Summary
Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.
Abstract
In utero Elektroporation ist eine schnelle und leistungsstarke Ansatz, um den Prozess der radialen Migration in der Hirnrinde der Entwicklung von Maus Embryonen zu studieren. Es hat dazu beigetragen, die verschiedenen Schritte der radialen Migration zu beschreiben und die molekularen Mechanismen zu charakterisieren, die diesen Prozess kontrollieren. Um die Migrationsneuronen direkt und dynamisch zu analysieren, müssen sie im Laufe der Zeit verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der in der utero- Elektroporation mit organotypischer Schichtkultur und zeitraffer konfokaler Bildgebung kombiniert, die eine direkte Untersuchung und dynamische Analyse von radial wandernden kortikalen Neuronen ermöglicht. Darüber hinaus ist eine detaillierte Charakterisierung von Migrationsneuronen wie Migrationsgeschwindigkeit, Geschwindigkeitsprofilen sowie radiale Orientierungsänderungen möglich. Die Methode kann leicht angepasst werden, um funktionelle Analysen von Genen von Interesse bei der radialen Migration von kortikalen Neuronen durch Verlust und Gewinn der Funktion sowie Rettungsexperimente durchzuführen. ZeitrafferDie Bildgebung von Migrationsneuronen ist eine hochmoderne Technik, die einstmals ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Entwicklung der Hirnrinde bei Mausmodellen von neuronalen Migrationsstörungen ist.
Introduction
Der Neocortex ist der Hauptort der kognitiven, emotionalen und sensomotorischen Funktionen. Es besteht aus sechs horizontalen Schichten, die parallel zur Oberfläche des Gehirns ausgerichtet sind. Während der Entwicklung führen die Vorläuferzellen in der lateralen Wand des dorsalen Telencephalons zu Projektion Neuronen, die radial in Richtung der Pial Oberfläche wandern und erwerben eine Schicht Typ-spezifische neuronale Identität. Nachdem sie in den ventrikulären / subventrikulären Zonen (VZ / SVZ) erzeugt wurden, werden diese Neuronen vorübergehend multipolar und verlangsamen ihre Migration. Nach einem kurzen Aufenthalt in der Zwischenzone (IZ) wechseln sie zu einer bipolaren Morphologie, befestigen sie an dem radialen Gliagerüst und setzen eine radial orientierte Migration in die Kortikalplatte (CP) fort. Bei Erreichen ihrer endgültigen Zielprojektion lösen sich Neuronen von den radialen Gliaprozessen und erwerben schichtspezifische Identität. Mutationen in Genen, die verschiedene Schritte der neuronalen Migration beeinflussen, können zu schweren kortikalen Fehlbildungen führen, wie zB lissencEphalie oder weiße Substanz Heterotopie 1 , 2 .
In utero Elektroporation ist eine schnelle und leistungsstarke Technik, um neuronale Vorläuferzellen in das sich entwickelnde Gehirn der Nagetierembryonen 3 , 4 zu transfizieren. Mit dieser Technik ist es möglich, Gene zu knüpfen und / oder zu überexprimieren, um ihre Funktionen bei der Entwicklung von Neuronen zu untersuchen. Diese Methode hat gezielt dazu beigetragen, die morphologischen Details zu beschreiben und die molekularen Mechanismen des Prozesses der radialen Migration zu charakterisieren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radial wandernde Neuronen unterliegen dynamischen Veränderungen in der Zellform, Migrationsgeschwindigkeit und Migrationsrichtung, die eine direkte und kontinuierliche Beobachtung über die Zeit erfordern. Organotypische ScheibenkulturRe und zeitraffer konfokale bildgebung von elektroporierten Gehirnen erlauben es, die migrierenden Neuronen im Laufe der Zeit direkt zu beobachten. Mit diesem kombinierten Ansatz ist es möglich, verschiedene Merkmale von migrierenden Neuronen zu analysieren, die nicht in festen Gewebeabschnitten von elektroporierten Gehirnen untersucht werden können.
Wir wendeten kürzlich Zeitraffer konfokale Bildgebung von Neuronen in Kulturen von slice elektroporiert Gehirnen wandernde die Rolle des Transkriptionsfaktors B - Zell CLL / Lymphom 11a (BCL11A) während des kortikalen Entwicklung 10 zu studieren. Bcl11a wird in jungen, migrierenden kortikalen Neuronen ausgedrückt und wir verwendeten ein bedingtes mutiertes Bcl11a- Allel ( Bcl11a flox ) 11 , um seine Funktionen zu studieren. Die Elektroporation von Cre-Rekombinase zusammen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) in kortikale Progenitoren von Bcl11a- Flox- / Flox- Gehirnen ermöglichte es uns, eine Mosaikmutanten-Situation zu schaffen, in der nur wenige Zellen in einem mutiert sindSonst Wildtyp Hintergrund. Auf diese Weise war es möglich, zell-autonome Funktionen von Bcl11a auf Einzelzellenebene zu untersuchen. Wir fanden, dass Bcl11a- Mutanten-Neuronen reduzierte Geschwindigkeit, Verschiebungen in ihren Geschwindigkeitsprofilen sowie zufällige Orientierungsänderungen während ihrer Migration zeigen 10 . In dem skizzierten Protokoll beschreiben wir einen Workflow für eine erfolgreiche Elektroporation und Slice-Kultur-Präparation 12 von Maus-Gehirnen sowie eine zeitliche Konfokale Bildgebung von kortikalen Scheibenkulturen.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tierschutzausschuss (Regierungspräsidium Tübingen) genehmigt und nach dem Tierschutzgesetz und der EU-Richtlinie 2010/63 / EU durchgeführt.
1. In der Utero Electroporation
- Mikroinjektionsnadeln
- Ziehen Sie Borosilikatglas-Kapillaren (Außendurchmesser: 1,0 mm, Innendurchmesser: 0,58 mm, Länge: 100 mm) in Mikroinjektionsnadeln unter Verwendung eines Mikropipettenabziehers mit einem Kastenfaden (2,5 mm x 2,5 mm) und dem folgenden Programm: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20 und DELAY: 140. Bestimmen Sie den HEAT-Wert für jeden einzelnen Faden, indem Sie einen RAMP-Test durchführen (HEAT-Wert: RAMP + 25).
- Kegelnadeln in einem Winkel von 38 ° und einer mittleren bis hohen Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Mikroförderer, um eine Spitzengröße von 20 bis 30 μm zu erhalten, um am embryonalen Tag (E) 13,5 oder jünger und 30 bis 40 μm für die Injektion bei älteren Embryonalen zu injizierenStufen Zur Aufbewahrung Nadel in einer Schachtel oder Petrischale mit modelliertem Ton fixieren, um Schäden an den Spitzen zu vermeiden.
- Plasmid-DNA-Lösung
- Vorbereiten des Plasmid-DNA-Konstrukts, das fluoreszierendes Reporterprotein ( z. B. GFP) enthält, unter Verwendung eines endotoxinfreien Maxi-Präparationskits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Die Plasmid-DNA-Lösung auf eine Endkonzentration von 1 - 2 μg / μl in endotoxinfreiem Tris-EDTA-Puffer mit Fast Green bei einer Endkonzentration von 0,01% verdünnen. Aliquot-Lösung und bei -20 ° C aufbewahren.
- Bakteriostatische Natriumchloridlösung
- Bakteriostatische Natriumchloridlösung durch Zugabe von Benzylalkohol zu einer Endkonzentration von 0,9% zu isotonischer 0,9% iger Natriumchloridlösung herstellen. Sterilfilterlösung sofort vor Gebrauch.
- Carprofen Injektionslösung
- Vorbereiten der Carprofen-Injektionslösung durchZugabe von Carprofen zu einer Endkonzentration von 0,5 mg / ml zu steriler isotonischer 0,9% iger Natriumchloridlösung. Bei 4 ° C für bis zu 28 Tage aufbewahren.
- Anästhesie, DNA-Injektion und Elektroporation
- Wiegen Sie eine E14.5-zeitgesteuerte Maus und legen Sie sie in eine transparente Betäubungskammer, die mit einem Verdampfer verbunden ist und mit 5% Isofluran gesättigt ist. Wenn das Tier bewusstlos ist, transportiere es auf eine anästhesierende Maske, die an einer 37 ° C wärmenden Platte befestigt ist und sie mit 1,8 - 2,2% Isofluran betäubt hält.
Anmerkung: Beurteilung der Entwicklung der chirurgischen Anästhesie durch Verlust der Heckklemme und Pedalreflexe ( Zehenklemme). - Für die Analgesie injizieren 100 μl Carprofen-Injektionslösung pro 10 mg Mauskörpergewicht (5 mg / kg Körpergewicht) subkutan. Drehen Sie die Maus mit dem Rücken nach unten und sorgfältig bedecken die Augen mit Vaseline, um sie vor dem Trocknen zu verhindern.
- Die Glieder vorsichtig ausbreiten und fixierenAuf die wärmende Platte mit chirurgischem Band. Sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol, gefolgt von Iodlösung (7,5 mg / ml) unter Verwendung von Cellulose-Tupfern. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um eine ordnungsgemäße Desinfektion zu gewährleisten.
- Decken Sie den Bauch mit steriler Gaze, in dem ein Schnitt wurde geschnitten, um ein Feld (Durchmesser: 2 - 2,5 cm) für die Bauch-Inzision zu ersparen. Befeuchten Sie die Gaze mit bakteriostatischer Kochsalzlösung.
Achtung: Neugestaltung der Entwicklung der chirurgischen Anästhesie durch Verlust des Pedalreflexes. - Mit Micro Adson Forceps (gezackt, Länge: 12 cm) und feine Schere (abgewinkelt zur Seite, Länge: 9 cm) schneiden Sie die Haut ca. 1,5 cm entlang der Mittellinie des Bauches. Schneide den zugrunde liegenden Muskel entlang der Linie alba.
- Entfernen Sie ein Uterushorn mit Ringpinzette (Länge: 9 cm, Außendurchmesser: 3 mm, Innendurchmesser: 2,2 mm) und legen Sie es vorsichtig auf die angefeuchtete Gaze.
Achtung: Halten Sie das Uterushorn mit Ringpinzetten nur zwischen den Embryonen anD stört die Plazenta oder keine Versorgungsschiffe. Halten Sie den Uterus jederzeit mit bakteriostatischer Kochsalzlösung feucht. - Sorgfältig einen Embryo mit Ringpinzette positionieren und den lateralen Ventrikel lokalisieren, der als halbmondförmiger Schatten parallel zum sagittalen Sinus steht. Die Injektionsstelle liegt etwa in der Mitte einer Linie zwischen dem pigmentierten Auge und dem Zusammenfluss von Nebenhöhlen, wo der Sagittal-Sinus zu zwei Quer-Nebenhöhlen verzweigt. Schieben Sie die Mikroinjektionsnadel durch die Uteruswand und in den Seitenventrikel.
Hinweis: Bei Bedarf kann die Tiefe der Einspritzung durch Rückzug der Nadel korrigiert werden. - 1 bis 2 μl DNA-Lösung in den lateralen Ventrikel mit einem mit einem Fußpedal betriebenen Mikroinjektor mit den folgenden Einstellungen einspritzen: 25 psi, 10 bis 20 ms pro Puls und 5 bis 10 Impulse. Eine erfolgreiche Injektion kann durch die farbige DNA-Lösung überwacht werden, die das ventrikuläre System füllen soll.
- Legen Sie Pinzetten-Elektroden (3 mm Durchmesser für E13.5 oder jüngeren und 5 mm Durchmesser für E14.5 oder älter) so ein, dass der "positive" Anschluss auf der gleichen Seite wie der eingespritzte Ventrikel und der "negative" Terminal ist auf der gegenüberliegenden Seite des injizierten Ventrikels unter dem Ohr des Embryos Kopf.
- Befeuchten Sie die Elektroporationsstelle mit einigen Tropfen bakteriostatischer Natriumchloridlösung und legen Sie 5 Wechselstromimpulse (35 V für E13.5 oder jünger und 40 V für E14.5 oder älter) von 50 ms Dauer mit 950 ms Intervallen auf.
Anmerkung: Ströme von 60 bis 90 mA reichen in der Regel für eine erfolgreiche Elektroporation aus. Niedrigere Ströme werden die Neuronen nicht effizient transfizieren, während höhere Ströme zum embryonalen Tod führen können. - Wiederholen Sie den Vorgang (vgl. Schritt 1.5.7 bis 1.5.10.) Für jeden Embryo des Uterushorns und legen Sie ihn vorsichtig wieder in die Bauchhöhle zurück.
- Das Uterushorn von der anderen Seite entfernen und den Proc wiederholenEdure beschrieben in Schritt 1.5.7. Bis 1.5.11.
- Schließen Sie die Bauchhöhle, indem Sie die Muskelschicht nähen, bevor Sie die Haut mit Micro Adson Forceps, Mathieu Nadelhalter (Wolframkarbid, Länge: 14 cm) und nicht resorbierbare chirurgische Naht (3/8 Kreis, 13 mm, Kegelspitze) nähen.
Achtung: Achten Sie darauf, den Uterus oder andere Organe während der Naht nicht zu fangen. - Die Hautnaht sorgfältig mit Jodlösung (7,5 mg / ml) desinfizieren und den periozioxten Überschuss von Vaseline mit Zellstofftupfern vorsichtig entfernen. Lege die Maus unter eine Infrarotlampe, bis sie aufwacht. Die Maus in den nächsten zwei Tagen genau beobachten. Wiederholen Sie die Analgesiebehandlung wie in Schritt 1.5.2 nach 12 bis 24 h beschrieben.
- Wiegen Sie eine E14.5-zeitgesteuerte Maus und legen Sie sie in eine transparente Betäubungskammer, die mit einem Verdampfer verbunden ist und mit 5% Isofluran gesättigt ist. Wenn das Tier bewusstlos ist, transportiere es auf eine anästhesierende Maske, die an einer 37 ° C wärmenden Platte befestigt ist und sie mit 1,8 - 2,2% Isofluran betäubt hält.
2. Organotypische Scheibe Kultur
- Laminin Stock Solution
- 1 mg lyophilisiertes Laminin in sterilem Wasser auflösen, um eine 1 mg / ml Laminin-Stammlösung zu erhalten. 50 μl Aliquots vorbereiten aLager bei -80 ° C.
- Poly-L-Lysin-Stammlösung
- 50 mg Poly-L-lysin in sterilem Wasser auflösen, um eine 1 mg / ml Poly-L-lysin-Stammlösung zu erhalten. 0,5 ml Aliquote vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren.
- Vollständige Hank's Balanced Salt Solution (Komplette HBSS)
- Vorbereiten des vollständigen HBSS durch Kombinieren von 50 ml 10x HBSS-Lösung, 1,25 ml 1 M HEPES-Puffer (pH 7,4), 15 ml 1 M D-Glucoselösung, 5 ml 100 mM Calciumchloridlösung, 5 ml 100 mM Magnesiumsulfat Lösung und 2 ml einer 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung. Füge steriles Wasser bis zu 0,5 l hinzu, steriler Filter und bei 4 ° C aufbewahren.
- Scheibe Kultur Medium
- Kombinieren Sie 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml vollständiges HBSS (vgl. 2.3.1.), 1,35 ml 1 M D-Glucose, 0,25 ml 200 mM L-Glutamin und 0,5 ml Penicillin-Streptomycin zu 50 ml Scheibenkultur erhaltenMittel. Sterilfilter und fügt Pferdeserum zu einer Endkonzentration von 5% hinzu. Bei 4 ° C bis zu 4 Wochen aufbewahren.
- Niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose Lösung
- Vorbereitung von 3% LMP-Agaroselösung durch Auflösen von 1,5 g LMP-Agarose in 50 ml vollständigem HBSS durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen für 1 bis 2 min bei mittlerer Leistung.
Hinweis: Überwachen Sie die Hitze sorgfältig, um einen Überlauf beim Kochen zu verhindern. - Legen Sie die Lösung in ein Wasserbad bei 38 ° C, bis sie gebrauchsfertig ist. Bei 4 ° C aufbewahren und einmal wieder verwenden.
- Vorbereitung von 3% LMP-Agaroselösung durch Auflösen von 1,5 g LMP-Agarose in 50 ml vollständigem HBSS durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen für 1 bis 2 min bei mittlerer Leistung.
- Beschichtung von Membraneinsätzen
- Füge ein Aliquot der Laminin-Stammlösung (vgl. Schritt 2.1.1) und ein Aliquot der Poly-L-lysin-Stammlösung (vgl. Schritt 2.2.1) zu 6 ml sterilem Wasser ein, um eine Beschichtungslösung zu erhalten (genügend für 6 Einsätze) .
- Legen Sie Membraneinsätze in eine 6-Well-Platte mit 2 ml sterilem Wasser in den Boden jeder Vertiefung. 1 ml Beschichtungslösung zugeben(Vgl. Schritt 2.6.1) oben auf jede Membran und über Nacht bei 37 ° C und 5% Kohlendioxidatmosphäre inkubieren.
Hinweis: Verwenden Sie nur Einsätze mit optisch klaren Membranen wie Polytetrafluorethylen (PTFE) Membran. - Die Membranen dreimal mit 1 ml sterilem Wasser waschen und trocknen. Verwenden Sie beschichtete Membranen am selben Tag oder lagern Sie in einer sauberen 6-Well-Platte bei 4 ° C für bis zu vier Wochen.
- Hirndissektion und Einbettung
- Zwei Tage nach der Elektroporation platzieren Sie die Maus in eine transparente Kammer, die mit einem Verdampfer verbunden ist und mit 5% Isofluran gesättigt ist. Wenn das Tier bewusstlos ist, entfernen Sie es aus der Kammer und opfern es durch zervikale Versetzung.
- Entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen und legen Sie sie in eine 10-cm-Petrischale mit eiskaltem komplettem HBSS.
Anmerkung: Von diesem Punkt an halten alle Lösungen, Embryonen und Gehirne auf Eis. - Verwenden Sie ein Stereomikroskop, feine Spitze Pinzette (gerade,11 cm) und ein Paar Vannas Tübingen Spring Scissors (abgewinkelt, Länge: 9,5 cm), um jeden Embryo vom Uterus zu trennen und auf eine andere Petrischale zu bringen, die eiskaltes komplettes HBSS enthält.
- Machen Sie einen Einschnitt auf der Höhe des Hirnstamms und schneiden Sie die sagittale Mittellinie. Schälen Sie die Haut und den Knorpel, der das Gehirn bedeckt. Dann schneide den Hirnstamm direkt hinter die Hemisphären und entferne das Gehirn vom Schädel. Übertragen Sie das Gehirn mit einem Mikro-Löffel-Spatel (185 mm x 5 mm) auf eine 12-Well-Platte mit eiskaltem komplettem HBSS. Sammle alle Gehirne aus dem Wurf in der 12-Well-Platte.
- Verwenden Sie ein fluoreszierendes Stereomikroskop, um das Gehirn in der 12-Well-Platte für die Fluoreszenzhelligkeit sowie die Größe der elektroporierten Region zu screenen. Wählen Sie 2 bis 4 Gehirne mit hellen Fluoreszenzsignalen in der vermutlich somatosensorischen Kortex für die weitere Verarbeitung.
- Gießen Sie 3% LMP-Agarose-Lösung bei 38 ° C in Abzieh-Einweg-Einbettungsform. EntfernenE Gehirn aus der 12-Well-Platte mit einem Mikro-Löffel Spatel und sorgfältig abtropfen überschüssige komplette HBSS um das Gehirn mit feinen Tissue-Papier.
- Legen Sie das Gehirn sanft in die Agarose-Lösung, schieben Sie es auf den Boden der Form, und passt sorgfältig seine Position mit einer 20-Gauge-Nadel. Für koronare Abschnitte orientieren Sie das Gehirn mit den nach oben weisenden Riechbirnen. Halten Sie die Form auf Eis, bis die Agarose-Lösung verfestigt ist und fahren Sie mit dem Abbau des Gehirns fort.
- Vibratome Sectioning und Slice Kultur
- Den Agaroseblock aus der Form nehmen und auf den Deckel einer sterilen Petrischale legen. Die überschüssige Agarose mit einer sauberen Rasierklinge abschneiden, die etwa 2 bis 3 mm unterhalb der olfaktorischen Glühbirnen und 1 mm Agarose auf den anderen Seiten verlässt. Fixieren Sie den beschnittenen Agaroseblock mit den olfaktorischen Glühbirnen, die nach unten zu einem Probenstadium unter Verwendung von Cyanoacrylatklebstoff zeigen.
Hinweis: Sterilisieren Sie Instrumente und Geräte mit 70% EthanoL vor dem schneiden. - Übertragen Sie die Probenstufe auf die Schneidkammer eines Vibrationsmesser-Mikrotoms, das eiskaltes komplettes HBSS enthält, und positionieren Sie das Gehirn mit seiner dorsalen Seite in Richtung der Klinge. Schneiden Sie 250 μm dicke Hirnscheiben, die den elektroporierten Bereich mit einer niedrigen bis mäßigen Amplitude von 0,9 mm und einer sehr langsamen Schnittgeschwindigkeit von 0,09-0,12 mm / s enthalten. Üblicherweise werden 4 bis 6 Scheiben mit hellem Fluoreszenzsignal aus jedem erfolgreich elektroporierten Gehirn gewonnen.
- Mit einem gebogenen Mikro-Löffel-Spatel und feiner Pinzette, übergeben Sie die Gehirnscheiben sorgfältig mit der umliegenden Agarose zu einer 6-Well-Platte, die eiskaltes komplettes HBSS enthält.
Achtung: Achten Sie darauf, das Gehirngewebe nicht zu beschädigen, indem Sie nur den Agaroserand um die Sektionen mit der Pinzette während des Transports berühren. - Verarbeiten Sie alle ausgewählten Gehirne wie in den Schritten 2.8.1 beschrieben. Bis 2.8.3.
- Befeuchten Sie die Membraneinsätze mit 100 μl komplettem HBSS, bevor Sie das Gehirn slAuf die Membranen, um die Positionierung der Scheiben zu erleichtern. Bis zu 5 Scheiben können auf 1 Membraneinsatz aufgesetzt werden.
- Sorgfältig die Scheiben auf die Membranen mit einem gebogenen Mikro-Löffel Spatel und feine Spitze Pinzette übertragen. Ziehen Sie vorsichtig eine Scheibe auf den Spatel, indem Sie nur den Agaroserand mit der Pinzette berühren und die Scheibe vorsichtig von der Spachtel auf die Membran schieben. Positionieren Sie die Scheibe mit Pinzette und fahren Sie fort, die restlichen Scheiben zu übertragen. Entfernen Sie überschüssiges HBSS mit einer Pipette.
Hinweis: Die Scheiben nicht überlappen. - Mit Hilfe der Pinzette sorgfältig die Membraneinsätze mit den Scheiben in eine 6-Well-Platte mit 1,8 ml Schichtkulturmedium (vgl. Schritt 2.4.1.) Geben und bei 37 ° C und 5% Kohlendioxidatmosphäre bis zum Zeitraffer inkubieren Bildgebung
- Den Agaroseblock aus der Form nehmen und auf den Deckel einer sterilen Petrischale legen. Die überschüssige Agarose mit einer sauberen Rasierklinge abschneiden, die etwa 2 bis 3 mm unterhalb der olfaktorischen Glühbirnen und 1 mm Agarose auf den anderen Seiten verlässt. Fixieren Sie den beschnittenen Agaroseblock mit den olfaktorischen Glühbirnen, die nach unten zu einem Probenstadium unter Verwendung von Cyanoacrylatklebstoff zeigen.
3. Zeitraffer-Bildgebung
- Mikroskop-Setup
- Stellen Sie eine Klimakammer auf die Bühne einInvertiertes konfokales Mikroskop auf 37 ° C und 5% Kohlendioxidatmosphäre. Verwenden Sie einen Hybrid-Detektor, um die Laserintensität zu reduzieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Für eine detaillierte Analyse verwenden Sie einen extra langen Arbeitsabstand 40X Trockenobjektiv mit einer numerischen Blende von 0,6 oder höher.
Hinweis: Alle Komponenten des Mikroskops müssen vor dem Imaging auf 37 ° C vorgewärmt werden, um eine stabile Fokussierung während des Bildgebungsprozesses zu gewährleisten.
- Stellen Sie eine Klimakammer auf die Bühne einInvertiertes konfokales Mikroskop auf 37 ° C und 5% Kohlendioxidatmosphäre. Verwenden Sie einen Hybrid-Detektor, um die Laserintensität zu reduzieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Für eine detaillierte Analyse verwenden Sie einen extra langen Arbeitsabstand 40X Trockenobjektiv mit einer numerischen Blende von 0,6 oder höher.
- Slice Imaging
- Wählen Sie eine Hirnscheibe für die Bildgebung aus der 6-Well-Platte, die die Membraneinsätze enthält, mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
Achtung: Vermeiden Sie eine längere Belichtungszeit für ultraviolettes Licht, da dies zu einer zellulären Photodamage führen kann.
Anmerkung: Wählen Sie eine Scheibe mit hellen einzelnen Neuronen im oberen SVZ, die radial zur Pialoberfläche der Scheibe wandern. Feine fluoreszierende Prozesse von radialen Gliazellen, die den gesamten CP überspannen, deuten auf ein intaktes radiales Gliagerüst hin, das verwendet wirdD durch radiales Migrieren von kortikalen Neuronen. - Übertragen Sie den Membraneinsatz mit der für die Zeitraffer-Bildgebung ausgewählten Scheibe in eine Glasbodenschale mit 50 mm Durchmesser, die 2 ml Scheibenkulturmedium mit Hilfe der Pinzette enthält. Legen Sie die Schale in die Klimakammer des konfokalen Mikroskops.
- Stellen Sie die Auflösung auf 512 mal 512 Pixel ein und erhöhen Sie die Scan-Geschwindigkeit von 400 Hz auf 700 Hz, um die Bildrate von etwa 1,4 bis etwa 2,5 Frames pro Sekunde zu erhöhen. Verwenden Sie nicht mehr als zwei Mal Mittelwert. Definieren Sie einen Z-Stapel durch den elektroporierten Bereich (üblicherweise 400-100 μm) mit einer Schrittweite von 1,5 μm. Zusammenfassend erlauben diese Einstellungen eine ausreichende Auflösung und Helligkeit des Bildes, während die Photodamage während des Erwerbs niedrig gehalten wird. Starten Sie die Zeitraffer-Serie, indem Sie alle 30 Minuten einen Z-Stack nehmen.
Anmerkung: Eine längere Belichtung der Scheibe an Laserlicht wird dazu führen, dass die Photodamage die Lebensfähigkeit der Zellen verringert. Stellen Sie die expOsure Zeit zum Laserlicht entsprechend. - Analysieren Sie die Zeitraffer-Serie mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/iij/) oder gleichwertig.
- Wählen Sie eine Hirnscheibe für die Bildgebung aus der 6-Well-Platte, die die Membraneinsätze enthält, mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Bisher haben wir gezeigt, dass die genetische Deletion von Bcl11a in der utero- Elektroporation die radiale Migration von spätgeborenen Oberschicht-Projektion Neuronen 10 beeinträchtigt. Die Elektroporation eines DNA-Plasmid-Vektors, der Cre-IRES-GFP enthielt, löschte Bcl11a effizient in bedingten Bcl11a- Flox / Flox- Gehirnen 11 . Als wir E14.5 elektroporierte Gehirne drei Tage nach der Elektroporation analysierten, waren die meisten Kontrollneuronen in den CP gewandert, während viele Bcl11a- Mutanten-Neuronen entlang der Migrationsroute im IZ und VZ / SVZ verstaut wurden. Darüber hinaus fanden wir eine Zunahme der Anzahl multipolarer Zellen auf Kosten von bipolaren Zellen spezifisch in der IZ nach Bcl11a- Deletion, die auf Defekte in der Polarisation 10 hindeutet.
Zur direkten und dynamischen Analyse von MigraTory-Verhalten von Bcl11a- Mutanten-Neuronen verwendeten wir die zeitlich abklingende konfokale Bildgebung von migrierenden Neuronen in der organotypischen Scheibenkultur, die aus elektroporierten Gehirnen hergestellt wurden. Überblick Zeitraffer-Serie mit einem 10X-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,4 bestätigte unsere Ergebnisse, dass Bcl11a Mutante Projektion Neuronen Defekte in der radialen Migration haben. Innerhalb von 36 h waren viele Kontrollneuronen in den CP gewandert, während nur wenige Bcl11a- Mutanten-Neuronen das IZ verlassen und in den CP migriert hatten. Interessanterweise schien es, dass viele Bcl11a- Mutanten-Neuronen nicht direkt in die piale Oberfläche des Gehirns migrierten, sondern die Migration verlangsamten und sich tangential oder sogar zurück zum Ventrikel (Film 1) drehten. Um diese Erkenntnisse weiter zu analysieren, erzeugten wir eine Zeitraffer-Reihe bei einer höheren Vergrößerung mit einem 40-fachen Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,6. Unsere Daten zeigen, dass Bcl11a Mutanten Neuronen nicht effizient polarisieren und radial orientiert Migrat fortsetzenIonen in den CP. Innerhalb von 12 h konnten viele Bcl11a- Mutanten-Neuronen nicht von einer multipolaren zu einer bipolaren Morphologie wechseln und stattdessen viele Prozesse in die Umgebung projizieren und zurückziehen (Movie 2, Abbildung 1A ).
Darüber hinaus haben wir die Migrationswege einzelner Neuronen in verschiedenen Zeitraffer-Serien verfolgt und diese zur Berechnung spezifischer Parameter von migrierenden Neuronen verwendet. Wir fanden, dass Bcl11a- Mutanten-Neuronen wiederholt Phasen von mehreren Stunden Dauer mit reduzierter Migrationsgeschwindigkeit und zufälligen Orientierungsänderungen (Film 3, Abbildung 1B , rote Pfeilspitzen) durchlaufen. Insbesondere wurde das Geschwindigkeitsprofil von Bcl11a- Mutanten-Neuronen gegenüber einer höheren Geschwindigkeit (25 μm / h) gegenüber einer niedrigeren Geschwindigkeit (5 μm / h) im Vergleich zu Kontrollneuronen verschoben ( Abbildung 1C ). Im Einklang damit, die gesamte Migrationsgeschwindigkeit von Bcl11Wurde ein mutierter Neuron signifikant von 10,34 ± 0,34 μm / h bei Kontrollen auf 6 ± 0,54 μm / h (p = 2.4889E-05) reduziert ( Abbildung 1D ). Schließlich wurde die Abweichung von der gerichteten Migration auf die Pialoberfläche des Gehirns signifikant von 17,15 ± 2,13 ° bei der Kontrolle auf 40,16 ± 4,42 ° in Bcl11a- Mutanten-Neuronen (p = 0,0002) erhöht ( Abbildung 1E ). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die zeitkonfliktbildende Bildgebung von GFP-elektroporierten Neuronen in der organotypischen Schichtkultur eine wertvolle Methode ist, molekulare Mechanismen zu untersuchen, die den Prozess der neuronalen Migration kontrollieren.
Film 1: Migration von GFP-markierter Kontrolle im Vergleich zu Bcl11a Mutantenneuronen in kortikalen Scheiben. Bcl11a flox / flox Gehirne wurden elektroporiert beiE14.5 mit einem Plasmidvektor, der IRES-GFP (A) oder Cre-IRES-GFP (B) enthielt, und Scheibenkulturen wurden bei E16.5 hergestellt. VZ / SVZ; Ventrikuläre / subventrikuläre Zonen; IZ, Zwischenzone; CP, kortikale Platte. Maßstab = 100 μm. Der Film besteht aus 108 Frames mit einer Rate von 5 Frames / s. Nachgedruckt von Wiegreffe et al. 10 mit Erlaubnis von Elsevier. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
Film 2: Polarisation einer GFP-markierten Kontrolle im Vergleich zu Bcl11a Mutantenneuronen in kortikalen Scheiben. Bcl11a- Flox- / Flox- Gehirne wurden bei E14.5 mit einem Plasmidvektor, der IRES-GFP (A) oder Cre-IRES-GFP (B) und Slice-Kulturen enthielt, elektroporiert Wurden bei E16.5 vorbereitet. Maßstab = 10 μm. Der Film besteht aus 25 Frames mit einer Rate von 5 Frames / s. Nachgedruckt von Wiegreffe et al. 10 mit Erlaubnis von Elsevier. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
Film 3: Animierte Spuren mit 1 h Intervall Auflösung der repräsentativen Kontrolle und Bcl11a Mutante Neuronen. Spuren von wandernden Neuronen wurden aus Zeitraffer-Reihen von E16.5-Scheibenkulturen von Bcl11a- Flox / Flox- Gehirnen erhalten, die bei E14.5 mit einem Plasmidvektor, der IRES-GFP ( A ) oder Cre-IRES-GFP ( B ) enthielt, elektroporiert wurden, . Maßstab = 20 μm. Nachgedruckt von Wiegreffe et al.> 10 mit Erlaubnis von Elsevier. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Klicken Sie mit der rechten Maustaste zum Herunterladen.)
Abbildung 1: Migrationsverhalten von Bcl11a- Mutanten-Oberschicht-Kortikalen Neuronen.
( A ) Repräsentative Bilder von migrierenden GFP-positiven Neuronen in E16.5-Slice-Kulturen aus Bcl11a- Flox- / Flox- Gehirnen, die bei E14.5 entweder mit Cre-IRES-GFP oder einem Kontrollvektor über eine Gesamtbildgebungsperiode von 12 h elektroporiert wurden. ( B ) Repräsentative Spuren mit 1-stündiger Intervallauflösung von migrierenden GFP-positiven Neuronen in E16.5-Slice-Kulturen aus Bcl11a- Flox- / Flox- Gehirnen, die bei E14.5 mit Cre-IRES-GFP oder einem Kontrollvektor über Gesamtbildgebungsperioden elektroporiert wurdenBis zu 22 h Bcl11a- Mutanten-Neuronen unterliegen häufig Wiederholungsphasen mit reduzierter Migrationsgeschwindigkeit und zufällig geänderter Orientierung (markiert durch rote Pfeilspitzen). ( C ) Geschwindigkeitsprofile, berechnet aus Spuren von migrierenden Neuronen, wie in B. gezeigt. ( DE ) Quantifizierung der Geschwindigkeit ( D ) und des Abweichungswinkels von der radialen Orientierung ( E ) der wandernden GFP-positiven Neuronen in E16.5 Scheibenkulturen aus Bcl11a flox / flox Gehirne, die bei E14.5 mit Cre-IRES-GFP oder einem Kontrollvektor (n = 15) elektroporiert wurden. Mittelwert ± sem; Student's Test; P <0,001. Maßstab = 10 μm. Nachgedruckt von Wiegreffe et al. 10 mit Erlaubnis von Elsevier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Radiale Migration ist ein wichtiger Prozess in der Neocortex-Entwicklung. Mutationen in Genen, die verschiedene Schritte dieses Prozesses beeinflussen, können schwere kortikale Fehlbildungen verursachen, einschließlich Lissencephalie und weiße Substanz Heterotopie 1 , 2 . Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Bcl11a, das in jungen wandernden kortikalen Projektion Neuronen ausgedrückt wird, eine Rolle bei der radialen Migration spielt. Wir haben die konfokale Bildgebung von migrierenden Neuronen in akuten kortikalen Scheiben von elektroporierten Gehirnen verwendet, um direkt zu zeigen, dass die genetische Deletion von Bcl11a bei wandernden Neuronen Polarisations- und Migrationsdefekte verursacht. Zeitraffer-Serien wurden verwendet, um Migrationswege einzelner Neuronen zu verfolgen und spezifische Parameter von migrierenden Neuronen zu berechnen, einschließlich Geschwindigkeitsprofilen, durchschnittlicher Migrationsgeschwindigkeit und Migrationsrichtung 10 .
Dieses Protokoll beschreibt einen wichtigen Ansatz beim Studium der MoleküleR Mechanismen in der radialen Migration. Durch die Verwendung von kurzen Haarnadel-RNA- oder DNA-Expressionsplasmiden kann nahezu jedes Gen von Interesse niedergeschlagen oder überexprimiert werden. Es ist ein starker Ansatz, die Elektroporation mit dem Cre-LoxP-System zu kombinieren. Die Transfektion von Gehirnen von bedingten mutierten ("floxed") Mäusen mit Cre-Rekombinase erzeugt eine Mosaik-Mutanten-Situation und ermöglicht eine selektive Analyse von einzelnen mutanten Neuronen, die von Wildtyp-Zellen umgeben sind. Auf diese Weise können zellautonome molekulare Mechanismen bei der Migration von Neuronen untersucht werden. Auch funktionelle Rettungsexperimente werden leicht durchgeführt. Die Vorbereitung der Zeitraffer-Reihe von elektroporierten Hirnschnitten ermöglicht eine dynamische Analyse des Migrationsverhaltens einzelner wandernder Neuronen, was viel mehr Informationen liefert, als aus festen Gehirnabschnitten gewonnen werden kann. In utero electroporation 3 , 4 erfordert eine Erstausbildung, aber - einmal gemeistert - ist einSchnelle und unkomplizierte Technik, um Neuronen der Hirnrinde in vivo reproduzierbar zu transfizieren. In dem hier beschriebenen Protokoll wurden wir bei der utero- Elektroporation bei E14.5 verwendet, als spätgeborene obere Schicht neokortikale Projektion Neuronen geboren werden. Für das Studium der frühgeborenen Tiefschichtprojektion müssen Neuronen in der Utero- Elektroporation am früheren Entwicklungsstadium durchgeführt werden ( dh E12.5) 13 . Grundsätzlich kann das Protokoll auch verwendet werden, um die Migration anderer neuronaler Subpopulationen im Gehirn zu untersuchen, die mit Elektroporation transfiziert werden können, einschließlich der Migration von Interneuronen 14 und zerebellärer Granulatzellen 15 .
Das Scheibenkulturprotokoll, das wir beschreiben, wurde von Polleux und Gosh 12 angepasst und zuvor haben wir es für die Ex utero Elektroporation 16 , 17 bis stu verwendetDy hippocampal Entwicklung. Am wichtigsten ist, dass die Gehirnscheiben während des gesamten Verfahrens sorgfältig behandelt werden müssen, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten. Wir verwenden ein invertiertes Mikroskop und optische Qualität Glasbodenschalen, um die Scheibenkultur, die auf einem Zellkultureinsatz ruht, abzubilden. Diese Konfiguration ist sehr einfach einzurichten und erlaubt sterile Bedingungen, da das Ziel niemals mit der Scheibenkultur oder dem Medium in Berührung kommt. Allerdings sind lange Arbeitsabstandsziele (> 2 mm) mit einer ausreichend hohen numerischen Apertur (0,6 oder höher) erforderlich. Andere Studien haben die Hirnscheibe direkt auf den Glasboden gelegt und eine Kollagenmatrix 18 , 19 verwendet , um die Scheibe an Ort und Stelle zu fixieren, wodurch der Gebrauch von Objektiven mit einem kürzeren freien Arbeitsabstand möglich ist. Allerdings bietet die Verwendung von Zellkultur-Einsätzen eine einfache Handhabung, reproduzierbare Ergebnisse und ermöglicht es dem Forscher, die Scheiben sogar 1 bis 2 Tage nach ihrer Vorbereitung ohne Co zu bildlich zu machenMpromising Lebensfähigkeit der Gehirnscheibe (Daten nicht gezeigt). Eine weitere kritische Frage betrifft die Beschädigung der Scheiben durch Laserlicht. Wir haben einen hochempfindlichen Hybrid-Detektor verwendet, der es uns ermöglicht, die Laserleistung auf ein Minimum zu reduzieren, während immer noch ausreichende Fluoreszenzsignale für die Zeitraffer-Bildgebung erhalten wurden. Die Verwendung von Multiphotonen-Bildgebung würde die Photodamage weiter reduzieren und eine tiefere Gewebepenetration sowie eine effizientere Lichtdetektion im Vergleich zur konventionellen konfokalen Mikroskopie ermöglichen.
Trotz seiner Nützlichkeit, neuronale Migration zu studieren, hat das Protokoll Einschränkungen und kann die Situation der Migration von Neuronen im intakten Gehirn nicht vollständig bewahren. Die extrazelluläre Matrix, die interzellulären Klebstoffkontakte und das Gefäßsystem innerhalb der Migrationszone können die radial wandernden Neuronen 20 , 21 dynamisch beeinflussen. Speziell hängen obere Schichtneuronen von langgestreckten radialen Gliaprozessen abIhre Migration 22 . Für eine erfolgreiche Bildgebung ist es daher wichtig, Hirnschnitten mit GFP-elektroporierten Radial-Gliazellen auszuwählen, die ihre Prozesse durch die gesamte kortikale Breite erweitern. "Schräge Scheiben", in denen das Radial-Glia-Gerüst abgeschnitten worden ist, bevor man die Hirnoberfläche des Gehirns erreicht, sollte aus der weiteren Analyse weggeworfen werden. Manchmal kann der Zelltod an der Luftoberfläche des Gehirns auftreten, was die Bildaufnahme in einen tieferen Bereich innerhalb der Probe beschränkt. Elektroporierte Neuronen in kultivierten Hirnschnitten können im Vergleich zu elektroporierten Neuronen in vivo weniger effizient wandern, was durch eine unzureichende Rückgewinnung aus der Herstellung verursacht werden kann. Dies erfordert Analysen von Mehrfachsegmentkulturen sowohl für experimentelle als auch für Kontrollsituationen und kritische Interpretation repräsentativer Datensätze. In einigen Fällen können die Beleidigungen, die mit der utero- Elektroporation verbunden sind, einen embryonalen Tod oder eine strukturelle Veränderung verursachenIonen des Gehirns, einschließlich vergrößerter Ventrikel, asymmetrisch verdünnter Kortex oder einer glialen Narbenbildung, die aus der DNA-Injektion resultiert. In diesen Fällen sollte die Probe aus der weiteren Analyse weggeworfen werden.
Während Gehirnscheiben von embryonalen Spendern auf den Membraneinsätzen 23 gut überleben, sind die Analysen auf frühe Entwicklungsereignisse beschränkt, einschließlich der neuronalen Migration, und wir haben sie nicht zum Studieren von späteren Ereignissen wie Dendritenentwicklung oder Synaptogenese verwendet. Zusammenfassend gibt es ein detailliertes Protokoll zur direkten und dynamischen Untersuchung der neuronalen Migration von elektroporierten Neuronen in Scheibenkulturen, die sich leicht an die Analyse von Funktionen von Genen, die an neurodevelopmentalen Störungen beteiligt sind, anpassen können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka und Matthias Toberer für hervorragende technische Unterstützung sowie Victor Tarabykin für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von einem Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft an SB (BR-2215) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
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