Summary
تحليل الجزيرة هو مقايسة جديدة نسبيا، وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن استخدامها لتقييم السلوك الحركي الأساسية من melanogaster المورفولوجية. ويصف هذه المخطوطة خوارزميات لمعالجة البيانات الأوتوماتيكية والهدف الكمي للجزيرة تحليل البيانات، مما يجعل هذا الاعتداء قراءات الحساسة، الفائق لشاشات الجينية أو صيدلانية كبيرة.
Abstract
التطورات في تقنيات الجيل التالي تسلسل تسهم في تحديد جينات المرض (مرشح) لاضطرابات الحركة وغيرها من الأمراض العصبية بسرعة متزايدة. ومع ذلك، يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية التي تكمن وراء هذه الاضطرابات. الأدوات الجينية والجزيئية، والسلوكية ل melanogaster المورفولوجية يجعل هذا الكائن نموذج مفيدة بشكل خاص لوصف الجينات الأمراض الجديدة والآليات بطريقة الفائق. ومع ذلك، تتطلب شاشات الفائق فحوصات فعالة وموثوق بها أنه، من الناحية المثالية، فعالة من حيث التكلفة، والسماح للتحديد الكمي الخاص للصفات ذات الصلة لهذه الاضطرابات. والرزن الجزيرة هو فعالية من حيث التكلفة وسهولة إنشاء أسلوب لتقييم السلوك الحركي المورفولوجية . في هذا الفحص، يتم طرح الذباب على منصة من ارتفاع ثابت. وهذا يدفع استجابة الحركية فطرية التي تمكن من الذباب للهروب من النظام الأساسي في غضون ثوان. في الوقت الحاضر، تتم التحاليل الكمية للجزيرة صورت الاختبارات يدوياً، وهي مهمة شاقة، ولا سيما عند أداء شاشات كبيرة.
ويصف هذه المخطوطة الخوارزميات "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" و "تحليل الإنزيم الجزيرة" الفائق والتجهيز الآلي للبيانات والقياس الكمي للبيانات المقايسة الجزيرة. في الإعداد، يجمع كاميرا ويب بسيطة متصلة بجهاز كمبيوتر محمول لسلسلة صورة من المنصة بينما تتم التحليل. الخوارزمية "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" المتقدمة لبرمجيات المصدر المفتوح فيجي عمليات سلسلة هذه الصورة ويوضحها، لكل حالة تجريبية، عدد الذباب على منصة على مر الزمن. البرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة"، متوافقة مع البرمجيات الحرة R، ووضعت لمعالجة البيانات التي تم الحصول عليها تلقائياً وحساب ما إذا كان العلاج/الأنماط الجينية تختلف إحصائيا. هذا إلى حد كبير يحسن كفاءة الإنزيم الجزيرة ويجعل من قراءات قوية للحركة الأساسية والسلوك الرحلة. وبالتالي فإنه يمكن تطبيقها على شاشات كبيرة تحقق القدرة الحركية يطير، نماذج المورفولوجية لاضطرابات الحركة، وفعالية العقاقير.
Introduction
وفي السنوات الأخيرة، أوجه التقدم في تقنيات الجيل التالي التسلسل قد أسهمت إسهاما كبيرا تحديد الجينات الكامنة وراء الاضطرابات التنكسية حركة الدماغ (مثلاً، ترنح الدماغ والرعاش)، من الخلايا العصبية الطرفية الأصل (مثل التصلب العضلي الجانبي والشلل النصفي التشنجي وراثية)، ومن أصل العضلات (Duchenneمثل ضمور العضلات وضمور myotonic)1،2،3،4 . وعلى الرغم من هذا، يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية التي تكمن وراء معظم هذه الاضطرابات. فهم أفضل لهذه الآليات أساسي لتطوير العلاجات.
كما هو الحال في البشر، وهو حركة في نموذج الكائنات، مثل الطيران والحركة في المورفولوجية، يسيطر عليها وسط المخ والجهاز العصبي المحيطي، والعضلات. وباﻹضافة إلى ذلك، الوقت جيل سريع والأدوات الجينية المورفولوجية لجعل هذا الكائن نموذج ملائمة بصفة خاصة للفرز الفائق للجينات المشاركة في اضطرابات الحركة وللمخدرات اختبار5،6 . بسبب عدد كبير من الظروف التي تحتاج إلى اختبار في هذه الشاشات، موثوقة وفعالة من حيث التكلفة، وفحوصات بسيطة نسبيا، فضلا عن أدوات لقياس نتائج المخرجات بطريقة تلقائية، مرغوب فيه للغاية.
شميت وآخرون (2012) 7 وصف اختبار منخفضة التكلفة يسمى "المقايسة الجزيرة" لتقييم السلوك الحركي المورفولوجية . والرزن الجزيرة قد استخدمت بنجاح في عروض واسعة النطاق لتحديد الجينات مع المهام الخاصة بإطلاق7، في تقييم نماذج المورفولوجية للإعاقة الفكرية8، والتقييم العام يطير السلوك الحركي9. تصميم مبدأ المقايسة الجزيرة يتكون من منصة مرتفعة على الذي يتم طرح عدد الذباب. وهذا الحث على سلوك الحركية فطرية التي تمكن الذباب صحية للهروب من النظام الأساسي في غضون ثوان. تدابير المقايسة عدد الذباب المتبقية على المنصة على مر الوقت7،،من89. كل هذه الميزات تشير إلى أن الإنزيم الجزيرة قد تكون أداة فحص قوية للجينات المشاركة في اضطرابات الحركة.
حاليا، أن التحليل الكمي للجزيرة صورت تحليل البيانات يتم ذلك يدوياً7،،من89. لتحسين كفاءة التحليل، تم تطوير طريقة منخفضة التكلفة لشبه تلقائياً التحديد الكمي لهروب الذباب من المنصة. الإعداد يستخدم كاميرا ويب بسيطة متصلة بجهاز كمبيوتر محمول لجمع الوقت صورة سلسلة من منهاج العمل، مع إطارات المكتسبة 0.1 كل الإطارات س. ثم تجهز مع الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" التي يوضحها عدد الذباب على المنصة على مدى الوقت. الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" ينقسم إلى ثلاث وحدات الماكرو الفرعية المستقلة: (ط) "إنشاء مكدس والإسقاط،" الماكرو الفرعية تحدد تجارب جزيرة مختلفة مخزنة في مجلدات فرعية مختلفة وإنشاء كومة واسقاطا لكل السلسلة الزمنية. (ثانيا) التتالي سيفتح الماكرو الفرعية "منصة تعريف" كافة الملفات "Projection_image_name.tif" الموجودة في المجلدات الفرعية التجريبية الفردية، عند هذه النقطة هو طلب المستخدم يدوياً تحديد منصة الجزيرة كالمنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار). (ثالثا) "تحليل" يقد تلقائياً عدد الذباب المتبقية على المنصة خلال السلسلة الزمنية. يمكن تشغيل وحدات الماكرو الفرعية التتالي (في شوط واحد) أو بشكل مستقل. لتحليل البيانات الإحصائية، ووضعت برنامج نصي لمعالجة البيانات التي تم الحصول عليها تلقائياً وتطبيق اختبار إحصائية لتحديد ما إذا كان العلاج/الأنماط الجينية تتصرف تختلف اختلافاً كبيرا عن بعضها البعض (الشكل 1). وأخيراً، ثبت أن هذا الإعداد يمكن استخدامها لتقييم وقياس القدرة الحركية الشاذة نموذج المورفولوجية لترنح-توسع الشعيرات (في).
Protocol
1-البناء في مربع الفحص الجزيرة
- تحضير صينية مصنوعة من مادة قوية، مثل بولي ميثاكريلات الميثيل (البولي ميثيل ميثا اكريلات)، تحتوي على طبقة من المياه (أي حمام). التأكد من أن المواد ليست بيضاء.
ملاحظة: يوصي بإبعاد 40 × 35 × 2.5 سم 3 ( الشكل 1A). - إعداد مربع (42 38 x 25 سم x 3) مصنوعة من مادة قوية وشفافة، مثل البولي ميثيل ميثا اكريلات، توضع حول الحمام لمنع الذباب من الهروب إلى الفضاء المختبر. وضع ثقب (20 × 30 سم 2) على الجانب الأفقي التي كبيرة بما يكفي المجرب بسهولة التعامل مع قارورة مع الذباب وإفلاتها في الجزيرة ( الشكل 1A). إعداد
- منصة مرتفعة 10 × 15 × 2.5 سم 3 في البعد، مصنوعة من مادة غير منفذة (البولي ميثيل ميثا اكريلات أو البلاستيك) هو محكم.
ملاحظة: مطلوب هذا المنهاج أن يكون سطح أبيض موحدة لضمان التباين جيدة لتحليل الصور. الحجم ليست ثابتة بالضرورة، ولكن ينبغي أن يكون كبيرا بما يكفي للتأكد من أن جميع الذباب في البداية على المنهاج الأرض والحصول على فرصة للسير على ذلك ( الشكل 1A). - إصلاح المنهاج بالالتصاق في إلى الحمام أو وضع الأوزان أو غيرها من الأشياء الثقيلة داخل مربع منصة لمنع التغييرات الموضعية لمنهاج العمل خلال الدورة التجريبية/تصوير-
2. متطلبات البرامج وتركيب
- التثبيت من صورة-تسجيل البرامج.
- تحميل الصورة-تسجيل البرامج لتسجيل سلسلة صورة الجزيرة (انظر الجدول المواد) وتثبيت البرنامج على جهاز كمبيوتر.
ملاحظة: فقط تصوير-تسجيل البرامج الموصوفة في هذا البروتوكول معتمد من قبل Windows. بديل للمستخدمين الآخرين قد أضيفت إلى جدول المواد-
- تحميل الصورة-تسجيل البرامج لتسجيل سلسلة صورة الجزيرة (انظر الجدول المواد) وتثبيت البرنامج على جهاز كمبيوتر.
- " المورفولوجية "الجزيرة الإنزيم" " التثبيت الماكرو-
- تحميل " المورفولوجية "الجزيرة بالانزيم" " الماكرو وفيجي متوافق مع الإصدار 10 (1، 4 أو أعلى) من الموقع التالي: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- تحريك المؤشر إلى " المقايسة جزيرة " الدليل وانقر على " عرض. "
- انقر فوق " تحميل جميع. " سيتم تحميل محتوى المجلد كملف.zip؛ وفك ضغط الملف الذي تم تنزيله.
- نسخة " Assay.ijm الجزيرة المورفولوجية " الملف في " Fiji.app/plugins/directory. "
ملاحظة: عند بدء تشغيل فيجي، " المورفولوجية "المقايسة جزيرة" " الماكرو سوف تظهر في الجزء السفلي من القائمة المنسدلة الإضافات.
- " "تحليل الإنزيم جزيرة" " برنامج نصي للتثبيت والتحميل-
موقع
- R تحميل 11 من التالي: https://cran.rstudio.com. تثبيت على جهاز كمبيوتر. ستوديو
- "آر التحميل" من الموقع التالي: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. تثبيت على جهاز كمبيوتر.
ملاحظة: " تحليل اختبار جزيرة " يمكن تشغيل البرنامج النصي مع R فقط. ويقدم استوديو R، مع أن واجهة المستخدم أسهل، كخطوة بديلة للمستخدمين عديمي الخبرة مع ر. - تحميل " "تحليل الإنزيم جزيرة" " النصي من " المورفولوجية "الجزيرة المقايسة" " دليل على الموقع التالي: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
ملاحظة: بعد إجراء الخطوة 2-2، " "تحليل الإنزيم جزيرة" " يمكن أيضا العثور على البرنامج النصي في المجلد محلول يسمى " الجزيرة المقايسة. "
3. إعداد الذباب "فحصها" في "مقايسة الجزيرة"
- قاموا بجمع الذباب لكل حالة تجريبية تحت البرد أو التخدير ثاني أكسيد الكربون (CO 2)، كما هو موضح سابقا 13 (على مدى فترة من 1-2 أيام)-
قارورة عينة
- إعداد الحد ني 3 كل حالة تجريبية، كل منها يحتوي على حوالي 15 نظموا الذباب. استخدام فقط يطير بأجنحة سليمة، والتي هي من نفس العمر والجنس.
ملاحظة: للتجارب الموضحة هنا، عينة 5 زجاجة تحتوي على الذباب الذكور 15 من الأنماط الجينية w –؛ أكتين-Gal4/+ (مراقبة) و w –؛ أكتين-Gal4/GD11950 (تيفو [رني]) جمعت في يوم اكلوسيون، الذين تتراوح أعمارهم بين 4 أيام، واستخدمت لإجراء الفحص الجزيرة. [رني] وسلالات تحكم السائق أكتين-gal4 تم الحصول عليها من تجاري المصدر (انظر الجدول المواد)-
- إعداد الحد ني 3 كل حالة تجريبية، كل منها يحتوي على حوالي 15 نظموا الذباب. استخدام فقط يطير بأجنحة سليمة، والتي هي من نفس العمر والجنس.
- اسمحوا الذباب استرداد لتجنب آثار من المسكنات (يوم واحد على الأقل عند استخدام CO 2) قبل اختبار الذباب المجمعة في مقايسة الجزيرة في سن الاهتمام.
4-الإعداد التجريبية
ملاحظة: انظر الشكل 1B.
- إضافة الماء البارد مع كمية صغيرة من الصابون إلى علبة حمام ووضع المنصة في الوسط.
ملاحظة: الصابون يقلل التوتر السطحي للمياه؛ وسوف يغرق الذباب الذي لمس الماء. وهذا ما يمنع كميات متزايدة من الذباب تحلق في المربع أثناء التقدم للدورة التجريبية. - ضع مربع شفاف على رأس الدرج وتسليط الضوء المنصة من استخدام مصباح.
ملاحظة: الإضاءة من المنصة مطلوب أساسا لضمان تباين الفيديو الصحيح. على ضوء LED 12-V عادي المناسب لهذا- - ضع كاميرا الويب مباشرة فوق المنصة (خارج المربع) وتوصيله بالكمبيوتر-
- إنشاء مجلدات جديدة على الكمبيوتر لتخزين بيانات تجريبية مختلفة قبل التجارب.
- متابعة هيكل المثال الموضحة في الشكل 2 ألف لإنشاء المجلدات. على سبيل المثال، إذا كان يتطلب التصميم التجريبي اختبار الأنماط الجينية اثنين مع كل خمسة replicates، أولاً إنشاء مجلد رئيسية التي تحتوي على تاريخ التجربة. داخل المجلد الرئيسي, إنشاء المجلدات الفرعية اثنين (واحد لكل النمط الوراثي). داخل المجلدات الوراثي، إنشاء خمس مجلدات فرعية جديدة، واحدة لكل تكرار.
ملاحظة: لمزيد من التحليل، من الضروري أن يتم حفظ سلسلة الصورة المقابلة للتجارب الفردية في مجلدات مع أسماء فريدة من نوعها-
- متابعة هيكل المثال الموضحة في الشكل 2 ألف لإنشاء المجلدات. على سبيل المثال، إذا كان يتطلب التصميم التجريبي اختبار الأنماط الجينية اثنين مع كل خمسة replicates، أولاً إنشاء مجلد رئيسية التي تحتوي على تاريخ التجربة. داخل المجلد الرئيسي, إنشاء المجلدات الفرعية اثنين (واحد لكل النمط الوراثي). داخل المجلدات الوراثي، إنشاء خمس مجلدات فرعية جديدة، واحدة لكل تكرار.
5. الإعداد إعدادات الفيديو في " "جهاز التقاط" " قسم من الواجهة
- فتح الصورة-تسجيل البرامج، وتحت " التقاط " علامة التبويب، انقر فوق " "الوقت الفاصل بين الصور" … " وتحديد كاميرا الويب المناسبة " التقاط الجهاز. "
- ضع ذبابة ميتة في الجزيرة؛ وضبط إعدادات الفيديو عن طريق النقر على " "إعدادات الفيديو" " مربع. قم بالتمرير من خلال أشرطة الأدوات، ضبط السطوع والتباين، والألوان بطريقة أن ذبابة ميتة تظهر سوداء على خلفية بيضاء ( الشكل 2). عند إكمال التعديلات، انقر فوق " موافق. "
6. تسجيل وإعداد إعدادات حفظ الفيديو في " الوقت الفاصل بين " قسم من الواجهة
< را>ملاحظة: لا يتم استخدام ملف الفيديو للتحديد الكمي للبيانات؛ ومع ذلك، قد يكون من المفيد للحصول على فكرة عامة حول التجربة.
- في المربع ضغط، حدد " رمز IYUV إنتل " لضغط الفيديو واختر " تأخذ إطار واحد كل 0.1 ثانية، " مع " معدل إعادة اللعب (الصور في الثانية الواحدة): " في 10.
- حفظ السلسلة الزمنية التجربة كإطارات.bmp بالنقر فوق " متقدم … " حدد " إنشاء صورة.bmp لأسر كل الإطار. " انقر فوق " تصفح. " حدد نفس الدليل في " "أفي أثناء" التقاط فيلم " الإطار (كما تم اختيارها في الخطوة 6، 1)، انقر فوق " مفتوحة، " واضغط " موافق. "
ملاحظة: لاحظ أنه خلال التجربة، يتم تخزين الإطارات كملفات.bmp (اللازمة لتحليل البيانات). البرنامج أسماء الإطارات ك " A " متبوعاً رقم يطابق تسلسل التقاط الإطار (مثلاً، " A_number.bmp ") ( الشكل 2). دائماً حفظ الصور ينتمون إلى تجارب مختلفة في مجلد جديد لضمان أن لا ستتم الكتابة فوق سلسلة الصورة المسجلة سابقا. انتبه إلى أن يتم لا تلقائياً حفظ الصور في نفس المجلد مثل ملف الفيديو ما لم يتم تحديد هذا المجلد تحت " تصفح … " عند النقر " خيارات متقدمة " مربع.
7. جزيرة المقايسة وجمع البيانات
- اضغط على زر ابدأ في الوقت الفاصل بين الصورة واجهة البرنامج تسجيل الصورة لبدء التسجيل- اضغط
- القنينة تجريبية تحتوي على الذباب (الخطوة 3) 2-3 مرات التأكد من وجود الذباب في أسفل القنينة. بسرعة إزالة المكونات القنينة، ومع حركة نشطة، انقر فوق القنينة على المنصة حيث أن جميع الذباب تقع على النظام الأساسي في نفس الوقت ( الشكل 1).
- بعد ما يقرب من 30 ثانية، اضغط " وقف " الزر لإيقاف التسجيل.
ملاحظة: إذا كان الذباب جميع تختفي من المنصة، التسجيل يمكن وقفها في وقت سابق- - إزالة الذباب الذي تبقى لمدة 30 ق على منصة باليد بعد إيقاف تسجيل الصورة.
- قبل الشروع في تسجيل هذه التجربة المقبلة، تغيير الدليل الهدف لملفات.bmp وأفلام (انظر الفرع 6)-
8. تجهيز البيانات: تشغيل " المورفولوجية الجزيرة الإنزيم " الماكرو
ملاحظة: انظر الشكل 1.
- تشغيل " إنشاء مكدس والإسقاط " الماكرو الفرعي الأول لإنتاج المداخن والإسقاطات من سلسلة الصورة التي جمعت.
- ابدأ فيجي، انقر فوق " الإضافات " في شريط الأدوات، واختار " المورفولوجية "الجزيرة الإنزيم" " في القائمة المنسدلة؛ وسوف تظهر نافذة جديدة.
- أدخل " أول صورة معرف السلسلة الزمنية " الإعداد في واجهة رسومية الماكرو.
ملاحظة: يتم حفظ الإطارات الصورة المسجلة ك " A number.bmp " وفقا للترتيب الذي يتم الحصول على الصور. في " أولاً الإطار المعرف " ماكرو واجهة، والتعبئة في الإعداد مع الرقم المحدد للإطار الأول من البرنامج ومع ملحق اسم الملف. ملء " أولاً الإطار المعرف " مع "-0001.bmp، " ما يسمى الإطار الأول " A 0001.bmp " ( الشكل 2). في حالة أخرى تنسيقات الصور (مثل.tiff أو.jpeg) يتم إنشاؤها بواسطة برنامج الكاميرا، حدد ملحق اسم الملف الصحيح للصورة الأولى في " أول صورة معرف السلسلة الزمنية. " - حدد فقط " إنشاء مكدس والإسقاط " الفرعية ماكرو، انقر فوق " طيب، " وحدد الدليل الرئيسي الذي يحتوي على كافة المجلدات الفرعية مع تجارب المقايسة الجزرية الفردية.
ملاحظة: الملفات.bmp في كل فرد تجربة المجلد الذي يحتوي " أولاً الإطار المعرف " سيتم معالجتها لاحقاً. جديدتين ستظهر الملفات في كل مجلد فرعي تجربة فردية، المسماة بشكل افتراضي " Stack_image_name.tif " و " Projection_image_name.tif " ( الشكل 1). بمجرد يتم إجراء هذه الخطوة، يمكن حذف الملفات.bmp. المكدس وإسقاط ملفات.tif تحتوي على كافة البيانات وهي كافية لمزيد من التحليل.
- تشغيل " "تحديد منصة" " الماكرو الفرعي الثاني لتحديد الموقع الدقيق لمنهاج العمل.
- فتح واجهة رسومية " المورفولوجية "الجزيرة المقايسة"، " حدد فقط " منصة تعريف " خانة الاختيار، واضغط " موافق. "
- في " اختيار دليل " نافذة، حدد الدليل الرئيسي حيث المجلدات الفرعية تجريبية يتم تخزينها واضغط " حدد. "
ملاحظة: " "منصة تعريف" " الفرعي ماكرو تلقائياً بالبحث عن " Projection_image_name.tif " الملفات الموجودة في كافة المجلدات المخزنة في الدليل الرئيسي. " Projection_image_name.tif " الصور المخزنة في المجلد الأول، جنبا إلى جنب مع اثنين من النوافذ — " تعريف النظام الأساسي " و " دوروا مدير " — سيفتح. - حدد " التحديدات المضلع " أداة في شريط الأدوات لرسم تحديد الذي يطابق منبر الجزيرة-
ملاحظة: من المهم جداً لاستبعاد الشريط الحدودي من المنصة من التحديد. انظر الشكل 2D. - بعد تحديد النظام الأساسي في الصورة الأولى، اضغط على " إضافة " في " دوروا مدير " النافذة؛ وإرادة المنطقة المحددة تظهر في إطار إدارة العائد على الاستثمار كمجموعة من القيم ( الشكل 2D). الصحافة " طيب " في " تعريف النظام الأساسي " النافذة. سوف تشرع الماكرو التالي الإسقاط.
- اضغط على الأرقام ( الشكل 2D) المخزنة في " دوروا مدير " النافذة؛ وإرادة التحديد السابق ثم تظهر تلقائياً في الإسقاط الصورة الحالية.
ملاحظة: منذ الجزيرة منصة من المحتمل أن يكون نفس الحجم وفي نفس الموضع عند إجراء التجارب في صف (طالما لم تتغير موقف كاميرا ويب والجزيرة)، أنها مفيدة لتخزين دوروا تحديد النظام الأساسي في " دوروا مدير. " قبل عند القيام بذلك، المستخدم سوف توفيرا للوقت؛ في الإسقاطات المقبلة، من الضروري فقط انقر فوق التحديد المخزنة مؤقتاً في إدارة العائد على الاستثمار- - إذا كان موقف الجزيرة تحركت قليلاً بالمقارنة إلى التجربة السابقة، ضبط موضع الاختيار رهانك في مركز التحديد والسحب المساحة المحددة إلى الموضع المطلوب.
- إذا كان التحديد لا يتطابق مع المنهاج، الأيسر خارج التحديد وتحدد تشكيلة جديدة لاستخدام منصة " التحديد المضلع " أداة. تخزين التحديد الجديد في إدارة العائد على الاستثمار بواسطة النقر فوق " إضافة؛ " تشكيلة جديدة سوف تظهر في " دوروا مدير " النافذة التي يمكن استخدامها بشكل مستمر.
- عندما يتم ضبط التحديد، انقر فوق " طيب " في " تعريف النظام الأساسي " نافذة وكرر الإجراء حتى يتم تحديد كافة الأنظمة الأساسية.
ملاحظة: لاحظ أن صورة ثنائي منهاج العمل المقابلة لمنطقة دوروا مرسومة باللون الأبيض على خلفية سوداء، يدعى " Platform_image_name.tif، " يبدو لكل صورة المجهزة في المجلد الفرعي التجريبية نفس المكدس والإسقاط الصور التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.1.3 ( الشكل 1).
- تحديد الحد الأدنى لحجم ذبابة.
ملاحظة: هذا الإعداد يحدد حجم ذبابة ضئيلة في بكسل. الجسيمات التي أصغر من الحجم الأدنى المحدد سيتم استبعادها من التحليل لتجنب المغلوطة بسبب الضوضاء.- فتح رصة صور تم إنشاؤها بواسطة " إنشاء مكدس والإسقاط " الماكرو الفرعي أولاً
- تحويل المكدس الصورة إلى 8-بت عن طريق النقر فوق الصورة > > نوع > > 8 بت-
- اذهب إلى القائمة، اضغط على الصورة > > ضبط > > العتبة، تأكد من أن " خلفية داكنة " مربع محدداً، ثم اضغط " تطبيق؛ " تسمى نافذة ثانية " عتبة " سوف تظهر. انقر فوق " باكجرو الظلامund " واضغط " موافق. "
ملاحظة: سيتم إنشاء كومة صورة ثنائية التي تم تعريفها الذباب الأسود والمنصة في الأبيض. عندما ليس هذا هو الحال، ينطبق " عكس " الدالة بواسطة النقر فوق تحرير > > عكس > > تشغيل. - تعيين المقياس الكشف عن عدد وحدات البكسل بواسطة النقر فوق تحليل > > "ضبط مقياس". تطبيق الإعدادات التالية: المسافة بالبكسل = 1، تعرف المسافة = 1، نسبة العرض إلى الارتفاع بكسل = 1، ووحدة الطول = بكسل. الصحافة " موافق. "
- حدد " العصا " (تتبع) أداة في شريط الأدوات، انقر على ذبابة (نقطة سوداء) الحالية في النظام الأساسي. اضغط ctrl + m (مستخدمي ويندوز) أو cmd + m (مستخدمي Mac)؛ جديد " نتائج " النافذة سوف تشير إلى المنطقة الموقع المحدد في بكسل. هل هذا التتالي للذباب عدة وتحديد الحد الأدنى لحجم ذبابة.
ملاحظة: عند تشغيل الماكرو، تعيين " الحد الأدنى للحجم يطير " إعداد إلى أصغر حجم ذبابة الملاحظ ناقص هامش بنسبة 10%. ( الشكل 2E).
- تشغيل " التحليل " الذباب الماكرو الفرعي الثالث للتحديد الكمي للهروب من المنصة.
- الذهاب إلى شريط الأدوات، حدد " الإضافات، " واختيار " المورفولوجية الجزيرة المقايسة. "
- ضبط " الحد الأدنى للحجم يطير " الإعداد وفقا للقيمة المحددة في الخطوة 8.3.
ملاحظة: استخدام القيمة المحددة في الخطوة 8.3 فقط إذا كان الإعداد القياسي من " الحد الأدنى للحجم يطير " أسباب استبعاد ذباب التي كانت موجودة في النظام الأساسي أو إذا كان الماكرو بالكشف عن الإشارات الخلفية كالذباب. - في " عدد الذباب كل قنينة "، ملء الحد الأقصى لعدد الذباب موجودة في القنينات أثناء التجربة كاملة. على سبيل المثال، إذا كان لتجربة واحدة قارورة تحتوي على الذباب 15، والبعض الآخر يحتوي على 20 الذباب وغيرها تحتوي على 23 من الذباب " عدد الذباب كل قنينة " يجب أن تكون الإشارة إلى 23-
- حدد " تحليل " خانة الاختيار ثم اضغط " طيب؛ " جديدة " اختر دليل " سوف تظهر نافذة. حدد الدليل الرئيسي (مع كافة المجلدات الفرعية والملفات داخل) واضغط على " تحديد. "
ملاحظة: الماكرو سيتم تحليل جميع الصور المخزنة في المجلدات الفرعية طالما أنها تحتوي على " stack_image_name، " " Projection_image_name، " و " Platform_image_name " الملفات. سيتم معالجة الماكرو الصورة بعد الصورة. الناتج الكلي يتكون من كدسة الصورة نتيجة ثنائي اسمه “ result_stack_subfolder_name.tif ” ويسمى ملف نصي نتيجة " result_subfolder_name.txt، " التي تظهر في كل مجلد البيانات. الناتج ملف نصي (txt.) يحتوي على القياسات الكمية المقابلة للصورة المكدس، ويتكون من 9 أعمدة. يتم تلخيص محتوى هذه الأعمدة في الجدول 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " يناظر الصورة السلسلة الزمنية لتجربة واحدة، حيث يتم تمثيل الذباب المكتشفة أثناء التجربة كنقاط سوداء على خلفية بيضاء ( الشكل 1E). - تفتيش دقيق المكدس نتيجة لضمان حدوث لا التحف وأن الماكرو يعمل بدقة ( الشكل 2 واو)-
ملاحظة: يمكن أن تكون أمثلة للتحف عناصر الصورة التي الذباب ليس إلا أن يتم الكشف عن هذا النحو من خوارزمية تجزئة الصورة (المغلوطة). وهذا، على سبيل المثال، يمكن بسبب الكشف عن الإشارات الخلفية بسبب اختياراً غير دقيقة للعائد على الاستثمار-
9. تحليل البيانات "باستخدام" " "تحليل الإنزيم الجزيرة" "
- هيكل البيانات كما هو مبين في الشكل 2 ألف للسماح للتحليل مع " "تحليل الإنزيم جزيرة" " البرنامج النصي. إنشاء دليل الرئيسي مع المجلدات الفرعية، حيث يتوافق مع كل مجلد فرعي لشرط تجريبي واحد يتم تحليلها.
- الموجودة في المجلدات الفرعية، إنشاء المجلدات التي تحتوي على replicates التجريبية المستقلة ( الشكل 2A) وملفات results.txt التي تنتجها " المورفولوجية الجزيرة الإنزيم " الماكرو.
ملاحظة: " "تحليل الإنزيم جزيرة" " الماكرو سيقوم بمعالجة كافة الشروط التجريبية الموجود في الدليل الرئيسي في وقت واحد.
ستوديو - ابدأ R أو R. انقر فوق الملف > > "فتح ملف" … في شريط الأدوات وحدد " "تحليل الإنزيم جزيرة" " النصي
- Ggplot2 وماتريكسستاتس الحزم عند تشغيل تثبيت " "تحليل الإنزيم جزيرة" " البرنامج النصي للمرة الأولى. اكتب الأمر التالي في إطار وحدة التحكم:
> install.packages("ggplot2")، أدخل
> install.packages("matrixStats")، أدخل-
- Ggplot2 وماتريكسستاتس الحزم عند تشغيل تثبيت " "تحليل الإنزيم جزيرة" " البرنامج النصي للمرة الأولى. اكتب الأمر التالي في إطار وحدة التحكم:
- تحديد موقع الإخراج البيانات وتحليل الملفات في البرنامج النصي. إدراج في الصفوف التالية البرنامج النصي:
- 16 الصف: إدراج المسار إلى الدليل الرئيسي الذي يحتوي على التجارب إلى تحليل ومقارنة (في الشكل 2 أ، هذا هو الطريق الذي توجه إلى " "المقايسة جزيرة" " مجلد)-
- صف 19: أدخل المسار إلى المجلد حيث يتم تخزين ملفات الإخراج تحليل-
ملاحظة: يمكن أن يحتوي الدليل المشار إليه في الصف 16 فقط على المجلدات ليتم تحليلها. البرنامج النصي أيضا لا ستعمل بشكل صحيح إذا كانت المسارات إدراجها في الصف 16 والصف 19 هي نفسها-
- تشغيل البرنامج النصي بواسطة النقر فوق رمز > > "تشغيل المنطقة" > > "تشغيل الكل" من شريط الأدوات.
ملاحظة: لاحظ أن ثلاثة ملفات.csv الناتجة وملف.txt الناتج واحد ( الشكل 1E) تظهر في الدليل المحدد في صف 19. وهذه: (ط) " data_all_conditions.csv " ملف يحتوي على البيانات المجهزة المقابلة لكل حالة تجريبية و replicates التجريبية، نظمت كما هو موضح في الجدول 2. (ثانيا) " summary.csv الإحصاءات " ملف يلخص المتوسط والانحراف المعياري (SD) والخطأ المعياري للوسط (SEM) في المائة من الذباب على المنصة لكل حالة تجريبية. (ثالثا) " AUC.csv " ملف يحتوي على المنطقة الواقعة تحت المنحنى لكل تكرار التجريبية. (رابعا) اعتماداً على عدد الشروط الموجودة في المجلد الرئيسي، سيقوم البرنامج النصي أما تصدير " Welch_t-test_results.txt " الملف (شروط 2) أو " AUC_anova_results.txt " الملف (شروط أكثر من 2)، حيث نتائج الاختبار t أو يتم الإشارة إلى ANOVA مقارنة المنطقة تحت المنحنى بين الظروف التجريبية. لاحظ أن تظهر أربعة أنواع مختلفة من ملفات الصور.tiff ( الشكل 1E) في المسار المعرف في صف 19. وتسمى هذه: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (حيث يمثل Name_Of_Data_Folder المجلد الاسم المعطى من قبل المستخدم)، " AUC.tiff، " " Escape_response_all_conditions.tiff، " و " AUC_anova.tiff. " معلومات مفصلة حول مضمون هذه الرسوم البيانية ويمكن الاطلاع على نتائج هذه المخطوطة الممثل وفي الشكل 3-
Representative Results
في بروتوكول وصف، والمكتسبة المورفولوجية الجزيرة تحليل البيانات ومعالجتها في ثلاث خطوات. أولاً، استجابة الهروب الرحلة المورفولوجية ألقيت على منبر الجزيرة سجلت مع كاميرا ويب وتخزينها كصور.bmp الفردية (الأجزاء 1-7 من البروتوكول). ثانيا، الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" (الخطوة 8) عمليات الإطارات، توليد ملف نصي "result.txt" (الجدول 1)، الذي هو تلخيص عدد الكائنات التي تم الكشف عنها في كل إطار، ورصة صور "Result_stack.tiff"، مما يدل على الكائنات التي اكتشفت داخل المنطقة لمنهاج العمل في كل إطار. ثالثا، عمليات البرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة" (المادة 9 من البروتوكول) البيانات الماكرو المخزنة في ملفات "results.txt" من التجارب الفردية. وأدرجت العديد من الخطوات في البرنامج النصي لتصفية ودمج البيانات للتحليل الإحصائي. يتم الكشف عن الإطار الأول الذي يتم طرح الذباب على المنصة واعتبار الوقت النقطة 1. إطارات سابقة يتم التخلص من dataset. إطارات 100 بعد وقت النقطة 1 (الموافق 10 s) المحددة للتحليل. التجارب التي عدد الذباب الكشف على المنصة الأولى أصغر من 5 تستثني تلقائياً من التحليل، والقضاء على نتائج يمكن الاعتماد عليها من تجارب أضعفت. كما تستبعد التجارب التي يتجاوز عدد الذباب الكشف على المنصة الأولى الإعداد '' عدد الذباب كل قنينة '' بالإضافة إلى تسامح من 3. وهذا يلغي datasets الجسيمات في الضوضاء التي تم اكتشاف خطأ كالذباب. البرنامج النصي ثم يقوم بحساب النسبة المئوية للذباب الكشف عن كل نقطة مرة مقارنة بأكبر عدد من الذباب الكشف عنها في السلسلة. تصحيح الأخطاء في مجموعات البيانات الناتجة عن الذباب المشي داخل وخارج العائد على الاستثمار (الكشف عن انخفاض يتبعه زيادة في النسبة المئوية للذباب على المنصة على مر الزمن) يتم تلقائياً قبل المتعلقة بهم كهذا دائماً على المنصة في المراحل المبكرة . الجمع بين جميع مجموعات البيانات نسخ متماثل لشرط معين تجريبية التي كانت موجودة في الدليل الرئيسي وتصديرها إلى ملف "data_all_conditions.csv". وتمثل الأعمدة به المتغيرات المبينة في الجدول 2. البرنامج النصي سيتم أيضا تصدير الرسم بياني الخطي لكل حالة تجريبية، اسمه وفقا للمجلد الذي يحتوي البيانات. يوضح هذا الرسم البياني يتطابق المئة من الذباب المتبقية على المنصة على مر الزمن (رحلة الهروب استجابة) للتجريبية الموجودة في المجلد كل منها (الشكل 3 ألف-ب). يعني، والتنمية المستدامة، ووزارة شؤون المرأة لكل شرط التجريبية هي محسوبة وتلخيصها في ملف "الإحصاءات summary.csv". الرسم بياني الخطي تسمى "Escape_response_all_conditions.tiff" يظهر استجابة الهروب رحلة المتوسط ليصل إلى 12 التجريبية الشروط الموجودة في المجلد الرئيسي (الرقم 3). وأخيراً، يحسب المنطقة تحت المنحنى لجميع الظروف التجريبية الموجودة في المجلد الرئيسي وتلخيصها في الملف "AUC.csv". اعتماداً على عدد الشروط الموجودة في المجلد الرئيسي, البرنامج النصي سوف أما أداء ثنائي الطرف مزاوج ولش اختبار t (شروط 2) أو ANOVA مع تصحيح توكي لاختبار متعددة (أكثر من 2 شروط) لتحديد ما إذا كانت التجريبية الظروف تختلف كثيرا عن بعضها البعض. يتم تلخيص هذه النتائج في "Welch_t-test_results.txt" أو "AUC_anova_results.txt." البرنامج النصي عند أداء ANOVA، سيتم أيضا تصدير ملف "AUC_anova.tiff" الذي يعرض الفرق في يعني أوك وفواصل الثقة 95% من الشروط التجريبية التي يتم مقارنتها. يتم عرض القيم المطلقة المشمول بمنحنى replicates التجريبية لجميع الظروف التجريبية كنقاط بيانات فردية مع الوساطات في "AUC.tiff" (3D الشكل).
رنح "توسع الشعيرات" (AT) اضطراب حركة جسمية مقهورة تتميز ببداية مبكرة لترنح الدماغ بسبب الطفرات في الجينات "رنح توسع الشعريات تحور" (ATM)14. عرض طفرات أورثولوجوي المورفولوجية ل أجهزة الصراف الآلي، تفو، عيوب في التنقل وطول العمر15. تقييم الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة"، تم اختبار نموذج المورفولوجية لدى في مقايسة الجزيرة، وإخراج البيانات الماكرو تمت مقارنته بإعداد البيانات يدوياً. وتبين النتائج أن كل مكان تفو ضربة قاضية (w–؛ Actin-Gal4/GD11950) يقلل بشكل ملحوظ قدرة هذه الذباب على مغادرة منصة مقارنة بضوابطها الخلفية الوراثية (w–؛ Actin-Gal4/+) (4 الرقم). بعد 1 s، هرب 50% الذباب التحكم منهاج العمل، خلافا < % 1 من تفو-[رني] الذباب. الأهم من ذلك، تتكرر البيانات المتحصل عليها مع الماكرو إخلاص البيانات المتحصل عليها من دليل العد، مما يشير إلى أن الماكرو هو أداة موثوقة يمكن استخدامها للتقدير الكمي للجزيرة تحليل البيانات وتقييم العيوب حركة ( الشكل 4 أ-ب).
رقم 1: مخطط انسيابي تحدد الشروط والإجراءات التجريبية، وتحليل للمقايسة الجزيرة- جزيرة (أ) الاعتداء على المعدات. (ب) الإعداد التجريبية للمقايسة الجزيرة. (ج) جزيرة الاعتداء. (د) تجهيز البيانات المقايسة الجزيرة مع الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة". الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" يتكون من وحدات الماكرو الفرعية 3: 1) جعل المكدس والإسقاط، 2) تعريف النظام الأساسي، و 3) تحليل. (ﻫ) تجهيز وتقييم إحصائي للبيانات باستخدام البرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أمثلة على مختلف التعديلات المطلوبة خلال البروتوكول. (أ) مطلوب بنية الدليل في الجزيرة التي يجب أن يتم تخزين التجارب المقايسة لمعالجة البيانات وتحليلها. (ب) عند ضبط إعدادات الفيديو، يجب أن يظهر الذباب الأسود على خلفية بيضاء. (ج) صورة الإطار إخراج الملفاتكما أنقذت الصورة-تسجيل البرامج الموصوفة في هذه المخطوطة. (د) الأصفر مخطط يظهر تحديد النظام الأساسي. يتم تمييز التحديد منصة المخزنة في "إدارة العائد على الاستثمار" باللون الأزرق. الذباب (ه) يتم تمثيلها كالنقاط البيضاء أثناء تعديل "تحديد الحد الأدنى للحجم يطير". ويبين الإطار نتائج منطقة الذباب بالبكسل. (و) مثال لإطار صورة مسجل واحد (على اليسار) والإطار المقابل في المكدس الصورة الناتجة والتي تم الحصول عليها مع الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" (على اليمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الحصول على صور النتيجة بعد معالجة البيانات مع برنامج "تحليل الإنزيم الجزيرة" (أ) خط التحكم الرسم البياني عرض استجابة الهروب الطيران لكل تكرار التجريبية. (ب) خط الرسم البياني عرض استجابة الهروب الطيران لكل تكرار التجريبية [رني] تفو. (ج) متوسط رحلة الهروب استجابة للظروف التجريبية المشار إليها؛ أشرطة الخطأ تمثل قطع دوت sem. (د) يمثل المنطقة تحت منحنى توزيع للتحكم وظروف متحولة. يتم عرض replicates التجريبية لكل الشروط [رني] ومراقبة تفو كنقاط بيانات فردية (بالأسود) مع الوساطات (الخط الأحمر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: إظهار الذباب في كل مكان تفو ضربة قاضية تناقص إلى حد كبير قدرة على مغادرة المنصة. البيانات تمثل النسبة المئوية من الذباب على المنصة على مر الزمن (s) لعنصر التحكم (w–؛ Actin-Gal4/+) وتفو [رني] (w–؛ Actin-Gal4/GD11950) الذباب. (عدد replicates = 5؛ وتمثل مجالات الخطأ ووزارة شؤون المرأة). (أ) البيانات الخام الحصول عليها مع الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة". يرسم النقطة (ب) تمثل المنطقة تحت منحنى توزيع للظروف [رني] تحكم وتفو الحصول عليها مع الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" (مزاوج ولش اختبار t، * * ف < 0.01). (ج) البيانات الأولية التي تم الحصول عليها عن طريق العد يدوياً عدد الذباب الحالية في الجزيرة في الثانية الواحدة. يرسم النقطة (د) يمثل المنطقة تحت منحنى توزيع للتحكم وظروف تفو [رني] التي تم الحصول عليها عن طريق العد يد (ولش مزاوج اختبار t، * * ف < 0.01). أشرطة الخطأ تمثل sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم العمود | الوصف | ||
| شريحة | اسم الإطار. | ||
| العد | عدد الكائنات التي تم الكشف عنها في الإطار في حدود النظام الأساسي (ROI). | ||
| إجمالي المساحة | المساحة الإجمالية للكائنات التي اكتشفت في الإطار في حدود النظام الأساسي (ROI) بالبكسل. | ||
| حجم متوسط | المساحة الإجمالية للكائنات اكتشفت في الإطار مقسوماً على عدد الكائنات في حدود النظام الأساسي (ROI). | ||
| % مساحة | النسبة المئوية للمساحة التي تشغلها الكائنات فيما يتعلق بالمساحة الكلية للنظام الأساسي (ROI). | ||
| ميون. | إجمالي محيط الكائنات الكشف عنها في الإطار في حدود النظام الأساسي (ROI) بالبكسل. | ||
| أدنى حجم ذبابة | الحد الأدنى يطير حجم الإعداد التي يحددها المستخدم في واجهة رسومية الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" (بالبكسل). | ||
| المنطقة عائد الاستثمار | تحديد المنطقة من النظام الأساسي (ROI) التي تم تعريفها من قبل المستخدم أثناء تشغيل الماكرو الفرعية منصة (بالبكسل). | ||
| عدد الذباب | عدد الذباب المستخدمة لكل التجربة التي يحددها المستخدم في واجهة رسومية الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة". | ||
الجدول 1: معلمات تقاس الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة". سوف تظهر المعلمات الموصوفة في هذا الجدول في ملف "results.txt" عند تشغيل الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة".
| اسم العمود | الوصف | ||
| شريحة | رقم الإطار. | ||
| العد | عدد الذباب الكشف عنها في الإطار في حدود النظام الأساسي (ROI). | ||
| X.Area | المساحة الإجمالية للذباب الكشف عنها في الإطار في حدود النظام الأساسي (ROI) بالبكسل. | ||
| أدنى حجم ذبابة | الحد الأدنى يطير حجم إدخال الإعداد التي يحددها المستخدم في واجهة رسومية الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" (بالبكسل). | ||
| المنطقة عائد الاستثمار | فيما يتعلق بالمنهاج (ROI، بالبكسل) تعريفها من قبل المستخدم عند تشغيل الماكرو الفرعية "تحديد النظام الأساسي". | ||
| عدد الذباب | عدد الذباب المستخدمة لكل التجربة التي يحددها المستخدم في واجهة رسومية الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة". | ||
| X.Count | % يطير على هذا المنهاج في كل الشريحة/الإطار بالنسبة لأكبر عدد من الذباب كشف على المنصة أثناء التجربة. | ||
| تيميبوينت | الوقت النقطة 1 يمثل الإطار الأول تحليل ويناظر الإطار حيث الذباب تظهر أولاً على المنصة. وهناك ما مجموعة 100 لقطة في تكرار تحليل (الموافق 10 ق، عند استخدام الإعدادات الموصوفة. | ||
| تجربة | عدد replicates كل حالة. | ||
| الشرط | يشير إلى اسم الشرط التجريبي (وفقا لاسم المجلد الذي يحتوي البيانات المعرفة من قبل المستخدم). | ||
الجدول 2: وصف للمتغيرات التي حصلت بعد معالجة البيانات مع برنامج "تحليل الإنزيم الجزيرة" تظهر المعلمات الموصوفة في هذا الجدول في ملف "data_all_conditions.csv" عند معالجة البيانات مع البرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة".
Discussion
ويصف هذا البروتوكول الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" الذي يقيم كمياً المورفولوجية السلوك الحركي أثناء الفحص الجزيرة. دقة حساب الماكرو الذباب على المنصة على مر الزمن، مما يجعل المقايسة الجزيرة حساسة للغاية ومناسبة للتقييم الكمي الفائق لعيوب الحركي. تسمح المنهجية لمقارنة أي شرط، مع الذباب نمت تحت ظروف مختلفة الوراثية و/أو البيئية، بما في ذلك التعرض للمخدرات. قراءات هذا مفيدة بشكل خاص كأداة اكتشاف وهكذا عند أداء شاشات الجينية أو صيدلانية كبيرة، عند دراسة نماذج المورفولوجية لاضطرابات الحركة وغيرها من الأمراض العصبية، أو عند دراسة الحركة أو الطيران السلوك.
وينص البروتوكول المقايسة الجزيرة المعروضة في هذه المخطوطة مزايا أكثر الأساليب القائمة البديلة. على سبيل المثال، الحركة تتبع الفيديو وقتاً أكثر بكثير وأقل ملاءمة لاختبار العينات ذات الأحجام الكبيرة. تحليل الجزيرة هو أداة فرز الفائق، وفي هذا المعني، فهي مماثلة ل الفحص السريع جيوتاكسيس السلبية التفاعلية (RING)16. الفرق بين الاثنين أن فحوصات الجزيرة يسمح للكشف عن مجموعة أوسع نطاقا من المشاكل الحركية؛ عدم قدرة الذباب على مغادرة المنصة يمكن أن يكون سببها عيوب في الرحلة، القفز، أو المشي السلوك الناجم عن الجناح (العضلات/العصبية) و/أو الساق (عضلة/العصبية) العيوب. من ناحية أخرى، يقيم المقايسة خاتم العيوب في التسلق أو المشي السلوك الناجم عن عيوب الساق (عضلة/الخلايا العصبية). في حالة المستخدمين المهتمين في قراءات السلوكية متعددة، يمكن دمج المقايسة الجزيرة أيضا بسهولة مع فحوصات أخرى، مثل التحليل الدائري. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة تثبيت الليزر اللازمة أوبتوجينيتيكس في مربع الفحص الجزيرة، والإعداد بسيطة جداً ويمكن نقلها بسهولة إلى غرفة حيث يمكن التحكم في درجة الحرارة والضوء.
لضمان النجاح وإمكانية تكرار نتائج للمقايسة الجزيرة الموصوفة هنا، ينبغي أن يتبع عدة توصيات. قاسمة ونقل زجاجة الذباب للاختبار التجريبي في أقل من يوم واحد قبل التجربة لتجنب آثار التخدير CO2 أو الباردة. لا أوفيركروود قارورة التجريبية (استخدام 10-15 الذباب كل قنينة؛ فمن الأفضل دائماً وضع نفس عدد الذباب كل قنينة). يبقى الذباب على المواد الغذائية الطازجة في جميع الأوقات. أن لم يكن بعد معتاداً على القيام التحليل، رمي الممارسة الذباب إلى ساحة لتعظيم العائد. الممارسة أيضا تراجعه بسرعة من ناحية اليمين بعد ذلك، كما أنها تتعارض مع تحليل البيانات (تحليل الصور ويطير العد ابدأ إلا بعد اليد خارج الصورة). الحفاظ على الظروف البيئية والتجريبية متطابقة في التجارب التي تحتاج إلى أن تكون المقارنة (مثلاً الضوابط مقابل طفرات أو التركيب وراثي اختبارها في مختلف الإعمار). دائماً إجراء التجارب في نفس الوقت من اليوم، والحفاظ على القنينات في ظل ظروف الرطوبة ودرجات الحرارة التي تسيطر عليها. للسلطة الإحصائية، اختبار replicates التقنية على الأقل ثلاثة كل تكرار البيولوجية.
لضمان نجاح أداء الماكرو هو موضح هنا، يجب تعديل إعدادات كاميرا الويب والصور لتحقيق التباين القصوى: الذباب الظهور كالكائنات السوداء على منصة بيضاء. عندما لا يتم حساب عدد الذباب صحيح الماكرو، قم بضبط إعدادات التباين وتحقق ما إذا تم تحديد العائد على الاستثمار بشكل صحيح، والتأكد من أن حجم الذباب على المنصة أعلى من الحد الأدنى المحدد يطير إعداد حجم (راجع الخطوة 8.3 من هذا البروتوكول). الإعدادات فقط تحتاج إلى تعريف مرة واحدة. فتنطبق على جميع التجارب، طالما لم يتم تغيير المسافة بين الكاميرا ومنهاج العمل. Circularity_min وإعدادات ماكس تعريف تدوير الجسيمات (الجسيمات = الذباب معدود) التي ستؤخذ في الاعتبار للتحليل (الذباب = الكائنات التي تم جردها). 1 يمثل دائرة كاملة، ويمثل 0 سطر17. منذ الذباب يقدم دائماً على درجة معينة من التدوير (ذبابة لا يمكن أن تظهر كخط مستقيم)، يتم تعيين إعداد "Circularity_max" في 1 ويتم تعيين إعداد "Circularity_min" في 0.4. من غير المحتمل أن يحتاج المستخدم لضبط هذه الإعدادات.
الماكرو أحياناً يخطئ العد عندما يطير يقع بالقرب من الحدود لمنهاج العمل. يمكن أن يحدث هذا إذا كان لا يطير الذباب لكن سيرا على الأقدام وخارجها دوروا المعرفة من قبل المستخدم. وفي معظم الحالات، يمكن إعادة تحديد العائد على الاستثمار (تركيب أنه قدر الإمكان إلى المنصة) بسهولة حل هذه المسألة. مع ذلك، البرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة" قادراً على الكشف عن والتهم البيانات غير السليم الصحيح الناجم عن الذباب المشي وخارجها دوروا جيدا نسبيا. على الرغم من أن القرار من كاميرا ويب المعروضة هنا عالية بما فيه الكفاية لتميز الذباب على مقربة من جيد إلى حد ما، قمنا بتنفيذ خوارزميات إضافية في إجراء معالجة الصورة الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة"، مثل مستجمعات المياه وتآكل الدالة17. هذه تسهيل ترسيم السليم من الذباب الموجودة على مقربة من على المنصة. بالإضافة إلى ذلك، الماكرو غير قادر على التمييز بين الذباب الذي قفز من المنصة أو طار بعيداً عن ذلك. ومع ذلك، لوحظ عموما أن سلالات يطير الشباب صحية يطير بعيداً فورا عندما أسقطت على منهاج العمل، بينما كبار الذباب والذباب مع العجز الحركي البقاء لفترة أطول في منهاج العمل وسيتم الانتقال في نهاية المطاف أو تقع قبالة المنصة. وعلى الرغم من هذه القيود، تقديم الفحص والتحليل مقياس دقيق جداً للسلوك الحركي.
لضمان الأداء الناجح للبرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة"، المستخدم لديه للتأكد من إدخال المسارات الصحيحة لملفات الإدخال والإخراج في البرنامج النصي الصفوف المشار إليها في البروتوكول وتقديم البيانات في تنسيق المجلد الصحيح (كما هو موضح في الشكل 2). إذا كان المستخدم يجد المعايير المستخدمة لتصفية البيانات التجريبية يمكن الاعتماد عليها صارمة جداً (صف 68: القيمة الأولى في العمود "حساب" أقل من أو يساوي إلى 5؛ صف 71: القيمة الأولى في العمود "العد" أعلى من إجمالي عدد الذباب ألقيت على بلاتفو rm + 3)، إيقاف هذه إعدادات عامل التصفية عن طريق إضافة # أمام النص في صفوف 68 و 71 في البرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة". وفي هذه الحالة، ستدرج جميع مجموعات البيانات في التحليل. وبدلاً من ذلك، يمكن تغيير إعدادات عامل التصفية عن طريق تعديل القيم الموجودة في الصفوف 68 و 71 وفقا لاحتياجات المستخدم. ويمكن أيضا تعديل التحف الممكنة في حساب عدد القيم في "results.txt" إنشاؤها بواسطة الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" يدوياً، ويمكن إعادة تشغيل البرنامج النصي على البيانات المعدلة. عندما يهتم المستخدم بتجهيز أكثر من 10 إطارا في الثانية، أو أكثر من 10 s للبيانات، ينبغي أن عدد الإطارات التي تم معالجتها بواسطة البرنامج النصي "تحليل الإنزيم الجزيرة"تعديل. يمكن أيضا استبدال التحليل الإحصائي ببدائل المعرفة من قبل المستخدم.
يمكن العثور على مجلد يسمى "أمثلة على جزيرة المقايسة،" التي تحتوي على أمثلة مع صورة السلسلة الزمنية التي تم الحصول عليها باستخدام مقايسة الجزيرة، على الموقع التالي: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. تحميل مجلد "أمثلة على جزيرة المقايسة" واتبع الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول يصبح اطلعت بسرعة مع بنية تخزين الملفات، معالجة الصور مع الماكرو "جزيرة المورفولوجية المقايسة"، و "تحليل الإنزيم الجزيرة" البرنامج النصي.
يمكن استخدام التحليل الجزيرة، بالاقتران مع الماكرو المتقدمة والتحليل النصي، لتقييم وقياس السلوك المنحرف حركة نموذج المورفولوجية لتوسع الشعريات ترنح. حيث يمكن تطبيق الفحص كفاءة لمختلف الإعمار، أنها مناسبة تماما لتحليل طبيعة تقدمية يحتمل أن تعمل.
وخلاصة القول، مقايسة الجزيرة، بالاقتران مع الماكرو "المورفولوجية الجزيرة المقايسة" والبرنامج النصي "جزيرة المقايسة التحليل"، مقايسة فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها وذات كفاءة عالية لتحليل موضوعي وقياس العيوب الحركي من المورفولوجية نماذج اضطرابات الحركة بطريقة الفائق.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
نعترف بمركز الموارد المورفولوجية فيينا ومركز الأسهم بلومينغتون المورفولوجية (P40OD018537 المعاهد الوطنية للصحة) لتوفير سلالات المورفولوجية . ونحن ممتنون للمختبر Klämbt على تقديمه لنا للمقايسة الجزيرة ومارتن ايدهوف لبناء إعداد المقايسة الجزيرة. هذه الدراسة كانت في جزء تدعمها "الدعوة عبر الوطنية المشتركة" ه-نادرة-3 منح "إعداد العلاجات أتاكسياس مقهورة جسمية" تحضير (جمعية البحث العلمي الهولندية 9003037604)، بمنحه أعلى (912-12-109) من "منظمة هولندا" للبحث العلمي (NWO)، وعن طريق زمالتين DCN/رادبود في "الجامعة الطبية مركز الدكتوراه". وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).
