Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Protokol for HER2 fiske med cross-sammenkædning, Formalin-fri væv fiksativ at kombinere fordelene ved Cryo-bevarelse og Formalin fiksation

Published: December 25, 2017 doi: 10.3791/55885
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2, 3, 1,2
1Christian Doppler Laboratory for Biospecimen Research and Biobanking Technologies, Institute of Pathology, Medical University Graz, 2Institute of Pathology, Medical University Graz, 3Research and Development, Qiagen GmbH

Summary

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) kræves ofte i kombination med histopatologi og molekylær diagnostik for valg af behandling hos personlig medicin. En roman cross-sammenkædning, formalin-fri væv fiksativ, der giver høj kvalitet morfologiske, molekylære og fisk analyser fra den samme prøvemateriale ved tilsætning af en post fiksering skridt før fisk er præsenteret.

Abstract

Morfologiske vurdering af formalin-fast, paraffin-embedded vævsprøver (FFPE) har været guldstandarden for kræft diagnose i årtier på grund af dens fremragende bevarelse af morfologi. Personlig medicin giver i stigende grad individuelt tilpassede og målrettede behandlinger for karakteriseret individuelle sygdomme aktiveret af kombinerede morfologiske og molekylære analytiske teknologier og diagnostik. Udførelsen af morfologiske og molekylære analyser fra samme FFPE modellen udfordrende på grund af de negative virkninger af formalin på grund af kemiske modifikation og cross-linking af nukleinsyrer og proteiner. Cross-sammenkædning, formalin-fri væv fiksativ er for nylig udviklet til at opfylde begge krav, dvs., at bevare morfologi ligesom FFPE og biomolekyler ligesom cryo-bevarelse. Da fisk er ofte nødvendigt i kombination med histopatologi og molekylær diagnostik, testede vi anvendeligheden af fisk protokoller på væv behandlet med denne nye fiksativ. Vi fandt at formalin efter fiksering af histologiske snit af ikke-cross-sammenkædning, formalin-fri og paraffin-embedded (NCFPE) bryst kræft væv genereret tilsvarende resultater til dem med FFPE væv i human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) FISH analyse. Denne protokol beskriver, hvordan en fisk assay oprindeligt udviklet og valideret for FFPE væv kan bruges til NCFPE væv af en simpel efter fiksering trin af histologiske sektioner.

Introduction

Personlig medicin er i stigende grad afhængig multi-parameter test involverer morfologiske og molekylære analyser. Formalin fiksering af væv som den gyldne standard giver fremragende morfologiske kvalitet1,2. Dog forstyrrer formalin-induceret kemiske modifikation og cross-linking af proteiner og nukleinsyrer3,4,5 negativt Molekylær analyse6. Disse molekylære ændringer begrænse kvaliteten af nukleinsyrer og proteiner og kan resultere i gen ordne i rækkefølge artefakter7 eller nedsat følsomhed af Polymerasekædereaktionen (PCR)-baseret assays8. Selv om store indsats blev taget til at optimere molekylære test for FFPE væv, er cryo-bevarelsen af væv i generel superior til formalin fiksering, hvilket gør det nødvendigt at opdele vævsprøver for forskellige bevarelse procedurer. For at undgå behovet for cryo-bevarelse til molekylære analyser, en ikke-cross-sammenkædning, formalin-fri Fikseringsvæske, PAXgene væv blev udviklet. Denne kommercielt tilgængelige system består af en fiksering og en stabilisering løsning indeholdende forskellige alkoholer, eddikesyre og et vandopløseligt organisk forbindelse. Korrekt opbevaring af nukleinsyrer, (phospo) proteiner og morfologi, der blev vist i flere undersøgelser6,9,10,11,12,13.

Et bestemt program i kræft diagnose er fisk afsløre en omfattende række kromosomale ændringer, såsom omplantninger, submikroskopiske sletninger og klarlægger 14. Tyve procent af invasiv brystkræft tumorer viser f.eks. forstærkning af human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) gen15,16,17, som er forbundet med dårlig prognose18 ,19. Bestemmelse af HER2 overekspression og forstærkning status i brystkræft af fisk er nødvendig for at vælge patienter for anti-HER2-rettet terapi og er en følgesvend diagnostiske opført af Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. For at muliggøre en bred anvendelse af fisk-baserede følgesvend diagnostik i sundhedsvæsenet, blev assays udviklet og godkendt for FFPE væv.

I en tidligere undersøgelse viste vi, at NCFPE væv ikke kan bruges til fisk-assays, som er blevet godkendt til FFPE væv. Men test af tid række forskellige indlæg fiksering procedurer af NCFPE væv med 4% buffered formaldehyd viste, at bogføre fiksering gange på 18 h eller længere NCFPE væv sektioner opnås tilsvarende resultater til dem med FFPE væv14.

I denne undersøgelse, vi leverer en detaljeret protokol og demonstrere virkningen af cross-sammenkædning, formalin-fri væv fiksering og 24 h 4% buffered formaldehyd efter fiksering på sektioner, der anvendes for HER2 fisk og RNA kvalitet fra den samme primære væv prøvemateriale.

Figure 1
Figur 1: Diagram, der viser trin til fluorescens i situ hybridisering (FISH) og RNA analyse af formalin fast paraffin indlejret (FFPE) og cross-sammenkædning, formalin-gratis fast paraffin indlejret (NCFPE) væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i den medicinske universitet i Graz (reference nummer 20-066), Østrig. Vævsprøver blev indhentet fra to tilfælde af kirurgisk resektion primære invasiv brystkræft efter patienterne havde givet skriftlig informeret samtykke.

1. Vævscentre fiksation

Bemærk: Væv fiksering er udført enten med standard buffer formalin løsning (SBFS), defineret som 10% formalin løsning indeholdende en massefordelingen af 3,7% (svarende til en volumenfraktion paa 4%) formaldehyd buffer til pH 6,8 til pH 7,2 efter CEN/TS 16827-1:2015 eller cross-sammenkædning, formalin-fri væv fiksering system (også benævnt skifte fiksation løsning nedenfor) bestående af fiksativ og en stabilisator løsning ved stuetemperatur (RT).

  1. Skær bryst kræft vævsprøver med en steril skalpel i to halvdele hver 4 mm tyk til at sikre passende væv mængde. Bruge en maksimal størrelse 4 x 15 x 15 mm til NCFPE eller SBFS væv fiksation.
  2. Hver halvdel af tumor modellen i en standard væv kassette og oversvømme det i SBFS eller alternative fiksering løsningen i 24 timer med en mængde per volumen ratio (v/v) af 4 dele fiksativ og en del væv (4 mL/1 g væv (ideelt 10 mL/1 g)).
  3. Overføre de alternativt fast prøver oploesningen stabilisator for 2-72 h ved at åbne containeren, dreje væv kassette 180 ° og sænkes ned i den.
  4. Placer væv kassetter med de SBFS-fast prøver i 250 mL 70% ethanol i 30 min på RT for at fjerne resterende SBFS.
    Bemærk: Dette trin er vigtigt at undgå SBFS kontaminering af cross-sammenkædning behandlet med fixativ prøver i automatiserede væv processor, som ville ødelægge de gavnlige egenskaber af cross-sammenkædning fikseringsmidler for bevarelse af biomolekyler.
    Forsigtig: SBFS er en farlig løsning, forårsager hudirritation, alvorlige øjenskader, kan forårsage en allergisk hudreaktion, er mistænkt for at forårsage genetiske defekter, kan forårsage kræft, luftvejssygdomme irritation, døsighed og forårsager skader på organer. Den alternative fiksativ er giftigt ved indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse, irriterer øjnene og huden, risikerer meget alvorlig uoprettelige virkninger gennem indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse. Indånding og fysisk kontakt bør undgås for begge fiksering løsninger. Brug egnet beskyttelsestøj, handsker og øjen-og ansigt. Arbejde i et stinkskab.
  5. Fortsæt til væv forarbejdning, integrering og væv skæring (afsnit 2 og 3).

2. Vævscentre forarbejdning og integrering

  1. Udfører trinvis dehydrering af væv kassetter med de faste vævsprøver i 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min), og 99% (2 x 60 min.) ethanol, efterfulgt af xylen (2 x 60 min). Derefter infiltrere med paraffin i en automatiseret væv processor (4 x 45 min).
  2. Brug af pincet, placere de dehydreret og paraffin-infiltreret prøver (alternativt og SBFS-fast) i metal forme.
  3. Integrere prøverne i 5-10 mL smeltet paraffin (størkning punkt 56-58 ° C) ved hjælp af en paraffin indlejring instrument.
  4. Placer forme på en afkøling tallerken på-5 ° C i 30 min.
  5. Genskab paraffin-embedded væv blokke fra formene.
  6. Gemme de resulterende blokke (alternativt-fast, paraffin-embedded (NCFPE) og SBFS-fast paraffin-embedded (FFPE)) i mørke ved 4 ° C indtil brug.

3. væv skæring og dias forberedelse til fisk

Bemærk: FFPE afsnit bruges direkte til fisk, mens dias med NCFPE sektioner er efter fast i SBFS i 24 timer før fisk procedure.

  1. Indsæt en enkelt-bruger klinge i mikrotomen og justere mikrotom til 10 µm.
  2. Tag den første blok fra køling pladen og indsætte det i instrumentet.
  3. Trim blokken, indtil en selv overflade er opnået. Ren mikrotom med en børste og justere det til 3 µm. kassere de første 2-3 afsnit.
  4. Skær 3 µm sektioner af NCFPE og FFPE blokke og placere dem i et koldt vandbad (ultrarent vand).
    Bemærk: For at opnå bedre fotografier uden overlappende kerner, her, billeder af 2 µm sektioner i stedet for 3-5 µm som anbefalet i manufacturer´s instruks er vist.
  5. Afhente hver flydende sektion med en fin pensel og en nål på en coated objektglas til vedhæftning af sektionerne væv.
  6. Styrte dette dias i en varm (40 ° C) vand bad og lad afsnittet strække helt.
  7. Sætte afsnittet tilbage i diaset ved forsigtigt at trække slide op af vandet og undgå rynker.
  8. Lad alle sektioner tørt ved stuetemperatur i 1 time.
  9. Varme dias ved 70 ° C i 30 min i en inkubator til at smelte paraffin.
  10. Sætte dias vandret i et glas farvning krukke.
  11. Rehydrere afsnittene trinvis på RT i farvning krukker fyldt med 250 mL af følgende væsker: 100% xylen 2 x 15 min, 96% ethanol 2 x 15 min., 90% ethanol 2 min, 80% ethanol 2 min, 70% ethanol 2 min, 50% ethanol 2 min , og destilleret vand 2 x 10 min.
    Forsigtig: Udfør deparaffinization og rehydrering trin i et stinkskab, ikke indånder giftige volatilized opløsningsmidler.
    Bemærk: Afhængigt af de afsnit og væv, kan det være nødvendigt at teste forskellige inkuberingstider på forhånd.

4. efter fiksering af NCFPE enheder

  1. Udføre efter fiksering af NCFPE dias ved at sætte dem ind i en ny farvning krukke fyldt med SBFS i 24 timer ved RT. sted krukke i et stinkskab under 24 timer efter fiksering trin.
  2. Fjern overskydende SBFS ved at vaske med phosphat bufferet saltvand (3 x 10 min) og destilleret vand (2 x 10 min).

5. fluorescens i situ hybridisering (FISH)

Bemærk: Her fiske udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelige HER2/CEN17 dobbelt farve sonden Kit ifølge producentens anvisninger. Tillad ikke afsnittene væv tørre under hybridisering og vaske trin. Tillad ikke DNA-sonder og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA kontrastfarve løsninger udsættes for lys i en længere periode. Udfør disse trin i mørke ved hjælp af lystæt containere. Afhængig af alder og trinnet fiksering af prøvematerialet, øge eller mindske den denaturering og vaske temperaturer til at opnå bedre resultater, hybridisering.

  1. Placer en farvning krukke indeholder 250 mL af varme forbehandling løsning citronsyre i en 98 ° C vandbad.
  2. Placer den rehydreret FFPE og efter faste NCFPE glider ind i krukken og inkuberes i 15 min.
Brug ikke mere end seks dias pr. farvning krukke.
  • Vask dias i destilleret vand i 3 min på RT i en ny farvning krukke.
  • Proteolyse, læg diassene i en temperatur kontrolleret hybridisering system ved 37 ° C.
    1. Umiddelbart, anvende the-klar-til-brug pepsinopløsning (2mg/ml) dråbevis (~ 30 µl pr. drop) til afsnittene væv, indtil det er helt dækket. Inkuber i 9 min ved 37 ° C i hybridisering system.
      Bemærk: En inkubationstiden på 5-15 min. anbefales. Det optimale tidspunkt for proteolyse bør undersøges på forhånd.
    2. Objektglassene i en krukke indeholdende vaskebuffer SSC og Inkuber i 5 min.
    3. Skyl dias i destilleret vand i 1 min på RT.
    4. Udføre dehydrering af sektionerne i de følgende sorterede alkoholer: 50%, 70%, 90% og 100% hver i 1 min. luft tørre sektionerne.
    5. For hybridisering, pipette 10 µL af HER2/CEN17 sonde ind på sektionerne tørrede væv dækker hver prøve med en coverslip og forsegle det med gummi cement.
      Bemærk: 10 µL af sonde anbefales pr. 22 x 22 mm væv område. En blid opvarmning af sonden gør pipettering processen lettere. Undgå bobler og lang eksponering af sonden til lyset.
    6. Co denaturere sonde og modellen DNA hybridisering system ved 75 ° C i 10 min.
    7. Indstil hybridisering system til 37 ° C og krydse sig natten over.
    8. Fjern forsigtigt gummi cement med pincet til post hybridisering og afsløring.
    9. Glassene inkuberes i en farvnings-krukke indeholdende 37 ° C pre varmede 1 x vaskebuffer A i 5 min. Fjern coverslips.
    10. Vask dias ved hjælp af pre varmede 1 x wash buffer A to gange i 5 minutter ved 37 ° C.
    11. Dehydrere dias i 70, 90% og 100% ethanol, 1 min.
    12. Tørre prøver i luften og beskytte mod lys.
    13. Til farvning, anvende 30 µL DAPI-løsning til området hybridiserede undgå boblerne. Dække sektioner med en coverslip.
    14. Inkuber i 15 min beskyttet mod lys.
    15. Fjern forsigtigt overskydende DAPI-løsning ved forsigtigt at trykke på dias mellem papirfiltre.
    16. Gemme diasene ved 2-8 ° C i mørke i op til 2 uger indtil evalueringen af Konfokal mikroskopi.

    • 6. Konfokal imaging og scanning af fisk dias

    1. Udføre Konfokal imaging og scanning af dias på en Konfokal digital scanner udstyret med en 40 x / 1.2 NA mål, quad band filtre (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) og en 5.5Mpx, 16 bit, afkølet videnskabelige komplementær metal oxide semiconductor (CMOS) kamera.
    2. Erhverve billederne med filtre til grøn (excitation: 503 nm, emission: 528 nm) og orange (excitation: 547 nm, emission: 572 nm) kanaler.

    7. fortolkning

    Bemærk: HER2/CEN17 sonde er en blanding af en rød fluorokrom-mærket CEN17 sonde specifikke for alpha satellit centromeric regionen kromosom 17 (D17Z1) og en grøn fluorokrom-mærket HER2 sonde specifikke for HER2 genet (sondens placering 17q12). Tumor prøver med en HER2:CEN17 ratio ≤2.0 per kerne er scorede som normale, mens dem med en HER2:CEN17 ratio ≥2.0 scorede som forstærkede17.

    1. Udføre kvalitet analyse af billeder med open source CaseViewer 2.120.
      1. Evaluere mindst 20 celler, der er placeret i to forskellige regioner af komponenten invasive karcinom som defineret af en patolog. Omfatte tydeligt adskiller sig godt fordelt kerner i området optælling. Udelukke fra tælle væv regioner på grænsen og tilbagetrukken eller klemt områder.

    8. RNA kvalitet

    1. RNA udvinding
      1. Sikre, at alle instrumenter og værktøjer er RNAse gratis. Bruge en RNAse-fjernelse løsning.
      2. Skær 10 til 20 sektioner (5 µm tykt) af NCFPE eller FFPE prøver ved hjælp af en mikrotom efter protokollen indtil trin 3.8.
      3. Uddrag RNA fra NCFPE prøver ved hjælp af RNA isolering kit (se tabel materialer). Uddrag RNA fra FFPE prøver ved hjælp af en FFPE RNA isolering kit.
        Bemærk: Udvinding af RNA fra cross-sammenkædning fikseringsmidler kræver en isolation metode tilpasset metoden fiksering. Brug ikke nogen andre RNA isolering metode (f.eks. Trizol, RNeasy FFPE, etc. for NCFPE modellen).
      4. Bestemme RNA koncentration og renhed ved hjælp af et spektrofotometer. Forholdet mellem absorbans på 260 nm og 280 nm (A260/280) bør være ~ 2.0.
      5. Gemme den isolerede RNA ved-70 ° C indtil yderligere analyse.
    2. Udføre en glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) real-time reverse transkription PCR ved hjælp af primere til at generere amplikoner af forskellige længder8,9.
      1. Bruge en cDNA reverse transkription kit efter manufacturer´s anvisninger til cDNA syntese. Bruge 500 ng RNA af hver prøve. Gemme cDNA ved-20 ° C indtil videre anvendelse.
      2. Forberede PCR master mix efter manufacturer´s anvisninger.
      3. Der afpipetteres PCR master mix i tre i en 384-godt reaktion plade. Tilføj 4 µL 1:16 fortyndet cDNA (PCR skabelon). Udføre PCR efter manufacturer´s anvisninger.
        Bemærk: For menneskelige GAPDH, anvendtes de følgende primere: GAPDH frem: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH omvendt: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ og 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.
      4. Analysere resultaterne ved hjælp af en software anvendelse til PCR-maskine. Uspecifik produkter skal udelukkes baseret på smeltende kurve analyse21.

    Representative Results

    FISK HER2 bestemmelse:

    HER2-fisk signal intensiteter fra FFPE og NCFPE er tilsvarende (figur 2). Begge tilfælde i de fleste celler viser en klar overskridelse af det grønne signal (vejledende af det forstærkede HER2 gen locus) i forhold til det røde signal (CEN17 reference gen). Sagen viser derfor, en forstærket HER2 genet, hvilket betyder, at denne patient forventes at reagere på trastuzumab, en anti-HER2 målrettet terapi. FFPE modellen fungerede som positiv kontrol. De signaler, der er observeret i ikke-neoplastiske celler (både i FFPE og NCFPE) fungerer som intern reference og negativ kontrol for HER2 genet forstærkning. For hver analyse serie, bør mindst én sektion med kendte gen amplifikation status bruges som positiv kontrol for hybridisering reaktion.

    RNA kvalitet:

    Tilsvarende FFPE og NCFPE prøver fra to forskellige sager viser forskelle i RNA kvalitet ved at ansætte real-time reverse transkription PCR. Resultaterne viser forskellige forstærkning effektivitetsgevinster for forskellige amplikon længder (dvs., 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) af GAPDH mRNA. Alle Ct (cyklus tærskel) værdier opnået fra FFPE prøver var højere end dem fra NCFPE. Denne forskel viser den lavere PCR amplificability af mRNA isoleret fra FFPE væv, hvilket tyder på en mere udtalt kemiske modifikation. Desuden, de højere Ct-værdier for længe i forhold til korte amplikoner er en indikator for mRNA fragmentering. I sammenligning viser Ct værdi skråningerne af forskellige amplikon længder, mere udtalt mRNA opsplitning i FFPE end NCFPE væv (figur 3).

    Figure 2
    Figur 2: repræsentative resultater af HER2 fisk for tilsvarende formalin fast paraffin indlejret (FFPE) og cross-sammenkædning, formalin-gratis fast paraffin indlejret (NCFPE) væv sektioner. Tilsvarende prøver fra de samme FFPE (A) og NCFPE (B) væv er vist. I modsætning til normale interphase celler (C), hvor to green (HER2) og to røde (CEN17) signaler forventes, celler med forstærkede HER2 genet locus repræsenterer flere kopier af grønne signaler (HER2) (D). HER2 forstærkning status var identiske i både FFPE og de efter faste NCFPE afsnit (A, B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3: resultater af en real-time reverse transkription PCR assay til RNA kvalitetskontrol. Y-aksen: Ct (cyklus tærskel) værdier af GAPDH genet er vist for forskellige amplikon længder (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) på x-aksen. mRNA blev isoleret fra FFPE og NCFPE af to forskellige bryst kræft vævsprøver behandles i parallel og transskriberede til cDNA for PCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    Resultaterne viser to vigtigste resultater. Først, en simpel 24 h SBFS efter fiksering trin af dele skåret fra NCFPE væv er tilstrækkelig til at opnå tilsvarende resultater til dem med FFPE i fisk analyser ved hjælp af fisk assays godkendt til FFPE væv (Se også reference14). Denne protokol har fordelen ved at bruge fisk assays oprindeligt udviklet og godkendt for FFPE uden behov for omfattende fornyelse (f.eks. ved at optimere pre hybridisering betingelser for ikke-cross-linked væv). FISK-protokollen kan bruges præcis som beskrevet i brugsanvisningen.

    Mindre ændringer fra manufacturer´s instruktionerne beskrevet i denne protokol (f.eks. væv afsnit diameter og inkubering perioder på deparaffinization trin) resultat fra tidligere tilpasninger, som er eksplicit anbefalet af fabrikanten anvendelse af forskellige vævstyper og fiksering metoder.

    Trinnet efter fiksering er kritisk, fordi det kræver en kemisk reaktion tid af 18-24 h, som udvider analyse tid af en dag, men giver mulighed for den samme daglige arbejdsgang, som er udviklet til FFPE væv (figur 1). SBFS er rapporteret at trænge væv med en gennemsnitlig hastighed på 1 mm pr. time22 til 5 mm i 2 h afhængigt af væv type23,24. Den iagttagelse, at kun længere efter fiksering perioder på mere end 18 h kunne ændre egenskaberne for NCFPE til FFPE sektioner, angiver, ikke penetration af fiksativ men den kemiske reaktion tid er afgørende for at opnå de ønskede resultater1 ,14.

    For det andet kan resterende NCFPE væv, der ikke bruges til efter fiksering bruges til yderligere molekylære analyser, som biomolekyler er velbevaret. Dette blev demonstreret af real-time reverse transkription PCR (figur 3). Analysen er mere følsom og specifik end elektroferogrammet-afledte RIN værdien (RNA integritet antallet) med hensyn til RNA kvalitet (dvs., kemisk modifikation og opsplitning) til mRNA isoleret fra paraffin-embedded væv8. Kvalitetskontrollen blev begrænset i denne undersøgelse til real-time PCR da uafhængige grupper har vist, at ud over RNA, DNA og proteiner isoleret fra NCFPE kvalitet er bedre end fra FFPE væv 8,9, 13.

    Protokollen præsenteret følger, eventuelt (f.eks. SBFS opskrift, fiksering betingelser, RNA kvalitetskontrol, validering), kravene i CEN tekniske specifikationer for pre analytiske procedurer for in vitro- diagnostik (IVD), der er for nylig blevet frigivet af europæiske udvalg af Standardiseringsorganisation (CEN) (f.eks. CEN/TS 16827-1:2015 for RNA-Isolation fra FFPE væv, som refererer til standarden, ISO 15189).

    Metoden er begrænset til denne særlige fiksativ. Selv om god bevarelsen af biomolekyler og morfologi ved hjælp af cross-sammenkædning, formalin-gratis fiksativ er blevet præsenteret i flere undersøgelser, er det hovedsagelig anvendes i forskning, men ikke i rutine medicinske anvendelser. En af grundene er at erstatte guldstandarden SBFS fiksering af en anden fiksativ ville kræve en række valideringsundersøgelser som ikke alle protokoller optimeret til FFPE materiale kan bruges til materialer fast med cross-sammenkædning fikseringsmidler. Andre væv fiksering metoder blev ikke testet for protokollens fisk.

    Den enkle efter fiksering trin beskrevet i dette manuskript har fordelen ved at bruge IVD godkendt assays, både for FFPE og NCFPE væv.

    Disclosures

    D.G. er ansat af Qiagen og har muligheder eller bond kvæghold i virksomhedens pensionsordning. Oplysningerne i dette manuskript henvise til PAXgene væv System, som er blevet udviklet i en fælles indsats af Qiagen og PreAnalytiX. Qiagen er industriel partner for den offentligt finansierede kristne Doppler laboratorium for Biospecimen forskning og Biobanking teknologier. Alle forfattere har nogen interessekonflikt og ingen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Vi takke holdet for laboratorium for Molekylær Patologi på Institut patologi af det medicinske universitet Graz for deres ekspertise og støtte. Desuden, vi takker Iris Kufferath og Daniela Pabst for teknisk bistand, Bernadette Rieger og Sylvia Eidenhammer til behandling af HER2 tilfælde samt Kinga Szurian (patolog) og Tamas Regényi (3DHISTEC). Vi takker Penelope Kungl for korrekturlæsning håndskriftet. Dette arbejde er blevet økonomisk støttet af den kristne Doppler forskningsfond, den østrigske føderale Ministeriet for videnskab, forskning og økonomi og National Foundation for forskning, teknologi og udvikling.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany www.sav-lp.de FN-200L-4-1 Tissue fixative
    Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada www.simport.com M-498 Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765112 For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 813150 Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
    Merck Millipore, Munich, Germany www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html MC1009834000 Dehydration of tissue samples
    VWR Chemicals, Darmstadt, Germany https://at.vwr.com 10293EP Dehydration of tissue samples
    ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria www.herba-chemosan.at 2549662 32 Paraffin used in a tissue processing device
    Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria www.LeicaBiosystems.com 39602004 Paraffin embedding medium
    Sanova Diagnostik, Vienna, Austria www.sanova.at 5229 Paraffin embedding instrument for tissues for histology
    Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria www.histocom.info M 910010 This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
    Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark www.chem.agilent.com K802021-2 Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 73504 For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765134 For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany www.zytovision.com Z-2015-200 For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
    3DHISTEC, Budapest, Hungary www.3dhistech.com Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4368814 The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4367659 PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
    ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE www.thermofisher.com Ser. Nr. F239 Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
    QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System www.thermofisher.com 4485701 PCR machine,
    Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
    2. Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).
    3. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
    4. Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).
    5. Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).
    6. Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).
    7. Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
    8. Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8 (7), e70714 (2013).
    9. Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).
    10. Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).
    11. Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).
    12. Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6 (11), e27704 (2011).
    13. Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
    14. Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).
    15. Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).
    16. Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).
    17. Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).
    18. Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).
    19. Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).
    20. Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. , (2017).
    21. Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. , Publication Number 4489822 (2013).
    22. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. , Wayne. (1999).
    23. Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
    24. Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).

    Tags

    Kræftforskning spørgsmålet 130 brystkræft ikke-cross-linker formalin-fri væv fiksativ formalin før analytics HER2 FISH analyse Molekylær diagnostik
    Protokol for HER2 fiske med cross-sammenkædning, Formalin-fri væv fiksativ at kombinere fordelene ved Cryo-bevarelse og Formalin fiksation
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Loibner, M., Oberauner-Wappis, L.,… More

    Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter