Summary
Øya analysen er en relativt ny, kostnadseffektiv analysen som kan brukes til å evaluere den grunnleggende locomotor virkemåten til Drosophila melanogaster. Dette manuskriptet beskriver algoritmer for automatisk databehandling og objektiv måling av øya analysen data, gjør denne analysen en følsom, høy gjennomstrømming avlesning for genetisk eller farmakologiske storskjermer.
Abstract
Fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi bidrar til identifisering av (kandidat) sykdom gener for bevegelsesforstyrrelser og andre nevrologiske sykdommer med en økende hastighet. Men er lite kjent om molekylære mekanismer som ligger til grunn for disse lidelser. Genetisk, molekylær og atferdsmessige verktøykassen i Drosophila melanogaster gjør denne modellen organismen spesielt nyttig å karakterisere ny sykdom gener og mekanismer på en høy gjennomstrømming måte. Likevel krever høy gjennomstrømming skjermene effektiv og pålitelig analyser at ideelt sett er kostnadseffektive og tillate den automatiske kvantifiseringen av egenskaper gjelder for disse lidelser. Øya analysen er en kostnadseffektiv og enkelt oppsett metoden for å evaluere Drosophila locomotor atferd. I denne analysen, blir fluer kastet på en plattform fra en fast høyde. Dette medfører en medfødt motor svar som gjør fluene å flykte fra plattformen i sekunder. I dag utføres kvantitative analyser av filmet øya analyser manuelt, som er en arbeidskrevende oppgave, spesielt når store skjermer.
Dette manuskriptet beskriver"Drosophila øya analysen" og "Øya analysen analyse" algoritmer for høy gjennomstrømming, automatisert databehandling og kvantifisering av øya analysen data. I oppsett samler en enkel webcam koblet til laptop en bilde serie plattformen mens analysen utføres. "Drosophila øya analysen" algoritme utviklet for åpen kildekode programvare Fiji behandler disse bildet serien og kvantifiserer, for hver eksperimentelle tilstand, antall fluer på plattformen over tid. "Øya analysen analyse" skriptet, kompatibel med gratisprogrammet R, utviklet automatisk behandle innhentet data og beregne om behandlinger/genotyper er statistisk forskjellige. Dette sterkt forbedrer effektiviteten til øya analysen og gjør det en kraftig avlesning for grunnleggende bevegelse og fly atferd. Det kan derfor brukes til store skjermer undersøker fly locomotor evne, Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser, og narkotika effekt.
Introduction
De siste årene, har fremskritt innen neste generasjons sekvensering teknologi sterkt bidratt til identifisering av gener underliggende degenerative bevegelsesforstyrrelser av hjernen (f.eks lillehjernen ataksi og Parkinsons), for perifere neuronal opprinnelse (f.eks amyotrofisk lateral sklerose og arvelige spastisk paraplegia), og muskel opprinnelse (f.eks Duchenne muskeldystrofi og myotonic dystrophy)1,2,3,4 . Til tross for dette, er lite kjent om molekylære mekanismer som ligger til grunn for de fleste av disse lidelsene. En bedre forståelse av disse mekanismene er avgjørende for å utvikle terapier.
Som mennesker kontrollert bevegelse i modellen organismer, som fly og bevegelse i Drosophila, av den sentrale hjernen, perifere nervesystemet og muskler. I tillegg den rask generasjonstid og genetisk verktøykassen i Drosophila gjør denne modellen organismen spesielt egnet for høy gjennomstrømming screening av gener involvert i bevegelsesforstyrrelser og for narkotikatesting5,6 . På grunn av betydelig antall betingelser som må testes i slike skjermer, pålitelig, kostnadseffektiv, og relativt enkle analyser, samt verktøy for å kvantifisere output resultatene på en automatisert måte, er svært ettertraktet.
Schmidt et al. (2012) 7 beskrev en rimelig test kalt "øya analysen" evaluere Drosophila locomotor atferd. Øya analysen har blitt brukt med hell i store screenings for å identifisere gener glia-spesifikke funksjoner7i evalueringen av Drosophila modeller av intellektuelle handikap8, og for generell vurdering av fly motor atferd9. Prinsippet utformingen av øya analysen består av en opphøyet plattform som flere fluer blir kastet. Dette medfører en medfødt motor virkemåten som gir sunn fluer å flykte fra plattformen i sekunder. Analysen måler antallet flyr igjen på plattformen over tid7,8,9. Alle disse funksjonene indikerer at øya analysen kan være et kraftig screeningsverktøy for tilblivelse involvert inne bevegelsesforstyrrelser.
Foreløpig er kvantitativ analyse filmet øya analysen data gjort manuelt7,8,9. For å forbedre effektiviteten av analysen, ble en rimelig metode utviklet for å kvantifisere halvautomatisk rømning av fluer fra plattformen. Oppsettet bruker en enkel webcam koblet til laptop for å samle bilde tid serie plattformen, med rammer kjøpt hver 0,1 s. rammer behandles deretter med makroen"Drosophila øya analysen" som kvantifiserer antall fluer på plattformen over tid. Makroen"Drosophila øya analysen" er delt inn i tre uavhengige sub makroer: (I) "Opprett stabel og projeksjon," sub makro identifiserer ulike øya eksperimenter lagret i forskjellige undermapper og skaper en stabel og en projeksjon av hver tidsserier. (II) "Definere plattform" sub makroen åpnes fortløpende alle "Projection_image_name.tif" filer i enkelte eksperimentelle undermappene, da brukeren blir bedt om å definere manuelt øya plattformen som region av interesse (ROI). (III) "analyse" kvantifiserer automatisk antall flyr igjen på plattformen under tiden serien. Sub makroene kan kjøres etter hverandre (i en løpe) eller uavhengig. For statistiske dataanalyse utviklet et skript til å behandle automatisk innhentet data og bruke en statistisk test for å fastslå om behandlinger/genotyper oppfører seg vesentlig forskjellig fra hverandre (figur 1). Til slutt er det vist at dette oppsettet kan brukes til å evaluere og kvantifisere avvikende locomotor evne til Drosophila modell for ataksi-telangiectasia (AT).
Protocol
1. bygging av øya analysen boksen
- forberede en skuff laget av en robust material, som poly methyl methacrylate (PMMA) inneholder et lag med vann (dvs. et bad). Sikre at materialet ikke hvit.
Merk: Dimensjoner av 40 x 35 x 2,5 cm 3 anbefales ( figur 1A). - Forberede en boks (42 x 38 x 25 cm 3) laget av en robust og gjennomsiktig materiale, for eksempel PMMA rundt badekaret å hindre fluene rømmer i laboratoriet plass. Plassere et hull (20 x 30 cm 2) på den laterale siden som er stor nok for eksperimentator enkelt håndtere hetteglass med fluer og slippe dem på øya ( figur 1A).
- Forberede en opphøyet plattform 10 x 15 x 2,5 cm 3 i dimensjon, laget av en ugjennomtrengelig materiale (PMMA eller plast) som er vanntett.
Merk: Denne plattformen er nødvendig å ha en jevn hvit overflate å sikre god kontrast for bildeanalyser. Størrelsen er ikke nødvendigvis fast, men det bør være store nok til å sikre at alle fluer først lande på plattformen og få sjansen til å gå på det ( figur 1A). - Fikse plattformen lime det i for bading eller å plassere vekter eller andre tunge gjenstander i boksen plattform å hindre posisjonelle endringer av plattformen i eksperimentell/filming økt.
2. Programvarekrav og installasjon
- installasjon av bilde-innspillingen programvare.
- Nedlasting bilde-innspillingen programvare registrere øya bildet serien (se Materialer tabell) og installere programvaren på en datamaskin som.
Merk: Bildebehandling-opptak programvaren som beskrives i denne protokollen støttes bare av Windows. Et alternativ for andre brukere har blitt lagt til Materialer tabell.
- Nedlasting bilde-innspillingen programvare registrere øya bildet serien (se Materialer tabell) og installere programvaren på en datamaskin som.
- " Drosophila øya analysen " makro installasjon.
- Laste ned den " Drosophila øya analysen " makro og den kompatibel Fiji 10-versjonen (1.4 eller høyere) fra følgende webområde: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
- Markøren den " øya analysen " mappen og klikk på " visningen. "
- Klikk på " laste ned alle. " mappen innholdet lastes ned som en zip-fil, unzip den nedlastede filen.
- Kopi av " Drosophila øya Assay.ijm " filen i " Fiji.app/plugins/directory. "
Merk: Når du starter Fiji, den " Drosophila øya analysen " makroen vises nederst på rullegardinmenyen plugins.
- " Øya analysen analyse " script installasjon og nedlasting.
- Last ned R 11 fra følgende nettsted: https://cran.rstudio.com. Installere den på en datamaskin som.
- Last ned R studio fra følgende nettsted: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Installere den på en datamaskin som.
Merk: Den " øya testanalyse " skript kan kjøres med R bare. R-studio, med sin enklere grensesnitt, er presentert som alternativ trinnet for brukernes uerfarne med R. - Dataoverføre den " øya analysen analyse " skript fra den " Drosophila øya analysen " katalog på følgende nettsted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
Merk: etter grepet 2.2, den " øya analysen analyse " skriptet finnes også i den åpnede mappen heter " Island analysen. "
3. Utarbeidelse av fluene skal testes i øya analysen
- samle iscenesatte fluer for hver eksperimentelle betingelse under kalde eller karbondioksid (CO 2) anestesi, som beskrevet tidligere 13 (over en periode 1 - 2 dager).
- Forbered minst 3 prøven ampuller per eksperimentelle betingelse, hver med ca 15 iscenesatt flyr. Bare bruke flyr med intakt vinger og som er av samme alder og kjønn.
Merk: For eksperimenter beskrevet her, 5 eksempel ampuller som inneholder 15 mannlige fluer av genotyper w -; Utgangen-Gal4 / + (kontroll) og w -; Utgangen-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) ble samlet ved eclosion, alderen for 4 dager, og ble brukt til å utføre øya analysen. RNAi, kontroll stammer og utgangen-gal4 driveren var oppnådd fra en kommersiell kilde (se Materialer tabell).
- Forbered minst 3 prøven ampuller per eksperimentelle betingelse, hver med ca 15 iscenesatt flyr. Bare bruke flyr med intakt vinger og som er av samme alder og kjønn.
- La fluene gjenopprette for å unngå virkningene av bedøvelse (minst 1 dag ved CO 2) før testing samlet fluene i øya analysen i en alder av interesse.
4. eksperimentelle oppsett
Merk: se figur 1B.
- Legge til kaldt vann med en liten mengde såpe bad skuffen og posisjonere plattformen midt.
Merk: Såpe reduserer overflatespenning vann. fluer som berører vil drukne. Dette forhindrer økende mengder fluer fly i boksen under utviklingen av eksperimentelle økten. - Sted gjennomsiktig boksen på skuffen og belyse plattformen ovenfra med en lamp.
Merk: Belysning av plattformen er hovedsakelig nødvendig for å sikre riktig kontrasten. En vanlig 12-V LED-lys er egnet for dette. - Plasser webcam rett over plattformen (utenfor boksen) og koble den til en datamaskin.
- Opprette nye mapper på datamaskinen for å lagre forskjellige eksperimentelle data før eksperimenter.
- Følger strukturen i eksemplet illustrert i figur 2A for å opprette mapper. For eksempel hvis eksperimentell design krever testing to genotyper med fem gjentak hvert, først opprette en viktigste mappe som inneholder datoen for eksperimentet. I hovedmappen, oppretter du to undermapper (én per genotype). I genotype mappene, opprette fem nye undermapper, ett per replikere.
Merk: For videre analyse, er det viktig at bildet serien tilsvarer personlige eksperimenter lagres i mapper med entydige navn.
- Følger strukturen i eksemplet illustrert i figur 2A for å opprette mapper. For eksempel hvis eksperimentell design krever testing to genotyper med fem gjentak hvert, først opprette en viktigste mappe som inneholder datoen for eksperimentet. I hovedmappen, oppretter du to undermapper (én per genotype). I genotype mappene, opprette fem nye undermapper, ett per replikere.
5. Video innstillinger oppsettet i den " fange enhet " delen av grensesnittet
- Åpne bilde-innspillingen programvare og, under den " fange " kategorien, klikk på " Time-Lapse bilder … " og velg riktig webcam som den " Fange enheten. "
- Sett en død flue på øya; justere skjerminnstillingene ved å klikke på den " videoinnstillingene " boksen. Bla gjennom verktøyet barer, justere lysstyrke, kontrast og farge på en måte slik at død fly vises svarte på hvit bakgrunn ( figur 2B). Når innstillingene er fullført, klikker du " Ok. "
6. Opptak og Video lagre innstillinger for oppsett i den " Time-lapse " delen av grensesnittet
< ol>Merk: videofilen brukes ikke for kvantifisering av data, men det kan være nyttig å få en generell ide om eksperimentet.
- Komprimering, Velg " Intel IYUV koden " for videokomprimering og velg " ta en ramme hver 0,1 sekunder, " med de " avspilling rate (bilder per sekund): " på 10.
- Lagre eksperiment tiden serien som BMP rammer ved å klikke på " avansert … " Velg " opprette et BMP-bilde for hver fanget ramme. " Klikk på " bla. " Velg samme mappe i den " under AVI film fange " vinduet (som Utvalgte i trinn 6.1), klikk " Open, " og trykk " Ok. "
Merk: Legg merke til at under eksperimentet rammene, lagres som BMP-filer (nødvendig for dataanalyse). Programmet navn rammene som " A " etterfulgt av nummeret som tilsvarer rammen fange sekvensen (f.eks " A_number.bmp ") ( figur 2C). Alltid lagre bildene tilhører forskjellige eksperimenter i en ny mappe slik at tidligere innspilte bildet serien ikke vil bli overskrevet. Vær oppmerksom på at bildene ikke lagres automatisk i samme mappe som videofilen hvis mappen velges under " bla … " ved å klikke på " avansert " boksen.
7. Øya analysen og datainnsamling
- trykker på startknappen i time-lapse bilde grensesnittet til bilde-innspillingen programvare starte innspillingen.
- Trykk eksperimentelle ampullen inneholder fluer (trinn 3) 2 - 3 ganger å sikre at fluer på bunnen av ampullen. Raskt fjerne pluggen av ampullen og, med en sterk bevegelse, trykk ampullen på plattformen slik at alle fluer faller på plattformen samtidig ( figur 1 c).
- Etter ca 30 s, trykk på " stopper " knappen for å stoppe opptaket.
Merk: Hvis alle fluer forsvinner fra plattformen, opptak kan bli stoppet tidligere. - Fjerne fluene som gjenstår for 30 s på plattformen for hånd etter bildet innførsel.
- Før du fortsetter til innspillingen neste eksperimentet, endre målmappen for BMP-filer og filmer (se avsnitt 6).
8. Behandling: Kjører den " Drosophila øya analysen " makroen
Merk: se figur 1 d.
- Kjøre den " opprette stabel og projeksjon " sub makro jeg stabler og projeksjoner av samlet bildet serien.
- Start Fiji, klikk på " Plugins " i verktøylinjen og valgte " Drosophila øya analysen " et nytt vindu vises på rullegardinmenyen;.
- Enter i " først bilde tidsserier identifikator " i makro grafiske grensesnittet.
Merk: De innspilte rammene lagres som " A-number.bmp " i rekkefølgen som bildene er oppnådd. I den " første ramme identifikator " makro grensesnitt, fyll i innstillingen med nummeret til den første rammen av programmet og med filtypen. Fyller " først ramme identifikator " med "-0001.bmp, " siden det første delbildet kalles " A-0001.bmp " ( figur 2C). I tilfelle andre bildeformater (for eksempel TIFF eller JPEG) genereres av webcam, angi den riktige filtypen det første bildet i " først bilde tidsserier identifikator. " - velger du bare de " opprette stabel og projeksjon " sub makroen, klikker " Ok, " og velge hovedkatalog som inneholder alle undermapper med personlige øya analysen eksperimenter.
Merk: BMP-filer i hver enkelt eksperiment mappen som inneholder den " første ramme identifikator " behandles senere. To nye filer vises i hver enkelt eksperiment undermappe, som standard navnet " Stack_image_name.tif " og " Projection_image_name.tif " ( figur 1 d). Når dette trinnet utføres, kan BMP-filer slettes. Stabel og projeksjon TIF-filer inneholder alle data og er tilstrekkelig for videre analyse.
- Kjøre den " definere plattform " sub makro II velge den nøyaktige plasseringen av plattformen.
- Åpner det grafiske grensesnittet i den " Drosophila øya analysen, " Velg bare den " Definer plattform " avmerkingsboks, og trykk " Ok. "
- i den " velge en katalog " vindu, velge hovedkatalog der eksperimentell undermapper lagres og trykk " Velg. "
Merk: på " definere plattform " sub makroen søker automatisk etter " Projection_image_name.tif " filer i alle undermapper som er lagret i hoved-katalogen. Den " Projection_image_name.tif " bildet lagret i den første mappen, sammen med to windows — " definere plattformen " og " ROI manager " — åpnes. - Velg den " Polygon valg " verktøy på verktøylinjen for å trekke et utvalg som samsvarer med øya plattformen.
Merk: Det er svært viktig å ekskludere grenselandet av plattformen fra utvalget. Se figur 2D. - Etter valg av plattform i det første bildet, klikk på " Legg til " i den " ROI Manager " vinduet, valgte området vil vises i vinduet ROI manager som et verdisett ( figur 2D). Trykk " Ok " i den " definere plattformen " vindu. Makroen vil fortsette til neste projeksjon.
- Klikk på tallene ( figur 2D) lagret i den " ROI manager " vinduet, tidligere utvalg vil vises automatisk i gjeldende bilde projeksjon.
Merk: siden øya platform er sannsynlig å ha samme størrelse og posisjon når eksperimenter utføres på rad (så lenge plasseringen av webcam og øya forblir uendret), er det nyttig å lagre Avkastningen definere plattformen i den " ROI prosjektlederen. " av Dermed vil brukeren spare tid. i de kommende anslagene, er det bare nødvendig å klikk på midlertidig lagrede markeringen i Avkastningen manager. - Plasseringen av øya har litt flyttes i forhold til forrige eksperimentet, justere plasseringen av valget ved venstreklikke midt i det merkede området og dra det merkede området til ønsket posisjon.
- Hvis valget ikke samsvarer med plattformen, venstreklikker utenfor markeringen og avgrense et nytt utvalg plattform ved hjelp av " Polygon utvalg " verktøyet. Lagre den nye markeringen i Avkastningen manager ved " legge; " et nytt utvalg vises i den " ROI manager " vinduet som kan brukes kontinuerlig.
- Når valg er justert, klikk " Ok " i den " definere plattformen " vinduet og gjenta prosedyren til alle plattformer er definert.
Merk: Legg merke til at en binære bilder av plattformen tilsvarende kodedel ROI området i hvitt på svart bakgrunn, kalt " Platform_image_name.tif, " opptrådte for hvert behandlet bilde i undermappen for samme eksperimentelle stabel og projeksjon bilder genereres i trinn 8.1.3 ( figur 1 d).
- Definere fly minimumsstørrelsen.
Merk: Denne innstillingen angir minimal fly størrelsen i piksler. Partikler som er mindre enn den angitte størrelsen utelukkes fra analyse for å unngå falske positive på grunn av støy.- Åpner en bildestakk skapt av den " opprette stabel og projeksjon " sub makro I.
- Konvertere bildestakk til 8-biters ved å klikke bildet > > Type > > 8-biters.
- Går til menyen, trykk bilde > > Juster > > terskel, kontroller at den " mørk bakgrunn " boksen, og trykk " gjelder; " et annet vindu kalt " terskelen " vises. Klikk på " mørk background " og trykk " Ok. "
Merk: en binær bildestakk opprettes som fluene er definert i svart og hvitt-plattformen. Når dette ikke er tilfelle, den " Inverter " funksjonen ved å klikke Rediger > > Inverter > > kjører. - Angi skalaen å oppdage antall piksler ved å klikke analyser > > satt skala. Bruk følgende innstillinger: avstanden i piksler = 1, kjent avstand = 1, bildepunktproporsjoner = 1 og enhet i lengde = piksel. Trykk " Ok. "
- Velg den " Wand " (tracing) verktøyet i verktøylinjen, og klikk på et fly (svart prikk) finnes på plattformen. Trykk ctrl + m (Windows-brukere) eller cmd + m (Mac-brukere); en ny " resultatene " vinduet angir området valgte stedet i piksler. Gjør dette fortløpende for flere fluer og bestemme fly minimumsstørrelsen.
Merk: Når du kjører makroen, sette det " fly minimumsstørrelse " til de minste observert fly størrelsen minus en margin på 10%. ( figur 2E).
- Kjøre den " analyse " sub makro III å kvantifisere flyr rømmer fra plattformen.
- Gå til verktøylinjen Velg " Plugins, " og valgte den " Drosophila øya analysen. "
- Juster den " fly minimumsstørrelse " sette i henhold til verdien som er definert i trinn 8.3.
Merk: Bruk verdien angitt i trinn 8.3 Hvis standardinnstillingen av " fly minimumsstørrelse " forårsaker utelukkelse av fluer som var tilstede på plattformen eller hvis makroen oppdager bakgrunn signal som fluer. - i den " antall fluer per medisinglass " innstilling, fylle maksimalt antall fluer i hetteglass under hele eksperimentet. Hvis et eksperiment har ampuller som inneholder 15 fluer, andre som inneholder 20 fluer og andre som inneholder 23 fluer, for eksempel den " antall fluer per medisinglass " må angis som 23.
- Velg den " analyser " boksen og trykk " Ok; " en ny " velge en katalog " vindu. Velg hoved-katalogen (med alle undermapper og filer) og trykk på " Velg. "
Merk: makroen vil analysere alle bilder som er lagret i undermappene så lenge de inneholder den " stack_image_name, " " Projection_image_name, " og " Platform_image_name " filer. Makroen vil behandle bildet bilde. Makro produksjonen består av en binær resultatet bildestakk oppkalt “ result_stack_subfolder_name.tif ” og en resultat-tekstfil kalt " result_subfolder_name.txt, " som vises i hver mappe. den resulterende tekstfilen (txt) inneholder kvantitative mål tilsvarer bildet stable og består av 9 kolonner. Innholdet i disse kolonnene summeres i tabell 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " tilsvarer bildet tid-serien av et eksperiment, der flyr oppdaget under eksperimentet vises som svarte prikker på hvit bakgrunn ( figur 1E). - Nøye undersøke resultatet stabelen for å sikre at noen gjenstander har skjedd, og at makroen jobbet nøyaktig ( figur 2F).
Merk: Eksempler på gjenstander kan være bildeelementer som ikke flyr, men som gjenkjennes som sådan av bildet segmentering algoritmen (falske positiver). Dette kan for eksempel skyldes påvisning av bakgrunn signal på grunn av en unøyaktig utvalg av Avkastningen.
9. Data analyse ved hjelp av " Island analysen analyse "
- struktur dataene som vist i figur 2A å tillate analyse med den " øya analysen analyse " skript. Generere en viktigste mappe med undermapper, der hver undermappe tilsvarer en eksperimentell betingelse som skal analyseres.
- i undermappene, generere mapper som inneholder de uavhengige eksperimentelle replikat ( figur 2A) og results.txt filene produsert av den " Drosophila øya analysen " makro.
Merk: Den " øya analysen analyse " makroen vil behandle alle eksperimentelle forhold ligger i hoved-katalogen samtidig. - Starte R eller R studio. Klikk på fil > > åpne filen … i verktøylinjen, og velg den " øya analysen analyse " scriptet
- Installere ggplot2 og matrixStats pakker når du kjører den " øya analysen analyse " skript for første gang. Skriv inn følgende i konsollvinduet:
> install.packages("ggplot2"), angi
> install.packages("matrixStats"), angi.
- Installere ggplot2 og matrixStats pakker når du kjører den " øya analysen analyse " skript for første gang. Skriv inn følgende i konsollvinduet:
- Angi plasseringen av data og analyse utdata filer i skriptet. Sett i følgende skript rader:
- rad 16: sette inn banen til de viktigste katalogen som inneholder forsøkene analysert og forhold (i figur 2A, er banen henviser til den " øya analysen " mappen).
- Rad 19: sette inn banen til mappen der utdatafiler analyse lagres.
Merk: Katalogen som er angitt i rad 16 kan bare inneholde mappene som skal analyseres. Skriptet vil heller ikke fungere skikkelig hvis banene i rad 16 og rad 19 er like.
- Kjører skriptet ved å klikke kode > > kjører regionen > > Kjør alle fra verktøylinjen.
Merk: Legg merke til at tre resulterende CSV-filer og en resulterende txt fil ( figur 1E) vises i katalogen angitt i rad 19. Disse er: (I) på " data_all_conditions.csv " inneholder behandlet data tilsvarende hver eksperimentelle tilstand og eksperimentelle gjentak, organisert som beskrevet i tabell 2. (II) den " statistikk summary.csv " fil oppsummerer gjennomsnittet og standardavviket (SD) standard feil av gjsnitt (SEM) prosent av fluer på plattformen for hver eksperimentelle tilstand. (III) den " AUC.csv " inneholder området under kurven for hver eksperimentelle replikere. (IV) avhengig av antall betingelser i hovedmappen, manuskriptet ville enten Eksporter en " Welch_t-test_results.txt " filen (2 betingelser) eller " AUC_anova_results.txt " filen (mer enn 2 betingelser), der resultatene av t-test eller ANOVA sammenligne området under kurven mellom eksperimentelle forhold er indikert. Merknad som fire typer TIFF-bildefiler ( figur 1E) vises i banen som er definert i raden 19. Disse kalles: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (der Name_Of_Data_Folder representerer mappenavnet av brukeren), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " og " AUC_anova.tiff. " detaljert informasjon om innholdet i disse grafene kan bli funnet i representant resultatene av dette manuskriptet og Figur 3.
Representative Results
I beskrevet protokollen, er Drosophila øya analysen data kjøpt og behandlet i tre trinn. Først fly escape svar Drosophila kastet på øya plattformen registreres med et webkamera og lagres som individuelle BMP-bilder (protokollen seksjoner 1-7). Andre behandler"Drosophila øya analysen" makroen (trinn 8) rammene, generere en "result.txt" tekstfil (tabell 1), som antall objekter i hver ramme summeres, og en bildestakk "Result_stack.tiff", som viser objektene funnet innenfor området for plattformen i hver ramme. Tredje behandler "Øya analysen analyse" skriptet (protocol delen 9) makro data lagret i "results.txt" filene personlige eksperimenter. Flere trinn er innlemmet i manuset for å filtrere og kombinere data for statistisk analyse. Den første rammen der fluene blir kastet på plattformen oppdages og betraktet som punkt 1. Tidligere rammer elimineres fra datasettet. 100 rammer følgende tid punkt 1 (tilsvarer 10 s) er valgt for analyse. Eksperimenter der det opprinnelige antallet fluer oppdaget på plattformen er mindre enn 5 er automatisk utelukket fra analysen, eliminere upålitelige resultater fra underpowered eksperimenter. Eksperimenter som første fluer oppdaget på plattformen overskrider innstillingen "Antall fluer per medisinglass" pluss en toleranse for 3 utelates også. Dette eliminerer datasett i som støy partikler ble feilaktig oppdaget som fluer. Skriptet beregner prosenten av fluer oppdaget for hvert punkt sammenlignet med flest fluer i serien. Feil i datasett forårsaket av fluer gangavstand av Avkastningen (oppdaget en nedgang etterfulgt av en økning i prosentandelen av fluer på plattformen over tid) er automatisk korrigert av om dem som konsekvent tilstede på plattformen på tidligere stadier . Alle Repliker datasett for en bestemt eksperimentelle tilstand som fantes i hoved-katalogen er kombinert og eksportert til filen "data_all_conditions.csv". Kolonnene representerer variablene beskrevet i tabell 2. Skriptet eksporterer også et linjediagram for hver eksperimentelle tilstand, oppkalt etter mappen som inneholder dataene. Denne grafen viser prosent av fluer igjen på plattformen over tid (flight escape svar) for den eksperimentelle replikerer finnes i mappen respektive ((figur 3A)-B). Mening, SD, og SEM for hver eksperimentelle betingelse beregnes og oppsummert i filen "Statistikk summary.csv". Et linjediagram kalt "Escape_response_all_conditions.tiff" viser gjennomsnittlig flight escape svaret for opptil 12 eksperimentelle forhold finnes i hovedmappen ()Figur 3 c). Endelig området under kurven for alle eksperimentelle forhold i hovedmappen beregnes og oppsummert i filen "AUC.csv". Hvor mange av betingelser i hovedmappen, skriptet vil utføre en tosidig kort Welch t-test (2 betingelser) eller en VARIANSANALYSE med Tukey korreksjon for flere tester (mer enn 2 betingelser) å fastslå om den eksperimentelle vilkårene avviker vesentlig fra hverandre. Disse resultatene oppsummeres i "Welch_t-test_results.txt" eller "AUC_anova_results.txt." Når du utfører VARIANSANALYSE, eksporterer skriptet også en "AUC_anova.tiff" fil som viser forskjellen i gjennomsnittet AUC og 95% sikkerhet intervaller av eksperimentelle forhold som sammenlignes. Verdiene for absolutt området under kurven av de eksperimentelle replikat for alle eksperimentelle forhold vises som individuelle datapunkter med medians i "AUC.tiff" (figur 3D).
Ataksi Telangiectasia (AT) er en autosomal recessiv bevegelighet lidelse preget av tidlig debut av lillehjernen ataksi på grunn av mutasjoner i den ataksi Telangiectasia mutert (ATM) genet14. Mutanter av Drosophila orthologue av ATM, tefu, vise feil i mobilitet og lang levetid15. For å vurdere makroen"Drosophila øya analysen", en Drosophila modell av AT ble testet i øya analysen, og dataene utgangen av makroen var i forhold til manuelle teller. Resultatene viser at allestedsnærværende tefu knockdown (w-; Actin-Gal4/GD11950) betydelig reduserer muligheten for disse fluene å la på plattformen sammenlignet med sine genetisk bakgrunn kontroller (w-; Actin-Gal4/+) (Figur 4). Etter 1 s, 50% av kontroll fluene hadde rømt plattformen, i motsetning til den < 1% av tefu- RNAi fluer. Viktigere, innhentet med makroen trofast gjengitt dataene innhentet av manuelle telle, indikerer at makroen er et pålitelig verktøy som kan brukes for kvantifisering av øya analysen data og evaluering av bevegelsen feil ( ) Figur 4 A-B).
Figur 1: flytskjema som viser kravene, eksperimentelle prosedyren, og analyse av øya analysen. (A) øya analysen utstyr. (B) eksperimentelle oppsett for øya analysen. (C) øya analysen. (D) behandling av øya analysen data med makroen"Drosophila øya analysen". Makroen"Drosophila øya analysen" består av 3 sub makroer: 1) kontroller stabelen og projeksjon, 2) definere plattform og 3) analyse. (E) behandling og statistiske evalueringer av data ved hjelp av skriptet "Øya analysen analyse". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempler på forskjellige justeringer kreves under protokollen. (A) den nødvendige mappestrukturen som øya analysen eksperimenter må lagres for databehandling og analyse. (B) når du justerer videoinnstillingene, fluer må vises svarte på hvit bakgrunn. (C) bilderammen utdatafilerlagret av bilde-opptak beskrevet i dette manuskriptet. (D) gule omriss viser valget som plattform. Lagrede plattform utvalget i "Avkastningen Manager" er uthevet i blått. (E) flyr vises som hvite prikker under justering av "fly minimumsstørrelse innstillingen." Resultatvinduet viser området fluene i piksler. (F) eksempel på en enkelt innspilt bilde ramme (på venstre) og den tilhørende rammen i den resulterende bildestakk, med makroen"Drosophila øya analysen" (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: resultatet bilder innhentet etter behandling med "Øya analysen analyse" scriptet (A) linje graf som viser flight escape respons for hver kontroll eksperimentelle replikere. (B) linje graf viser flight escape svaret for hver tefu RNAi eksperimentelle replikere. (C) gjennomsnittlig flight escape respons for angitte eksperimentelle forhold; feilfeltene representerer SEM. (D) Dot tomter som representerer området under kurven fordelingen for kontroll og mutant forhold. Eksperimentell gjentak for både tefu RNAi og kontroll forhold vises som individuelle datapunkter (i svart) med medians (rød linje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Allestedsnærværende tefu knockdown fluer viser en betydelig redusert evne til å forlate plattformen. Dataene representerer prosent av fluer på plattformen over tid (s) for kontrollen (w-; Actin-Gal4/+) og tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) flyr. (tall av replikat = 5; feilfeltene representerer SEM). (A) rå data innhentet med makroen"Drosophila øya analysen". (B) Dot tomter som representerer området under kurven fordelingen for kontroll og tefu RNAi forhold med makroen"Drosophila øya analysen" (Welch unpaired t-test, ** p < 0,01). (C) rådata ved manuelt å telle antall flyr finnes på øya per sekund. (D) Dot tomter som representerer området under kurven fordelingen for kontroll og Tefu RNAi forhold innhentet av hånd-telling (Welch unpaired t-test, ** p < 0,01). Feilfeltene representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kolonnenavn | Beskrivelse | ||
| Skive | Navnet på rammen. | ||
| Antall | Antall objekter i rammen innenfor rammene av plattformen (ROI). | ||
| Areal | Totalt areal på objektene oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI) i piksler. | ||
| Gjennomsnittlig størrelse | Totalt areal på objektene oppdaget inne rammen delt på antall objekter innenfor rammene av plattformen (ROI). | ||
| % Området | Prosenten av område okkupert av objektene forhold til det totale arealet av plattformen (ROI). | ||
| Perim. | Totalt omkretsen av objektene oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI) i piksler. | ||
| Min. flyr størrelse | Minimum fly innstillingen definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen" (i piksler). | ||
| Området avkastning | Området av plattformen (ROI) defineres av brukeren under kjøring av makroen sub definere plattform (i piksler). | ||
| Antall fluer | Antall fluer brukes per eksperiment definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen". | ||
Tabell 1: Parametere målt ved makroen"Drosophila øya analysen". Parameterne som beskrives i denne tabellen vises i filen "resultat.txt" ved"Drosophila øya analysen" makroen.
| Kolonnenavn | Beskrivelse | ||
| Skive | Bildenummer. | ||
| Antall | Antall fluer oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI). | ||
| X.Area | Totalt areal på fluene oppdaget inne rammen innenfor rammene av plattformen (ROI) i piksler. | ||
| Min. flyr størrelse | Minimum fly posten innstillingen definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen" (i piksler). | ||
| Området avkastning | Området av plattformen (ROI, i piksler) defineres av brukeren når sub-makroen "Definer plattform". | ||
| Antall fluer | Antall fluer brukes per eksperiment definert av brukeren i det grafiske grensesnittet i makroen"Drosophila øya analysen". | ||
| X.Count | % flyr tilstede på plattformen i respektive skive/rammen i forhold til det høyeste antallet fluer oppdaget på plattformen under eksperimentet. | ||
| Timepoint | Punkt 1 representerer den første rammen å bli analysert og tilsvarer rammen hvor fluene først vises på plattformen. Det er totalt 100 bilder per replikere analysert (tilsvarer 10 s, når du bruker innstillingene som beskrevet ovenfor. | ||
| Eksperimentet | Antall gjentak per betingelse. | ||
| Tilstand | Angir navnet på eksperimentell tilstanden (ifølge brukerdefinerte navnet på mappen som inneholder dataene). | ||
Tabell 2: beskrivelse av variablene innhentet etter behandling data med "Øya analysen analyse" scriptet Parameterne som beskrives i denne tabellen vises i filen "data_all_conditions.csv" ved behandling av data med skriptet "Øya analysen analyse".
Discussion
Denne protokollen beskriver"Drosophila øya analysen" makroen som kvantitativt vurderer Drosophila motor oppførsel under øya analysen. Makroen teller nøyaktig fluene på plattformen over tid, gjør øya analysen svært sensitive og egnet for kvantitative høy gjennomstrømming evaluering av locomotor defekter. Metodikken kan sammenligne betingelsene, med fluer dyrket under ulike genetiske og/eller miljømessige forhold, herunder narkotika eksponering. Denne avlesning er derfor spesielt nyttig som oppdagelsesverktøy når utføre genetiske eller farmasøytiske storskjermer, når studere Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser og andre nevrologiske sykdommer, eller undersøke bevegelse eller fly oppførsel.
Øya analysen protokollen presentert i dette manuskriptet gir fordelene over eksisterende/alternativ metoder. For eksempel er video-sporing bevegelse mye mer tidkrevende og mindre egnet for testing store utvalgene. Øya analysen er en høy gjennomstrømming screening verktøyet, og i denne forstand, er sammenlignbar med rask interaktive negative geotaxis (RING) analysen16. Forskjellen mellom to er at øya analyser tillater påvisning av et bredere spekter av locomotor problemer; russernes fluer forlate plattformen kan skyldes feil i flyet, hopping, eller gå atferd forårsaket av vingen (muskel/neuronal) og/eller ben (muskel/neuronal) feil. På den annen side, vurderer RING analysen defekter i klatring/gåing atferd skyldes etappe (muskel/neuronal) feil. Dersom brukerne er interessert i flere atferdsmessige readouts, kan øya analysen også kombineres med andre analyser, for eksempel RING analysen. I tillegg lasere kreves for optogenetics kan enkelt installeres i boksen øya analysen, og oppsettet er så enkel at den kan lett flyttes til et rom der temperaturen og lys kan kontrolleres.
For å sikre suksess og reproduserbarhet til øya analysen beskrevet her, bør flere anbefalinger følges. Aliquot og overføre fluene eksperimentell test ampuller på minst en dag før å unngå virkningene av CO2 eller kald anestesi. Ikke overfylle eksperimentelle hetteglass (bruker 10-15 fluer per medisinglass, er det best å alltid plassere samme antall fluer per medisinglass). Holde fluene på fersk mat til alle tider. Hvis ikke ennå kjent med gjennomføre analysen, praksis kaster flyr på plattformen å maksimere avkastningen. Også praksis raskt trekke hånden rett etterpå som det forstyrrer dataanalyse (bildeanalyse og fly teller start før hånden er ut av bildet). Holde de miljømessige og eksperimentelle forholdene identiske eksperimenter som skal sammenlignes (f.eks kontroller versus mutanter eller et genotype testet på ulike aldersgrupper). Alltid utføre eksperimenter på samme tid av dagen og opprettholde hetteglass under kontrollert temperatur og luftfuktighet. Statistisk makt, teste minst tre tekniske gjentak per biologiske replikere.
For å sikre vellykket ytelsen til makroen som beskrives her, webkamera og innstillinger må justeres for å oppnå maksimal kontrast: flyr vises som svarte objekter på en hvit plattform. Når antall fluer ikke regnes riktig makroen, justere kontrasten, se om Avkastningen er riktig valgt og sikre at flyr på plattformen er over angitte minimumsverdien fly innstillingen (se trinn 8.3 av denne protokollen). Innstillingene må bare defineres én gang. De gjelder for alle eksperimenter, som avstanden mellom webkameraet og plattformen ikke er endret. Circularity_min og maks innstillinger definerer circularity av partikler (partikler = telt fluer) som vil bli tatt i betraktning for analyse (flyr = telt objekter). 1 representerer en perfekt sirkel, og 0 representerer en linje17. Siden fluene presentere alltid en viss grad av circularity (et fly ikke kan vises som en rett linje), den "Circularity_max"-innstillingen er satt til 1 og innstillingen "Circularity_min" er satt på 0,4. Det er usannsynlig at du må justere disse innstillingene.
Makroen gjør noen ganger telling feil når en flue ligger nær grensen til plattformen. Dette kan skje hvis fluene ikke kan fly men spasertur av brukerdefinerte Avkastningen. Oftest kanne merke Avkastningen (montering det så mye som mulig til plattformen) lett oppklare problemet. Men skriptet "Øya analysen analyse" er kjøpedyktig merker og riktige feil data teller forårsaket av fluer gangavstand av Avkastningen relativt godt. Selv om oppløsningen til webkameraet presenteres her er høy nok til å diskriminere fluer i nærheten ganske godt, har vi implementert flere algoritmer i bildet behandlingen prosedyren for"Drosophila øya analysen" makroen, som den vannskille og eroderes funksjonen17. Disse lette riktig avgrensning av fluer i nærheten på plattformen. i tillegg makroen er ikke kan skille mellom fluene som hoppet fra plattformen eller fløy fra den. Likevel, det er vanligvis observert at friske unge fly stammer fly bort umiddelbart når slippes på plattformen, mens eldre fluer og fluer med locomotor underskudd forbli lenger på plattformen og vil til slutt hoppe eller faller av plattformen. Til tross for disse begrensningene gir analysen og analyse en svært nøyaktig grad av locomotor atferd.
For å sikre vellykket resultatene av skriptet "Øya analysen analyse", må brukeren sørge for å angi riktig banene for input og output filene i skript-rader som er angitt i protokollen og gi dataene i riktig mappe format (som angitt i figur 2). Hvis brukeren finner kriteriet for å filtrere ut upålitelige eksperimentelle data for strenge (rad 68: den første verdien i kolonnen "Teller" er mindre enn eller lik 5, rad 71: den første verdien i kolonnen "Teller" er høyere enn det totale antallet fluer kastet på platfo RM 3), slå av disse innstillingene ved å legge en # foran teksten i rader 68 og 71 i skriptet "Øya analysen analyse". I dette tilfellet inkluderes alle datasett i analysen. Eventuelt kan innstillinger endres ved å justere verdiene i radene med 68 og 71 i henhold til brukernes behov. Mulig gjenstander i telle verdiene i "results.txt" genereres"Drosophila øya analysen" makroen kan også justeres manuelt, og skriptet kan kjøres igjen på justert dataene. Når brukeren er interessert i behandling av mer enn 10 fps, eller mer enn 10 s data, antall rammer behandles av skriptet "Øya analysen analyse" børjusteres. Den statistiske analysen kan også bli erstattet av brukerdefinerte alternativer.
En mappe kalt "Eksempler øya analysen," som inneholder eksempler med bilde tidsserier får øya analysen, kan finnes på følgende nettsted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Last ned mappen "Eksempler øya analysen" og Følg fremgangsmåten beskrevet i denne protokollen for raskt bli kjent med strukturen for fillagring, behandling av bilder med makroen "Drosophila øya analysen" og "Øya analysen analyse" skriptet.
Øya analysen, kan i kombinasjon med utviklet makro og analyse skript, brukes til å evaluere og kvantifisere avvikende bevegelse virkemåten til en Drosophila modell av ataksi-Telangiectasia. Siden analysen kan effektivt brukes til ulike aldre, er det godt egnet til å analysere fenotyper potensielt progressiv natur.
Oppsummert er øya analysen, i kombinasjon med makroen"Drosophila øya analysen" og "Øya analysen analyse" manuset, en kostnadseffektiv, pålitelig og svært effektiv analysen objektivt analysere og kvantifisere locomotor feil av Drosophila modeller av bevegelsesforstyrrelser på en høy gjennomstrømming måte.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner Vienna Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila lager center (NIH P40OD018537) for å gi Drosophila stammer. Vi er takknemlige for Klämbt laboratorium for å introdusere oss til øya analysen og Martijn Eidhof for å bygge øya analysen oppsettet. Denne studien var i delen støttet av E-SJELDNE-3 felles transnasjonale kaller gi "Forbereder terapi for autosomalt recessiv ataxias" FORBERED (NWO 9003037604), av en topp grant (912-12-109) fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO), og ved to DCN/Radboud University Medical Center PhD stipend. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | - |
| Logitech C525 HD Webcam | Logitech | - | Any webcam with USB connection is suitable. |
| Stand to hold webcam | - | - | - |
| Lamp | - | - | 12 V LED lights are appropriate |
| Pounding pad | - | - | Any mouse pad works |
| Island Assay box | - | - | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent. |
| Island Assay bath | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
| Island/platform | - | - | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
| Soap | - | - | Standard dishwashing detergent is suitable. |
| Computer | - | - | Scripts run both on Windows and Mac |
| Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | - | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
| Image-recording software: WebcamCapture | - | - | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
| Fiji | - | - | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
| R studio | - | - | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
| R | - | - | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |
References
- Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
- Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
- He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
- Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
- Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
- Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
- Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
- Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
- RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
- Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
- Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).
- Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).
