Immunology and Infection

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/55898

Laura Rodriguez¹, Aitor Nogales¹, Luis Martínez-Sobrido¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Summary

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Abstract

Vírus da gripe causam mais de 500.000 mortes em todo o mundo¹ e estão associados a um custo anual de US $ 12 bilhões nos Estados Unidos sozinho, considerando médica direta e as despesas de hospitalização e de absentismo de trabalho². Modelos animais são cruciais em estudos de Influenza A virus (IAV) para avaliar a patogênese viral, as interações patógeno-hospedeiro, respostas imunes, e a eficácia da vacina atual e/ou nova abordagens bem como antivirais. Ratos são um modelo animal pequeno vantajoso porque seu sistema imunológico é evolutivamente semelhante ao encontrado em seres humanos, eles estão disponíveis de fornecedores comerciais como indivíduos geneticamente idênticos, há múltiplas variedades que podem ser exploradas para avaliar a base genética das infecções, e são relativamente baratos e fáceis de manipular. Para recapitular infecção IAV nos seres humanos através das vias aéreas, os ratos são primeiro anestesiados antes da inoculação intranasal com infecciosas IAVs sob contenção adequada de biossegurança. Após a infecção, a patogênese da IAVs é determinada pelo monitoramento diário da morbidade (perda de peso de corpo) e a taxa de mortalidade (sobrevivência). Além disso, a patogênese viral também pode ser avaliada por avaliar a replicação do vírus no superior (mucosa nasal) ou inferior (pulmões) do trato respiratório de ratos infectados. Respostas humorais após infecção IAV podem ser rapidamente avaliadas por sangramento não-invasiva e detecção do anticorpo secundário ensaios destinados a detectar a presença de total ou anticorpos neutralizantes. Aqui, descrevemos os métodos comuns usados para infectar camundongos practicar (i.n) com IAV e avaliar a eficácia de proteção, humorais respostas imunes e patogênese.

Introduction

IAVs são vírus envelopadas classificados na família Orthomyxoviridae ³. Eles contêm oito moléculas de RNA único-encalhado com polaridade negativa³. Em humanos, IAVs causam epidemias sazonais e ocasionais pandemias de consequência importante quando novos vírus são introduzidas na população humana⁴. Além disso, IAVs sazonais são altamente e rapidamente transmitidos entre os seres humanos, produzindo uma elevada perda econômica em todo o mundo a cada ano²^,⁵. IAV os sintomas incluem tosse, congestão nasal, febre, mal-estar, dor de cabeça, anorexia e mialgia, mas o vírus também pode produzir uma doença mais grave em pacientes imunocomprometidos⁶. Na verdade, a Organização Mundial de saúde (OMS) calcula que os vírus da gripe sazonal com 300.000-500.000 mortes em todo o mundo que cada ano¹. Existem apenas duas classes de drogas atualmente aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para a profilaxia de gripe e tratamento em seres humanos: inibidores de neuraminidase (NA) (por exemplo, oseltamivir) e bloqueadores do canal de íon M2 (por exemplo, Amantadina); no entanto, o surgimento de variantes do vírus resistentes aos medicamentos é uma preocupação crescente. Vacinação, portanto, continua a ser a melhor opção de médica para proteger os humanos contra infecções IAVs. Até à data, três tipos de gripe, as vacinas licenciadas pelo FDA para uso humano estão disponíveis: vacinas de proteína hemaglutinina viral recombinante (HA), inactivadas (IIV) vacinas contra a gripe e viver-atenuado gripe vacinas (LAIV)⁵^, ⁷. as três vacinas são projetadas para induzir resposta imune adaptativa contra a proteína viral HA, o alvo principal dos anticorpos contra IAVs neutralizantes.

Um modelo de mouse validado para estudar IAV infecção na vivo

Modelos animais têm sido usados para estudar, entre outros, IAV patogênese⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹, virais fatores que contribuem para doença¹² e/ou transmissão viral¹³ ^,¹⁴, e testar a eficácia de novas vacinas ou antiviral drogas⁹^,¹⁰^,¹⁵. Camundongos (Mus musculus) são o modelo animal mais extensivamente usado para pesquisa IAV por vários motivos: 1) o sistema imunológico é evolutivamente semelhante ao que se apresentam nos seres humanos; 2) compra animal de baixo custo, incluindo, moradia e reprodução; 3) pequeno tamanho facilmente manipular e armazenar; 4) variabilidade do anfitrião mínima para obter respostas homogêneas e resultados; 5) amplo conhecimento da biologia de ratos, incluindo a sequência do genoma; 6) muitos disponíveis de biologia molecular e/ou reagentes Imunologia; 7) disponível nocaute (KO) ratos para estudar a contribuição de uma proteína do hospedeiro na infecção viral; e, 8) múltiplas variedades do mouse que podem ser exploradas para avaliar as bases genéticas de infecções.

Existem várias cepas de rato atualmente disponíveis para estudar IAV na vivo. Idade, estado imune, sexo, estirpe genética de fundo e mouse, bem como rotas de infecção, dose e estirpes virais influenciam o resultado da infecção do IAV em camundongos. As cepas de rato mais comuns utilizadas na investigação IAV são C57BL/6, BALB/C e, mais recentemente, DBA.2 ratos, desde que eles são mais suscetíveis à doença do IAV que as duas linhagens ex¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^, ¹⁹ ^, ²⁰. importante, a resposta imune também pode ser diferente dependendo o rato estirpe¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Assim, é muito importante recuperar todas as informações disponíveis sobre o mouse e a estirpe do IAV para escolher a melhor opção para o experimento a ser realizado.

Embora o rato é um bom modelo animal de infecção para estudos em vivo com IAV, eles têm várias limitações, que precisam ser considerados no projeto experimental. Por exemplo, uma grande limitação do uso de ratos para estudos em vivo é que IAVs não transmitem entre ratos. Assim, para a transmissão de estudos, mais aceitos modelos animais (por exemplo, furões ou cobaias) são usados¹⁶^,¹⁷^,²¹. Além disso, existem várias diferenças entre as manifestações da IAV em camundongos e humanos. Ao contrário dos humanos, os ratos não desenvolvem febre após infecção IAV; por outro lado, eles apresentam com hipotermia¹⁶^,¹⁷. Em camundongos, replicação IAV está concentrada no trato respiratório inferior (pulmões) em vez de vias aéreas superiores. Assim, virulência do IAV em ratos não é sempre correlacionada ao observado em seres humanos. No total, porque as vantagens superam as desvantagens limitadas, rato representa o primeiro modelo animal usado para avaliar a patogênese viral da gripe, imunogenicidade e eficácia protetora em estudos de vacina e antiviral. Além disso, não seria eticamente aceitável para realizar estudos com IAV usando modelos animais grandes sem provas anteriores em um modelo animal pequeno de infecção IAV. Neste manuscrito, descrevemos como infectar camundongos practicar (óssea) com IAV, como monitorar a gravidade e o progresso da infecção viral e como realizar as experiências necessárias para avaliar humorais respostas imunes e eficácia de proteção.

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Protocol

todos os protocolos animais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal institucional e Comissão de utilização (IACUC) e a Comissão de biossegurança institucional (IBC) na Universidade de Rochester faculdade de medicina e odontologia e cumprir com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do nacional pesquisa Conselho 22. As instalações e programas do viveiro e divisão de laboratório de medicina Animal da faculdade de medicina e odontologia são acreditados pela AAALAC International e cumprirem com a lei estadual, a lei federal e a política National Institutes of Health (NIH). Semelhantes requisitos devem ser aplicados em cada instituição a aderir aos protocolos animais descritos neste manuscrito.

1. uso de pequenos animais vertebrados

Nota: O adequado equipamento de proteção individual (EPI) é necessário para trabalhar com os ratos. Requisitos mínimos incluem fatos-macaco descartáveis, tampas da sapata, cabeça gorro, máscara e luvas.

Em conformidade com o protocolo IACUC, coloque um máximo de 5 ratos por gaiola. Seguindo o protocolo IACUC, eutanásia em ratos com dois métodos de eutanásia (o segundo deve ser um método físico) para garantir que o animal está morto.
Nota: Nos experimentos em que IAV morbidade e mortalidade são avaliadas, ratos que perderam 20% do seu peso corporal inicial foram considerados por ter atingido o ponto de extremidade experimental, em foram sacrificados com CO ₂ e deslocamento cervical como o método físico secundário. Esta percentagem do peso corporal pode ser diferente em outras instituições. Nos procedimentos de pulmões de ratos e mucosa nasal são cobrados após a infecção do IAV, os ratos são sacrificados com uma dose letal de 2, 2,2-tribromoetanol (TBE), em cortando a hepática veia como método secundário de física. Femininos camundongos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade foram comprados e mantidos na instalação de cuidado animal na Universidade de Rochester faculdade de medicina e odontologia, sob condições específicas isentos de organismos patogénicos.

2. Biossegurança

Nota: neste relatório, os IAVs usados para infectar ratos são a comum adaptado rato laboratório cepa de gripe H1N1 de Rico/8/34 A/Puerto (PR8 WT) ²² ^, ²³ e uma temperatura sensível LAIV variante, LAIV PR8 ⁸. Executar todos os procedimentos que envolvem infecções IAV (em vitro ou na vivo), culturas de células e amostras biológicas, em uma câmara de segurança biológica em nível de biossegurança (BSL) -2 condições. Utilizar outras BSL fatos ou condições de contenção se forem utilizadas cepas altamente virulentas do IAV.

Limpar o armário com desinfectante de dióxido de cloro antes e depois de executar todos os procedimentos experimentais descritos neste manuscrito de biossegurança. Esterilize todo o material de dissecação (tesouras, bisturi e dissecando fórceps) e o homogenizador homogenizacao antes e após o uso, seguindo as recomendações de IBC adequadas. Descarte todo o material produzido durante os procedimentos sob orientações adequadas do IBC e IACUC.

3. Infecção intranasal

lugar de 6 a 8 semanas de idade feminino C57BL/6 ratos sob condições específicas isentos de organismos patogénicos. Organizar e rotular o mouse gaiolas com o vírus e a dose utilizada. Identifica os ratos em cada gaiola usando um código de soco de orelha ou com outro método aprovado como pintura das caudas. Coloque um máximo de 5 ratos por gaiola.
Preparar a diluição do IAV (unidades formando fluorescente (FFU) / rato) sob condições assépticas em um volume total de 30 µ l/mouse no estéril 1 x salino de tampão fosfato (PBS). Manter o inóculo de vírus no gelo. Calcular a quantidade de IAV adicionar na diluição viral com a fórmula: ((X FFU por rato/30 µ l) x volume final) / estoque título viral.
Os ratos com uma escala de pesar e registrar o peso de cada rato (dia 0). Mantenha o mouse na posição dorsal por pegá-la pela nuca do pescoço entre o dedo indicador e o polegar. Segure a cauda contra a mão com o dedo mindinho.
Anestesiar o mouse intraperitonealmente (i.p.) com 240-250 mg/kg de TBE, inserindo a agulha no caudal 2/3 do lado direito do abdômen. Pausar brevemente antes de retirar a agulha. Retornar o rato da gaiola e esperar 5 min.
Aplicar a pomada oftálmica estéril para os olhos para evitar ressecamento enquanto o mouse é anestesiado. Verifique se o mouse é anestesiado por falta de reflexo de retirada de pedal (ou seja, pitada de dedo do pé). Se os ratos não são totalmente anestesiados eles dólares o vírus.
Quando o mouse é totalmente anestesiado, posicione o mouse em prostração dorsal. Colocar a ponta da pipeta contendo 30 µ l de inóculo vírus na narina e, lentamente, mas constantemente ejetar a solução. Certifique-se de que o mouse é inalar a preparação, observando o inóculo gota desaparecendo.
Verificar que o rato está respirando como TBE pode deprimir a taxa de temperatura e respiração. Devolver o animal para a gaiola, colocando-o em prostração dorsal. Monitorar os ratos por sinais de insuficiência respiratória e se observado, ajudar o mouse para respirar por animal segurando verticalmente e induzir impacto conduzido respiração ²⁴. Monitorar o mouse até que recupere a consciência (30-45 min depois ele estava anestesiado).

4. Caracterização de patogênese Viral ( Figura 1)

avaliação da morbidade e mortalidade ( Figura 1 e Figura 2)
1. Infectar óssea 3-4 grupos de ratos fêmeas de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (pelo menos 5 ratos por grupo, n = 5) com doses 10 vezes (10, 10 ², 10 ³ e 10 ⁴ FFU/rato) de WT PR8 conforme descrito na seção 3.
2. Monitor e pesar os ratos com uma escala durante os próximos 14 dias aproximadamente o mesmo tempo para minimizar as variações de peso devido a ingestão de alimentos. Eutanásia em ratos que perdem 20% do seu peso corporal inicial, conforme descrito na seção 1.
3. Após 14 dias, eutanásia os ratos que sobrevivem a infecção viral, conforme descrito na seção 1.
4. Calcular o viral do mouse 50% dose letal (MLD ₅₀) baseado nos dados de sobrevivência obtidos usando o método de Reed e Muench ²⁵. Primeiro, calcular a distância de proporção (PD):
  1. , em seguida, calcular o MLD ₅₀ pela seguinte fórmula:
avaliação de títulos virais nos pulmões e mucosa nasal ( Figura 1 e Figura 2. )
recuperação dos pulmões e mucosa nasal
1. infectar camundongos C57BL/6 6 a 8-semana-idade fêmeas de óssea (n = 6) com a dose viral para testar 10 10 ⁴ FFU de PR8 WT, conforme descrito na seção 3.
2. Recolher o rato pulmões e mucosa nasal em dias 2 (n = 3) e 4 (n = 3).
  1. Eutanásia os ratos com uma dose letal (i.p.) de TBE (500 mg/kg). Coloque o animal em prostração dorsal e desinfectar a pele sobre o tórax com etanol a 70%. Corte a pele com um bisturi do esterno à base do abdômen. Fazer cortes de 1 cm da base da incisão para as partes laterais dos ratos com a tesoura.
  2. Cortar a veia hepática com uma tesoura para sangrar o mouse como o método de eutanásia secundário. Coloque o animal em posição ventral e esperar 2 minutos para permitir que o sangue escorrer para fora. Este passo é importante para reduzir o sangue nos pulmões.
  3. Remover a pele da parte superior inteira do mouse (incluindo a cabeça) para a base do abdômen onde a primeira incisão foi feita com o auxílio de fórceps e a tesoura de dissecação. Cortou a cabeça com a tesoura e coloque-o em uma placa de Petri estéril seco.
  4. Corte as junções entre a maxila e mandíbula com a tesoura e elimine a mandíbula. Com a tesoura, faça dois cortes nas extremidades dos arcos zigomático e removê-los. Remova os olhos com a ajuda da pinça dissecação.
  5. Segura o crânio com a pinça de dissecação e cortar o crânio ao longo da sutura sagital com um bisturi. Levante as duas metades do crânio com o cérebro para ver a mucosa nasal. As mucosas nasais são cercados pelos ossos etmoidais anteriores ossos do crânio, incluindo o nasal, maxilar, Palatino, zigomático e.
  6. Com o bisturi, corte a parte do crânio com o cérebro e descarte. Coloque a outra parte do crânio com a mucosa nasal em um tubo estéril. Armazenar o tubo no gelo (4 ° C), se as amostras são processadas no mesmo dia, ou em gelo seco para congelá-los rapidamente se as amostras serão processadas depois.
  7. Para evitar a contaminação das amostras, limpar e desinfectar as ferramentas de dissecção entre cada tecido recuperado e entre cada animal dissecação com desinfectante de dióxido de cloro.
  8. Para coletar os pulmões, coloque o animal em prostração dorsal e corte da pleura com a tesoura. Abra a caixa torácica por cortar as costelas em 1 cm em ambos os lados do esterno. Fazer os cortes da base da caixa torácica para a parte superior com a tesoura.
  9. Fazer um corte com a tesoura entre as duas incisões na parte superior da caixa torácica e retire a placa do peito. Mantenha os pulmões com a pinça, corte na extremidade da traqueia (antes dos pulmões), com a tesoura e coloque os pulmões em um tubo estéril. Armazenar o tubo no gelo (4 ° C), se as amostras são processadas no mesmo dia, ou em gelo seco para congelá-los rapidamente se as amostras serão processadas depois.
    Nota: Homogeneizar as amostras de tecido no mesmo dia em que eles são recolhidos e armazene a-80 ° C para analisar títulos virais mais tarde. É importante que as amostras não sejam objecto de congelamento-descongelamento repetidos ciclos antes de títulos de vírus são determinados. Alternativamente, armazenar as amostras a-80 ° C, até que eles serão processados.
Homogeneização dos pulmões e mucosa nasal
1. colocar os pulmões ou mucosa nasal em um homogeneizador homogenizacao estéril e adicionar 1 mL de mídia infecção frio. Homogeneizar a amostra, movendo o pilão acima e para baixo por aproximadamente 1 min à temperatura ambiente (RT) até que os pulmões estão completamente interrompidos. Colocar a amostra homogeneizada em um tubo estéril e loja em 4 ° C. utilizar um novo homogenizacao homogenizador para cada amostra.
2. Centrifugar as amostras a 300 x g, durante 5-10 min a RT. recolher o sobrenadante em um tubo estéril de novo. Armazenar o sobrenadante a 4 ° C, se a titulação viral é executada no mesmo dia e descartar a pelota. Alternativamente, congelar as amostras (-80 ° C) o sobrenadante do homogeneizado para avaliar títulos virais mais tarde.
Titulação do vírus por imunofluorescência indireta
1. no dia anterior a titulação, semente placas de 96 poços com células epiteliais Madin-Darby Canine renal (MDCK) (4 x 10 ⁴ células/poço) para alcançar a confluência de ~ 80-90% em meios de cultura de tecido. Coloca as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO ₂. O dia da titulação viral, verificar as células sob o microscópio para confirmar uma monocamada antes de iniciar a infecção viral.
2. 01:10 de preparar diluições do sobrenadante das amostras homogeneizadas (pulmão ou mucosa nasal) em meios de infecção em uma placa de 96 poços. Realizar a titulação viral triplica para determinar com precisão a concentração viral.
  1. Adicionar 90 µ l de mídia de infecção a cada um dos poços da placa de 96 poços. Adicione 10 µ l de um do sobrenadante das amostras homogeneizadas poços A1, A2 e A3 para avaliar a titulação viral de cada amostra em triplicado. Adicione 10 µ l do sobrenadante outra das amostras homogeneizadas para poços, A4, A5 e A6. Executar a mesma diluição consecutivamente com o resto das amostras.
  2. Após a adição da amostra sobrenadante com a linha A, usar uma pipeta multicanal para misturar pipetando para cima e para baixo. Transferir 10 µ l de linha A linha b alteração as pontas entre diluições e misture bem. Repita isto até atingir a última linha (H).
3. Remover o meio de cultura de tecido (passo 4.2.3.1) usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo de células MDCK em placas de 96 poços e lavar duas vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS.
4. transferir 50 µ l/poço do sobrenadante das amostras homogeneizadas para a placa de 96 poços com MDCK serialmente diluído. Comece a transferir as diluições superiores (linha H) para as diluições inferiores (linha A). Neste caso, não é necessário alterar as pontas entre diferentes linhas.
5. Colocar as placas de 96 poços em uma plataforma de balanço por 1h no RT para permitir que a adsorção viral. Após a adsorção viral, remover o inóculo usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e adicionar 100 µ l/poço de pós-infecção mídia. Incube as células infectadas para 8 h em uma incubadora de 33 ° C ou a 37 ° C com 5% de CO ₂. Proceder à fixação, coloração, imagem e cálculo de título viral, conforme descrito nas etapas 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
6. Remover o meio de cultura de tecidos das placas de 96 poços, usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Corrigir e permeabilize as células com 100 µ l/poço de solução de fixação/permeabilização por 20 min no RT.
  Atenção: Use a solução de permeabilização/fixação em uma coifa para evitar a exposição do formol.
7. Remover a solução de fixação/permeabilização usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo, lave com PBS 1x e incube as celulas fixas com bloqueio solução por 1h na loja RT. as células no bloqueio a 4 ° C ou prosseguir para a próxima etapa.
8. Remover a solução de bloqueio. Adicionar 50 µ l/poço de anticorpo monoclonal (mAb) 1 µ g/mL anti-NP HB-65 diluído em solução de diluição de anticorpo. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Different mAb ou polyclonAl (pAb) de anticorpos anti-PR8 pode ser usado.
9. Entretanto, diluir a 1: 200 o isotiocianato de fluoresceína (FITC)-anticorpo secundário conjugado do anti-rato na solução de diluição de anticorpo. Centrifugue a solução a 1.700 x g, durante 5-10 min à RT Podem ser usados outros anticorpos secundarios conjugados com outros fluorophores.
10. Remover o anticorpo primário e lavar 3 vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS. Adicionar 50 µ l/poço de diluição o anticorpo secundário e incube por 30-45 min a 37 ° C. Remove o anticorpo secundário e lavagem 3 vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS. Embora a última lavagem da placa.
11. Observar as células sob um microscópio de fluorescência para determinar o número de células (verdes) manchadas positivas. Calcule o título viral contando FFU/mL. Calcular o título viral expressado em FFU/mL da diluição com 30-50 células coradas positivas, usando a fórmula: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/diluição.

5. Avaliação da resposta imune Humoral ( Figura 3)

infectar óssea 3 grupos de ratos fêmeas de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (n = 5) com as diferentes doses (10 ², 10 ³ e 10 ⁴ FFU / rato) de LAIV PR8 e mock-infectar um grupo (n = 5) com 1X PBS estéril como controlo negativo. Executar as infecções de rato i.n, conforme descrito na seção 3.
1. Mouse sangramento por punção submandibular
  1. 14 dias após a imunização, coletar o sangue de ratos usando submandibular sangramento uma lanceta 4mm ²⁶, ou usando outro IACUC métodos aprovados.
    1. Segure o mouse por pegá-la pela nuca do pescoço entre o dedo indicador e o polegar. Segure a cauda contra a mão com o dedo mindinho para imobilizar o mouse.
    2. Colocar o mouse em uma posição lateral para ver o rosto. Fazer a punção na junção das veias retrô-orbital e submandibulares com a veia jugular. Afundar a lanceta (4mm) e recuperar o sangue em um tubo estéril (aproximadamente 0,2 - 0,4 mL/rato são recuperados). Aplica pressão sobre a punção com um guardanapo esterilizado por alguns segundos. Coloque o mouse volta para a jaula.
  2. Colocar os tubos para 1-2 h a 37 ° C e em seguida centrifugar-lhes a 700 x g, durante 30 min à RT para separar o soro do sangue. Transferi a camada superior que consiste o soro com uma pipeta para um novo tubo estéril. Descarte a pelota de glóbulos vermelhos (hemácias). Armazene o soro em -20 ° C.
Análise de totais anticorpos contra as proteínas virais
1. preparação dos extratos de células MDCK infectados
  1. o dia antes da infecção, semente de um prato de 100 mm com 4-5 x 10 ⁶ células MDCK (até ~ 80-90 confluência de % no dia seguinte) em meios de cultura de tecido. Coloca as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO ₂. O dia da infecção viral, verificar as células sob o microscópio para confirmar uma monocamada antes de iniciar a infecção viral.
  2. Preparar uma diluição viral com um multiplicity (0,001) baixa de infecção (MOI) de PR8 WT em meios de infecção no total volume final de 4 mL. Calcular a quantidade de PR8 WT com a fórmula ((MOI X x células n °) x volume final) / estoque título viral.
  3. o meio de cultura de tecido da placa de células MDCK de aspirar e lavar duas vezes com 4 mL de 1X PBS. Adicione o inóculo viral (4 mL) e colocar a placa sobre uma plataforma oscilante para 1h no RT para permitir que a adsorção viral. Remova o inóculo viral com vácuo e adicione 8 a 10 mL de pós-infecção mídia contendo 1 µ g/mL de tripsina tratada com TPCK. Incubar as células infectadas por 48-72 h numa incubadora de 33 ° C ou a 37 ° C com 5% de CO ₂.
  4. Separar as células com o auxílio de um raspador de célula e coletar as células e o meio de cultura de tecido com uma pipeta em um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 400 x g, durante 5-10 min no RT. Aspire o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão RIPA e coloque a mistura em um tubo estéril de 1,5 mL. Incubar no gelo por 20-30 min.
  5. Centrifugar o tubo a 1.300 x g por 20-30 min a 4 ° C. cuidadosamente, recuperar o sobrenadante. Loja a célula extrair em 100 alíquotas µ l a -20 ° C.
  6. Titular os extratos de células, como descrito por ensaio imunoenzimático (ELISA) antes avaliando-os para a presença de anticorpos ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ²⁷. incluir célula extrai de células MDCK infectadas por simulação (preparadas como indicado acima) como controlo negativo.
2. ELISA ( Figura 4)
  1. revestimento de poliestireno, placas de 96 poços com a diluição adequada de célula infectada-MDCK extrair em 1X PBS (normalmente entre 1: 200 - 1:1, 000). Revesti outra placa com a mesma diluição do extrato de células MDCK mock-infectados como controlo negativo. Incubar durante a noite (O/N) em 4 ° C.
  2. Remover o sobrenadante usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e lave uma vez com 100 µ l/poço de 1X PBS com uma pipeta multicanal. Bloquear ligação não específica adicionando-se 100 µ l/poço de bloqueio solução por 1h no RT.
  3. Enquanto isso, fazer 2 vezes diluições em série (começando a diluição 01:50) do sera de cada rato infectado na etapa 5.1 em solução de diluição de anticorpo em uma placa de 96 poços.
  4. Retire a solução bloqueio as chapas poliestireno de 96 poços usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Adicionar 50 µ l de cada diluição do soro de rato no poço apropriado e incubar 1 h a 37 ° C.
  5. Remover o sera de ratos com um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Lave os poços 3 vezes com água destilada, usando uma pipeta multicanal. Adicione 50 µ l/poço de um anticorpo secundário anti-rato conjugado com a 1:2,000 Peroxidase de rábano (HRP) diluído em solução de diluição de anticorpo. Incubar a 1 h a 37 ° C.
  6. Remover o anticorpo secundário com um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Lave os poços 3 vezes com água destilada, usando uma pipeta multicanal. Preparar a solução de substrato tetrametilbenzidina (TMB) misturando a solução 1:1 A e B. Adicione 100 µ l/poço de substrato e incubar durante 5-10 min a RT no escuro.
  7. Pare a reação adicionando-se 100 µ l/poço de 0,2 N H ₂ então ₄. Ler as placas a 450 nm em um leitor ELISA.
  8. Subtrair o valor obtido em cada diluição MDCK mock-infectados 96 poços da placa de partir o valor obtido da placa de 96 poços MDCK infectados. Calcular os valores médios para cada diluição com o sera diferente e representá-los em um gráfico mostrando desvios padrões (DP).
Análise de anticorpos neutralizantes
1. ensaio de inibição da hemaglutinação (HAI) ( Figura 5)
  1. antes de executar o ensaio HAI, tratar os soros de rato com receptor destruir a enzima (RDE) para eliminar todos os inibidores não específicos presentes no soro. Adicionar 1 volume de soro de rato para 4 volumes de diluição de trabalho RDE (diluição do soro é agora 1:5). Incubar O/N (12- 18 h) em banho maria a 37 ° C.
  2. Aquecer as amostras de soro a 56 ° C durante 30 min inactivar a RDE.
  3. Pre-determinar a atividade de hemaglutinação (HAU) de WT PR8 pelo padrão de ensaio HA ²⁸. Uma vez que o HAU viral é determinado, diluir o estoque viral para 8 HAU por 50 µ l de PBS 1x.
  4. Preparar diluições em série 2 vezes (12 diluições) do RDE-tratados sera em uma placa de V-fundo de 96 poços. Use uma linha para cada amostra de soro (por exemplo, A1 a A12).
    1. Adicionar 25 µ l de 1X PBS de A1 a A12 poços. Teste cada uma das amostras de soro em uma linha. Adicione 25 µ l do soro RDE-tratada (1:5) a 25 µ l de PBS 1x no primeiro poço da coluna (A1). A primeira diluição do soro é 01:10.
    2. , Uma vez que todos os soros RDE-tratados são adicionados para a primeira coluna, (por exemplo, A1, B1, C1), usar uma pipeta multicanal para misturar os soros e 1X PBS pipetando para cima e para baixo. Transferi 25 µ l do sera diluído da primeira coluna para a segunda coluna (por exemplo, de A1 a A2). Alterar as pontas entre diluições e misture.
    3. Repetir passos 5.3.1.4.2. até atingir a última coluna (por exemplo, A12, B12, C12). Descarte a 25 µ l da última coluna, mantendo o volume consistente em todos os poços (25 µ l). Incluir uma linha de poços que contém apenas 25 µ l de PBS 1x sem qualquer soros como controlo negativo.
  5. Adicionar 25 µ l do IAV diluído a 8 µ l de HAU/50 para cada um dos poços com sera em placa de 96 poços V-fundo; o volume final em cada bem é 50 µ l, contendo 4 HAU do vírus. Misture o conteúdo por pipetagem repetidas. Incubar durante 1 h em RT.
  6. . Misture o conteúdo por pipetagem repetidas. Incube a placa por 30-45 min no gelo. Ler o ensaio HAI visualmente quando as hemácias em poços de controle (1X PBS) formam um precipitado vermelho (ou seja, da pelota) no fundo dos poços.
    Nota: Hemácias de outras espécies tais como frango, cobaia ou cavalo também pode ser usado.
  7. Calcular a concentração HAI identificando o último bem em que as hemácias formam uma bolinha vermelha e hemaglutinação não ocorre.
    Nota: O valor recíproco desta diluição é o título HAI. O valor recíproco é multiplicado por um fator de 20 para corrigir a 01:20 diluição do soro na primeira linha.
2. Ensaio microneutralization de vírus (VNA) ( Figura 6)
  1. no dia anterior VNA, preparar células MDCK em uma placa de 96 poços para alcançar confluência de 80-90% no dia seguinte, conforme descrito na etapa 5.2.1.1. Preparar uma diluição de PR8 WT em meios de infecção ter 200 µ l de FFU/25.
  2. Inativar o sera rato no 56 ° C durante 1 h. fazer 2 vezes diluições em série (12 diluição) por sera de rato em triplicado usando uma placa de 96 poços.
    1. Adicionar 40 µ l de soro a 160 µ l de mídia de infecção no primeiro bem de primeira linha, (por exemplo, A1) (soro diluição 1:5). Misture por pipetagem. Adicionar 100 µ l de mídia de infecção para os outros poços (A2 a H12).
    2. Transferir 100 µ l de primeira linha para a segunda linha para fazer diluições de 1:2 (por exemplo, de A1 a A2). Trocar dicas entre diluições e mistura por pipetagem. Repita isto até a última linha (por exemplo, A12). Descartar a 100 µ l de última linha, mantendo o volume consistente em todos os poços (100 µ l).
  3. Adicione 100 µ l da diluição do IAV a todos os poços. Incubar a 1 h no RT. Enquanto isso, retire o meio de cultura de tecido as células MDCK em placa de 96 poços, usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e lavar duas vezes com 100 µ l/poço de 1X PBS.
  4. Em cada placa de 96 poços de células MDCK, deixar duas linhas para os controles. Uma linha é o controle negativo (células sem vírus e soros), e a outra linha é o controlo positivo de infecção (células com vírus na ausência de soros ou soros de ratos infectados por simulação).
  5. Transferir 50 µ l/poço da placa de vírus-anticorpo para as placas de 96 poços de células MDCK. Ponha as placas sobre uma plataforma oscilante para 1h no RT para permitir que a adsorção viral.
  6. Remover o inóculo de vírus-anticorpo usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e adicionar 100 µ l/poço de pós-infecção mídia contendo 1 µ g/mL de tripsina tratada TPCK.
  7. Incubar as células ~ 3-4 dias em uma incubadora de 33 ° C ou a 37 ° C com 5% CO ₂ até efeito citopático (ECP) é observado no controle positivo (células infectadas na ausência de soros ou com soro de controlo).
  8. Remover o meio de cultura de tecido usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo e adicionar 100 µ l/poço de violeta de cristal de 0,1%. Incube durante 1 h em RT. Remove a solução de cristal violeta usando um adaptador de multicanal-aspirador a vácuo. Lave os poços 3 vezes com água destilada. Seque as placas no RT.
  9. Calcular a concentração VNA identificando a maior diluição que retém uma monocamada confluente celular de células MDCK.
    Nota: O valor recíproco desta diluição correspondente é o título de anticorpos neutralizantes. O valor recíproco é multiplicado por um fator de 10 para corrigir as 01:10 diluição do sera o primeiro poço da linha.

6. Avaliação de vacinas de eficácia de proteção ( Figura 3)

óssea vacinar um grupo de ratos fêmeas de C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (n = 11) com a dose de PR8 LAIV para testar (FFU/mouse) e simulação-vacinar um outro grupo de camundongos (n = 11) com 1X PBS estéril. Executar as imunizações óssea de rato conforme descritas na seção 3.
Quatorze dias pós-vacinação, sangrar os ratos e coletar o sera conforme descrito na seção 3. Analisar a presença de total e neutralizando anticorpos contra PR8 WT, conforme descrito na seção 5.1.1.
Quinze dias pós-vacinação, medir e registrar o peso do corpo do mouse (dia 0). Desafio óssea de ratos com uma dose letal do PR8 WT (desafio homólogo), conforme descrita na seção 3.
Medir o peso corporal e sobrevivência (n = 5 / grupo) durante 14 dias após o desafio de avaliar a morbidade e a mortalidade produzida pelo desafio PR8 WT em camundongos vacinados (seção 4.1).
Recuperar rato pulmões e mucosa nasal (n = 3/dia) no dia 2 e dia 4 pós-desafio com PR8 peso homogeneizar e analisar os pulmões e mucosa nasal conforme descrito na seção 4.2, que avalia a replicação viral em camundongos vacinados de PR8 WT.

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Representative Results

Caracterização de patogênese viral em camundongos

A patogênese da IAV está relacionada a morbidade e a mortalidade causada por sua infecção. Esses dois parâmetros podem ser avaliados em camundongos facilmente: morbidade IAV está associada a perda de peso corporal em camundongos infectados e a porcentagem de sobrevivência irá indicar a taxa de mortalidade (Figura 1). O peso corporal e sobrevivência em camundongos infectados IAV geralmente são monitorados diariamente pelo menos duas semanas após a infecção⁸^,⁹^,¹⁰^,²⁹. Os dados de sobrevivência obtidos podem determinar o MLD₅₀ que foi calculado usando o método de Reed e Muench²⁵. Outro indicador de patogênese IAV está relacionado à replicação viral, na parte inferior (pulmões) e no trato respiratório superior (mucosa nasal) (Figura 1). As informações obtidas com o título viral nesses órgãos correspondem a morbidade e mortalidade valores e em conjunto fornecem uma boa indicação de patogênese viral. É conhecido que replicação IAV nos pulmões de rato de pico entre post-infecção de dias 2 e 4 (PI), e então é recomendável recuperar estes órgãos no p.i. dias 2 e 4

Figura 1: caracterização da IAV patogênese em ratos: Patogênese da IAV em ratos está relacionado à sua morbidade (perda de peso corporal) e mortalidade (% de sobrevivência) e também a capacidade de IAV para replicar no inferior do trato respiratório (pulmões) e superior (mucosa nasal). Brevemente, no dia 0 ratos são pesados e anestesiados intraperitonealmente com 2, 2,2-tribromoetanol (TBE) antes que eles estão infectados por com IAV. Do dia 1 a dia 14, os ratos são pesados diariamente para avaliar a perda de peso de corpo (morbidade) e sobrevivência % (mortalidade) para calcular a dose letal de rato 50 (MLD₅₀). Nos dias 2 e pós-infecção dia 4, mucosa nasal e pulmões de ratos são recuperados e homogeneizados para avaliar a replicação viral. São realizados experimentos de ratos para caracterizar a patogênese IAV usando PR8 WT sob condições de BSL-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na Figura 2, os dados obtidos na avaliação de patogênese PR8 WT são representados. Quatro grupos de camundongos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (n = 11) foram infectados óssea com as doses indicadas (10, 10², 10³ e 10⁴ FFU/rato) de PR8 WT. O peso corporal e a sobrevivência de 5 ratos por grupo foram medidos por 14 dias p.i. (Figura 2A–B). Todos os ratos imunizados com 10⁴ FFU de PR8 WT perdeu peso rapidamente (Figura 2A) e todos eles morreram no p.i. dias 5 e 6 (Figura 2B). Camundongos imunizados com 10³ FFU de PR8 WT perdeu peso ao mais tarde vezes pi (Figura 2A) e eles todos morreram pela p.i. dias 7 e 8 (Figura 2B). Todos os ratos imunizados com 10²FFU de PR8 WT perdeu peso corporal (Figura 2A), mas apenas 2 deles morreu no dia 9 p.i. (Figura 2B). Finalmente, os ratos imunizados com 10 FFU de PR8 WT não perdeu peso (Figura 2A) e todos eles sobreviveram a infecção (Figura 2B). O MLD₅₀ de WT PR8 neste experimento calculadas com o método de Reed e Muench²⁵ foi 1,5 x 10² FFU (Figura 2).

Para avaliar a replicação PR8 na parte superior e inferior respiratório trato de ratos infectados óssea com as doses indicadas (10, 10², 10³e 10⁴ FFU/rato), os pulmões e mucosa nasal foram recuperados no p.i. dias 2 e 4 (n = 3). Após homogeneização do pulmão, a quantidade de vírus presente neste órgão foi analisada por meio de ensaio imunofluorescência (Figura 2D). O título viral detectado nos pulmões dos grupos diferentes de ratos foi relacionado com a dose utilizada para imunizar os: maior concentração viral foram detectadas nos pulmões de ratos imunizados com 10⁴FFU de PR8 WT no p.i. dias 2 e 4, enquanto baixa concentração viral foram detectadas em os pulmões de camundongos imunizados com 10 FFU de PR8 WT.

Figura 2: representação dos dados obtidos na avaliação de patogênese Viral: Para analisar a morbidade e mortalidade de PR8 WT, camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (n = 5) foram infectados óssea com o número indicado de fluorescente-formando unidades (FFU) de PR8 WT e então monitorado diariamente por 2 semanas para perda de peso corporal (A) (morbidade) e (B) sobrevivência (mortalidade). Dados representam os meios e os desvios-padrão dos resultados determinados para ratos individuais (n = 5). (C) valores de sobrevivência % avaliada mais de 2 semanas são usados para calcular o MLD₅₀ usando o método de Reed e Muench²⁵. (D) para avaliar a replicação viral, camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (n = 6) foram infectados óssea com o número indicado de FFU. Replicação viral nos pulmões ou mucosa nasal de ratos infectados geralmente é avaliada no dias 2 e 4 p.i. usando um ensaio de immunofocus. Títulos virais são registados como FFU/mL. Dados representam os meios e SDs de resultados obtidos em cada rato. Linhas tracejadas são incluídas para indicar o limite de detecção (FFU/200ml) do ensaio. Ratos e cultura de tecidos de experimentos para avaliar IAV morbilidade, mortalidade e títulos virais usando PR8 foram realizados sob condições de BSL-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação das respostas humorais induzida após a vacinação

Respostas humorais induzidas contra infecção IAV desempenham um papel essencial no controle da infecção viral. Por esta razão, é muito importante analisar as respostas humorais provocadas por infecções IAV WT ou novas vacinas IAV (Figura 3). No modelo de rato, 14 dias após a imunização, os ratos são sangrados para analisar a presença de anticorpos contra as proteínas virais totais por ELISA (Figura 4) e a presença de segmentação da proteína viral HA, que normalmente é de anticorpos neutralizantes analisado por abordagens sorológicos comuns, tais como um HAI ensaio (classe ng = "xfig" > Figura 5) e/ou um VNA (Figura 6).

Figura 3: esquema das diferentes etapas na caracterização do segurança, imunogenicidade e eficácia da proteção de um LAIV: Quando um novo LAIV é desenvolvido, o modelo do rato da infecção IAV geralmente é usado para testar a eficácia de segurança, imunogenicidade e protecção. Neste esquema, os experimentos para avaliar a segurança (A), (B) de imunogenicidade e eficácia da proteção (C) de um candidato LAIV são indicados. (A) para avaliar a segurança de um LAIV é necessário para os mesmos parâmetros de ensaios (morbilidade, mortalidade e replicação viral na parte superior e o trato respiratório inferior) descrito na Figura 1. Para avaliar a imunogenicidade, ratos são imunizados e 14 dias após a vacinação eles sangrarão por punção submandibular. Respostas humorais são analisadas, avaliando a presença de anticorpos totais contra proteínas IAV por ensaio imunoenzimático (ELISA) e avaliando a presença de anticorpos por ensaio de inibição da hemaglutinação (HAI) e/ou vírus neutralizantes ensaio de microneutralization (VNA). (C) avaliar a eficácia da proteção, 15 dias após a vacinação, os ratos são desafiados com IAV WT. Protection eficácia é avaliada pela medição de ratos morbilidade, mortalidade e títulos virais nos pulmões de ratos desafiados, conforme descrito em Figura 1 . São realizados experimentos de ratos para caracterizar a eficácia segurança, imunogenicidade e protecção de um candidato LAIV sob condições de BSL-2. Outros fatos BSL ou condições de contenção podem ser necessárias dependendo a IAV as estirpes utilizadas pelo desafio de ratos vacinados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para avaliar a imunogenicidade de PR8 LAIV, três grupos de camundongos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (n = 5) foram imunizadas com diferentes doses (10², 10³e 10⁴ FFU/rato) de LAIV PR8 ou simulação vacinados com PBS 1x como controlo negativo. Quatorze dias após a vacinação, soros de ratos foram coletados pelo sangramento submandibular²⁶ (Figura 3). Respostas de anticorpos contra as proteínas virais totais foram avaliadas por ELISA usando uma diluição de 1: 200 de extrato celular de células MDCK PR8-infectado (Figura 4). Cada soro foi analisado individualmente. Os resultados indicam que os soros de camundongos imunizados com a dose mais elevada (10⁴ FFU) de LAIV PR8 tinha maiores anticorpos contra proteínas PR8 totais do que os soros dos camundongos imunizados com a dose mais baixa (10² FFU). Controle de soros (ratos infectados por simulação) não mostraram reatividade contra antígenos PR8.

Figura 4: representação esquemática do ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA) para avaliar as respostas do anticorpo Humoral: Níveis de anticorpos específicos PR8 presentes em camundongos infectados são determinados por ELISA em placas de poliestireno de 96 poços revestidas com extractos de célula de simulação (controle) ou células MDCK PR8-infectados. Brevemente, em 14 dias p.i. (Figura 3), camundongos imunizados com as doses indicadas de LAIV PR8 sangravam por punção submandibular e soros foram coletados. Cada soro foi avaliado individualmente por ELISA para detecção de anticorpos IgG contra proteínas totais PR8. Dados do gráfico representam os meios e os desvios-padrão dos resultados obtidos de ratos individuais soros (n = 6). O.D, densidade óptica. Ensaios de ELISA foram realizados em um gabinete de BSL-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para analisar a presença de anticorpos no mouse neutralizantes soro usando o HAI do ensaio, seriais 2 vezes diluições dos soros (anteriormente inactivadas a 56 ° C) de cada grupo de camundongos imunizados com diferentes doses (10², 10³e 10⁴ FFU) de LAIV PR8 foram incubados com 4 HAU de PR8 WT por 1h no RT (Figura 5). Então, 0,5% de Turquia hemácias foram adicionados para as misturas PR8-soros. A parte superior da Figura 5 é uma representação esquemática dos possíveis resultados HAI: quando o soro contém anticorpos neutralizantes, precipitação de hemácias é observada no fundo do poço, porque os anticorpos ligados à proteína viral HA impedem a hemaglutinação da RBCs. Por outro lado, na ausência de anticorpos neutralizantes, hemaglutinação da RBCs é observada. Em seguida, o título HAI é calculado como a recíproca da diluição do soro no último hemaglutinação bem carente. Os resultados HAI mostrou na parte inferior da Figura 5 indicam que o soro do mouse vacinados com a maior quantidade de LAIV PR8 (10⁴ FFU) têm o maior título de anticorpos neutralizantes, enquanto o soro de um rato imunizado com o dose mais baixa (10² FFU) tem o mais baixo título de anticorpos contra PR8 neutralizantes. Sem anticorpos neutralizantes estavam presentes no soro controle (ratos infectados por simulação).

Figura 5: ensaio de hemaglutinação inibição (HAI): Níveis de anticorpos contra PR8 WT em camundongos infectados neutralizantes podem ser facilmente avaliados por ensaio HAI. Brevemente, 2 vezes diluições em série (começando a diluição 01:10) de soro de camundongos imunizados com as doses indicadas de PR8 LAIV foram misturadas (1:1) com 4 HAU de PR8 WT por 1h no RT em uma placa de V-fundo de 96 poços. Após incubação de 1 h, 0,5% de hemácias foram adicionadas para as misturas de vírus-soro para 30-60 min no gelo. Títulos HAI são determinados, identificando o último bem em que as hemácias formam um botão vermelho e hemaglutinação não ocorre (em cima). HAI ensaios com WT PR8 foram realizados em um gabinete de BSL-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na Figura 6, os dados obtidos na avaliação de anticorpos no soro de rato neutralizantes pelo VNA são representados. FFU 200 de WT PR8 foram misturadas com seriais 2 vezes diluições dos soros (anteriormente inactivatEd a 56 ° C) de camundongos imunizados com diferentes doses (10², 10³e 10⁴ FFU) de LAIV PR8 por 1h no RT Cada amostra de soro foi avaliada em triplicado. As misturas de vírus-soros foram usadas para infectar monocamadas de células MDCK em uma placa de 96 poços. A parte superior da Figura 6 é uma representação esquemática dos possíveis resultados VNA: ausência de anticorpos nos resultados do soro no CPE em aproximadamente 3-4 dias p.i. neutralizantes Em contraste, quando os anticorpos neutralizantes estão presentes (monocamada celular intacta), eles ligam para o viral HA e prevenir a infecção viral, e não há nenhum CPE. Presença de CPE geralmente é visualizada pela coloração de células infectadas com violeta de cristal, e títulos de neutralização viral são calculados como a recíproca da última diluição em que a infecção está completamente bloqueada. Os resultados da VNA são representados na parte inferior da Figura 6. O soro de camundongos imunizados com a alta quantidade de LAIV PR8 (10⁴ FFU) têm o maior título de anticorpos neutralizantes enquanto soros de camundongos imunizados com a dose mais baixa ou PR8 LAIV (10² FFU) tem do mais baixo título de anticorpos, neutralizantes semelhante aos resultados obtidos com o ensaio HAI. Sem anticorpos neutralizantes estavam presentes no soro de ratos infectados por simulação.

Figura 6: ensaio de Microneutralization vírus (VNA): Uma alternativa para o ensaio HAI, o ensaio VNA pode avaliar a presença de WT PR8 anticorpos neutralizantes. Brevemente, os soros de ratos vacinados com as doses indicadas de PR8 LAIV estavam em série 2 vezes diluído (início diluição 1:5) em placas de 96 poços e misturado 1:1 com 200 FFU de PR8 WT por 1h no RT Depois de 1 h, as misturas de vírus-soro foram usadas para infectar placas de 96 poços de células MDCK. Células infectadas foram incubadas por 3-4 dias até o efeito citopático completo. As placas de 96 poços então estavam manchadas com violeta de cristal de 0,1%. Títulos VNA são determinados pela identificação maior diluição para reter uma monocamada confluente célula. VNA com WT PR8 foram realizadas sob condições de BSL-2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação de eficácia de proteção das vacinas IAV em ratos

Quando um novo LAIV é desenvolvido, sua eficácia, segurança, imunogenicidade e protecção deve ser testado na vivo, e o modelo do rato é geralmente o primeiro modelo animal escolhido para analisar esses parâmetros. A Figura 3 é um esquema das diferentes etapas necessárias para caracterizar um novo LAIV em camundongos. Para avaliar a segurança de um LAIV (Figura 3A), os ratos são infectados óssea utilizando um protocolo semelhante aos procedimentos experimentais descritos na seção de patogênese (seção 4), e o peso corporal e monitoramento de sobrevivência irão fornecer informações relacionadas com a morbidade e mortalidade do LAIV (figuras 2A–2B), incluindo o MLD₅₀. Além disso, após a inoculação com doses de vacina diferente, a replicação de LAIV na parte inferior (pulmões) e no trato respiratório superior (mucosa nasal) deve ser avaliada⁸^,⁹^,¹⁰^, ¹¹^,²⁹ (Figura 2D). Para testar a imunogenicidade, soros de ratos vacinados com o LAIV são coletados antes de desafio com PR8 WT (desafio homólogo), usando protocolos semelhantes para as descritas na seção de imunogenicidade (secção 5) (Figura 3B). A presença de total e neutralizando anticorpos no sera pode ser detectada por ELISA e HAI e/ou VNA, respectivamente.

Por último, para testar a eficácia de proteção, os ratos vacinados LAIV são desafiados com PR8 WT e a eficácia de proteção caracteriza-se por monitoramento de morbilidade, mortalidade e a presença de desafio PR8 WT nos pulmões, como descrito anteriormente na seção 4 ( Figura 3)⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Se o LAIV induz proteção contra desafio PR8 WT, ratos não perderá peso corporal, e eles vão sobreviver o desafio letal com IAV WT. Além disso, não serão detectados títulos virais de WT IAV nos pulmões, ou será significativamente reduzidos, comparado a simulação (PBS) vacinados ratos⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹.

Soluções e meios de cultura de tecido	Composição	Armazenamento	Uso	Comentários
Meios de cultura de tecido: Dulbecco modificada do meio da águia (DMEM), 10% soro bovino Fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-L-glutamina (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG)	445 ml DMEM, 50ml de FBS e 5 ml de 100 x 1% penicilina (100 unidades/ml)-estreptomicina (100 µ g/ml) - L - glutamina (2 mM) (PSG)	Loja a 4° C	Essa mídia é usada para a manutenção das células epiteliais Madin-Darby Canine renal (MDCK)
Pós-infecção mídia: DMEM 0,3% Albumina bovina (BA), 1% PSG (DMEM 0.3% BA 1% PSG)	491 ml DMEM, 4,2 ml de 35% BA e 5 ml de 100 x PSG	Loja a 4° C	Essa mídia é usada para manutenção de células MDCK após infecção com o vírus da Influenza A (IAV)
10 x salina tamponada fosfato (PBS de x 10)	80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na₂HPO₄₂O .7h, 2 g de KH₂PO₄. Adicionar ddH₂O até 1 L. ajuste de pH para 7,3	Armazenar em temperatura ambiente (RT)		Esterilizar em autoclave
1X PBS	Diluir 10 x PBS 01:10 com O ddH₂	Loja em RT		Esterilizar em autoclave
Mídia de infecção: 1X PBS, 0,3% BA, 1% penicilina-estreptomicina (PS) (PBS/BA/PS)	487 ml 1X PBS estéril, 4,2 ml de 35% BA e 5 ml de 100 x 1% penicilina (100 unidades/ml)-estreptomicina (100 µ g/ml) (PS)	Loja a 4 ° C	Essa mídia é usada para infecções do IAV
Solução de permeabilização/fixação: formol 4%, 0,5% triton X-100 diluído em PBS 1x	400ml neutro tamponado formalina 10%, 5 ml de Triton X-100 e 595 ml de 1X PBS

d > loja no RT Esta solução é usada para reparar e permeabilize células MDCK em experimentos de titulação viral Preparar a solução em uma coifa para evitar a exposição ao formaldeído Solução de bloqueio: 2,5% albumina de soro bovino (BSA) em PBS 1x 2,5 g de BSA em 97,5 mL de 1X PBS Loja a 4 ° C Esta solução é utilizada como uma solução de bloqueio para ensaios de imunofluorescência e Elisa. Esterilize por filtração com filtro de 0,2 µm. Solução de diluição de anticorpo (1% de BSA em PBS 1x) 1 g de BSA em 99 mL de 1X PBS Loja a 4 ° C Esta solução é utilizada para a diluição de anticorpos primários e secundários em ensaios de imunofluorescência e ELISA Esterilizar por filtração com filtro de 0,2 µm 0,1 solução de cristal violeta % 1 g de cristal violeta em 400 ml de metanol. Adicione 600 ml de DDQ₂O Loja em RT Esta solução é usada para reparar e mancha células MDCK em ensaios de neutralização viral Tosylsulfonyl fenilalanil clorometil cetona (TPCK)-tratada com tripsina Prepare uma solução stock de 1.000 x 1 mg/ml em ddH₂O Loja a-20 ° C O TPCK-tripsina é adicionado em infecções IAV Fazer 100 µ l alíquotas Amortecedor de RIPA 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% de sódio Deoxycholate do, 0,1% SDS, 140 mM de NaCl Loja a 4 ° C Esta solução é usada para fazer a célula extratos

Tabela 1: soluções e meios de cultura de tecido.

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Discussion

O modelo do rato do IAV é amplamente utilizado na vivo estudos de eficácia de proteção, a imunogenicidade e a patogênese do IAV. O pequeno tamanho dos ratos torna fácil de manipular e armazenar em comparação com outros modelos animais, como furões ou cobaias. Além disso, a facilidade em termos de custo de animal, habitação e reprodução permitem sua utilização em testes pré-clínicos vacinação em que um grande número de animais é necessários. Notavelmente, desde que os ratos têm sido usados em pesquisa de múltiplas disciplinas, vários molecular e murino reagentes Imunologia estão disponíveis para facilitar a sua utilização para estudos do IAV. Além disso, a variabilidade de acolhimento mínimo e a presença de um sistema imunológico que é evolutivamente semelhante ao presente em seres humanos torná-los um robusto pequeno modelo animal para estudos do IAV. Finalmente, o estudo das interações da proteína viral-anfitrião e sua contribuição para a patogênese viral são actualmente possíveis pelo acesso aos ratos KO. No entanto, ao lado de várias vantagens de usar ratos para estudos do IAV, eles não são úteis para estudos de transmissão do IAV. Portanto, furões ou cobaias são modelos animais mais adequados para estudar a transmissão do IAV. Sintomas clínicos em camundongos infectados com IAV geralmente aparecem pós-infecção 2-3 dias, embora isto pode variar dependendo da idade do mouse, estado imune, sexo, fundo genético e tensão; assim como a estirpe viral e dose utilizada. Os sintomas incluem anorexia, letargia, aconchegando-se, pele, perda de corpo peso e morte¹⁶^,¹⁷de babados.

Este manuscrito, descrevemos como avaliar patogênese viral em camundongos infectados óssea com IAV, monitorando a perda de peso corporal (morbidade), porcentagem de sobrevivência (mortalidade) e avaliando a replicação viral na parte superior (mucosa nasal) e inferior (pulmões) trato respiratório (Figura 1 e Figura 2). A patogênese da IAV é um parâmetro muito importante, não só no contexto de novas cepas do IAV, mas também na implementação segura de candidatos de vacina LAIV (Figura 3). Sazonais IAVs e IAVs que infectam outros mamíferos (como cavalos, cães ou porcos) geralmente não produzem sinais de doença em camundongos¹¹^,²⁷. Neste caso, a análise de títulos virais nos pulmões ou mucosa nasal de ratos infectados é o principal parâmetro para avaliar a patogênese viral de cepas do IAV. Uma vez que os pulmões e mucosa nasal são colhidos, eles são homogeneizados e a quantidade de vírus presente nesses órgãos pode ser analisada pelo ensaio de placa, ensaio de imunofluorescência, cultura de tecidos infecciosa dose 50 (TCID₅₀) ou outro método validado⁸ ^,²⁹. Recomenda-se avaliar a concentração viral usando a imunofluorescência indireta, desde que o ensaio de placa requer uma quantidade mais elevada de células MDCK (formato 6-placa) e, como o TCID₅₀, é necessário mais tempo (3-4 dias) para calcular a concentração viral. No entanto, para realizar o teste de imunofluorescência indireta, é necessário ter: 1) primários anticorpos específicos contra uma proteína do IAV (recomenda-se usar um anticorpo contra a cadeia IAV, NP, uma vez que é a mais abundante proteína viral produzida durante a infecção viral); 2) secundários anticorpos conjugados com um fluoróforo; e 3) um microscópio de fluorescência para contar células infectadas positivas fluorescentes.

Desde que o sistema imunológico de ratos é evolutivamente semelhante ao sistema imunológico de seres humanos¹⁶ e porque os ratos podem eliciar uma resposta humoral forte e protetora contra a infecção do IAV, a imunogenicidade da IAVs (ou candidatos vacinais) pode ser facilmente avaliado por determinação total (ELISA; A Figura 4) e neutralizar (HAI, Figura 5) ou respostas de anticorpos VNA (figuras 6). Para analisar as respostas humorais após a imunização, os ratos podem ser sangrados por diferentes métodos aprovados como punção retrô-orbital, clip de cauda, punção de veia safena ou punção submandibular. Escolhemos a técnica de punção submandibular²⁶ porque o procedimento não requer o uso de anestesia e permite-nos obter um volume aceitável de sangue para estudos imunológicos; em oposição a punção retrô-orbital, onde os ratos devem ser anestesiados e com o clipe de cauda ou punção de veia safena, onde o volume de sangue recuperados geralmente são baixo.

Neste manuscrito, descrevemos como avaliar a presença de anticorpos contra as proteínas virais totais por ELISA utilizando extratos de célula infectada pelo vírus. Desde que o IAV infecção induz uma imunidade protetora mediada, principalmente, por anticorpos contra a HA viral (o antigênico viral alvo principal), é altamente recomendável para avaliar a quantidade de anticorpos específicos induzidos contra HA por ELISA usando recombinante purificada HA proteínas¹⁰. Para analisar a presença de anticorpos neutralizantes, os HAI VNA métodos e são aceites, mas ambos têm vantagens e desvantagens. O HAI é rápida (2-3h) e aprovado pelo centro de doenças e controle (CDC) avaliar a presença de IAV neutralizando anticorpos³⁰. O VNA é mais demorados (3-4 dias), mas é mais específico, uma vez que avalia apenas os anticorpos que podem neutralizar a infecção viral. Notavelmente, o VNA foi mostrado para detectar talo-reactivo HA neutralizando anticorpos³¹, bem como NA neutralização de anticorpos³². Outra vantagem do VNA é a sensibilidade do ensaio, desde menos IAV (200 FFU) é necessária em comparação com o ensaio HAU que requer aproximadamente 10 ~⁴-10⁵ FFU. Além disso, o ensaio HAI pode ser problemático para a detecção de anticorpos neutralizantes contra IAVs aviária devido à dificuldade com interpretação de resultados³³^,³⁴^,³⁵. Além disso, VNA não requer o uso de hemácias para a identificação de anticorpos neutralizantes de gripe.

Finalmente, descrevemos os procedimentos experimentais para avaliar os três principais aspectos que devem ser considerados no desenvolvimento de novas vacinas IAV (Figura 3): 1) segurança: a vacina deve ser seguro e não produzem doença; 2) imunogenicidade: a vacina deve ser imunogênicas e induzir respostas protetoras humorais e celulares; 3) eficácia de proteção: a vacina deve induzir proteção contra desafio com vírus homólogos ou heterólogos de WT. O modelo do rato é uma boa escolha para o primeiro da seleção de um novo IAV vacina na vivo porque ele pode avaliar esquemas de vacinação diversas e condições, incluindo o usam de diferentes adjuvantes, a dose de antígeno/vacina, a administração e a ampla proteção contra o desafio com homóloga ou heteróloga IAVs estirpes¹⁶^,¹⁷. No entanto, antes de prosseguir para testes clínicos em humanos, candidatos vacinais devem no mínimo ser testados em um segundo modelo in vivo .

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Pesquisa sobre o vírus da gripe em laboratório LM-S é parcialmente financiada pelo The New York gripe centro de excelência (NYICE), um membro dos NIAID centros de excelência para a investigação de Influenza e vigilância (CEIRS). Agradecemos seu apoio nas correções do manuscrito Wendy Bates.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells	ATCC	CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice	National Cancer Institute (NCI)	01XBE
Turckey red blod cells	Biolink Inc		Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Corning Cellgro	15-013-CV	Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-050	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x	Corning	30-009-CI	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	Corning	30-00-CI	Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA)	Sigma-Aldrich	A7409	Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647	Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin	Sigma-Aldrich	T8802	Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10%	EMD	65346-85	Store at RT
Triton X-100	J.T.Baker	X198-07	Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65	ATTC	H16-L10-4R5	Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC	Dako	F0261	Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody	GE Healthcare	LNA931V/AG	Store at 4 °C
TMB substrate set	BioLegend	421101	Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader	Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders	Thomas Scientific	7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II)	Denka Seiken Co.	370013	Store at -20 °C
Crystal Violet	Fisher Scienctific	C581-100	Store at RT
96-well Cell Culture Plate	Greiner Bio-one	655-180
Cell Culture dishes 100 mm	Greiner Bio-one	664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo Fisher Scienctific	269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates	Thermo Fisher Scienctific	249570
Puralub Vet Ointment	Dechra	9N-76855
Fluorescent microscope	Olympus	Olympus IX81

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References

Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857 (2009).
Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

Immunology and Infection

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

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Protocol

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