Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Drosophila द्वीप परख में हरकत व्यवहार के उच्च प्रवाह विश्लेषण

Published: November 5, 2017 doi: 10.3791/55892
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, *1, *1
1Department of Human Genetics, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center, 2Centre for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 3Department of Neurology, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

द्वीप परख एक अपेक्षाकृत नए, लागत प्रभावी परख कि Drosophila melanogasterके बुनियादी हरकत व्यवहार का मूल्यांकन किया जा सकता है । इस पांडुलिपि स्वचालित डेटा प्रसंस्करण और द्वीप परख डेटा के उद्देश्य ठहराव के लिए एल्गोरिदम का वर्णन, इस परख एक संवेदनशील, उच्च बड़े आनुवंशिक या औषधीय स्क्रीन के लिए readout का प्रवाह बना ।

Abstract

अगली पीढ़ी के sequencing प्रौद्योगिकियों में अग्रिमों एक बढ़ती हुई गति में आंदोलन विकारों और अन्य स्नायविक रोगों के लिए (उंमीदवार) रोग जीन की पहचान करने के लिए योगदान करते हैं । हालांकि, थोड़ा आणविक तंत्र है कि इन विकारों आबाद के बारे में जाना जाता है । आनुवंशिक, आणविक, और Drosophila melanogaster के व्यवहार toolbox इस मॉडल विशेष रूप से एक उच्च प्रवाह तरीके से नए रोग जीन और तंत्र की विशेषताएं उपयोगी जीव बनाता है । फिर भी, उच्च प्रवाह स्क्रीन कुशल और विश्वसनीय परख कि, आदर्श रूप में, लागत प्रभावी है और इन विकारों के लिए प्रासंगिक लक्षण की स्वचालित ठहराव के लिए अनुमति की आवश्यकता है । द्वीप परख एक लागत प्रभावी और आसानी से स्थापित करने के लिए Drosophila हरकत व्यवहार का मूल्यांकन विधि है । इस परख में, मक्खियों एक निश्चित ऊंचाई से एक मंच पर फेंक दिया जाता है । यह सेकंड के भीतर मंच से बचने के लिए मक्खियों को सक्षम बनाता है कि एक सहज मोटर प्रतिक्रिया लाती है । वर्तमान में, फिल्माया द्वीप परख के मात्रात्मक विश्लेषण मैंयुअल रूप से किया है, जो एक श्रमसाध्य उपक्रम है, खासकर जब बड़ी स्क्रीन प्रदर्शन कर रहे हैं ।

इस पांडुलिपि का वर्णन "Drosophila द्वीप परख" और "द्वीप परख विश्लेषण" उच्च प्रवाह, स्वचालित डेटा प्रसंस्करण और द्वीप परख डेटा के ठहराव के लिए एल्गोरिदम । सेटअप में, एक साधारण webcam एक लैपटॉप से जुड़ा मंच के एक छवि श्रृंखला इकट्ठा जबकि परख की जाती है । "Drosophila द्वीप परख" मुक्त स्रोत सॉफ्टवेयर फिजी के लिए विकसित एल्गोरिथ्म इन छवि श्रृंखला और quantifies प्रक्रियाओं, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए, समय के साथ मंच पर मक्खियों की संख्या । "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट, नि: शुल्क सॉफ्टवेयर आर के साथ संगत, स्वचालित रूप से प्राप्त डेटा प्रक्रिया और गणना करने के लिए विकसित किया गया था कि उपचार/पादी सांख्यिकीय रूप से अलग हैं । यह बहुत द्वीप परख की क्षमता में सुधार और यह बुनियादी गतिवान और उड़ान व्यवहार के लिए एक शक्तिशाली readout बनाता है । यह इस प्रकार बड़ी मक्खी हरकत क्षमता, आंदोलन विकारों के Drosophila मॉडल, और नशीली दवाओं की प्रभावकारिता की जांच स्क्रीन पर लागू किया जा सकता है ।

Introduction

हाल के वर्षों में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में अग्रिम बहुत मस्तिष्क की अपक्षयी आंदोलन विकारों अंतर्निहित जीन की पहचान के लिए योगदान दिया है (जैसे, अनुमस्तिष्क गतिभंग और पार्किंसंस), परिधीय न्यूरॉन्स की मूल (जैसे, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस और वंशानुगत स्पास्टिक paraplegia), और पेशी मूल के (जैसे, Duchenne पेशी dystrophy और myotonic dystrophy)1,2,3,4 . इस के बावजूद, थोड़ा आणविक तंत्र है कि इन विकारों के सबसे आबाद के बारे में जाना जाता है । इन तंत्रों की बेहतर समझ के लिए उपचारों का विकास आवश्यक है.

मनुष्य के रूप में, मॉडल जीवों में आंदोलन, जैसे उड़ान और गतिवान Drosophilaमें, केंद्रीय मस्तिष्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है, परिधीय तंत्रिका तंत्र, और मांसपेशियों. इसके अलावा, तेज पीढ़ी के समय और Drosophila के आनुवंशिक toolbox इस मॉडल जीव आंदोलन विकारों में शामिल जीन के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाने के लिए और दवा परीक्षण के लिए5,6 . कारण शर्तों की पर्याप्त संख्या है कि इस तरह की स्क्रीन, विश्वसनीय, लागत प्रभावी, और रिश्तेदार सरल परख, साथ ही उपकरण में परीक्षण किया जा करने के लिए एक स्वचालित तरीके से उत्पादन परिणामों को बढ़ाता है, अत्यधिक वांछनीय है की जरूरत है ।

श्मिट एट अल । (२०१२) 7 वर्णित एक कम लागत परीक्षण "द्वीप परख" के लिए Drosophila हरकत व्यवहार का मूल्यांकन कहा जाता है । द्वीप परख सफलतापूर्वक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है glia के साथ जीन की पहचान विशेष कार्य7, बौद्धिक विकलांगता के Drosophila मॉडल के मूल्यांकन में8, और के सामांय मूल्यांकन के लिए मक्खी मोटर व्यवहार9. द्वीप परख के सिद्धांत डिजाइन एक ऊंचा मंच है जिस पर कई मक्खियों फेंक रहे है के होते हैं । यह एक सहज मोटर व्यवहार है कि स्वस्थ मक्खियों सेकंड के भीतर मंच से बचने के लिए सक्षम बनाता है लाती है । परख समय7,8,9पर मंच पर शेष मक्खियों की संख्या के उपाय । इन सभी सुविधाओं का संकेत है कि द्वीप परख आंदोलन विकारों में शामिल जीन के लिए एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण हो सकता है ।

वर्तमान में, फिल्माया द्वीप परख डेटा का मात्रात्मक विश्लेषण मैंयुअल रूप से किया जाता है7,8,9। परख की दक्षता में सुधार करने के लिए, एक कम लागत विधि अर्द्ध करने के लिए विकसित किया गया था स्वचालित रूप से मंच से मक्खियों के भागने यों तो । सेटअप एक साधारण एक लैपटॉप के लिए मंच की छवि समय श्रृंखला इकट्ठा करने के लिए, फ्रेम के साथ हर ०.१ एस फ्रेम हासिल की है वेब कैमरा का उपयोग करता है तो "Drosophila द्वीप परख" स्थूल के साथ कार्रवाई कर रहे है कि मंच पर मक्खियों की संख्या quantifies समय. "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो तीन स्वतंत्र उप-मैक्रोज़ में विभाजित है: (I) "स्टैक और प्रोजेक्शन बनाएं", उप-मैक्रो अलग अलग सबफ़ोल्डर में संग्रहीत विभिंन द्वीप प्रयोगों की पहचान करता है और एक स्टैक बनाता है और प्रत्येक के एक प्रक्षेपण समय श्रृंखला । (II) "प्लेटफ़ॉर्म परिभाषित करें" उप-मैक्रो लगातार सभी "Projection_image_name. tif" फ़ाइलें व्यक्तिगत प्रयोगात्मक सबफ़ोल्डर्स, पर जो बिंदु पर उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से ब्याज के क्षेत्र (ROI) के रूप में द्वीप प्लेटफ़ॉर्म को परिभाषित करने के लिए अनुरोध किया गया है में स्थित खोल देगा । (III) "विश्लेषण" स्वचालित रूप से समय श्रृंखला के दौरान मंच पर शेष मक्खियों की संख्या quantifies । उप-मैक्रोज़ लगातार (एक रन में) या स्वतंत्र रूप से चलाया जा सकता है । सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण के लिए, एक स्क्रिप्ट के लिए स्वचालित रूप से प्राप्त डेटा प्रक्रिया और एक सांख्यिकीय परीक्षण लागू करने के लिए निर्धारित है कि उपचार/पादी एक दूसरे से काफी अलग व्यवहार विकसित किया गया था (चित्र 1) । अंत में, यह प्रदर्शित किया जाता है कि इस सेटअप का मूल्यांकन और गतिभंग-telangiectasia (पर) के लिए एक Drosophila मॉडल की ंयायपालिका हरकत क्षमता को बढ़ाता है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. द्वीप की परख बॉक्स का निर्माण

  1. एक मजबूत सामग्री, जैसे पॉली मिथाइल methacrylate & #160;(P एमएमए) की बनाई गई ट्रे तैयार करें, जिसमें पानी की एक परत ( यानी & #160; बाथ) हो । सुनिश्चित करें कि सामग्री सफेद नहीं है ।
    नोट: आयाम ४० x ३५ x २.५ सेमी 3 (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 1a ) अनुशंसित हैं.
  2. एक बॉक्स तैयार (४२ x ३८ x 25 सेमी 3 ) पीएमएमए के रूप में एक मजबूत, पारदर्शी सामग्री से बना है, के लिए प्रयोगशाला अंतरिक्ष में भागने से मक्खियों को रोकने के लिए स्नान के आसपास रखा जाएगा । एक छेद (20 x 30 सेमी 2 ) पार्श्व ओर है कि आसानी से मक्खियों के साथ शीशियों संभाल और उन्हें द्वीप पर ड्रॉप करने के लिए काफी बड़ा है पर प्लेस (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
  3. एक ऊंचा मंच तैयार 10 x 15 x २.५ सेमी 3 आयाम में, एक अभेद्य सामग्री (पीएमएमए या प्लास्टिक) कि निर्विवाद है से बना है ।
    नोट: इस मंच के लिए एक समान सफेद सतह के लिए छवि विश्लेषण के लिए अच्छा विपरीत सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । आकार जरूरी नहीं है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए कि सभी मक्खियों को शुरू में मंच पर देश और उस पर चलने का मौका मिलता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
  4. या तो यह स्नान करने के लिए या मंच बॉक्स के अंदर वजन या अंय भारी वस्तुओं रखने के लिए gluing द्वारा मंच तय प्रायोगिक सत्र के दौरान मंच के स्थान परिवर्तन को रोकने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 2. सॉफ्टवेयर आवश्यकताओं और अधिष्ठापन

  1. स्थापना की छवि रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर.
    1. डाउनलोड छवि-रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वीप छवि श्रृंखला रिकॉर्ड करने के लिए ( सामग्री तालिका देखें) और एक कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर स्थापित करें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित इमेजिंग-रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर केवल Windows द्वारा समर्थित है । अंय उपयोगकर्ताओं के लिए एक विकल्प सामग्री तालिका .
      2. करने के लिए जोड़ा गया है
  2. & #34; Drosophila Island परख & #34; स्थूल स्थापना.
    1. डाउनलोड & #34;D rosophila द्वीप परख & #34; मैक्रो और संगत फिजी < सुप वर्ग = "xref" > 10 संस्करण (१.४ या उच्चतर) निम्न वेबसाइट से: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
    2. कर्सर ले जाने के लिए & #34; द्वीप परख & #34; निर्देशिका और & #34 पर क्लिक करें; दृ. & #34;
    3. पर क्लिक करें & #34;D ownload सभी. & #34; & #160; फ़ोल्डर सामग्री. zip फ़ाइल के रूप में डाउनलोड की जाएगी; डाउनलोड की गई फ़ाइल खोलना ।
    4. कॉपी द & #34; Drosophila द्वीप परख. ijm & #34; file in & #34; फिजी. app/प्लगइंस/& #34;
      नोट: फिजी शुरू करते समय, & #34;D rosophila Island परख & #34; मैक्रो प्लगइंस ड्रॉपडाउन मेनू के नीचे दिखाई देगा ।
  3. & #34; द्वीप परख विश्लेषण & #34; स्क्रिप्ट स्थापना और डाउनलोड.
    1. Download R < सुप class = "xref" > 11 निम्न वेबसाइट से: https://cran.rstudio.com. इसे किसी कंप्यूटर पर स्थापित करें ।
    2. निंन वेबसाइट से आर स्टूडियो डाउनलोड करें: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/। इसे किसी कंप्यूटर पर स्थापित करें ।
      नोट: द & #34; आइलैंड टेस्ट एनालिसिस & #34; स्क्रिप्ट को केवल R के साथ चलाया जा सकता है । आर स्टूडियो, अपने आसान उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ, आर
      3. के साथ अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए वैकल्पिक कदम के रूप में प्रस्तुत किया है
    3. डाउनलोड & #34; Island परख Analysis & #34; स्क्रिप्ट से & #34; Drosophila Island परख & #34; निंन वेबसाइट पर निर्देशिका: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      नोट: २.२ चरण निष्पादित करने के बाद, & #34; द्वीप परख विश्लेषण & #34; स्क्रिप्ट को भी अनज़िप्ड फ़ोल्डर में पाया जा सकता है जिसे & #34; द्वीप परख सकते हैं । & #34;
< p class = "jove_title" > 3. मक्खियों की तैयारी के लिए द्वीप में परीक्षण किया परख

  1. ठंडा या कार्बन डाइऑक्साइड (CO 2 ) संज्ञाहरण के तहत प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए स्टेज्ड मक्खियों इकट्ठा, के रूप में पहले वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > 13 (की अवधि खत्म 1-2 दिन).
    1. प्रायोगिक शर्त प्रति 3 नमूना शीशियों की एक ंयूनतम तैयार, प्रत्येक लगभग 15 मंचन मक्खियों से युक्त । केवल बरकरार पंखों के साथ मक्खियों का उपयोग करें और है कि इसी तरह की उंर और लिंग के हैं ।
      नोट: यहां वर्णित प्रयोगों के लिए, पादी w - के 15 नर मक्खियों से युक्त 5 नमूना शीशियों; Actin-Gal4/+ (control) व w -; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) eclosion के दिन, 4 दिनों के लिए वृद्ध पर एकत्र थे, और द्वीप परख प्रदर्शन करते थे । RNAi, नियंत्रण उपभेदों, और Actin-gal4 चालक एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया ( सामग्री तालिका देखें) ।
  2. चलो मक्खियों निश्चेतक से प्रभाव से बचने के लिए ठीक हो (कम 1 दिन जब सह 2 का उपयोग कर) ब्याज की उंर में द्वीप परख में एकत्र मक्खियों परीक्षण से पहले ।
< p class = "jove_title" > 4. प्रायोगिक सेटअप

< p class = "jove_content" > NOTE: < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b .

  1. स्नान ट्रे को साबुन की एक छोटी राशि के साथ ठंडा पानी जोड़ें और बीच में मंच की स्थिति ।
    नोट: साबुन पानी की सतह तनाव कम हो जाती है; मक्खियों कि पानी को छूने डूब जाएगा । यह प्रयोगात्मक सत्र की प्रगति के दौरान बॉक्स में उड़ान मक्खियों की मात्रा में वृद्धि को रोकता है ।
  2. ट्रे के शीर्ष पर पारदर्शी बॉक्स जगह और एक चिराग का उपयोग कर ऊपर से मंच रोशन ।
    नोट: मंच की रोशनी मुख्य रूप से उचित वीडियो कंट्रास्ट सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । एक साधारण 12 वी एलईडी प्रकाश इस के लिए उपयुक्त है ।
  3. सीधे मंच (बॉक्स के बाहर) के ऊपर वेब कैमरा की स्थिति और यह एक कंप्यूटर से कनेक्ट ।
  4. विभिन्न प्रयोगात्मक डेटा को प्रयोगों से पहले संग्रहीत करने के लिए कंप्यूटर पर नए फ़ोल्डर बनाएँ ।
    1. फ़ोल्डर बनाने के लिए < सुदृढ वर्ग = "xfig" > आरेख 2a में सचित्र उदाहरण की संरचना का अनुसरण करें. उदाहरण के लिए, यदि प्रायोगिक डिजाइन की आवश्यकता है परीक्षण के साथ दो पादी पांच प्रतिकृतियां प्रत्येक, पहले एक मुख्य प्रयोग की तारीख युक्त फ़ोल्डर बनाएं । मुख्य फ़ोल्डर के अंदर, दो सबफ़ोल्डर बनाएं (एक प्रति जीनोटाइप) । जीनोटाइप फ़ोल्डर के अंदर, पांच नए सबफ़ोल्डर, एक दोहराने के प्रति बनाएं ।
      नोट: आगे विश्लेषण के लिए, यह आवश्यक है कि व्यक्तिगत प्रयोगों के लिए इसी छवि श्रृंखला अद्वितीय नाम के साथ फ़ोल्डरों में सहेजे जाते हैं.
< p class = "jove_title" > 5. & #34 में वीडियो सेटिंग्स सेटअप; कैप्चर डिवाइस & #34; इंटरफ़ेस के अनुभाग

  1. छवि-रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर खोलें और, के अंतर्गत & #34; कैप्चर & #34; टैब पर, & #34; समय-चूक छवियां & #8230; & #34; और & #34 के रूप में उपयुक्त वेबकेम का चयन करें; कैप्चर डिवाइस. & #34;
  2. द्वीप पर एक मरा मक्खी जगह; पर क्लिक करके वीडियो सेटिंग्स को एडजस्ट करें & #34; video settings & #34; box. उपकरण पट्टी के माध्यम से स्क्रॉल, चमक, इसके विपरीत, और एक तरीके से रंग का समायोजन ऐसा है कि मृत मक्खी एक सफेद पृष्ठभूमि पर काला दिखाई देता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ). समायोजन पूर्ण होने पर, & #34; ok. & #34;
< p class = "jove_title" > 6. रिकॉर्डिंग और वीडियो सेविंग सेटिंग्स सेटअप & #34; समय-चूक & #34; अंतरफलक की धारा

< राजभाषा>
  • में सेटिंग्स समायोजित करें & #34; समय-चूक मूवी सेटअप & #34; प्रयोग को एक. avi फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए । & #34 पर क्लिक करें; ब्राउज & #8230;, & #34; उस निर्देशिका का चयन करें जहां मूवी संग्रहीत की जाएगी, वीडियो का नाम परिभाषित करे, और & #34 दबाएं; save. & #34;
    नोट: वीडियो फ़ाइल डेटा के ठहराव के लिए उपयोग नहीं किया जाता है; हालांकि, यह एक समग्र विचार प्राप्त करने के लिए उपयोगी हो सकता है प्रयोग के बारे में.
  • में सेटिंग्स समायोजित करें & #34; समय-चूक चलचित्र सेटअप & #34; अनुभाग.
    1. संपीड़न बॉक्स में, का चयन करें & #34; Intel IYUV code & #34; वीडियो संपीड़न के लिए और & #34 चुनें; हर ०.१ सेकंड में एक फ्रेम ले लो, & #34; साथ & #34;P िरे-बैक दर (images प्रति सेकंड): & #34; पर 10.
    2. . bmp फ़्रेंस के रूप में प्रयोग समय श्रृंखला सहेजें & #34 पर क्लिक करके; नत & #8230; & #34; चय & #34; प्रत्येक कैप्चर किए गए फ़्रेम के लिए एक. bmp छवि बनाएं । & #34; पर क्लिक करें & #34; ब्राउज. & #34; में एक ही निर्देशिका का चयन करें & #34;D uring अवि मूवी कैप्चर & #34; विंडो (as चरण ६.१ में चुना), क्लिक करें & #34; खुला, & #34; र प्रेस & #34; ओके. & #34;
      नोट: ध्यान दें कि, प्रयोग के दौरान, फ़्रेंस. bmp फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत की जाती है (डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक) । इस प्रोग्राम के नाम फ़्रेंस के रूप में & #34; A & #34; इसके बाद फ़्रेम कैप्चर अनुक्रम के संगत संख्या ( उदा., & #34; A_number. bmp & #34;) (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ). यह सुनिश्चित करने के लिए कि पहले से रिकॉर्ड की गई छवि श्रृंखला अधिलेखित नहीं होगी, हमेशा एक नए फ़ोल्डर में विभिंन प्रयोगों से संबंधित छवियों को सहेजें । यह ध्यान रखें कि छवियां स्वचालित रूप से वीडियो फ़ाइल के रूप में उसी फ़ोल्डर में नहीं सहेजी जाती है जब तक इस फ़ोल्डर के अंतर्गत & #34; ब्राउज़ करें & #8230; & #34; पर क्लिक करने पर & #34; नत & #34; box.
    • < p class = "jove_title" > 7. द्वीप परख और डेटा संग्रह

    1. रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए छवि रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के समय चूक छवि इंटरफेस में प्रारंभ बटन दबाएँ.
      2. मक्खियों युक्त प्रयोगात्मक शीशी
    2. ठोकर (चरण 3) 2-3 बार यह सुनिश्चित करने के लिए कि मक्खियों शीशी के तल पर हैं । जल्दी से शीशी के प्लग निकालें और, एक जोरदार आंदोलन के साथ, प्लेटफार्म पर शीशी नल ताकि सभी मक्खियों एक ही समय में मंच पर गिर (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ).
    3. लगभग 30 s के बाद, दबाएँ & #34; stop & #34; बटन रिकॉर्डिंग रोकने के लिए ।
      नोट: सभी मक्खियों मंच से गायब हो जाते हैं, रिकॉर्डिंग पहले रोका जा सकता है.
    4. छवि रिकॉर्डिंग को रोकने के बाद हाथ से मंच पर 30 एस के लिए रहना है कि मक्खियों को हटा दें ।
      5. अगले प्रयोग को रिकॉर्ड करने के लिए आगे बढ़ने से पहले
    5. ,. bmp फ़ाइलों और चलचित्रों के लिए लक्ष्य निर्देशिका परिवर्तित करें (अनुभाग 6 देखें) ।
    < p class = "jove_title" > 8. डाटा प्रोसेसिंग: रनिंग & #34; Drosophila द्वीप परख & #34; मैक्रो

    < p class = "jove_content" > नोट: < सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 1 d .

    1. रन द & #34; बना स्टैक और प्रोजेक्शन & #34; उप-स्थूल मैं ढेर और एकत्र छवि श्रृंखला के अनुमानों का उत्पादन करने के लिए ।
      1. प्रारंभ फिजी, click on & #34;P lugins & #34; उपकरण पट्टी में, और चुना & #34; Drosophila द्वीप परख & #34; ड्रॉपडाउन मेनू में; एक नई विंडो दिखाई देगी.
      2. Enter & #34; पहली छवि समय-श्रृंखला पहचानकर्ता & #34; मैक्रो ग्राफ़िकल इंटरफ़ेस में सेटिंग.
        नोट: रिकॉर्ड किए गए छवि फ़्रेम्स के रूप में सहेजे जाते हैं & #34; A-number. bmp & #34; उस क्रम के अनुसार जिसमें छवियां प्राप्त की गई हैं । म & #34; प्रथम फ़्रेम पहचानकर्ता & #34; मैक्रो इंटरफ़ेस, प्रोग्राम द्वारा और फ़ाइल एक्सटेंशन के साथ पहले फ़्रेम को दी गई संख्या के साथ सेटिंग भरें । भरण & #34; प्रथम फ़्रेम पह & #34; साथ & #34; -0001. bmp, & #34; चूंकि प्रथम फ़्रेम कहा जाता है & #34; A-0001. bmp & #34; (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ). मामले में अन्य छवि स्वरूपों (जैसे. tiff या. jpeg) वेब कैमरा सॉफ़्टवेयर द्वारा जनरेट किया गया हैं, पहले छवि का सही फ़ाइल एक्सटेंशन निर्दिष्ट करें & #34; पहली छवि समय-श्रृंखला पहचानकर्ता. & #34;
      3. चयन केवल द & #34; स्टैक और प्रोजेक्शन & #34 बनाएं; उप-मैक्रो, क्लिक करें & #34; ok, & #34; और मुख्य निर्देशिका है कि व्यक्तिगत द्वीप परख प्रयोगों के साथ सभी सबफ़ोल्डर शामिल चुनें ।
        नोट:. bmp फ़ाइलें जिनमें प्रत्येक व्यक्ति प्रयोग फ़ोल्डर में & #34; प्रथम फ़्रेम पहचानकर्ता & #34; इसके बाद कार्रवाई की जाएगी । प्रत्येक व्यक्ति प्रयोग सबफ़ोल्डर में दो नई फ़ाइलें दिखाई देंगी, जिसका नाम डिफ़ॉल्ट & #34; Stack_image_name. tif & #34; और & #34;P rojection_image_name. tif & #34; (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 1 d ). एक बार यह चरण किया जाता है, तो. bmp फ़ाइलें हटाई जा सकती हैं । ढेर और प्रोजेक्शन. tif फ़ाइलें सभी डेटा होते है और अधिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं ।
    2. रन द & #34;D efine platform & #34; उप-स्थूल द्वितीय प्लेटफ़ॉर्म के सटीक स्थान का चयन करने के लिए ।
      1. & #34 के ग्राफिकल इंटरफेस को खोलें; Drosophila द्वीप परख, & #34; चयन केवल & #34;D efine platform & #34; चेकबॉक्स, और प्रेस & #34; ओके. & #34;
      2. & #34; कोई निर्देशिका & #34 चुनें; विंडो, मुख्य निर्देशिका का चयन करें जहां प्रयोगात्मक सबफ़ोल्डर्स संग्रहीत और दबाएँ & #34; चयन करें. & #34;
        नोट: द & #34;D efine Platform & #34; उप-मैक्रो स्वचालित रूप से खोजता है & #34;P rojection_image_name. tif & #34; मुख्य निर्देशिका में संग्रहीत सभी सबफ़ोल्डर्स में फ़ाइलें । द & #34;P rojection_image_name. tif & #34; छवि संग्रहीत पहले फ़ोल्डर में, साथ में दो windows & #8212; & #34;D efine द प्लेटफार्म & #34; र & #34; रोि धक & #34; & #8212; खुलेगा ।
      3. चयन & #34;P olygon सिलेक्शन & #34; उपकरण उपकरण पट्टी में द्वीप प्लेटफ़ॉर्म से मेल खाता चयन आरेखित करने के लिए ।
        नोट: यह चयन से मंच की सीमा रेखा को बाहर करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । See < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d .
      4. पहली इमेज में प्लेटफॉर्म का चयन करने के बाद & #34 पर क्लिक करें; Add & #34; में & #34; रॉय मैनेजर & #34; विंडो; चयनित क्षेत्र roi प्रबंधक विंडो में मानों के एक सेट के रूप में दिखाई देगा (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ). प्रेस & #34; ओके & #34; म & #34;D efine मंच & #34; window. मैक्रो अगले प्रक्षेपण के लिए आगे बढ़ना होगा ।
      5. संख्याओं पर क्लिक करें (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d ) में संग्रहित & #34; ROI manager & #34; विंडो; पिछला चयन तब स्वचालित रूप से वर्तमान छवि प्रोजेक्शन में दिखाई देगा ।
        नोट: जब से द्वीप मंच एक ही आकार और स्थिति है जब प्रयोग एक पंक्ति में प्रदर्शन कर रहे है की संभावना है (जब तक वेब कैमरा और द्वीप की स्थिति अपरिवर्तित रहने के रूप में), यह करने के लिए उपयोगी है रॉय स्टोर में मंच को परिभाषित & #34; रॉय प्रबंधक. & #34; द्वारा ऐसा करने पर, उपयोगकर्ता समय की बचत करेगा; आगामी अनुमानों में, यह केवल रॉय प्रबंधक में अस्थाई रूप से संग्रहीत चयन पर क्लिक करने के लिए आवश्यक है ।
      6. यदि द्वीप की स्थिति को थोड़ा पिछले प्रयोग की तुलना में ले जाया गया है, चयन के केंद्र में बाएं क्लिक करके और आवश्यक स्थिति में चयनित क्षेत्र खींचकर चयन की स्थिति समायोजित करें ।
      7. यदि चयन प्लेटफ़ॉर्म के साथ मेल नहीं खाता है, तो चयन के बाहर बाएं क्लिक करें और & #34;P olygon चयन & #34; उपकरण का उपयोग कर प्लेटफ़ॉर्म के लिए कोई नया चयन चित्रित । नए चयन को ROI प्रबंधक में स्टोर करें & #34; Add; & #34; एक नया चयन & #34 में दिखाई देगा; रॉय प्रबंधक & #34; विंडो जिसे लगातार उपयोग किया जा सकता है ।
      8. जब चयन को समायोजित किया जाता है, तो & #34; ओके & #34; म & #34;D efine को मंच & #34; विंडो और सभी प्लेटफ़ॉर्म निर्धारित होने तक कार्यविधि को दोहराएँ ।
        नोट: नोटिस कि एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर सफेद में delineated रॉय क्षेत्र के लिए इसी मंच के एक द्विआधारी छवि, नाम & #34;P latform_image_name. tif, & #34; ढेर और प्रक्षेपण के रूप में एक ही प्रयोगात्मक सबफ़ोल्डर में प्रत्येक संसाधित छवि के लिए दिखाई दिया चरण 8.1.3 में उत्पंन छवियां (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 1 d ).
    3. न्यूनतम मक्खी के आकार को परिभाषित करें ।
      नोट: यह सेटिंग पिक्सेल में न्यूनतम मक्खी के आकार को परिभाषित करता है । निर्दिष्ट न्यूनतम आकार की तुलना में छोटे होते हैं कि कणों शोर के कारण झूठी सकारात्मक से बचने के लिए विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा.
      1. द्वारा बनाई गई छवि स्टैक खोलें & #34; बनाएं स्टैक और प्रोजेक्शन & #34; उप-मैक्रो I.
      2. इमेज टैक् स को 8-bit में परिवर्तित कर image & #62; & #62; टाइप & #62; & #62; 8-bit.
      3. मेनू पर जाएं, प्रेस इमेज & #62; & #62; समायोजित & #62; & #62; थ्रेशोल्ड, सुनिश्चित करें कि & #34;D सन्दूक पृष्ठभूमि & #34; बॉक्स चयनित है, और दबाएँ & #34; लागू करें; & #34; किसी दूसरी विंडो नामक & #34; थ्रेशोल्ड & #34; प्रकट होगा । & #34;D सन्दूक backgro पर क्लिक करेंund & #34; र प्रेस & #34; ओके. & #34;
        नोट: एक बाइनरी छवि स्टैक जिसमें मक्खियों काले और सफेद में प्लेटफ़ॉर्म में परिभाषित किए जाते हैं बनाया जाएगा । जब यह मामला नहीं है, लागू & #34; उल्टे & #34; णाली पर क्लिक करके Edit & #62; & #62; पलटन & #62; & #62; रन.
      4. पर क्लिक करके पिक्सल की संख्या का पता लगाने के लिए स्केल सेट करें विश्लेषण & #62; & #62; सेट स्केल । निंनलिखित सेटिंग्स लागू करें: पिक्सल में दूरी = 1, ज्ञात दूरी = 1, पिक्सेल पहलू अनुपात = 1, और लंबाई की इकाई = पिक्सेल । प्रेस & #34; ओके. & #34;
      5. Select & #34; छड़ी & #34; (tracing) उपकरण उपकरण पट्टी में और एक मक्खी पर क्लिक करें (काले डॉट) मंच पर मौजूद है । ctrl + m (Windows उपयोगकर्ता) या cmd + m (Mac users) दबाएँ; एक नया & #34; result & #34; विंडो पिक्सेल में चयनित स्थान के क्षेत्र का संकेत होगा । यह लगातार कई मक्खियों के लिए करते हैं और न्यूनतम मक्खी का आकार निर्धारित करते हैं ।
        नोट: जब मैक्रो चल रहा हो, तो सेट करें & #34; न्यूनतम मक्खी का आकार & #34; सबसे छोटी से कम मनाया मक्खी आकार 10% की एक मार्जिन घटा । (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2E ).
    4. रन द & #34; Analysis & #34; उप-मैक्रो III यों तो प्लेटफार्म से भागने मक्खियों को ।
      1. टूलबार पर जाएं, & #34;P lugins, & #34; और चुना & #34; Drosophila द्वीप परख. & #34;
      2. समायोजित & #34; न्यूनतम फ्लाई साइज & #34; चरण ८.३ में निर्धारित मान के अनुसार सेटिंग करें.
        नोट: चरण ८.३ में निर्धारित मान का उपयोग केवल तभी करें जब मानक सेटिंग & #160; & #34; न्यूनतम फ्लाई साइज & #34; कारण & #160; उन मक्खियों का बहिष्करण जो प्लेटफ़ॉर्म पर मौजूद थे या यदि & #160; मैक्रो मक्खियों के रूप में पृष्ठभूमि संकेत का पता लगाता है ।
      3. & #34; मक्खियों की संख्या प्रति शीशी & #34; सेटिंग, पूरी प्रयोग के दौरान शीशियों में मौजूद मक्खियों की अधिकतम संख्या भरें । उदाहरण के लिए, यदि एक प्रयोग में 15 मक्खियों वाली शीशियों है, जिसमें 20 मक्खियों, और 23 मक्खियों वाले अन्य लोगों को शामिल किया गया है, तो & #34; प्रति शीशी मक्खियों की संख्या & #34; 23 के रूप में इंगित किया जाना चाहिए.
      4. Select & #34; श्लेष & #34; चेकबॉक्स और प्रेस & #34; ठीक; & #34; क नया & #34; कोई निर्देशिका & #34 चुनें; विंडो दिखाई देगी. मुख्य निर्देशिका का चयन करें (सभी सबफ़ोल्डर और फ़ाइलों के अंदर के साथ) और दबाएँ & #34; select. & #34;
        नोट: मैक्रो जब तक वे होते हैं, तो सबफ़ोल्डर्स में संग्रहित सभी छवियों का विश्लेषण करेंगे & #34; stack_image_name, & #34; & #34;P rojection_image_name, & #34; और & #34;P latform_image_name & #34; files. मैक्रो छवि के बाद छवि को संसाधित करेगा । मैक्रो आउटपुट में एक बाइनरी परिणाम छवि स्टैक नाम के होते हैं & #8220; result_stack_subfolder_name. tif & #8221; और एक परिणाम पाठ फ़ाइल नामक & #34; result_subfolder_name. txt, & #34; जो प्रत्येक डेटा फ़ोल्डर में प्रकट होता है । & #160; परिणामी पाठ फ़ाइल (. txt) में शामिल है मात्रात्मक माप छवि स्टैक करने के लिए इसी और 9 कॉलम के होते हैं । इन स्तंभों की सामग्री तालिका 1 में सारांशित है । & #34; Result_stack_subfolder_name. tif & #34; एक प्रयोग की छवि समय-श्रृंखला के लिए संगत है, जहां प्रयोग के दौरान पाई गई मक्खियों को सफ़ेद पृष्ठभूमि पर काले डॉट्स के रूप में दर्शाया जाता है (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा 1E ).
      5. ध्यान से परिणाम स्टैक का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई कलाकृतियों हुआ है और कि स्थूल सही काम किया (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2F ).
        नोट: कलाकृतियों के उदाहरण छवि तत्व है कि मक्खियों नहीं कर रहे हैं, लेकिन है कि इस तरह के रूप में छवि विभाजन एल्गोरिथ्म (झूठी सकारात्मक) का पता लगाया है हो सकता है । इस उदाहरण के लिए, क्योंकि रॉय की एक गलत चयन की पृष्ठभूमि संकेत का पता लगाने के कारण हो सकता है ।
    < p class = "jove_title" > 9. डेटा विश्लेषण का उपयोग & #34; द्वीप परख विश्लेषण & #34;

    1. संरचना में संकेत के रूप में डेटा < सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 2a & #34 के साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए; द्वीप परख विश्लेषण & #34; लिपि. सबफ़ोल्डर, जहां प्रत्येक सबफ़ोल्डर विश्लेषण किया जा करने के लिए एक प्रयोगात्मक स्थिति से मेल खाती है के साथ एक मुख्य निर्देशिका जनरेट करें ।
      2. सबफ़ोल्डर में
    2. , जिसमें स्वतंत्र प्रायोगिक प्रतिकृति फ़ोल्डर जनरेट करें (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 2a ) और परिणाम. txt फ़ाइलें & #34 द्वारा निर्मित; Drosophila Island परख & #34; मैक्रो.
      नोट: द & #34; द्वीप परख विश्लेषण & #34; मैक्रो एक ही बार में मुख्य निर्देशिका में स्थित सभी प्रायोगिक शर्तों को संसाधित करेगा ।
    3. प्रारंभ r या r studio । file & #62 पर क्लिक करें; & #62; ओपन फाइल & #8230; टूलबार में और & #34 का चयन करें; द्वीप परख विश्लेषण & #34; script.
      1. ggplot2 और matrixStats संकुल को स्थापित करते समय & #34; द्वीप परख विश्लेषण & #34; पहली बार के लिए स्क्रिप्ट । कॉनसोल विंडो में निम्न टाइप करें:
        & #62; install. संकुल (& #34; ggplot2 & #34;), लिहा
        & #62; install. संकुल (& #34; matrixStats & #34;), लिहा.
    4. स्क्रिप्ट में डेटा और विश्लेषण आउटपुट फ़ाइलों का स्थान निर्दिष्ट करें । निंन स्क्रिप्ट पंक्तियों में संमिलित करें:
      1. पंक्ति 16: उस मुख्य निर्देशिका का पथ संमिलित करें जिसमें विश्लेषित और तुलना किए जाने वाले प्रयोग शामिल हैं (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 2a , इस & #34 के लिए पथ निर्देशन; द्वीप परख & #34; फ़ोल्डर).
      2. पंक्ति 19: जहाँ विश्लेषण आउटपुट फ़ाइलें संग्रहीत की जाती हैं फ़ोल्डर के लिए पथ सम्मिलित करें ।
        नोट: 16 पंक्ति में इंगित निर्देशिका केवल विश्लेषण करने के लिए फ़ोल्डर हो सकते हैं । यदि पंक्ति 16 और पंक्ति 19 में संमिलित पथ समान हैं, तो स्क्रिप्ट भी ठीक से काम नहीं करेगा ।
    5. पर क्लिक करके स्क्रिप्ट चलाएं कोड & #62; & #62; रन क्षेत्र & #62; & #62; सभी उपकरण पट्टी से चलाएं ।
      नोट: सूचना है कि तीन परिणामी. csv फ़ाइलें और एक परिणामी. txt फ़ाइल (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 1E ) पंक्ति 19 में निर्धारित निर्देशिका में प्रकट होते हैं । ये हैं: (I) द & #34;d ata_all_conditions. csv & #34; फ़ाइल में प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति और प्रायोगिक प्रतिकृति, तालिका 2 में वर्णित के रूप में व्यवस्थित करने के लिए संगत संसाधित डेटा है । (II) द & #34; सांख्यिकी सारांश. csv & #34; फ़ाइल मतलब संक्षेप में, मानक विचलन (एसडी), और प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए मंच पर मक्खियों के प्रतिशत का मतलब (SEM) के मानक त्रुटि । (III) द & #34; ईमेज. csv & #34; फ़ाइल में प्रत्येक प्रायोगिक दोहराने के लिए वक्र के अंतर्गत क्षेत्र होता है । (IV) मुख्य फ़ोल्डर में मौजूद स्थितियों की संख्या के आधार पर, स्क्रिप्ट या तो निर्यात करेगा a & #34; Welch_t-test_results. txt & #34; फ़ाइल (2 शर्तें) या an & #34; AUC_anova_results. txt & #34; फ़ाइल (2 से अधिक शर्तें), जहां t-परीक्षण के परिणाम या ANOVA प्रायोगिक स्थितियों के बीच वक्र के तहत क्षेत्र की तुलना संकेत कर रहे हैं । ध्यान दें कि. tiff छवि फ़ाइलों के चार भिंन प्रकार (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 1E ) पंक्ति 19 में निर्धारित पथ में प्रकट होते हैं । ये कहा जाता है: & #34; Name_Of_Data_Folder. tiff & #34; (जहां Name_Of_Data_Folder उपयोगकर्ता द्वारा दिए गए फ़ोल्डर नाम का प्रतिनिधित्व करता है), & #34; ईमेज. tiff, & #34; & #34; Escape_response_all_conditions. tiff, & #34; और & #34; AUC_anova. tiff. & #34; विस्तृत जानकारी इन रेखांकनों की सामग्री के बारे में इस पांडुलिपि के प्रतिनिधि परिणामों में पाया जा सकता है और < सबल वर्ग में = "xfig" > चित्रा 3 .

    Representative Results

    वर्णित प्रोटोकॉल में, Drosophila द्वीप परख डेटा प्राप्त कर रहे है और तीन चरणों में संसाधित । सबसे पहले, Drosophila के द्वीप मंच पर फेंक दिया उड़ान एस्केप रिस्पांस एक webcam के साथ दर्ज की गई है और व्यक्तिगत. bmp छवियों के रूप में संग्रहीत (प्रोटोकॉल 1-7 वर्गों) । दूसरा, "Drosophila द्वीप परख" स्थूल (कदम 8) फ्रेम प्रक्रियाओं, एक "परिणाम. txt" पाठ फ़ाइल (तालिका 1), जिसमें प्रत्येक फ्रेम में पाया वस्तुओं की संख्या संक्षेप है पैदा कर रहा है, और एक छवि ढेर "Result_stack. tiff," जो दिखाता है प्रत्येक फ़्रेम में प्लेटफ़ॉर्म के क्षेत्र में ऑब्जेक्ट्स का पता लगाया गया । तीसरा, "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट (प्रोटोकॉल अनुभाग 9) मैक्रो डेटा "परिणाम. txt" व्यक्तिगत प्रयोगों की फ़ाइलों में संग्रहीत प्रक्रियाओं । कई कदम स्क्रिप्ट में शामिल करने के लिए फ़िल्टर और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा गठबंधन कर रहे हैं । पहली फ्रेम जिसमें मक्खियों मंच पर फेंक दिया जाता है पता चला है और समय बिंदु 1 के रूप में माना जाता है । पहले वाले फ़्रेम डेटासेट से समाप् त हो जाते हैं । १०० फ़्रेम्स निंन समय बिंदु 1 (10 s से संबंधित) विश्लेषण के लिए चयनित हैं । प्रयोग जिसमें प्लेटफ़ॉर्म पर पाए जाने वाले मक्खियों की आरंभिक संख्या 5 से छोटी होती है, विश्लेषण से स्वचालित रूप से बाहर रखा जाता है, जो कि शक्तिहीन प्रयोगों से अविश्वसनीय परिणामों को नष्ट करते हैं । प्रयोगों जिसमें मंच पर पाया मक्खियों की प्रारंभिक संख्या से अधिक "प्रति शीशी मक्खियों की संख्या" सेटिंग प्लस 3 की सहनशीलता भी शामिल नहीं हैं । यह जो में शोर कणों ग़लती से मक्खियों के रूप में पाया गया डेटासेट समाप्त । स्क्रिप्ट तो प्रत्येक समय बिंदु के लिए पता चला मक्खियों के प्रतिशत की तुलना में इस श्रृंखला में पाया मक्खी की संख्या की गणना करता है । में और रॉय के बाहर चलने मक्खियों के कारण डेटासेट में त्रुटियाँ (समय के साथ मंच पर मक्खियों के प्रतिशत में वृद्धि के बाद एक कमी के रूप में पाया) स्वचालित रूप से पहले के चरणों में मंच पर लगातार मौजूद के रूप में उन्हें के बारे में द्वारा सही कर रहे हैं . सभी प्रतिकृति datasets मुख्य निर्देशिका में मौजूद थे जो किसी विशिष्ट प्रायोगिक शर्त के लिए संयुक्त और "data_all_conditions. csv" फ़ाइल में निर्यात किए जाते हैं । इसके स्तंभ तालिका 2में वर्णित चरों का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्क्रिप्ट भी प्रत्येक प्रयोगात्मक शर्त के लिए एक लाइन ग्राफ निर्यात करेगा, डेटा युक्त फ़ोल्डर के अनुसार नाम । इस ग्राफ को समय के साथ मंच पर शेष मक्खियों का प्रतिशत (उड़ान एस्केप रिस्पांस) प्रयोगात्मक संबंधित फ़ोल्डर में मौजूद दोहराने के लिए दिखाता है (चित्र 3ए-बी)। मतलब, एसडी, और SEM प्रत्येक प्रयोगात्मक शर्त के लिए गणना कर रहे है और संक्षेप में "सांख्यिकी सारांश. csv" फ़ाइल । "Escape_response_all_conditions. tiff" नामक एक पंक्ति ग्राफ़ मुख्य फ़ोल्डर में मौजूद 12 प्रायोगिक शर्तों के लिए औसत फ़्लाइट एस्केप प्रतिसाद दिखाता है (चित्र 3सी). अंत में, मुख्य फ़ोल्डर में मौजूद सभी प्रायोगिक शर्तों के लिए वक्र के अंतर्गत क्षेत्र की गणना की जाती है और "ईमेज. csv" फ़ाइल में सारांशित की जाती है । मुख्य फ़ोल्डर में मौजूद शर्तों की संख्या के आधार पर, स्क्रिप्ट या तो एक दो-पुच्छीय वेल्च t-परीक्षण (2 शर्तें) या एकाधिक परीक्षण (2 शर्तों से अधिक) के लिए Tukey सुधार के साथ एक ANOVA करने के लिए निर्धारित करेगा कि क्या प्रायोगिक शर्तें एक दूसरे से काफी अलग हैं । ये परिणाम "Welch_t-test_results. txt" या "AUC_anova_results. txt" में सारांशित किए जाते हैं. ANOVA का प्रदर्शन करते समय, स्क्रिप्ट भी एक "AUC_anova. tiff" फ़ाइल जो माध्य ईमेज और ९५% विश्वास अंतरालों की तुलना की गई है प्रयोगात्मक शर्तों में अंतर प्रदर्शित करता है जो निर्यात करेगा । सभी प्रायोगिक शर्तों के लिए प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां के वक्र के तहत निरपेक्ष क्षेत्र के मूल्यों "ईमेज. tiff" (चित्रा 3 डी) में माध्य के साथ व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं ।

    गतिभंग Telangiectasia (पर) एक ऑटोसोमल अवकाश आंदोलन गतिभंग गतिभंग में उत्परिवर्तनों के कारण अनुमस्तिष्क Telangiectasia की जल्दी शुरुआत द्वारा विशेषता विकार (एटीएम) जीन14है । एटीएम, tefuके Drosophila orthologue की म्यूटेंट, गतिशीलता और दीर्घायु में प्रदर्शन दोष15. "Drosophila द्वीप परख" स्थूल, एटी का एक Drosophila मॉडल का मूल्यांकन द्वीप परख में परीक्षण किया गया था, और स्थूल के डेटा उत्पादन मैनुअल डेटा गिनती की तुलना में था । परिणाम बताते हैं कि सर्वत्र tefu पछाड़ना (डब्ल्यू -; Actin-Gal4/GD11950) काफी अपने आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण की तुलना में मंच छोड़ने के लिए इन मक्खियों की क्षमता को कम करता है (डब्ल्यू -; Actin-Gal4/+) (चित्रा 4). 1 एस के बाद, ५०% नियंत्रण मक्खियों के मंच से बच गया था, इसके विपरीत में & #60; 1% tefu-RNAi मक्खियों । महत्वपूर्ण बात, डेटा के साथ स्थूल ईमानदारी से प्राप्त डेटा मैनुअल गिनती द्वारा प्राप्त reproduced, यह दर्शाता है कि स्थूल एक विश्वसनीय उपकरण है कि द्वीप परख डेटा के ठहराव और आंदोलन दोषों के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( चित्र 4 A-B)।

    Figure 1
    चित्रा 1: फ़्लोचार्ट आवश्यकताओं, प्रयोगात्मक प्रक्रिया, और द्वीप परख के विश्लेषण को रेखांकित । (एक) द्वीप परख उपकरण । (ख) द्वीप की परख के लिए प्रायोगिक सेटअप । (ग) द्वीप परख । (घ) "Drosophila द्वीप परख" स्थूल के साथ द्वीप परख डेटा के प्रसंस्करण । "Drosophila द्वीप परख" मेक्रो 3 उप से बना है-मैक्रोज़: 1) स्टैक और प्रोजेक्शन करें, 2) प्लेटफ़ॉर्म को परिभाषित करें, और 3) विश्लेषण । (ई) डेटा के प्रसंस्करण और सांख्यिकीय मूल्यांकन "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2: प्रोटोकॉल के दौरान आवश्यक विभिंन समायोजनों के उदाहरण. (क) आवश्यक निर्देशिका संरचना जिसमें द्वीप परख प्रयोगों डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जाना चाहिए । (B) वीडियो सेटिंग्स समायोजित करते समय, मक्खियों को सफ़ेद पृष्ठभूमि पर काला दिखाई देना चाहिए । (ग) छवि फ़्रेम आउटपुट फ़ाइलेंके रूप में छवि रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर इस पांडुलिपि में वर्णित द्वारा बचाया । (D) पीली बाह्यरेखा प्लेटफ़ॉर्म चयन दिखाती है । "रॉय प्रबंधक" में संग्रहीत प्लेटफ़ॉर्म चयन नीले रंग में हाइलाइट किया गया है । (ई) मक्खियों "ंयूनतम मक्खी के आकार की स्थापना के समायोजन के दौरान सफेद डॉट्स के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । परिणाम विंडो पिक्सेल में मक्खियों का क्षेत्र दिखाता है । (च) एक ही दर्ज की छवि फ्रेम का उदाहरण (बाईं ओर) और परिणामस्वरूप छवि ढेर में इसी फ्रेम, "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो के साथ प्राप्त (सही पर) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्रा 3: "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट के साथ डेटा प्रोसेसिंग के बाद प्राप्त परिणाम छवियों. (A) रेखा प्रत्येक नियंत्रण प्रयोगात्मक दोहराने के लिए उड़ान एस्केप प्रतिक्रिया दिखा ग्राफ । (ख) रेखा प्रत्येक tefu RNAi प्रयोगात्मक दोहराने के लिए उड़ान एस्केप प्रतिक्रिया दिखा ग्राफ । (ग) इंगित प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए औसत उड़ान एस्केप प्रतिक्रिया; त्रुटि पट्टियां SEM. (D) डॉट प्लॉट नियंत्रण और उत्परिवर्ती शर्तों के लिए वक्र वितरण के अंतर्गत क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं । दोनों tefu RNAi और नियंत्रण की स्थिति के लिए प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां (लाल रेखा) माध्य के साथ व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं (काले में) के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्रा 4: सर्वव्यापी tefu पछाड़ना मक्खियों मंच छोड़ने के लिए एक काफी कमी की क्षमता दिखा. डेटा नियंत्रण के लिए समय (s) पर प्लेटफ़ॉर्म पर मक्खियों के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व (w-; Actin-Gal4/+) और tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) मक्खियों । (प्रतिकृति की संख्या = 5; त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं) । (क) रॉ "Drosophila द्वीप परख" स्थूल के साथ प्राप्त डेटा । (ख) डॉट भूखंड नियंत्रण और tefu RNAi "Drosophila द्वीप परख" स्थूल के साथ प्राप्त शर्तों के लिए वक्र वितरण के तहत क्षेत्र का प्रतिनिधित्व (वेल्च ख़राब टी परीक्षण, * * p & #60; ०.०१) । (C) प्रति सेकंड द्वीप पर मौजूद मक्खियों की संख्या की गणना करके मैंयुअल रूप से प्राप्त किया गया अपुष्ट डेटा । (D) डॉट भूखंडों पर नियंत्रण और हाथ से प्राप्त Tefu RNAi शर्तों के लिए वक्र वितरण के अंतर्गत क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने वाले (वेल्च ख़राब t-परीक्षण, * * p & #60; ०.०१) । त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    स्तंभ नाम विवरण
    टुकड़ा फ़्रेम का नाम ।
    गिनती प्लेटफ़ॉर्म (ROI) की सीमाओं में फ़्रेम में पाए गए ऑब्जेक्ट्स की संख्या ।
    कुल क्षेत्रफल ऑब्जेक्ट्स का कुल क्षेत्र पिक्सेल में प्लेटफ़ॉर्म (ROI) की सीमाओं के भीतर फ़्रेम में पाया गया.
    औसत आकार प्लेटफ़ॉर्म की सीमाओं (ROI) के भीतर ऑब्जेक्ट्स की संख्या द्वारा विभाजित फ़्रेम में पाए गए ऑब्जेक्ट्स का कुल क्षेत्र ।
    % क्षेत्र प्लेटफ़ॉर्म के कुल क्षेत्र (ROI) के संबंध में ऑब्जेक्ट्स द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र का प्रतिशत.
    Perim । ऑब्जेक्ट्स की कुल परिधि, पिक्सेल में प्लेटफ़ॉर्म (ROI) की सीमाओं के भीतर फ़्रेम में पाई जाती है.
    Min. मक्खी का आकार न्यूनतम मक्खी आकार "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो (पिक्सल में) के चित्रमय अंतरफलक में उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित सेटिंग ।
    क्षेत्र रॉय प्लेटफ़ॉर्म के क्षेत्र (ROI) उप-मैक्रो के चलाने के दौरान उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित (पिक्सेल में) प्लेटफ़ॉर्म निर्धारित करें ।
    मक्खियों की संख्या "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो के ग्राफिकल इंटरफेस में उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित प्रयोग प्रति इस्तेमाल मक्खियों की संख्या ।

    तालिका 1: पैरामीटर "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो द्वारा मापा । इस तालिका में वर्णित मापदंडों "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो चलाने पर "result. txt" फ़ाइल में दिखाई देगा ।

    स्तंभ नाम विवरण
    टुकड़ा फ़्रेम संख्या ।
    गिनती प्लेटफ़ॉर्म की सीमाओं (ROI) के भीतर फ़्रेम में पाए गए मक्खियों की संख्या ।
    X. क्षेत्र मक्खियों का कुल क्षेत्र पिक्सेल में प्लेटफ़ॉर्म (ROI) की सीमाओं के भीतर फ़्रेम में पाया गया.
    Min. मक्खी का आकार न्यूनतम मक्खी आकार प्रविष्टि "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो (पिक्सल में) की चित्रमय अंतरफलक में उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित सेटिंग ।
    क्षेत्र रॉय प्लेटफ़ॉर्म का क्षेत्र (ROI, पिक्सेल में) उप-मैक्रो "परिभाषित प्लेटफ़ॉर्म" चलाते समय उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किया जाता है.
    मक्खियों की संख्या "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो के ग्राफिकल इंटरफेस में उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित प्रयोग प्रति इस्तेमाल मक्खियों की संख्या ।
    X. Count % मक्खियों के प्रयोग के दौरान मंच पर पाया मक्खियों की सबसे अधिक संख्या के सापेक्ष संबंधित स्लाइस/फ्रेम में मंच पर मौजूद है ।
    Timepoint समय बिंदु 1 विश्लेषण किया जा करने के लिए पहली फ्रेम का प्रतिनिधित्व करता है और जहां मक्खियों पहली बार मंच पर दिखाई फ्रेम करने के लिए से मेल खाती है । एक कुल १०० फ्रेम प्रति दोहराने का विश्लेषण कर रहे है (संगत 10 एस, जब वर्णित सेटिंग्स का उपयोग कर ।
    प्रयोग प्रति शर्त प्रतिकृतियों की संख्या ।
    हालत (डेटा वाले फ़ोल्डर के यूज़र-डिफ़ाइंड नाम के अनुसार) प्रयोगात्मक शर्त का नाम इंगित करता है ।

    तालिका 2: "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट के साथ डेटा प्रसंस्करण के बाद प्राप्त चर का विवरण । इस तालिका में वर्णित पैरामीटर "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट के साथ डेटा संसाधित करने पर "data_all_conditions. csv" फ़ाइल में दिखाई देते हैं ।

    Discussion

    इस प्रोटोकॉल का वर्णन "Drosophila द्वीप परख" स्थूल कि मात्रात्मक द्वीप परख के दौरान Drosophila मोटर व्यवहार का आकलन है । स्थूल सही समय के साथ मंच पर मक्खियों गिना जाता है, द्वीप परख अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक उच्च हरकत दोषों का प्रवाह मूल्यांकन के लिए उपयुक्त बना । इस पद्धति की अनुमति देता है किसी भी हालत की तुलना के लिए, मक्खियों के साथ विभिंन आनुवंशिक और/ यह readout खोज उपकरण के रूप में विशेष रूप से उपयोगी है जब बड़े आनुवंशिक या दवा स्क्रीन प्रदर्शन, जब आंदोलन विकारों और अंय स्नायविक रोगों के Drosophila मॉडल का अध्ययन, या जब गतिवान या उड़ान की जांच व्यवहार.

    द्वीप परख इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल मौजूदा पर लाभ प्रदान करता है/ उदाहरण के लिए, वीडियो ट्रैकिंग गतिवान अधिक समय लेने वाली और बड़े नमूना आकार के परीक्षण के लिए कम उपयुक्त है । द्वीप परख एक उच्च प्रवाह जांच उपकरण है, और, इस अर्थ में, तेजी से इंटरैक्टिव नकारात्मक geotaxis (अंगूठी) परख16के बराबर है । दोनों के बीच अंतर यह है कि द्वीप परख हरकत समस्याओं की एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए अनुमति देता है; मक्खियों की अक्षमता के लिए मंच छोड़ने के लिए उड़ान में दोषों के कारण हो सकता है, कूद, या चलने की वजह से व्यवहार विंग (मांसपेशी/न्यूरॉन्स) और/या पैर (मांसपेशी/ दूसरी ओर, अंगूठी परख चढ़ाई में दोषों का आकलन/पैदल व्यवहार पैर की वजह से (मांसपेशी/ मामले में उपयोगकर्ताओं को कई व्यवहार readouts में रुचि रखते हैं, द्वीप परख भी आसानी से ऐसे अंगूठी परख के रूप में अंय परख, के साथ संयुक्त किया जा सकता है । इसके अलावा, optogenetics के लिए आवश्यक पराबैंगनीकिरण आसानी से द्वीप परख बॉक्स में स्थापित किया जा सकता है, और सेटअप इतना आसान है कि यह आसानी से एक कमरे में ले जाया जा सकता है, जहां तापमान और प्रकाश नियंत्रित किया जा सकता है ।

    को सफलता और द्वीप परख यहां वर्णित की reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, कई सिफारिशों का पालन किया जाना चाहिए । Aliquot और प्रायोगिक परीक्षण शीशियों के लिए मक्खियों हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग करने से पहले एक दिन में सह के प्रभाव से बचने के लिए2 या ठंडा संज्ञाहरण । भीड़ न करें प्रयोगात्मक शीशियों (उपयोग 10-15 मक्खियों प्रति शीशी; यह हमेशा के लिए मक्खियों की एक ही संख्या प्रति शीशी जगह सबसे अच्छा है) । हर समय ताजे खाने पर मक्खियों को रखें । अगर परख के संचालन के साथ अभी तक परिचित नहीं है, अभ्यास मंच पर मक्खियों फेंकने के लिए उपज को अधिकतम । इसके अलावा जल्दी से हाथ वापस लेने का अभ्यास सही बाद में, के रूप में यह डेटा विश्लेषण (छवि विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप और उड़ान शुरू गिनती के बाद ही हाथ चित्र से बाहर है) । की तुलना की जरूरत है कि प्रयोगों में पर्यावरणीय और प्रयोगात्मक शर्तों समान रखें (जैसे, नियंत्रण बनाम म्यूटेंट या एक जीनोटाइप विभिन्न उम्र में परीक्षण). हमेशा दिन के एक ही समय में प्रयोगों का प्रदर्शन और नियंत्रित तापमान और आर्द्रता की स्थिति के तहत शीशियों को बनाए रखने. सांख्यिकीय शक्ति के लिए, परीक्षण जैविक नकल के प्रति कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृतियां ।

    यहां वर्णित मैक्रो के सफल प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए, वेब कैमरा और छवि सेटिंग्स को अधिक से अधिक विपरीत प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए: एक सफेद मंच पर काले वस्तुओं के रूप में प्रदर्शित मक्खियों । जब मक्खियों की संख्या ठीक से मैक्रो द्वारा गिना नहीं है, कंट्रास्ट सेटिंग्स समायोजित करें, जांचें कि क्या रॉय ठीक से चयनित है, और यह सुनिश्चित करें कि मंच पर मक्खियों के आकार निर्दिष्ट ंयूनतम मक्खी आकार सेटिंग से ऊपर है (इस प्रोटोकॉल का चरण ८.३ देखें) । सेटिंग्स केवल एक बार परिभाषित करने की आवश्यकता है । वे सभी प्रयोगों के लिए लागू कर रहे हैं, जब तक वेब कैमरा और मंच के बीच की दूरी बदल नहीं है । Circularity_min और अधिकतम सेटिंग्स कणों के प्रचलन को परिभाषित (कण = गिना मक्खियों) कि विश्लेषण के लिए खाते में ले जाया जाएगा (मक्खियों = वस्तुओं गिना). 1 एक परिपूर्ण वृत्त का प्रतिनिधित्व करता है, और 0 एक पंक्ति17का प्रतिनिधित्व करता है । मक्खियों हमेशा परिपत्र की एक निश्चित डिग्री मौजूद (एक मक्खी एक सीधी रेखा के रूप में प्रकट नहीं कर सकते हैं) के बाद से, "Circularity_max" सेटिंग 1 पर सेट है और "Circularity_min" सेटिंग ०.४ पर सेट किया गया है । यह संभावना नहीं है कि उपयोगकर्ता को इन सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता है ।

    एक मक्खी मंच की सीमा के करीब स्थित है जब मैक्रो कभी-कभार गिनती गलतियां करता है. यह हो सकता है अगर मक्खियों मक्खी लेकिन में और बाहर उपयोगकर्ता परिभाषित रॉय के चलने नहीं कर सकते । ज्यादातर मामलों में, रॉय का चयन (यह फिटिंग के रूप में ज्यादा के रूप में मंच के लिए संभव) आसानी से इस मुद्दे को हल कर सकते हैं । हालांकि, "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट का पता लगाने और सही अनुचित डेटा में और रॉय अपेक्षाकृत अच्छी तरह से बाहर चलने मक्खियों की वजह से गिनती करने में सक्षम है । हालांकि वेब कैमरा के संकल्प यहां प्रस्तुत काफी उच्च है भेदभाव के करीब निकटता में मक्खियों काफी अच्छी तरह से, हम इस तरह के रूप में "Drosophila द्वीप परख" स्थूल, की छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया में अतिरिक्त एल्गोरिदम लागू किया है वाटरशेड और घिस समारोह17. इन मक्खियों कि मंच पर करीब निकटता में है की उचित विरेखा की सुविधा । इसके अतिरिक्त, मैक्रो उस प्लेटफ़ॉर्म से जंप करने वाले मक्खियों के बीच अंतर करने में असमर्थ है या इससे दूर उड़ गया था । बहरहाल, यह आम तौर पर मनाया जाता है कि स्वस्थ युवा मक्खी उपभेदों तुरंत उड़ जब मंच पर गिरा दिया, जबकि पुराने मक्खियों और हरकत घाटे के साथ मक्खियों मंच पर लंबे समय तक रहने के लिए और अंत में कूद या मंच गिर जाएगा । इन सीमाओं के बावजूद, परख और विश्लेषण हरकत व्यवहार का एक बहुत ही सटीक उपाय प्रदान करते हैं ।

    "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट के सफल प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए, उपयोगकर्ता के लिए इनपुट और आउटपुट स्क्रिप्ट पंक्तियों में फ़ाइलें प्रोटोकॉल में संकेत के लिए सही रास्ते में प्रवेश करने के लिए और सही फ़ोल्डर प्रारूप में डेटा प्रदान करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए है (संकेत के रूप में चित्रा 2में) । उपयोगकर्ता भी कड़े (पंक्ति ६८: अविश्वसनीय प्रयोगात्मक डेटा बाहर फिल्टर करने के लिए इस्तेमाल किया मानदंड पाता है "count" स्तंभ में पहला मान 5 से कम या बराबर है; पंक्ति ७१: "गणना" स्तंभ में पहला मान platfo पर फेंकी गई मक्खियों की कुल संख्या से अधिक है rm + 3), ६८ और ७१ "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट में पंक्तियों में पाठ के सामने एक # जोड़कर इन फ़िल्टर सेटिंग्स बंद कर दें । इस स्थिति में, विश्लेषण में सभी डेटासेट को शामिल किया जाएगा. वैकल्पिक रूप से, फ़िल्टर सेटिंग्स पंक्तियाँ ६८ और ७१ उपयोगकर्ता आवश्यकताओं के अनुसार में मानों को समायोजित करके परिवर्तित किया जा सकता है । "परिणाम. txt" "Drosophila द्वीप परख" मैक्रो द्वारा उत्पंन में गिनती मूल्यों में संभव कलाकृतियों को भी मैंयुअल रूप से समायोजित किया जा सकता है, और स्क्रिप्ट को समायोजित डेटा पर फिर से चला जा सकता है । जब उपयोगकर्ता प्रसंस्करण में रुचि है 10 से अधिक एफपीएस, या डेटा के 10 से अधिक एस, "द्वीप परख विश्लेषण द्वारा संसाधित फ्रेम की संख्या स्क्रिप्ट" चाहिएसमायोजित किया जाएगा । सांख्यिकीय विश्लेषण भी यूज़र-डिफ़ाइंड विकल्प द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

    एक फ़ोल्डर बुलाया "उदाहरण द्वीप परख," छवि समय के साथ उदाहरण युक्त-श्रृंखला द्वीप परख का उपयोग कर प्राप्त की, निंनलिखित वेबसाइट पर पाया जा सकता है: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1 । डाउनलोड "उदाहरण द्वीप परख" फ़ोल्डर और इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का पालन करने के लिए जल्दी से फ़ाइल भंडारण की संरचना के साथ परिचित हो, "Drosophila द्वीप परख मैक्रो" के साथ छवियों के प्रसंस्करण, और "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट.

    द्वीप परख, विकसित स्थूल और विश्लेषण स्क्रिप्ट के साथ संयोजन में, का मूल्यांकन करने के लिए और गतिभंग-Telangiectasia के एक Drosophila मॉडल के ंयायपालिका आंदोलन व्यवहार को बढ़ाता है इस्तेमाल किया जा सकता है । के बाद से परख कुशलतापूर्वक विभिंन उंर के लिए लागू किया जा सकता है, यह अच्छी तरह से phenotypes के संभावित प्रगतिशील प्रकृति का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल है ।

    सारांश में, द्वीप परख, "Drosophila द्वीप परख" स्थूल और "द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट के साथ संयोजन में, एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय है, और अत्यधिक कुशल परख के लिए होना चाहए विश्लेषण और हरकत दोष यों की मात्रा एक उच्च प्रवाह तरीके में आंदोलन विकारों के Drosophila मॉडल ।

    Disclosures

    लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

    Acknowledgments

    हम P40OD018537 उपभेदों प्रदान करने के लिए वियना Drosophila संसाधन केंद्र और ब्लूमिंगटन Drosophila स्टॉक सेंटर (NIH Drosophila) स्वीकार करते हैं । हम द्वीप परख करने के लिए हमें शुरू करने और द्वीप परख सेटअप के निर्माण के लिए Martijn Eidhof के लिए Klämbt प्रयोगशाला के लिए आभारी हैं । इस अध्ययन में ई दुर्लभ-3 संयुक्त अंतरराष्ट्रीय कॉल अनुदान "ऑटोसोमल अवकाश ataxias के लिए तैयारी" (NWO ९००३०३७६०४), एक शीर्ष अनुदान (912-12-109) से नीदरलैंड संगठन के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान (NWO), और द्वारा समर्थित भाग में था two DCN/Radboud यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर पीएचडी फैलोशिप. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    25 x 95 mm Drosophila vials Flystuff 32-116SB -
    Logitech C525 HD Webcam Logitech - Any webcam with USB connection is suitable.
    Stand to hold webcam - - -
    Lamp - - 12 V LED lights are appropriate
    Pounding pad - - Any mouse pad works
    Island Assay box - - Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
    Island Assay bath - - Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
    Island/platform - - Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
    Soap - - Standard dishwashing detergent is suitable.
    Computer - - Scripts run both on Windows and Mac
    Image-recording software: HandiAvi® AZcendant® - HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
    Image-recording software: WebcamCapture - - Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.
    Fiji - - Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
    R studio - - Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
    R - - Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
    2. Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
    3. He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
    4. Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
    5. Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
    6. Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
    7. Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
    8. Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
    9. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
    10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    11. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
    12. RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
    13. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
    14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
    15. Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
    16. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
    17. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).

    Tags

    तंत्रिका विज्ञान अंक १२९ उच्च प्रवाह स्वत: ठहराव मोटर व्यवहार गतिवान उड़ान प्रतिक्रिया रोग मॉडल आंदोलन विकारों द्वीप परख Drosophila
    <em>Drosophila </em>द्वीप परख में हरकत व्यवहार के उच्च प्रवाह विश्लेषण
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Eidhof, I., Fenckova, M., Elurbe, D. … More

    Eidhof, I., Fenckova, M., Elurbe, D. M., van de Warrenburg, B., Castells Nobau, A., Schenck, A. High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay. J. Vis. Exp. (129), e55892, doi:10.3791/55892 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter