Summary
Sunulan iki antikor tabanlı protein-protein etkileşimi araştırma tekniği vardır: ayirt ve immunoprecipitation. Bu teknikler proteinlerin hücresel sinyal yollar roman bileşenleri keşfi ve anlayış protein dinamikleri arasında fiziksel etkileşimleri çalışmak için uygundur.
Abstract
Protein-protein etkileşimleri anlayış hücresel sinyal cascades ve tanımlayıcı roman yol bileşenleri ve protein dynamics için önemlidir. Hücresel aktiviteler çoğunluğu proteinler arasındaki fiziksel etkileşim gerektirir. Analiz ve bu etkileşimler eşlemek için Biyoinformatik araçlarını yanı sıra çeşitli deneysel teknikler geliştirilmiştir. Autophagy besin yoksunluğu, kimyasallar ve hipoksi gibi farklı stres ile başa çıkmak hücreleri sağlar mekanizması geri dönüşüm bir cep var. Autophagy ilgili sinyal olayları daha iyi anlamak için ve protein kompleksleri autophagy düzenleyen roman etkenler keşfetmeye, protein-protein etkileşim ekranlar uygulandı. Bu tarama sonuçlar doğrulama ayirt ve immunoprecipitation teknikleri kullanımını gerektirir. Bu sistemde biz keşfetti belirli autophagy kaynaklı protein-protein etkileşimleri Neuro2A içinde test edildi (N2A) ve HEK293T hücre hatları. Kullanılan teknik prosedürler ayrıntılarını bu görüntülenmeyecektir deney yazıda açıklanmıştır.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, burada) toplu sitoplazma, proteinler ve organelleri autophagic veziküller denilen çift cidarlı veziküller içinde tutma ile karakterize bir hücresel stres mekanizmadır. Çift cidarlı dış tabakası füzyonu, autophagic veziküller ve onların kargo organellerin için teslim edilir ve orada1bozulmuş. Tüm hücre tipleri ve tüm organizmalar, homeostatik fonksiyonları protein yıkımı ve organel (örneğin, mitokondri) ciro gibi performans düşük Bazal seviyelerde Autophagy oluşur. Hücresel stres, açlık gibi önde gelen koşullar altında autophagy hızla upregulated ve hücre enerji düzeyleri ve temel metabolizma1,2,3korumak için olanak sağlar.
30 autophagy genler Maya klonlanmış ve protein ürünleri sivilce çekirdekleşme, genişleme, vezikül fusion geç endosome/lysosome ve kargo bozulması autophagic bir işlemi, çeşitli aşamalarında bir rol oynamaya gösterildi 4 , 5. Orthologs bu genlerin çoğunluğunun tespit edilmiştir ve çeşitli organizmalar çalışmalarda doğruladı onların hücresel işlevler6korunması. Çalışmalar son on yılda birkaç protein kompleksleri ve protein-protein etkileşimleri ve onlar karmaşık ve kontrollü bir şekilde autophagy yolları yöneten ilgili autophagy gösterdi. Kesişme noktalarında, yedeklemeler, geri bildirim ve feedforward mekanizmaları var ve onlar hücre autophagy (veziküler salgılanması, lysosome dipnotlar, endosomal sıralama ve taşıma7, vb) gibi ilgili diğer olaylar ile koordine etmek için izin Autophagy protein ATG5 bir yem olarak kullanarak bir tarafsız Maya-iki melez ekran (ATG5 olan bir anahtar autophagy protein açlık LC3 lipidation aracılık eder E2 benzeri conjugating sistemi dahil indüklenen autophagy), biz aktive reseptör belirledik C-kinaz 1 (RACK1; GNB2L1) olarak güçlü bir etkileşen ve roman autophagy bileşen8. Önemlisi, ekran ATG5 RACK1 etkileşim autophagy indüksiyon klasik autophagy indükleyicileri (Yani, açlık ve mTOR inhibisyon) tarafından için vazgeçilmez olduğunu gösterdi.
Ayirt tabanlı yöntemler genellikle protein-protein etkileşimleri izlemek için kullanılır. Bu teknikler antikor ağırlıklı ve etkileşimleri görselleştirmek ve hücresel yerelleştirmeler onaylamak için yardımcı olur. Bu teknikte, floresan tag özgü konjuge antikor protein ilgi genellikle belirli boyama için kullanılır. Her protein ile birleştiğinde için farklı floresan boyalar antikor olarak etiketlenmiş olabilir. Protein özel antikorlar kullanarak, bir çakışma görüntüleri birleştirildiğinde sinyal içinde eş yerelleştirme confocal mikroskobu altında proteinlerin gösterir. Hücreleri veya hatta dokular için uygun bir tekniktir. Ayirt teknikleri etkileşim dinamikleri hakkında ipuçları sağlayabilir ve hücresel Morfoloji farklı koşullar9altında genel değişiklikleri izlerken protein kompleksleri, dağılımı ve boyutu belirlemek. Immunoprecipitation tekniktir etkileşimleri analiz için izin veren başka bir sık kullanılan antikor tabanlı arasında proteinler10göz önüne alındığında. Bu tekniği kullanarak, ilgi hücreleri izole proteinlerdir veya karmaşık veya ilgi bir protein ile temas halinde olan proteinlerin yağış kaynaklanan özel antikorlar kullanarak doku ayıklar. Co-immunoprecipitation, nerede protein ve onun ortak etkileşen tespit edilir, sadece iki protein arasındaki etkileşimi ortaya çıkarır, ama farklı koşullar11altında etkileşimin gücünü ölçebilirsiniz.
Bu iletişim kuralı onaylayın ve ATG5-RACK1 ve RACK1-LC3 etkileşim karakterize için kullanılan ayrıntı anahtar teknikleri açıklar. Kritik adımlar ve tuzaklar autophagy araştırma gibi öneriler sorun giderme için vurgu ile ayirt ve immunoprecipitation teknikleri üzerine odaklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ayirt
- HEK293T korumak insan embriyonik böbrek hücreleri DMEM yüksek glikoz ortamda ve N2A fare neuroblast hücrelerde DMEM düşük glikoz orta, % 5 CO 2-37 ° C'de oksijen kuluçka makinesi % 10 ısı inaktive fetal sığır (FBS) serum, kültür ortamıyla ek antibiyotik (50 U/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin) ve L-glutamin (2 mM).
- % 0.25 tripsin kullanarak hücreleri bağlantısını kesin. İlk hücre kültürü medyayı çıkarın sonra 10 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) hücrelerle yıkama ve tripsin 2 mL DMEM orta ekleyerek 5 dk. Yinele tripsin için 37 ° C'de 1 mL ile kuluçkaya.
- De pipetting tarafından plaka yıkayın. Hücre Çözümü 10 µL kaldırmak ve trypan mavi 10 µL ile karıştırın. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saydırmak.
- Hem HEK293T ve N2A yapisan hücre hatları, ancak, HEK293T hücreleri kolayca plaka bağlantısını kesin. Bu nedenle, eğer HEK293T hücre satırı ile çalışma, kat coverslides ile steril % 0,01 Poli-L-lizin hücreleri tohum önce filtre.
- 10 cm Petri kabına yer steril coverslides. Poli-L-lizin çözüm her coverslide üzerine uygun miktarda ekleyin. 10 dakika süreyle Poli-L-lizin Çözümle coverslides kuluçkaya
- Kaldırmak Poli-L-lizin çözüm.
Not: Poly-L-lizin yeniden kullanılabilir; toplamak ve daha fazla deneyler için yeniden kullanmak isteğe bağlıdır. Poli-L-lizin zehirli olduğundan, tüm çözüm coverslides üzerinde tamamen buharlaşır kadar bekleyin ve sonra Poli-L-lizin kurtarmak. - Steril PBS ile coverslides yıka.
- 1 mL DMEM 12-şey plaka her kuyuya ekleyin. Bir coverslide her kuyuya yerleştirin.
- Tohum 20.000 hücre/iyi, damla damla coverslides sayfasında bulunan bir hücreler homojen bir dağılım için aynı zamanda plaka sallayarak süre. Hücrelerin içinde CO 2 kuluçka 37 ° C'de tutun ve ilaç eklemek toplam kuluçka süresi 48 saat fazla olamaz, Yani, 3 h, Torin tedavi için ekleyebilir, böylece ilaç sonrası 45 h tohum.
- İçin RACK1-LC3 etkileşim çalışmaları, Torin 1, rapamycin ve açlık autophagy indükleyicileri kullanılmıştır. Hücreleri Torin 1 ile 3 h (250 nM son konsantrasyonu); inkübe ile Rapamycin 16 h (200 nM nihai toplama); ve Earle ile ' s dengeli tuz çözüm (EBSS) hücreleri açlıktan için 2 h için.
Not: Kuluçka içinde FBS denetim koşulu olarak kullanıldı % 10 ile DMEM.
- İçin RACK1-LC3 etkileşim çalışmaları, Torin 1, rapamycin ve açlık autophagy indükleyicileri kullanılmıştır. Hücreleri Torin 1 ile 3 h (250 nM son konsantrasyonu); inkübe ile Rapamycin 16 h (200 nM nihai toplama); ve Earle ile ' s dengeli tuz çözüm (EBSS) hücreleri açlıktan için 2 h için.
- 48 h toplam kuluçka süresi sonra coverslides medyada kaldırmak ve 1 mL PBS ile yıkayın.
- Hücreleri, düzeltmek için kuluçkaya 1 mL buz soğuk steril süzülmüş % 4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS (pH 7,4), herhangi bir ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 20 dakika içinde hücrelerle.
İngiltere'de yılın ışığa duyarlı olduğundan, plaka karanlıkta kuluçka döneminde (önemli) bırakın; Alüminyum folyo ile plaka kapsayan yardımcı olabilir. Ayrıca, İngiltere'de yılın toksik, bu nedenle, iş bir duman başlık altında hücreleri tamir ederken.
Not: belirli antikor en iyi farklı fiksasyon ajanlar ve koşulları kullanarak çalışabilir gibi fiksasyon adım ayirt deneylerde unutmayın, optimize edilmelidir. - Sonra 20 dk, İngiltere'de yılın kuluçka, önce İngiltere'de yılın çözüm coverslides üzerinde kaldırın ve sonra her örnek 3 kez 1 mL steril süzülmüş PBS ile yıkayın. At Bu adım, (önemli) Kuyu kuru, Hadi onlar kadar değil için tek tek yıkayın. Beri o hücreleri izleyen tepkiler ile müdahale, hücre morfolojisi değiştirmek ve belirsiz sinyaller artırmak kurutma önlemek.
- Yıkama tamamlandığında, 1 mL PBS üzerinde buz örneklerinde tutmak
- Engelleme çözüm hazırlamak: %0,1 sığır Serum Albumin (BSA) ve % 0.1 saponin ile PBS.
- 6-şey plaka parafin film ile kapak. Plaka alt parafin film kaplama sonra düzgün olduğundan emin olun. 6-şey plaka etiket.
- Transfer coverslides 12-şey tabak 6-şey plakaları parafin film ile kaplı cımbız kullanma.
- Coverslides üzerinde PBS atmak ve çözüm permeabilization için her coverslide üzerine engelleme 100 µL ekleyin. Örnekleri 30 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
- Çözüm kapatmaktır birincil antikor hazırlayın. Boyama için en iyi çalışma konsantrasyonları tanımlamak için antikor dilutions deneyler önce optimize.
Not: Örneğin, LC3 antikor çözüm kapatmaktır 1: 100 seyreltme kullanılır. - 30 dk kuluçka sonra engelleme çözüm atmak ve PBS 1 mL yavaşça örnekleriyle bir kez yıkayın.
- Ekle 100 µL birincil antikor çözüm için her coverslide. Bir shaker üzerinde 1 h için oda sıcaklığında örnekleri kuluçkaya.
Not: Kuluçka zaman birincil antikor ile optimize edilmelidir. Antikor bağlı olarak, bir gecede kuluçka 4 ° C'de daha uygun olabilir. Bir shaker yavaşça kuluçkaya en iyisidir (100 rotasyonlar antikor coverslides üzerinde eşit olarak dağıtmak için /dk). - Birincil antikor ile kuluçka sonra örnekleri ayrı ayrı, 3 kez 1 mL PBS ile yıkayın. Çözüm (en iyi duruma getirmeleri ikincil antikor dilutions, gerekli olabilir) engelleme
- hazırla 1:500 ikincil antikor. Burada, Anti-tavşan IgG Alexa Fluor 568 ikincil bir anti-tavşan antikor kullanıldı.
- Kuluçkaya ikincil antikor çözüm üzerinde bir shaker oda sıcaklığında 1 h için 100 µL örnekleriyle. Fluorophore etiketli ikincil antikorlar beri gün ışığına duyarlı, (önemli) çözümü karanlıkta bırakın. Örnekleri yer karanlıkta sırasında ve sonra ikincil antikor kuluçka.
- 3 kez PBS ile plaka ikincil antikor kuluçka sonra yıkayın.
Not: Temel deneyim üzerine bazı antikorlar tarafından PBS ortadan yüksek arka plan sinyalleri var yıkar. -Den sonra adım 1,21, böyle bir antikor ile ilgili örnekleri 4 ° c 6 h için PBS içinde tutmak yardımcı olabilir.- Gerekirse, Höchst çekirdeklerin işaretlemek için gibi bir DNA'ya bağlanıcı boya hücrelerle leke.
- Birden fazla protein leke, başlamak--dan adım 1.16 ikinci protein için aynı yordamı uygulamak.
Birden fazla antikor (örneğin, Kullanım fare ve tavşan antikorları) ile boyama işlemi sırasında antikor arasında hiçbir tür reaktivite olduğunu
- emin olun.
Not: Burada, RACK1 ikinci protein anti-RACK1 birincil antikorlar ve yukarıda belirtilen aynı konsantrasyonları kullanarak anti-fare Alexa Fluor 488 IgG ikincil antikorları kullanarak lekeli.
- emin olun.
- Montaj çözüm hazırlamak: % 50 1 x PBS gliserol. 22 µm filtre filtreden.
- Hav bırakmayan mendil kullanarak etanol ile slaytları silin ve 10 µL montaj çözüm her slayta eklemek. Bir cımbız kullanarak, coverslides hücreleri ile yan montaj orta ile doğrudan temas halinde olduğunu her dropso yerleştirin. Yavaşça hav bırakmayan mendil kullanarak aşırı montaj çözüm atın.
- Coverslides şeffaf oje ile kapatın. İlk olarak, 4 kenarlardan oje damla ekleyerek coverslides stabilize etmek ve onları tamamen mühür.
- Floresan sinyal birkaç saat sonra çamaşır suyu bu yana bir flüoresan veya confocal mikroskop altında örnekleri en kısa zamanda analiz.
- Ayır ve sayısı hücreler olarak açıklanan adımları 1.2 ve 1.3.
- Eğer HEK293T hücrelerle çalışma 4 milyon hücre 15 cm Petri yemeklerinde her koşul için tohum. Eğer N2A hücrelerle çalışma, 5 milyon hücre 15 cm Petri yemeklerinde tohum. CO 2 kuluçka 37 ° C'de hücreler deneme sonuna kadar kuluçkaya.
- Böylece hücrelerin toplam kuluçka süresi 48 h. aşmadığı ilgili uyuşturucu ya da şartlar tanımlı bir süre için hücrelerle tedavi
Not: Bu çalışmada immunoprecipitation testler için hücreleri Torin 1 ile 3 h için tedavi edildi (250 nM), rapamycin ile 16 h (200 nM) ve 2 h ile EBSS. DMEM FBS denetimi olarak hücrelere eklendi % 10. - Sonra 48 h toplam kuluçka süresi, medyayı çıkarın ve hücreleri hasat. HEK293T hücreleri kolayca plaka ayırmak, buz ile tabak yıkama soğuk PBS hasat için yeterli olabilir. Ancak, N2A hücreleri dekolmanı daha dayanıklıdır; hücreleri hasat için hücre Kazıma aletleri kullanın.
- Microcentrifuge tüpler tüm hücreleri toplamak.
- Santrifüj örnekleri 15 dakika 4 ° C. atma süpernatant ve yıkama 1 mL PBS pipetting tarafından yeniden askıya ile Pelet 16.000 x g de.
- Tekrar santrifüj adım ama 15 dakika süreyle 4 ° C'de en yüksek santrifüj hızda süpernatant atın.
- Denemeyi başlatmadan önce hazırlamak radyo IMMUNO-yağış tahlil (RIPA) arabellek.
Not: RIPA arabellek 3 türü vardır; (bkz. Aşağıdaki formüller) soruşturuluyor protein etkileşim yoğunluğunu göre seçin.- Bir güçlü protein-protein etkileşimi ise normal RIPA arabellek seçin.
- Etkileşim zayıftır seçin hafif RIPA veya daha hafif RIPA.
Not: Aşağıdaki adımlarda bu arabellekleri tarifleri vardır. İmmunoprecipitation testlerinde kullanılan tüm arabellekleri proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş.- Düzenli RIPA arabelleği %1 NP-40, 150 mM NaCl, % 0.5 sodyum deoxycholate ve % 0.1 Sodyum Lauryl Sülfat 50 mM Tris pH 8 kullanarak hazırlayın.
- Hafif RIPA arabelleği % 1 NP-40, 150 mM NaCl ve % 0.25 sodyum deoxycholate 50 mM Tris pH 7.5 kullanarak hazırlayın.
- Daha hafif RIPA arabelleği %1 Triton-X 100, 137 mM NaCl, % 1 gliserol ve 1 mM sodyum orthovanadate 50 mM Tris pH 7.4 kullanarak hazırlayın.
- Uygun RIPA arabellek seçtikten sonra proteaz inhibitörleri (RIPA +) ile tampon ek. Sonra 3 x hücre Pelet RIPA + cilt hücreleri parçalayıcı.
- Girdap süspansiyon 15 s. almak o buz üzerinde 5 dk. tekrar girdap ve 5 kez buzlanma ve 4'te 16.000 x g 15dk için de örnekler santrifüj kapasitesi ° C.
- Süpernatant temiz microcentrifuge tüp ve kalan hücre artıkları kaldırmak için santrifüj aktarın. Süpernatant temiz bir tüp transfer.
- Protein lysates 1:50 sulandırmak ve 96-şey plaka boş ve standartları ile hazırlayın. Örnekleri sulandırmak.
- Mix örnekleri Bradford ile çözüm 1:20. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık kuluçkaya.
- 595 nm dalga boyu, optik yoğunluk ölçer. Her örnek için Absorbans değerleri kullanarak protein konsantrasyonu hesaplayın.
- Bir gün önce hücreleri, hasat ilgi protein için özel antikorlar ile protein artı işareti boncuk çift.
- 200 µL bahşiş makas kullanarak kenar kesme ve boncuk Bulamaç üzerinden 25 µL her koşul için kullanın.
- Boncuk 1 mL PBS ile bir kez, bir kez 1 mL RIPA arabellek ile bir kez 1 mL RIPA + ile yıkayın. 3300 x g, 1 dk. 4 ° C de yıkama adımları gerçekleştirmek
- Son yıkama sonra RIPA + 300 µL üstündeki ekleyin ve çekilecek protein için özel olan 1,5 µg antikor ekleyin.
- Tüpler gecede 4 ° C'de bir rotator (20 rotasyonlar/dk) üzerinde kuluçkaya.
Not:, ATG5 immunoprecipitated özel anti-ATG5 antikorları kullanarak buradaydı.
- Sonra gece kuluçka antikor ile boncuk boncuk PBS ile bir kez, bir kez RIPA ve bir kez ile RIPA + 2.12.2. adımda açıklandığı gibi yıkayın.
- Ekleyin 2 mg protein üzerinde her boncuk lysate durumu ve 300 µL RIPA + tampon/tüp ile toplam birime tamamlamak. Saat 4'te bir gecede üzerine bir değiştirici boruları kuluçkaya ° C.
- Kuluçka sonra daha önce açıklandığı gibi boncuk (Adım 2.12.2) yıkayın.
- Sonra son yıkama, tüm süpernatant boncuk dokunmadan kaldırmak için daha küçük damlalıklı bahşiş kullanın.
- Ekleyin 10 µL boya yükleme x 3: % 6 SDS, %30 gliserol, % 16 β-Mercaptoethanol ve % 0.1 Bromophenol mavi 1M Tris-HCl pH 6.8.
- Her koşul için en az 100 µg protein lysate kullanarak giriş denetimleri hazırlamak. Su kullanarak örnek birimleri eşitlemek ve boya yükleme x 3 uygun hacmi ekleyin.
- Kaynatın örnekleri 10 dakika süreyle 95 ° C'de
Not: Genellikle ne zaman örnekleri kaynama kapaklar tüplerinin kendiliğinden açabilirsiniz ve örnekleri kaybolur. Bu kapaklar belirli kap Engelleyicisi ile kapalı tutarak kaçının.
Örnekleri ve proteinler standart protokolleri kullanarak kendi boyutları göre ayırmak için SDS-sayfa jelleri üzerine yük aşağı spin - .
Not: RACK1 ve ATG5 bu çalışmada, % 12'si polyacrylamide jeller 80 V 30 dk için ve daha sonra 120 V yaklaşık 90 dakika boyunca örnekleri işletilmiştir. Ancak, LC3 gibi daha küçük proteinler için % 15 polyacrylamide Jeller kullanarak daha uygun.
Çalışan jel tamamlandıktan sonra - nitroselüloz veya ya da ıslak veya yarı kuru transfer yöntemleri kullanılarak PVDF membran proteinleri aktarın. O zaman, PBS %5 yağsız süt % 0.05 ile kuluçka tarafından membranlar blok ara 20 (PBST), oda sıcaklığında 1 h. yıkama membranlar için 3 kez ile 5 dk. PBST
- Oda sıcaklığında 1 h için çalışma konsantrasyonlarda birincil antikorlar ile membranlar kuluçkaya. BSA kırmızı çözümleri içeren birincil antikor dilutions için kullanın (%5 BSA Cohn V kesir, %0.02 sodyum azid PBST, pH 7.5; içinde fenol red pH marker olarak eklendi ekleyin) antikorları yeniden izin vermek için.
Not: Örneğin, ATG5 antikor 2.000 x kırmızı çözümde oranında seyreltin.- Kuluçka süresi sonunda, 3 kez ile PBST membranlar yıkayın.
- % 5 yağsız süt çözümde hazırlanmıştır HRP Birleşik ikincil antikorlar ile membranlar kuluçkaya (burada, 1:10.000, Anti-tavşan IgG kullanılmıştır). Sonra yıkayın ve membranlar 3 x 5 dakika süreyle PBST ile
- Olun ECL çözüm: 25 mM luminol, 9 mM kumarik asit, 3 x 10 -4% H 2 O 2 70 mM Tris-HCl pH 8.8 '. Her deneme için taze H 2 O 2 kullanın.
Not: 2 H sonra reaksiyon başlatır < /sub > O 2 toplama ve bunu devam ediyor yaklaşık 20 dakikadır.- Membranlar kuluçkaya ve filmler ECL içinde 20 dk için x-ışını. Geliştirmek ve karanlık bir odada düzeltmek.
- Co-immunoprecipitation ile yakın ya da moleküler ağırlık örtüşen proteinlerin denetlemek için 30 dk içinde sıyırma arabellek için 60 ° C'de membranlar kuluçka tarafından antikorlar membranlar kapalı şerit gerekebilir: (25 mM Tris-HCl pH 2 ve %1 SDS). Co-immunoprecipitation için farklı antikorları kullanarak kontrol etmek için
- Yinele adımları 2.20-2.23. Örneğin, aşağıdaki ATG5 algılama ve zarı sıyırma, RACK1 protein bir anti-RACK1 birincil antikor (1:1, 000) ve ikincil antikorlar (1:10, 000) kullanarak aynı membranlar üzerinde test edildi. Β-aktin yükleme denetimi olarak kullanılan; ve IgG sinyal yükleme denetim immunoprecipitated örnekleri için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 ' de ortak bir yerelleştirme örneği bu protokolü kullanarak elde edilen sonuç gösterilir. Bizim son kağıt bir rakam8sunulur. Burada, endojen LC3 kırmızı lekeli iken endojen RACK1 protein yeşille, lekeli. Birleştirilmiş resimlerde görülmektedir Sarı noktalar yeşil ve kırmızı sinyalleri arasında örtüşme siteleri gösterir. Böylece sarı noktalar bu iki proteinlerin kısmi co yerelleştirme temsil eder.
Resim 1 : Temsilcisi ayirt sonuçları. HEK293T hücreleri üzerinde coverslides kültürlü. Hücreleri tedavi veya rapamycin ile tedavi değil (Rapa, 200 nM, 16 h) Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) ya da içinde aç EBSS (Stv, 2 h). O zaman endojen proteinler immunostained anti-RACK1 ve anti-LC3 birincil antikorları kullanarak vardı. Hücreleri confocal mikroskop altında analiz edildi. CNT, tedavi olmayan hücreleri; Birleştirme, greenand redsignals ilişkin bir bindirme. Beyaz arrowsshow yellowcytoplasmic RACK1 ve LC3 ortak yerelleştirme noktalı. Bu araştırma aslında Erbil ve ark. tarafından Yayınlandı 8 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2' de, örnek bir endojen immunoprecipitation sonuç olarak sunulur. Bu şekilde, ATG5 protein çöktürülmüş ve RACK1 co-immunoprecipitation farklı koşullar altında tespit edildi. Normal tavşan serum bir negatif kontrol kullanıldı.
Resim 2: Temsilcisi immunoprecipitation sonuçları. HEK293T hücreleri tedavi değil rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) veya Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) ile tedavi veya EBSS (2 h) açlıktan öldü. Endojen ATG5 protein immunoprecipitated protein artı işareti boncuk birleştiğinde anti-ATG5 antikorları kullanarak hücre özleri üzerinden yapıldı. Anti-ATG5 ve anti-RACK1 antikorları immunoblotting için kullanıldı. Serum, denetim tavşan serum. Bu araştırma aslında Erbil ve ark. tarafından Yayınlandı 8. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu sonuçlar RACK1 protein autophagy yollar dahil gösterir. RACK1 protein LC3 protein autophagosome benzeri yapıları ile birlikte autophagy indüksiyon sırasında lokalize. Ayrıca, co-immunoprecipitation sonuçları RACK1 ve ATG5 proteinleri bile Bazal koşullar etkileşim ve etkileşim düzeyleri altında koşullar aktive autophagy artış gösterdi. Biz daha önce autophagic akı altında deneysel koşullar8inhibe değil lizozomal inhibitörleri (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A) olup p62 bozulması ve LC3-II birikimi testleri kullanılarak doğruladı. Bu nedenle, sonuçları burada sunulan ve başka bir yerde RACK1 ATG5 etkileşim autophagy ilk etap için önemli olduğunu gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunoprecipitation ve ayirt teknikleri protein-protein etkileşimleri çalışma için önemlidir. Bu iki teknikleri yaygın olarak kullanılan ve iyi kurulmuş olmakla birlikte, bu teknikleri kullanırken deneyler kalitesini tanımlamak için çeşitli kriterler dikkate alınmalıdır.
Bu testlerde kullanılan ilk, birincil antikorlar faiz proteinler için kesin gerekir. Bunu sağlamak için shRNA nakavtlar veya nakavt hücreleri antikor söz konusu özgüllük sınamak için kullanın. Ayrıca, pozitif denetimleri kullanın veya bilinen bir uyarıcı ilgi proteinin hücrelerle tedavi. Toplu iş toplu iş varyasyonlarının antikorların de mevcut. Ayrıca, bazı poliklonal antikorlar veya sera yüksek arka plan ve belirsiz bantları olabilir. Bazı bu grup ilgi protein alternatif formları olabilir, ancak genel olarak olan ilişkili proteinler ile poliklonal antikorlar sonucu ya da non-spesifik interactors olabilir. Oluşturulan sinyalleri zayıf olmasına rağmen bu anlamda genel daha fazla özel monoklonal antikorlar vardır. Tagged proteinler ve kurulan Anti-etiket antikor antikor özgüllük onay yararlı ama hala daha değerli ve temel endojen etkileşimleri vardır.
Co yerelleştirme veya co-immunoprecipitation testleri protein-protein etkileşimi doğrudan olup olmadığını kesin olarak kuracak değil. Bu ek Ortaklar gözlenen etkileşimlerin arabuluculuk mümkündür. Gerçekten de, şekil 1' de, RACK1 ve LC3 proteinlerin kısmi bir eş yerelleştirme, hangi onların etkileşim bir belirtisi olabilir görülmüştür; Ancak, doğrudan bağlama rekombinant proteinler kullanarak vitro açılan deneyleri veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gözlenen etkileşimi doğrudan olup olmadığını kurmak için kullanılan gibi sınar. Öte yandan, jel filtrasyon gibi teknikleri daha inandırıcı bir şekilde ikiden fazla protein içeren karmaşık protein etkileşimleri ortaya çıkarmak için yardımcı olacaktır. Bir autophagy perspektif ayirt sonuçlarından daha titiz bir analizini autophagy indüksiyon LC3 sayısı artış beri her hücre, LC3 autophagy işaretleyicisinde için olumlu nokta sayısını sayarak izlemek için olurdu olumlu noktalar autophagosomes numarası ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Pearson katsayısı, Li'nin yöntemi veya Manders katsayıları testleri kullanımı deneysel sonuçlar daha iyi nicel ve karşılaştırmalı değerlendirme sağlar.
Başka bir önemli nokta bağımsız teknikleri ve farklı hücre hatları kullanarak etkileşimlerin doğrulama olduğunu. Bazı etkileşimler proteinler veya protein overexpression yapışkanlık ile ilgili eserler olabilir. Değil dikkatli bir şekilde yıkanmış, ATG5 protein de immunoprecipitations (özel veya sepharose Boncuk) kullanılan boncuklar sadık eğilimli olur. Ayrıca, ayirt testler, autophagosomes veya autolysosomes gibi bakmak toplamları protein overexpression oluşabilir. Bu nedenle, geçici transfections olarak transfection etkinliğini kontrol, immunoblots, ortak transfected floresan proteinler kullanarak gerçekleştirirken proteinler ilgi düzeylerini ifade kullanarak özleri floresan protein düzeyleri karşılaştırılabilir Özel antikorlar, normalleştirme yöntemi sağlar.
Bütün bu testler, tekrarlanabilirlik sonuçlarının son derece önemlidir. Elde edilen sonuçlar ikna olmak için en az 3 - 4 kez her denemeyi tekrarlamak tercih ediyoruz. Gözlemlerimiz hücre türüne özgü değildir kanıtlamak için en az iki farklı hücre hatlarında da benzer deneyler yapmak. Ayrıca, doğru pozitif ve negatif denetimleri (örneğin, boncuk yalnız veya denetim antikorlar artı serum immunoprecipitation testler için) doğru sonuçlara ulaşmak için planlanmalıdır. Ayirt teknikleri duruma getirilmesi sırasında bir ikincil antikor sadece nerede birincil antikor girilmediği denetiminiz yararlıdır. Bu denetim birincil antikor bağlayıcı protein ilgi ve ikincil antikor bir non-spesifik bağlama kaynağı sinyalleri gözlenen emin olun.
Protein kompleksleri autophagy ve diğer biyolojik etkinlikler düzenleyen sayısı bulma gelen artmaktadır, henüz araştırma tam bir resim olması çok uzak bir şey. Her ne kadar yüksek üretilen iş teknikleri kütle spektrometresi veya Biyoinformatik dayalı Öngörüler gibi ağları birkaç autophagy kaynaklı proteinler, klasik Biyokimya kullanarak bu etkileşimlerin onay için etkileşimin ortaya çıkarmak devam etmek ve mikroskopi yöntemleri temel ve önemli hücresel para nereye fonksiyonel ve dinamik özellikleri ortaya çıkarmak için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser bilimsel ve Teknolojik Araştırma Konseyi, Türkiye (TÜBİTAK) 1001 Grant 107T153 tarafından Sabancı Üniversitesi desteklenmiştir. SEB ve NMK TÜBİTAK BIDEB 2211 burs doktora çalışmaları için destekler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
