte behandlats med rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) eller Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) eller svalt i EBSS (2 h). Endogena ATG5 protein var immunoprecipitated från cell extrakt med anti-ATG5 antikroppar som var kopplad till protein A Plus pärlor. Anti-ATG5 och anti-RACK1 antikroppar användes för immunoblotting. Serum, kanin kontrollserum. Denna forskning publicerades ursprungligen av Erbil o.a. 8. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Dessa resultat indikerar att RACK1 protein är inblandat i autofagi vägar. RACK1 protein Co lokaliserade med LC3 proteinet på autophagosome-liknande strukturer under autofagi induktion. Co-immunoprecipitation resultaten visade dessutom att RACK1 och ATG5 proteiner interagerar även vid basala förhållanden, och interaktion nivåerna ökade under autofagi aktivera villkor. Vi bekräftade tidigare använda p62 nedbrytning och LC3-II ackumulering tester i närvaro eller frånvaro av lysosomala hämmare (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A) att autophagic flux inte hämmades under de experimentella villkor8. Därför resultaten presenteras här och på andra håll visade att RACK1-ATG5 interaktion är viktigt för de inledande skedena av autofagi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunoprecipitation och immunofluorescens tekniker är avgörande för studien av protein-protein interaktioner. Även om dessa två tekniker är vanliga och väletablerade, flera kriterier bör övervägas att definiera kvaliteten på experiment medan du använder dessa tekniker.
Första, primära antikroppar som används i dessa tester bör vara specifika för proteinerna av intresse. För att säkerställa detta, använda shRNA knockdowns eller knockout celler för att testa specificiteten av antikroppen i fråga. Dessutom använda positiva kontroller eller behandla celler med en känd inducerare av proteinet av intresse. Batch till batch variationer av antikroppar finns också. Dessutom kanske vissa polyklonala antikroppar eller sera hög bakgrund och icke-specifika band. Även om några av dessa band kan vara alternativa former av proteinet av intresse, i allmänhet är ett resultat av korsreaktivitet av polyklonala antikroppar med relaterade proteiner eller de kan vara icke-specifik interactmedlemmar. Monoklonala antikroppar är allmänt mer specifikt i denna mening, även om signaler som genereras kan vara svagare. Bekräftelse av antikropp specificitet med märkta proteiner och etablerade mot taggen antikroppar kan vara användbara, men endogena interaktioner är fortfarande mer värdefulla och viktiga.
Samtidig lokalisering eller co-immunoprecipitation tester kommer inte slutgiltigt fastställa om protein-protein interaktioner är direkt. Det är möjligt att ytterligare partners kan medla de observerade interaktionerna. Faktiskt i figur 1observerades en partiell samtidig lokalisering av RACK1 och LC3 proteiner, vilket kan vara ett tecken på deras interaktion; dock tester direkt bindande som in vitro- pull-down-analyser med hjälp av rekombinanta proteiner eller fluorescens resonans energi överföring (bandet) mikroskopi kan användas för att fastställa om de observerade interaktionerna är direkt eller inte. Å andra hjälper tekniker såsom gelfiltrering till att avslöja de komplexa proteininteraktioner som mer än två proteiner på ett mer övertygande sätt. En mer rigorös analys av immunofluorescens resultaten från ett autofagi perspektiv skulle vara att övervaka autofagi induktion genom att räkna antalet punkter som är positiva för den LC3 autofagi markören i varje cell, sedan en ökning av antalet LC3 positiva punkter korrelerar med antalet autophagosomes. Användning av den Pearsons koefficient, Lis metod eller Manders koefficienter tester ge bättre kvantitativa och jämförande bedömning av experimentella resultat.
En annan viktig punkt är validering av interaktioner med oberoende tekniker och olika cellinjer. Vissa interaktioner kan vara artefakter som är relaterade till klibbighet av proteiner eller protein överuttryck. Om inte noggrant tvättas, är det ATG5 proteinet också benägna att hålla sig till de pärlor som används i immunoprecipitations (både agaros eller sepharose pärlor). Dessutom i immunofluorescens tester, kan protein överuttryck bilda aggregat som ser ut som autophagosomes eller autolysosomes. Därför, när de utför övergående transfections med samtidig transfekterade fluorescerande proteiner som kontrollen transfection effekt, i immunoblots, uttryck nivåer av proteiner av intresse kan jämföras fluorescerande proteinnivåer i extrakt med hjälp specifika antikroppar, som tillhandahåller en metod för normalisering.
I alla dessa tester är reproducerbarheten av resultaten av yttersta vikt. Vi föredrar att upprepa varje experiment minst 3 - 4 gånger övertygas av erhållna resultat. Vi utför även liknande experiment i minst två olika cellinjer att bevisa att våra observationer inte cell typspecifika. Dessutom bör rätta positiva och negativa kontroller (t.ex., pärlor ensam eller kontroll antikroppar plus serum för immunoprecipitation tester) planeras att dra rätt slutsatser. Under optimering av immunofluorescens tekniker är det användbart att ha en enda sekundär antikropp-kontroll där primär antikropp utelämnas. Denna kontroll kontrollera som observeras signaler har sitt ursprung från primär antikropp bindningen till proteinet av intresse och inte från en icke-specifik bindning av sekundär antikropp.
Antalet proteinkomplex som reglerar autofagi och andra biologiska händelser ökar i discovery, men forskningen är långt ifrån att ha en fullständig bild. Även om hög genomströmning tekniker såsom masspektrometri eller bioinformatik-baserade förutsägelser fortsätter att avslöja nätverk av interaktion för flera autofagi-relaterade proteiner, bekräftelse av interaktionerna med klassiskt biokemi och mikroskopi metoder är viktigt för att avslöja funktionella och dynamiska egenskaper av denna grundläggande och viktiga cellulära väg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av vetenskaplig och teknisk forskning rådet av Turkiet (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, Sabanci University. SEB och NMK stöds av ett TUBITAK BIDEB 2211 stipendium för Ph.D. studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
