Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/55898
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Summary

فيروسات الإنفلونزا A (IAVs) هي العوامل الممرضة التنفسية البشرية الهامة. لفهم الحالة المرضية التي تحدثها IAVs وإجراء الاختبار السريري نهج لقاح الرواية، نماذج حيوانية تقليد الفسيولوجيا البشرية مطلوبة. هنا، نحن وصف تقنيات تقييم IAV المرضية واستجابات خلطيه وفعالية اللقاحات باستخدام نموذج الفأر من العدوى.

Abstract

فيروسات الإنفلونزا تتسبب في وفاة ما يزيد على 500,000 في العالم1 ، وترتبط بتكلفة سنوية تبلغ 12 بیلیون دولار في الولايات المتحدة وحدها النظر الطبية المباشرة، ونفقات العلاج في المستشفيات و التغيب عن العمل2. نماذج حيوانية تشكل عاملاً حاسما في فيروس الإنفلونزا أ الفيروس (عياف) دراسات لتقييم المرضية الفيروسية، والتفاعلات المضيف الممرض، والاستجابات المناعية، وفعالية اللقاحات الحالية و/أو رواية نهج فضلا عن الأدوية المضادة للفيروسات. الفئران نموذج حيوانات صغيرة مفيدة لأن نظامهم المناعي تقحم مشابهة لتلك الموجودة في البشر، فمتوفرة من البائعين التجاريين كمواضيع متطابقة وراثيا، وهناك سلالات متعددة يمكن استغلالها لتقييم الأساس الوراثي للإصابة، وغير مكلفة نسبيا وسهلة للتلاعب. أن الخص عياف الإصابة في البشر عبر الخطوط الجوية، أولاً يتم تخديره الفئران قبل التلقيح داخل الآنف مع IAVs المعدية تحت الاحتواء السلامة الأحيائية السليمة. بعد الإصابة، تتحدد الآلية المرضية ل IAVs الرصد اليومي الاعتلال (فقدان وزن الجسم) ومعدل الوفيات (البقاء على قيد الحياة). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تقييم المرضية الفيروسية بتقييم النسخ المتماثل الفيروس في الأعلى (الغشاء المخاطي للأنف) أو الجهاز التنفسي (الرئتين) أقل من الفئران المصابة. يمكن تقييم استجابات خلطيه عند الإصابة عياف سريعاً بالنزيف غير الغازية وكشف الأجسام المضادة الثانوية فحوصات تهدف إلى الكشف عن وجود مجموعة أو تحييد الأجسام المضادة. وهنا، يمكننا وصف الطرق الشائعة المستخدمة لتصيب الفئران إينتراناسالي (i.n) مع عياف وتقيم المرضية، والاستجابات المناعية خلطيه وفعالية الحماية.

Introduction

IAVs هي الفيروسات المغلفة مصنفة في أسرة اورثوميكسوفيريداى 3. أنها تحتوي على ثمانية جزيئات الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل مع الأقطاب السالبة3. في البشر، وتسبب IAVs الأوبئة الموسمية والأوبئة العرضية تترتب عليها آثار هامة عندما يتم إدخال فيروسات جديدة في عدد السكان4. وعلاوة على ذلك، IAVs الموسمية العالية وسرعة تنتقل بين البشر تنتج خسارة اقتصادية مرتفعة في جميع أنحاء العالم كل سنة2،5. وتشمل الأعراض عياف السعال، احتقان الآنف، الحمى والشعور بالضيق، والصداع، وفقدان الشهية وألم عضلي، ولكن الفيروس يمكن أن تنتج أيضا مرض أكثر شدة في مرضى المناعة6. في الواقع، أن منظمة الصحة العالمية (WHO) يحسب أن فيروسات الإنفلونزا الموسمية تتسبب في 300,000-500,000 حالة وفاة في العالم كل سنة1. وهناك فقط فئتين من الأدوية المعتمدة حاليا للأغذية والدواء (FDA) للوقاية من الإنفلونزا ومعاملة البشر: مثبطات النورامينيداز (غ) (مثلاً، الأوسيلتاميفير) وسد القناة أيون M2 (مثلاً، أمانتادين)؛ ومع ذلك، ظهور متغيرات الفيروس المقاوم للأدوية تثير قلقا متزايداً. ولذلك، يظل التطعيم، خيار طبية أفضل لحماية البشر ضد الإصابات IAVs. وحتى الآن، ثلاثة أنواع من الإنفلونزا تتوفر لقاحات مرخصة من قبل إدارة الأغذية والعقاقير للاستخدام البشري: اللقاحات البروتين المؤتلف الفيروسية هيماغلوتينين (ها)، إبطال لقاحات الإنفلونزا (IIV)، ويعيش يخفف الإنفلونزا اللقاحات (لايف)5، 7-اللقاحات الثلاثة مصممة لحفز الاستجابة المناعية التكيفية ضد البروتين الفيروسي هكتار، هدفا رئيسيا لتحييد الأجسام المضادة ضد IAVs.

نموذج ماوس المصادق عليها لدراسة IAV العدوى في فيفو

وقد استخدمت نماذج حيوانية لدراسة، بين أمور أخرى، IAV المرضية8،،من910،11، العوامل الفيروسية التي تساهم في المرض12 و/أو انتقال العدوى الفيروسية13 ،14، والأدوية لاختبار فعالية اللقاحات الجديدة أو المضادة للفيروسات9،،من1015. الفئران (Mus musculus) هي نموذج الحيوانية المستخدمة على نطاق واسع معظم البحوث عياف لعدة أسباب: 1) المناعي يشبه تقحم إلى أن هناك حاليا في البشر؛ 2) منخفضة التكلفة، بما في ذلك شراء الحيوان والسكن والإنجاب؛ 3) صغيرة الحجم سهولة التعامل معها وتخزينها؛ 4) تقلب المضيف الحد الأدنى للحصول على استجابات متجانسة والنتائج؛ 5) على معرفة كبيرة بالبيولوجيا الفئران، بما في ذلك تسلسل الجينوم؛ 6) العديد من البيولوجيا الجزيئية المتاحة و/أو الكواشف علم المناعة؛ 7) متاح ضرب الفئران (كو) لدراسة مساهمة البروتين مضيف معين على العدوى الفيروسية؛ و، 8) سلالات الماوس المتعددة التي يمكن استغلالها لتقييم الأساس الوراثي للعدوى.

وهناك عدة سلالات الماوس المتوفرة حاليا لدراسة عياف في فيفو. العمر والحالة المناعية، والجنس، والسلالة الوراثية الخلفية والماوس، فضلا عن طرق العدوى والجرعة وسلالات فيروسية التأثير على نتيجة الإصابة إياف في الفئران. هي سلالات الماوس الأكثر شيوعاً المستخدمة في البحوث IAV C57BL/6، بالب/ج، وفي الآونة الأخيرة، الفئران DBA.2 نظراً لأنهم أكثر عرضه للأمراض إياف من السلالات السابقة هما16،،من1718، 19 , 20-الأهم من ذلك الاستجابة المناعية أيضا يمكن أن تختلف تبعاً للماوس السلالة18،،من1920. وهكذا، المهم جداً لاسترداد كافة المعلومات المتوفرة عن الماوس وسلالة إياف لاختيار أفضل خيار للتجربة التي ستجري.

على الرغم من أن الفأر نموذج حيوان جيد للعدوى في فيفو الدراسات مع عياف، لديهم العديد من القيود، التي تحتاج إلى النظر في التصميم التجريبي. على سبيل المثال، قيداً رئيسيا لاستخدام الفئران في فيفو الدراسات أن لا ترسل IAVs بين الفئران. وهكذا، لانتقال قبول الدراسات، أكثر النماذج الحيوانية (مثلاً، فرت أو خنازير غينيا) هي المستعملة16،،من1721. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من الاختلافات بين مظاهر عياف في الفئران والبشر. بخلاف البشر، لا تتطور الفئران الحمى عند عياف العدوى؛ على العكس من ذلك فإنها تعرض مع انخفاض درجة حرارة الجسم16،17. ويتركز في الفئران، عياف النسخ المتماثل في الجهاز التنفسي السفلي (الرئتين) بدلاً من الخطوط الجوية العليا. وهكذا، ضراوة عياف في الفئران لا يرتبط دائماً بأن ينظر في البشر. بالإجمال، نظراً للمزايا التي تفوق المساوئ محدودة، الماوس يمثل أول نموذج الحيوانات المستخدمة لتقييم أمراض الإنفلونزا الفيروسية، الاستمناع والنجاعة الوقائية في دراسات اللقاحات والأدوية المضادة. وعلاوة على ذلك، سيكون غير مقبولة أخلاقيا لإجراء دراسات مع عياف باستخدام نماذج حيوانية كبيرة دون الأدلة السابقة في نموذج حيوانات صغيرة للعدوى عياف. في هذه المخطوطة، ونحن تصف كيفية تصيب الفئران إينتراناسالي (i.n.) مع عياف وكيفية مراقبة بشدة والتقدم للعدوى الفيروسية وكيفية إجراء التجارب اللازمة لتقييم الاستجابات المناعية خلطيه وفعالية الحماية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع البروتوكولات الحيوان الموصوفة هنا ووافق "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) ولجنة السلامة الأحيائية المؤسسية (IBC) في جامعة روتشستر مدرسة الطب وطب الأسنان، والتقيد مع التوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من 22 مجلس البحوث الوطني. المرافق والبرامج فيفاريوم و "شعبة الطب الحيوانات المختبرية" في كلية الطب وطب الأسنان هي معتمدة من قبل "آآلاك الدولية" والامتثال لقانون الدولة والنظام الأساسي الاتحادي وسياسة المعاهد الوطنية للصحة (NIH). ينبغي أن تطبق اشتراطات مماثلة في كل مؤسسة الانضمام إلى البروتوكولين الحيوان الموصوفة في هذه المخطوطة.

1-"استخدام الحيوانات الفقارية الصغيرة"

ملاحظة: السليم شخصية حماية المعدات (معدات الوقاية الشخصية) مطلوب للعمل مع الفئران. الحد الأدنى من المتطلبات وتشمل والمآزر المتاح ويغطي الحذاء وغطاء الرأس، وقناع وقفازات.

  1. وفقا لبروتوكول إياكوك، وضع حد أقصى 5 الفئران في قفص. بعد بروتوكول إياكوك، euthanize الفئران مع اثنين من الأساليب للقتل الرحيم (الثاني يجب أن يكون أسلوب مادية) التأكد من أن الحيوان الميت.
    ملاحظة: في التجارب التي عياف المراضة والوفيات يتم تقييمها، الفئران التي فقدت 20% وزن الجسم الأولية تعتبر قد وصلت إلى نقطة النهاية تجريبية، وقد euthanized مع CO 2، والتفكك عنق الرحم الأسلوب الثانوي المادية. قد تكون هذه النسبة المئوية من وزن الجسم المختلفة في المؤسسات الأخرى. في الإجراءات حيث يتم جمع الفئران الرئتين والغشاء المخاطي للأنف بعد الإصابة عياف، الفئران هي euthanized مع جرعة قاتلة من 2,2,2-تريبروموثانول (TBE)، وقطع الكبد في الوريد كأسلوب الثانوية المادية. الإناث من الفئران C57BL/6 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها تم شراؤها وصيانة في منشأة رعاية الحيوان في جامعة روتشستر مدرسة الطب وطب الأسنان تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض.

2. السلامة الأحيائية

ملاحظة: في هذا التقرير، هي IAVs المستخدمة لتصيب الفئران سلالة المختبر تتكيف مع الماوس الشائعة من الإنفلونزا H1N1 A/Puerto ريكو/8/34 (PR8 WT) 22 ، 23 و درجة حرارة حساسة ليف البديل، ليف PR8 8. القيام بجميع الإجراءات التي تنطوي على الالتهابات عياف (في المختبر أو في الجسم الحي) والثقافات الخلية، والعينات البيولوجية، في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء تحت مستوى السلامة الأحيائية (BSL)-2 الشروط. استخدام BSL الدعاوى أو ظروف الاحتواء الأخرى إذا استخدمت ضراوة شديدة عياف سلالات.

  1. نظيفة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع مطهر ثاني أكسيد الكلور قبل وبعد تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية المبينة في هذه المخطوطة. تعقيم كل المواد تشريح (مقص ومشرط تشريح الملقط) والخالطون دونس قبل وبعد استخدامها بعد الحَوسة التوصيات المناسبة. تجاهل جميع المواد المنتجة خلال الإجراءات المنصوص عليها في المبادئ التوجيهية الحَوسة و IACUC سليم.

3. العدوى داخل الآنف

  1. مكان C57BL/6 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها الإناث الفئران تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض. تنظيم وتسمية الماوس أقفاص مع الفيروس والجرعة المستخدمة. تحديد الفئران في قفص كل استخدام رمز لكمه إذن أو بأسلوب آخر المعتمدة مثل لوحة الذيول. وضع حد أقصى 5 الفئران في قفص.
  2. إعداد تمييع عياف (وحدات تشكيل الفلورسنت (فو)/الماوس) تحت ظروف معقمة في إجمالي حجم 30 ميليلتر/الماوس في عقيم 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS). الحفاظ على العدوى الفيروس على الجليد. حساب مقدار عياف لإضافة في تمييع الفيروسية مع الصيغة: ((فو س كل الماوس/30 ميليلتر) x الحجم النهائي)/الأسهم عيار الفيروسية.
    3. وزن الفئران باستخدام مقياس
  3. وتسجيل وزن كل الماوس (يوم 0). أمسك الماوس في وضع الظهرية بالتقاط بالقفا العنق بين السبابة والإبهام. عقد الذيل ضد اليد مع إصبع الخنصر.
    4. تخدير
  4. الماوس إينترابيريتونيلي (القائمة) مع 240-250 ملغ/كغ TBE بإدخال الإبرة في 2/3 والذيلية من الجانب الأيمن من البطن. توقف فترة قصيرة قبل سحب الإبرة. العودة الماوس إلى القفص وانتظر دقيقة 5
  5. تطبيق مرهم العيون معقمة للعين لمنع جفاف بينما تم تخديره من الماوس. تحقق إذا كان الماوس هو تخديره بانعدام منعكس سحب دواسة (أي، قرصه تو). إذا لم يتم تخديره الفئران تماما أنهم سوف السعال الفيروس.
  6. عندما يتم تخديره تماما من الماوس، ضع الماوس في ريكومبينسي الظهرية. وضع تلميح بيبيت تحتوي على 30 ميليلتر من العدوى الفيروس في الآنف وبطء ولكن باستمرار إخراج الحل. تأكد من أن الماوس هو استنشاق الإعداد عن طريق مراقبة العدوى إسقاط تختفي.
  7. التحقق من أن الماوس هو التنفس كما TBE يمكن أن تخفض بمعدل درجة الحرارة والتنفس. إرجاع الحيوان إلى القفص وضعه في ريكومبينسي الظهرية. رصد الفئران أي علامات الضائقة التنفسية وإذا لاحظت، مساعدة الماوس للتنفس بالحيوان عقد عمودياً والحث على أثر مدفوعة التنفس 24. رصد الماوس حتى أنه يستعيد وعيه (30-45 دقيقة بعد أن تم تخديره).

4. وصف "المرضية الفيروسية" ( الشكل 1)

  1. تقييم معدلات الاعتلال والوفيات ( الشكل 1 و الشكل 2)
    1. تصيب i.n. 3-4 مجموعات من 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها الإناث C57BL/6 الفئران (الفئران على الأقل 5 كل مجموعة، ن = 5) مع جرعات إذ (10، 10 2، 10 3 و 10 4 فو/الماوس) من وزن PR8 كما هو موضح في القسم 3-
    2. مراقبة ووزن الفئران باستخدام مقياس على مدى الأيام ال 14 القادمة في نفس الوقت تقريبا للتقليل من الاختلافات الوزن بسبب ابتلاع الغذاء. Euthanize الفئران التي تفقد 20% وزن الجسم الأولى كما هو موضح في القسم 1-
    3. بعد 14 يوما، euthanize الفئران التي تقاوم العدوى الفيروسية كما هو موضح في القسم 1-
    4. حساب فيروسي الماوس 50% جرعة مميتة (MLD 50) استناداً إلى بقاء البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام أسلوب ريد ومونش 25. أولاً، حساب المسافة نسبة (PD):
      Equation 1
      1. وبعد ذلك، حساب MLD 50 بالصيغة التالية:
        Equation 2
  2. تقييم التتر الفيروسية في الرئتين والغشاء المخاطي للأنف ( الشكل 1 و الشكل 2. )
    1. الانتعاش من الرئتين والغشاء المخاطي للأنف
      1. تصيب الفئران C57BL/6 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها الإناث i.n. (ن = 6) مع الجرعة الفيروسية لاختبار 10-10 4 فو WT PR8 كما هو موضح في القسم 3-
      2. جمع الماوس الرئتين والغشاء المخاطي للأنف في أيام 2 (n = 3) و 4 (n = 3).
        1. Euthanize الفئران بجرعة قاتلة (القائمة) من TBE (500 مغ/كغ). وضع الحيوان في ريكومبينسي الظهرية وتطهير الفراء على الصدر مع الإيثانول 70%. قطع الجلد مشرط من القص لقاعدة للبطن. إجراء تخفيضات 1 سم من قاعدة للشق على الأجزاء الجانبية من الفئران مع المقص.
        2. قطع الوريد الكبدي مع مقص ينزف الماوس كأسلوب القتل الرحيم الثانوية. ضع الحيوان في موقف البطني وانتظر 2 دقيقة للسماح للدم إلى استنزاف خارج. تعد هذه الخطوة مهمة للحد من الدم في الرئتين.
        3. إزالة الجلد من الجزء العلوي بأكمله الماوس (بما في ذلك الرأس) لقاعدة للبطن حيث تم شق أول مع المعونة من تشريح ملقط ومقص. قطع الرأس بالمقص ووضعه في طبق بتري جافة عقيمة.
        4. قطع الوصلات بين في الفك الأعلى والفك السفلي مع المقص وتجاهل الفك السفلي. مع المقص، إجراء تخفيضات اثنين في نهايات أقواس زيجوماتيك وإزالتها. إزالة العين بمساعدة ملقط تشريح.
        5. عقد في الجمجمة مع ملقط تشريح وقص الجمجمة على طول خياطة السهمي مع مشرط. أرفع نصفي الجمجمة مع الدماغ لمعرفة الغشاء المخاطي للأنف. موكوساس الآنف محاطة بالعظام الأمامية من الجمجمة، بما في ذلك الآنف، الفك، بلاطي، زيجوماتيك، وعظام غربالي.
        6. تستخدم دون مشرط، قص الجزء من الجمجمة بالمخ وتجاهل. ضع الجزء الآخر من الجمجمة مع الغشاء المخاطي الأنفي في أنبوب عقيم. تخزين الأنبوب على الجليد (4 درجة مئوية) إذا كانت العينات التي يتم معالجتها في نفس اليوم، أو في الثلج الجاف تجميدها بسرعة إذا سيتم تجهيز العينات لاحقاً.
        7. لتجنب تلوث العينات، تنظيف وتطهير أدوات تشريح بين كل الأنسجة استردادها، وبين كل تشريح الحيوان مع مطهر ثاني أكسيد الكلور.
        8. لجمع الرئتين ووضع الحيوان في ريكومبينسي الظهرية وقص الجنب مع المقص. فتح القفص الصدري بقطع الأضلاع في 1 سم في كلا الجانبين للقص. إجراء التخفيضات من قاعدة القفص الصدري إلى الجزء متفوقة مع المقص.
        9. مقطع عرضي مع المقص بين شقوق اثنين في الجزء متفوقة من القفص الصدري وإزالة لوحة الصدر. عقد الرئتين بالملقط وقطع في نهاية القصبة الهوائية (قبل الرئتين) مع المقص ووضع الرئتين في أنبوب عقيم. تخزين الأنبوب على الجليد (4 درجة مئوية) إذا كانت العينات التي يتم معالجتها في نفس اليوم، أو في الثلج الجاف تجميدها بسرعة إذا سيتم تجهيز العينات لاحقاً.
          ملاحظة: مجانسة عينات الأنسجة التي جمعها في اليوم نفسه، وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحليل التتر الفيروسية في وقت لاحق. من المهم أن العينات لا يخضع تجميد أذاب المتكررة دورات قبل التتر الفيروس مصممون. وبدلاً من ذلك، تخزين عينات الأنسجة في-80 درجة مئوية حتى أنهم سوف تتم معالجتها.
    2. التجانس من الغشاء المخاطي للأنف والرئتين
      1. مكان الرئتين أو الغشاء المخاطي للأنف في الخالطون دونس عقيمة وإضافة 1 مل الإعلام الإصابة بالبرد. مجانسة العينة بتحريك المدقة صعودا وهبوطاً لمدة 1 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى يتم تعطل الرئتين تماما. وضع العينة المتجانس في الأنبوب عقيمة ومخزن في 4 ° جيم-استخدام الخالطون دونسي جديدة لكل عينة.
      2. الطرد المركزي العينات من 300 غرام x لمدة 5-10 دقيقة في الرايت جمع المادة طافية في أنبوب عقيم جديدة. تخزين المادة طافية في 4 درجات مئوية إذا كان يتم إجراء المعايرة الفيروسية في نفس اليوم وتجاهل بيليه. وبدلاً من ذلك، تجميد عينات (-80 درجة مئوية) المادة طافية للمتجانس لتقييم التتر الفيروسية لاحقاً.
    3. معايرة الفيروس قبل الفلورة غير المباشرة
      1. البذور في اليوم قبل المعايرة، لوحات 96-جيدا مع الخلايا الظهارية داربي مدين الكلاب الكلي (مدك) (4 × 10 4 خلايا/جيد) للتوصل إلى التقاء ~ 80-90 ٪ في وسائل الإعلام زرع الأنسجة. وضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2. يوم المعايرة الفيروسية، فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أحادي الطبقة قبل بدء العدوى الفيروسية.
        2. إعداد
      2. 01:10 تخفيف من المادة طافية عينات المتجانس (الرئة أو الغشاء المخاطي للأنف) في وسائل الإعلام العدوى في صفيحة 96-جيدا. إجراء المعايرة الفيروسية عن طريق تريبليكاتيس تحديد دقة التتر الفيروسية.
        1. ميليلتر 90 إضافة وسائط العدوى إلى كل من الآبار في لوحة 96-جيدا. إضافة 10 ميليلتر واحد من المادة طافية عينات المتجانس لآبار A1، A2 و A3 لتقييم عيار الفيروسية لكل عينة في ثلاث نسخ. إضافة 10 ميليلتر من المادة طافية أخرى من العينات المتجانس لآبار A4 و A5 و A6. أداء إضعاف نفس التتابع مع بقية العينات.
        2. بعد إضافة العينة طافية للصف A، استخدم بيبيت الأقنية إلى مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. نقل 10 ميليلتر من صف بصف التغيير ب النصائح بين تخفيف ومزيج جيد. كرر هذه العملية حتى وصلت إلى الصف الأخير (ح)-
      3. إزالة المتوسطة زراعة الأنسجة (الخطوة 4.2.3.1) تستخدم محول متعدد الأقنية المضخة فراغ من الخلايا مدك في لوحات 96-جيدا ويغسل مرتين مع 100 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني 1 س.
        4. الخلايا
      4. من المادة طافية متسلسل المخفف للعينات المتجانس للوحة 96-جيدا مع مدك نقل 50 ميليلتر/جيدا. البدء في نقل تخفيف أعلى (صف ح) لتخفيف السفلي (صف أ). في هذه الحالة، فإنه ليس من الضروري تغيير النصائح بين صفوف مختلفة.
      5. وضع لوحات 96-جيدا على منصة هزاز ح 1 في الرايت السماح الامتزاز الفيروسية. بعد الامتزاز الفيروسية، إزالة العدوى استخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ وإضافة 100 ميليلتر/جيدا لوسائل الإعلام بعد الإصابة. احتضان الخلايا المصابة ح 8 في حاضنة 33 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية مع شركة 5% 2. الشروع في إصلاح وتلطيخ والتصوير وحساب عيار الفيروسية كما هو موضح في الخطوات 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
        6. إزالة
      6. المتوسطة زراعة الأنسجة من لوحات 96-جيدا باستخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ. إصلاح وبيرميبيليزي الخلايا مع 100 ميليلتر/جيدا لحل التثبيت/بيرميبيليزيشن لمدة 20 دقيقة في الرايت
        تحذير: استخدام الحل التثبيت/بيرميبيليزيشن في غطاء دخان لمنع التعرض فورمالدهايد.
      7. إزالة التثبيت/بيرميبيليزيشن الحل باستخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ أو تغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x، واحتضان الخلايا الثابتة مع حظر حل ح 1 في مخزن الرايت الخلايا في عرقلة الحل في 4 درجات مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية-
      8. إزالة الحل حظر. إضافة 50 ميليلتر/بئر 1 ميكروغرام/مل [مونوكلونل] جسم (ماب) المضادة NP غبطة-65 المخفف في جسم تمييع الحل. احتضانها ح 1 في 37 ° ماب مختلفة جيم أو بوليكلونيمكن استخدامها الأجسام المضادة (pAb) مكافحة-PR8.
      9. وفي الوقت نفسه، يؤدي إلى تمييع 1: 200 fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مترافق الثانوي الماوس المضادة الأجسام المضادة في جسم تمييع الحل. الطرد المركزي الحل في 1,700 س ز لمدة 5-10 دقيقة في الرايت أخرى أجسام الثانوي مترافق مع أخرى فلوروفوريس يمكن استخدامها-
        10. إزالة الأجسام المضادة الأولية
      10. ويغسل 3 مرات من برنامج تلفزيوني 1 x 100 ميليلتر/جيدا. إضافة 50 ميليلتر/جيدا لتمييع جسم الثانوية واحتضان لمدة 30-45 دقيقة في 37 درجة جيم إزالة الأجسام المضادة الثانوية ويغسل 3 مرات من برنامج تلفزيوني 1 x 100 ميليلتر/جيدا. ترك غسل آخر في اللوحة-
      11. مراقبة الخلايا تحت مجهر الأسفار لتحديد عدد الخلايا (الأخضر) الملون إيجابية. حساب عيار الفيروسية عن طريق العد فو/مل. حساب عيار الفيروسية المعرب عنها في فو/ملليلتر من التخفيف مع 30-50 إيجابية الخلايا ملطخة باستخدام الصيغة: ((n1 + n2 + n3)/3) × 20 × 1/تمييع.

5. تقييم "الاستجابات المناعية خلطيه" ( الشكل 3)

  1. تصيب المجموعات i.n. 3 من 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها الإناث C57BL/6 الفئران (n = 5) مع جرعات مختلفة (10 2، 10 3 و 10 4 فو/ الماوس) من ليف PR8، وصورية-تصيب مجموعة واحدة (n = 5) مع 1 × PBS العقيمة كعنصر سلبي. تؤدي التهابات الماوس i.n كما هو موضح في القسم 3- نزيف
    1. الماوس بثقب اللهاة
      1. أربعة عشر يوما بعد التحصين، جمع الدم الفئران باستخدام النزيف اللهاة 4 مم انسيت 26، أو استخدام IACUC آخر الموافقة على الأسلوب.
        1. عقد الماوس عن طريق التقاط بالقفا العنق بين السبابة والإبهام. عقد الذيل ضد اليد مع إصبع الخنصر شل الماوس.
        2. وضع الماوس في وضع أفقي لأنظر الخد. جعل في الثقب في المنعطف الأوردة الرجعية-المداري واللهاة بحبل الوريد. غرقت في مجلة لانسيت (4 ملم)، واسترداد الدم في أنبوب عقيم (حوالي 0.2-0.4 مل/الماوس تسترد). ممارسة الضغط على الثقب منديل معقم لبضع ثوان. ضع الماوس مرة أخرى إلى القفص.
      2. وضع أنابيب لح 1-2 في 37 درجة مئوية وثم الطرد المركزي في 700 غ س لمدة 30 دقيقة على RT لفصل المصل من الدم. نقل الطبقة العليا التي تتكون من المصل مع بيبيت إلى أنبوب عقيمة جديدة. تجاهل بيليه خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). تخزين المصل في-20 درجة مئوية.
  2. تحليل لمجموع الأجسام المضادة ضد البروتينات الفيروسية
    1. إعداد المصابين مقتطفات الخلية مدكك
      1. البذور قبل الإصابة، اليوم واحد طبق 100 ملم مع 4-5 × 10 6 مدكك الخلايا (للوصول إلى ~ 80-90 التقاء % في اليوم التالي) في وسائل الإعلام زرع الأنسجة. وضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2. يوم العدوى الفيروسية، فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أحادي الطبقة قبل بدء العدوى الفيروسية.
        2. إعداد
      2. إضعاف فيروسية مع تعدد (0.001) منخفضة العدوى (وزارة الداخلية) من وزن PR8 في وسائل الإعلام العدوى في الحجم النهائي الإجمالي 4 مل. حساب مقدار وزن PR8 مع الصيغة ((موي X x الخلايا جوان) x الحجم النهائي)/الأسهم عيار الفيروسية.
      3. نضح المتوسطة زراعة الأنسجة من لوحة الخلية مدك ويغسل مرتين مع 4 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. إضافة العدوى الفيروسية (4 مل) ووضع اللوحة على منصة هزاز ح 1 في الرايت السماح الامتزاز الفيروسية. إزالة العدوى الفيروسية بالفراغ وإضافة 8-10 مل من الإصابة بعد الوسائط التي تحتوي على 1 ميكروغرام/مل من تعامل تبكك التربسين. احتضان الخلايا المصابة عن 48-72 ساعة في حاضنة 33 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
        4. فصل الخلايا بمساعدة مكشطة خلية
      4. وجمع الخلايا وزراعة الأنسجة المتوسطة مع بيبيت في أنبوب 15 مل. الطرد المركزي الأنبوب في 400 غرام x لمدة 5-10 دقيقة في الرايت أسبيراتي المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للمعهد الملكي ووضع المزيج في أنبوب عقيم 1.5 مل. تبني على الجليد للحد الأدنى من 20-30
        5. °
      5. الطرد المركزي الأنبوب في س 1,300 ز لمدة 20-30 دقيقة في 4 "جيم بعناية"، استعادة المادة طافية. مخزن استخراج الخلية في 100 ميليلتر مختبرين في-20 درجة مئوية.
      6. تيتراتي مقتطفات الخلية كما هو موضح بمقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) قبل أن يقيم لهم لوجود الأجسام المضادة 9 ، ، من 10 11 ، 27-خلية ما يلي مقتطفات من مدك الخلايا المصابة موك (أعدت كما هو مبين أعلاه) كعنصر تحكم سلبية.
    2. أليسا ( الشكل 4)
      1. معطف البوليستيرين استخراج لوحات 96-جيدا مع تمييع الخلايا المصابة مدكك المناسبة في برنامج تلفزيوني 1 x (عادة ما بين 1: 200-1:1، 000). معطف لوحة أخرى مع نفس تمييع المصابات موك استخراج خلية مدكك كعنصر سلبي. تبني بين عشية وضحاها (O/N) في 4 ° C.
        2. إزالة المادة طافية باستخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ
      2. ويغسل مرة واحدة مع 100 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني 1 x مع بيبيت الأقنية. كتلة غير محددة ملزمة بإضافة 100 ميليلتر/جيدا من عرقلة الحل ح 1 في الرايت
      3. وفي الوقت نفسه، جعل تخفيف المسلسل إضعاف (ابتداء من تمييع 01:50) سيرا من الماوس كل مصاب في الخطوة 5، 1 في جسم تمييع الحل في صفيحة 96-جيدا-
        4. لوحات
      4. إزالة الحل حظر من البوليستيرين 96-جيدا باستخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ. إضافة 50 ميليلتر من كل تخفيف المصل الماوس في البئر المناسبة واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
        5. إزالة
      5. سيرا الفئران مع محول متعدد الأقنية المضخة فراغ. غسل الآبار 3 مرات بماء مقطر استخدام بيبيت الأقنية. إضافة 50 ميليلتر/جيدا من جسم الثانوي الماوس المضادة مترافق مع 1:2,000 الفجل البيروكسيديز (HRP) المخفف في جسم تمييع الحل. احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية
      6. إزالة الأجسام المضادة الثانوية مع محول متعدد الأقنية المضخة فراغ. غسل الآبار 3 مرات بماء مقطر استخدام بيبيت الأقنية. إعداد الحل الركيزة تيتراميثيلبينزيديني (TMB) عن طريق خلط 1:1 حل أ وب إضافة 100 ميليلتر/جيدا من الركازة، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT في الظلام-
      7. وقف رد الفعل بإضافة 100 ميليلتر/جيدا من 0.2 "ن ح" 2 حتى 4. قراءة اللوحات في 450 نانومتر على قارئ لوحة أليسا.
      8. طرح القيمة التي تم الحصول عليها في كل تمييع مدكك المصابة موك لوحة 96-جيدا من القيمة التي تم الحصول عليها في لوحة 96-بئر مدكك المصابة. حساب متوسط القيم لكل تمييع مع الأمصال المختلفة وتمثيلهم في رسم بياني عرض الانحرافات المعيارية (SD)-
  3. تحليل لتحييد الأجسام المضادة
    1. مقايسة تثبيط Hemagglutination (هاي) ( الشكل 5)
      1. قبل إجراء الفحص هاي، علاج الأمصال الماوس مع مستقبلات تدمير إنزيم (استخلاص) للقضاء على جميع مثبطات غير محددة موجودة في المصل. إضافة إلى حجم 1 من المصل الماوس إلى 4 وحدات لاستخلاص العامل إضعاف (تخفيف المصل الآن 1:5). احتضان O/N (12- 18 h) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      2. عينات المصل في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإلغاء تنشيط استخلاص الحرارة.
      3. قبل تحديد النشاط هيماجلوتيناتيون (هاو) لوزن PR8 ب مقايسة هكتار قياسي 28. حالما يتم تحديد هاو الفيروسية، تضعف الأسهم الفيروسية لهاو 8 الواحد 50 ميليلتر في برنامج تلفزيوني 1 س.
      4. إعداد إضعاف تخفيف المسلسل (تخفيف 12) المعالجة باستخلاص سيرا في صفيحة الخامس-أسفل 96-جيدا. استخدام صف واحد لكل عينة المصل (مثلاً، A1 إلى A12).
        1. ميليلتر إضافة 25 س 1 برنامج تلفزيوني من A1 إلى الآبار A12. اختبار كل من عينات المصل في صف واحد. إضافة 25 ميليلتر من المعالجة باستخلاص سيرا (1:5) إلى 25 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x في البئر الأولى للعمود (A1). تخفيف المصل الأول 01:10-
        2. حالما تتم إضافة جميع الأمصال المعالجة باستخلاص للعمود الأول، (مثلاً، A1، B1 C1)، استخدم بيبيت متعددة القنوات لخلط الأمصال وبرنامج تلفزيوني x 1 من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. نقل 25 ميليلتر من الأمصال المخففة من العمود الأول إلى العمود الثاني (مثلاً، من A1 إلى A2). تغيير النصائح بين تخفيف ومزيج.
        3. كرر الخطوات 5.3.1.4.2. حتى وصلت إلى العمود الأخير (مثلاً، A12، B12، C12). تجاهل ميليلتر 25 من العمود الأخير، إبقاء الحجم متسقة في جميع الآبار (25 ميليلتر). إدراج صف واحد من الآبار التي تحتوي على فقط 25 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x دون أي سيرا كعنصر سلبي.
      5. المخفف إضافة 25 ميليلتر من إياف إلى 8 هاو/50 ميليلتر لكل من الآبار بالأمصال في 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة؛ وكذلك هو الحجم النهائي في كل 50 ميليلتر، تتضمن هاو 4 من الفيروس. خلط المحتويات من بيبيتينج المتكررة. احتضانها ح 1 في الرايت
      6. إضافة 50 ميليلتر من تركيا 0.5% كرات الدم الحمراء لكل من الآبار. خلط المحتويات من بيبيتينج المتكررة. احتضان لوحة لمدة 30-45 دقيقة على الجليد. قراءة المقايسة هاي بصريا عندما كرات الدم الحمراء في آبار مراقبة (1 x PBS) شكل ترسبات حمراء (أي، بيليه) في الجزء السفلي من الآبار-
        ملاحظة: كرات الدم الحمراء من الأنواع الأخرى مثل الدجاج، ويمكن أيضا استخدام خنزير غينيا أو حصان-
      7. حساب التتر هاي بتحديد آخر جيدا التي كرات الدم الحمراء تشكل بيليه أحمر ولا تحدث هيماجلوتينيشن.
        ملاحظة: قيمة المعاملة بالمثل لتمييع هذا هو عيار هاي. يتم ضرب القيمة المتبادلة بمعامل 20 لتصحيح 01:20 إضعاف المصل في الصف الأول-
    2. فيروس درياقي المقايسة (الفيتنامية) ( الشكل 6)
      1. اليوم السابق الفيتنامية، إعداد الخلايا مدك في صفيحة 96-جيدا للتوصل إلى التقاء 80-90% في اليوم التالي وكما هو موضح في الخطوة 5.2.1.1. إعداد إضعاف وزن PR8 في وسائط العدوى على 200 فو/25 ميليلتر.
      2. إيناكتيفاتي جعل الأمصال الماوس في 56 درجة مئوية حاء – 1 إضعاف تخفيف المسلسل (تمييع 12) كل الأمصال الماوس في تتبع استخدام لوحة 96-جيدا. ميليلتر
        1. ميليلتر إضافة 40 من المصل إلى 160 وسائط العدوى في البئر الأولى من الصف الأول، (مثلاً، A1) (مصل تمييع 1:5). مزيج من بيبيتينج. إضافة 100 ميليلتر من الإصابة بوسائل الإعلام إلى الآبار الأخرى (A2 إلى H12).
        2. نقل 100 ميليلتر من الصف الأول إلى الصف الثاني لجعل تخفيف 1:2 (مثلاً، من A1 إلى A2). تغيير نصائح بين تخفيف ومزيج من بيبيتينج. كرر هذه العملية حتى الصف الأخير (مثلاً، A12). تجاهل 100 ميليلتر من الصف الأخير، إبقاء الحجم متسقة في جميع الآبار (100 ميليلتر)-
      3. إضافة 100 ميليلتر لتمييع عياف لجميع الآبار. احتضان ح 1 في الرايت من جهة أخرى، إزالة المتوسطة زراعة الأنسجة من الخلايا مدك في لوحة 96-جيدا باستخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ ويغسل مرتين مع 100 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني 1 س.
      4. في كل لوحة 96-جيدا من الخلايا مدك، ترك صفين لعناصر التحكم. صف واحد هو مراقبة سلبية (الخلايا دون الفيروسات والأمصال)، والصف الأخرى الإيجابية مراقبة العدوى (الخلايا مع الفيروس في غياب سيرا أو الأمصال من الفئران المصابة بصورية).
      5. نقل 50 ميليلتر/بشكل جيد من لوحة أضداد الفيروس إلى لوحات 96-جيدا من الخلايا مدك. وضع اللوحات على منهاج ح 1 في الرايت السماح الامتزاز الفيروسية هزاز.
      6. إزالة العدوى الفيروس أضداد تستخدم محول متعدد الأقنية المضخة فراغ وإضافة 100 ميليلتر/جيدا ما بعد الإصابة بالوسائط التي تحتوي على 1 ميكروغرام/مل من تعامل تبكك التربسين.
      7. احتضان الخلايا ~ 3-4 أيام في حاضنة 33 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 حتى يلاحظ تأثير سيتوباثيك (CPE) في مراقبة إيجابية (الخلايا المصابة في غياب سيرا أو بمصل مراقبة)-
        8. إزالة المتوسط زراعة الأنسجة باستخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ
      8. وإضافة من البنفسجي كريستال 0.1% 100 ميليلتر/جيدا. احتضانها ح 1 في إزالة الرايت الحل البنفسجي كريستال باستخدام محول متعدد الأقنية المضخة فراغ. غسل الآبار 3 مرات بماء مقطر. جاف اللوحات في الرايت
      9. حساب التتر الفيتنامية بتحديد إضعاف أعلى أن يحتفظ أحادي الطبقة المتلاقية خلية من خلايا مدك.
        ملاحظة: قيمة المعاملة بالمثل لتمييع هذه المقابلة هو عيار الأجسام المضادة تحييد. يتم ضرب قيمة المعاملة بالمثل بمقدار 10 تصحيح في 01:10 إضعاف سيرا في البئر الأولى من الصف.

6. تقييم حماية فعالية اللقاحات ( الشكل 3)

  1. i.n. تلقيح مجموعة من الفئران C57BL/6 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها الإناث (ن = 11) مع جرعة PR8 لايف لاختبار (فو/الماوس) وصورية-تطعيم مجموعة أخرى من الفئران (n = 11) مع 1 × PBS العقيمة. إجراء التحصينات i.n. الماوس كما سبق ذكره في الفرع 3-
    2. التسييل الفئران
  2. أربعة عشر يوما بعد انتهاء التلقيح، وجمع سيرا النحو المبين في الفرع 3. تحليل وجود مجموعة وتحييد الأجسام المضادة ضد PR8 WT كما هو موضح في القسم 5.1.1.
  3. خمسة عشر يوما بعد انتهاء التلقيح، قياس وتسجيل وزن الجسم الماوس (يوم 0). تحدي i.n. الفئران بجرعة قاتلة من وزن PR8 (تحدي مثلى) كما سبق ذكره في الفرع 3-
  4. قياس وزن الجسم والبقاء على قيد الحياة (n = 5/المجموعة) خلال 14 يوما من تاريخ التحدي تقييم معدلات الاعتلال والوفيات التي تنتجها التحدي PR8 WT في تطعيم الفئران (الفرع 4-1)-
  5. استعادة الغشاء المخاطي للأنف والرئتين الماوس (n = 3/يوم) في اليوم الثاني ويوم 4 بعد تحدي مع PR8 تجانسه بالوزن وتحليل الرئتين والغشاء المخاطي للأنف كما هو موضح في القسم 4.2 ليقيم تكرار PR8 WT الفيروسية في الفئران الملقحين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وصف المرضية الفيروسية في الفئران

أمراض ال عياف تتصل المراضة والوفيات الناجمة عن الإصابة به. ويمكن تقييم هذه معلمتين من المعلمات في الفئران بسهولة: الاعتلال عياف يرتبط بفقدان وزن الجسم في الفئران المصابة وسوف تبين النسبة المئوية لبقاء معدل الوفيات (الشكل 1). وزن الجسم والبقاء على قيد الحياة في الفئران المصابة عياف تخضع عادة يوميا لمدة أسبوعين على الأقل بعد الإصابة8،،من910،29. ويمكن تحديد بقاء البيانات المتحصل عليها MLD50 التي تم حسابها باستخدام طريقة ريد ومونش25. مؤشر آخر لنشوء المرض IAV تتصل بالنسخ المتماثل الفيروسية في السفلي (الرئتين) وفي الجهاز التنفسي العلوي (الغشاء المخاطي للأنف) (الشكل 1). المعلومات التي تم الحصول عليها مع عيار الفيروسية في هذه الأجهزة يتوافق مع معدلات الاعتلال والوفيات بين القيم، ومجتمعة توفر مؤشرا جيدا لنشوء المرض الفيروسي. ومن المعروف أن النسخ المتماثل عياف في الرئتين الماوس ذروته بين الإصابة بعد انتهاء أيام 2 و 4 (بي)، وذلك أوصينا باسترداد هذه الأجهزة في بي أيام 2 و 4

Figure 1
رقم 1: توصيف IAV المرضية في الفئران: ويرتبط عياف المرضية في الفئران إلى الاعتلال (فقدان وزن الجسم) والوفيات (البقاء على قيد الحياة في المائة)، وأيضا إلى قدرة عياف نسخاً متماثلاً في الأعلى (الغشاء المخاطي للأنف) والجهاز التنفسي (الرئتين) أقل. بإيجاز، في اليوم 0 وزن الفئران وتخديره إينترابيريتونيلي مع 2,2,2-تريبروموثانول (TBE) من قبل أنهم مصابون إينتراناسالي مع إياف. من يوم 1 إلى 14 يوم، يتم وزن الفئران يوميا لتقييم الوزن الجسم (المرض) وبقاء % (الوفيات) لحساب الجرعة المميتة الماوس 50 (MLD50). في أيام 2 ويوم 4 ما بعد الإصابة، استعادت الفئران الرئتين والغشاء المخاطي للأنف وتجانس لتقييم النسخ المتماثل الفيروسية. فئران تجارب لتوصيف المرضية عياف استخدام PR8 WT تتم تحت ظروف BSL-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في الشكل 2، يتم تمثيل البيانات التي تم الحصول عليها في تقييم وزن PR8 المرضية. أربع مجموعات من الفئران C57BL/6 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها (n = 11) كانت i.n. المصابة بجرعات المشار إليه (10، 102، 103 و 104 فو/الماوس) من وزن PR8. وقيست بوزن الجسم والبقاء على قيد الحياة من الفئران 5 كل مجموعة خلال 14 يوما بي (الشكل 2A–ب). جميع الفئران تحصين مع 104 فو WT PR8 فقدان الوزن بسرعة (الشكل 2A) وكل منهم توفي في أيام 5 و 6 بي (الشكل 2). الفئران تحصين مع 10 من وزن الجسم فو WT PR8 فقدت3 في وقت لاحق مرات بي (الشكل 2A) وأنهم جميعا توفي قبل أيام 7 و 8 بي (الشكل 2). تحصين جميع الفئران بوزن الجسم 10 فو WT PR8 فقدت2 (الشكل 2A) لكن فقط 2 منهم توفي في يوم 9 بي (الشكل 2). وأخيراً، الفئران تحصين مع 10 فو WT PR8 لم تفقد الوزن (الشكل 2A) وكل منهم نجوا من الإصابة (الشكل 2). MLD50 من وزن PR8 في هذه التجربة التي تحسب ب طريقة ريد ومونش25 كان 1.5 × 102 فو (الشكل 2).

تقييم النسخ المتماثل PR8 في الجزء العلوي والسفلي من الجهاز التنفسي المسالك للفئران المصابة i.n. بجرعات المشار إليه (10، 102، 103و 104 فو/الماوس)، عثر على الرئتين والغشاء المخاطي للأنف في أيام 2 و 4 بي (n = 3). بعد تحقيق التجانس في الرئة، وقد تم تحليل كمية الفيروس الموجودة في هذا الجهاز بمقايسة الفلورة (الشكل 2D). عيار الفيروسية التي اكتشفت في الرئتين مجموعات مختلفة من الفئران يرتبط مع الجرعة المستخدمة لتحصين لهم: تم الكشف عن التتر الفيروسية أعلى في رئات الفئران تحصين مع 104 فو WT PR8 في أيام 2 و 4 بي، بينما تم اكتشاف التتر الفيروسية أقل في رئات الفئران تحصين مع فو 10 من وزن PR8.

Figure 2
رقم 2: تمثيل للبيانات التي تم الحصول عليها في تقييم أمراض فيروسية: لتحليل المراضة والوفيات من وزن PR8، 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها الإناث الفئران C57BL/6 (n = 5) كانت i.n. المصابة مع المشار إليه بعدد فلوري-تشكيل وحدات (فو) PR8 WT ورصدها ثم يوميا لمدة أسبوعين لفقدان وزن الجسم (A) (اعتلال) و (ب) بقاء (الوفيات). تمثل البيانات بوسائل والانحرافات المعيارية لنتائج مصممة للفئران الفردية (n = 5). يتم استخدام القيم (ج) بقاء % تقييم أكثر من 2 أسابيع لحساب MLD50 باستخدام أسلوب ريد ومونش25. (د) تقييم النسخ المتماثل الفيروسية، 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها الإناث C57BL/6 الفئران (n = 6) كانت i.n. المصابة مع المشار إليه بعدد فو. عادة ما يتم تقييم النسخ المتماثل الفيروسية في الرئتين أو الغشاء المخاطي للأنف من الفئران المصابة في بي أيام 2 و 4 باستخدام فحص إيمونوفوكوس. وتسجل التتر الفيروسية فو/مل. وتمثل البيانات بالوسائل والحزب الديمقراطي الصربي للنتائج التي تم الحصول عليها في كل الماوس. خطوط متقطعة مدرجة للإشارة إلى الحد الأقصى للكشف عن (200 فو/mL) المقايسة. تجارب زراعة الأنسجة لتقييم عياف المراضة والوفيات والتتر الفيروسية باستخدام PR8 والفئران أجريت تحت ظروف BSL-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تقييم استجابات خلطيه التي يسببها بعد التطعيم

خلطيه ردود فعل ضد العدوى عياف تلعب دوراً أساسيا في السيطرة على العدوى الفيروسية. ولهذا السبب، من المهم جداً تحليل استجابات خلطيه أثارت بالتهابات WT عياف أو بواسطة اللقاحات عياف الجديدة (الشكل 3). في طراز الماوس، 14 يوما بعد التحصين، الفئران هي نزف لتحليل وجود أجسام مضادة ضد مجموع البروتينات الفيروسية بإليزا (الشكل 4)، ووجود تحييد الأجسام المضادة لاستهداف البروتين هكتار الفيروسية، التي عادة ما تكون تحليلها من قبل نهج مقايسات مشتركة، مثل (مقايسة هايفئة نانوغرام = "إكسفيج" > الشكل 5) و/أو الفيتنامية (الشكل 6).

Figure 3
الشكل 3: مخطط لمختلف الخطوات في وصف السلامة، الاستمناع وفعالية الحماية من لايف: عندما يتم وضع ليف جديد، نموذج العدوى عياف الماوس يستخدم عادة لاختبار فعالية السلامة، الاستمناع وحماية. ويشار في هذا المخطط، تجارب لتقييم السلامة (A)، الاستمناع (ب) وفعالية الحماية (ج) مرشح لايف. (أ) لتقييم السلامة من ليف من الضروري الاعتداء نفس المعلمات (معدلات الاعتلال والوفيات والنسخ المتماثل الفيروسية في الجزء العلوي والجهاز التنفسي السفلي) المبين في الشكل 1. تقييم الاستمناع، تم تحصين الفئران و 14 يوما بعد التلقيح هي نزف بثقب اللهاة. ويتم تحليل استجابات خلطيه بتقييم وجود مجموع أضداد البروتينات عياف المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) وتقييم وجود تحييد الأجسام المضادة التي هيماجلوتينيشن بتثبيط الإنزيم (هاي) و/أو فيروس درياقي المقايسة (الفيتنامية). (ج) تقييم فعالية الحماية، 15 يوما بعد التلقيح، وتحدي الفئران مع حماية الوزن عياف يتم تقييم فعالية بالقياس من الفئران معدلات الاعتلال والوفيات والتتر الفيروسية في رئات الفئران المطعون فيه كما هو موضح في الشكل 1 . فئران تجارب لوصف فعالية السلامة، الاستمناع والحماية من مرشح لايف تتم تحت ظروف BSL-2. قد يكون أخرى تناسب BSL أو ظروف الاحتواء المطلوبة اعتماداً على سلالة عياف المستخدمة للتحدي المتمثل في تطعيم الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تقييم الاستمناع لليف PR8، ثلاث مجموعات من الفئران C57BL/6 6 إلى 8-الأسبوع-عمرها (n = 5) تم تحصين بجرعات مختلفة (102، 103و 104 فو/الماوس) ليف PR8 أو وهمية تلقيح مع برنامج تلفزيوني 1 x كعنصر سلبي. أربعة عشر يوما بعد التلقيح، جمعت الأمصال الفئران ب نزيف اللهاة26 (الشكل 3). تم تقييم استجابات الأجسام المضادة ضد مجموع البروتينات الفيروسية أليسا استخدام إضعاف 1: 200 استخراج خلية من الخلايا المصابة PR8 مدك (الشكل 4). وقد تم تحليل مصل كل على حدة. وتشير النتائج إلى أن يحصنوا الأمصال من الفئران بجرعة أعلى (104 فو) من ليف PR8 كان أعلى جسم التتر ضد مجموع PR8 البروتينات من الأمصال الفئران تحصين مع أقل جرعة (102 فو). ولم تظهر مراقبة الأمصال (الفئران المصابة بصورية) مفاعليه ضد المستضدات PR8.

Figure 4
الشكل 4: التمثيل التخطيطي مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) تقييم استجابات جسم خلطيه: تتحدد مستويات من الأجسام المضادة PR8 محددة موجودة في الفئران المصابة بإليزا في ألواح البوليسترين 96-جيدا المغلفة مع الخلية مقتطفات صورية (تحكم) أو الخلايا المصابة PR8 مدك. بإيجاز، في بي 14 يوما (الشكل 3)، كانت نزفت الفئران تحصين بجرعات المشار إليها من ليف PR8 بثقب اللهاة وجمع الأمصال. تم تقييم كل مصل على حدة بإليزا للأجسام المضادة مفتش ضد مجموع PR8 البروتينات. بيانات الرسم البياني تمثل الوسائل والانحرافات المعيارية للنتائج التي تم الحصول عليها من الفئران الفردية سيرا (n = 6). O.D، الكثافة البصرية. وأجريت فحوصات أليسا في خزانة BSL-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

لتحليل وجود تحييد الأجسام المضادة في الماوس المصل باستخدام هاي الاعتداء، تخفيف إضعاف المسلسل سيرا (سابقا معطل في 56 درجة مئوية) لكل مجموعة من الفئران تحصين بجرعات مختلفة (102، 103و 104 فو) من لايف PR8 كانت المحتضنة مع هاو 4 من وزن PR8 ح 1 في الرايت (الشكل 5). ثم أضيفت إلى الخلائط سيرا PR8 0.5% من كرات الدم الحمراء في تركيا. الجزء العلوي من الرقم 5 تمثيل تخطيطي لنتائج هاي ممكن: عندما يحتوي المصل على تحييد الأجسام المضادة، يلاحظ ترسيب كرات الدم الحمراء في أسفل البئر لمنع الأجسام المضادة منضمة إلى البروتين هكتار الفيروسية هيماجلوتينيشن كرات الدم الحمراء. من ناحية أخرى، في غياب لتحييد الأجسام المضادة، يلاحظ هيماجلوتينيشن لكرات الدم الحمراء. ثم يحسب عيار هاي المتبادلة لتخفيف المصل في hemagglutination تفتقر كذلك إلى الماضي. هاي النتائج تظهر في الجزء السفلي من الشكل 5 تشير إلى أن المصل من الماوس تطعيم مع أكبر قدر من ليف PR8 (104 فو) بعيار أعلى من تحييد الأجسام المضادة حين تحصين المصل من ماوس مع الجرعة الدنيا (102 فو) بعيار أدنى من تحييد الأجسام المضادة ضد PR8. لا الأجسام المضادة لتحييد كانت موجودة في المصل التحكم (الفئران المصابة بوهمية).

Figure 5
الرقم 5: مقايسة تثبيط (هاي) هيماجلوتينيشن: ويمكن تقييم مستويات تحييد الأجسام المضادة ضد PR8 WT في الفئران المصابة بسهولة بمقايسة هاي. بإيجاز، إضعاف تخفيف المسلسل (ابتداء من تمييع 01:10) من الأمصال من الفئران تحصين مع جرعات لايف PR8 المشار إليها كانت مختلطة (1:1) مع هاو 4 من وزن PR8 ح 1 في RT في صفيحة الخامس-أسفل 96-جيدا. بعد حضانة ح 1، أضيفت كرات الدم الحمراء 0.5% للخلائط مصل الفيروس لمدة 30-60 دقيقة على الجليد. هاي التتر تتحدد بتحديد آخر جيدا في التي تشكل كرات الدم الحمراء زر أحمر ولا تحدث هيماجلوتيناتيون (أعلى). وأجريت فحوصات هاي مع PR8 WT في خزانة BSL-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في الشكل 6، يتم تمثيل البيانات التي تم الحصول عليها في التقييم لتحييد الأجسام المضادة في الأمصال الماوس بالفيتنامية. فو 200 من وزن PR8 كانت مختلطة مع تخفيف إضعاف المسلسل سيرا (سابقا إيناكتيفاتاد في 56 درجة مئوية) من الفئران تحصين بجرعات مختلفة (102، 103و 104 فو) من ليف PR8 ح 1 في الرايت وقيمت كل عينة المصل في ثلاث نسخ. واستخدمت الخلائط الفيروس--سيرا لتصيب مونولاييرس الخلايا مدك في لوحة 96-جيدا. الجزء العلوي من الرقم 6 تمثيل تخطيطي لنتائج الفيتنامية الممكنة: غياب لتحييد الأجسام المضادة في المصل النتائج في التعليم المهني المستمر في حوالي 3-4 أيام بي وفي المقابل، عندما تكون الأجسام المضادة لتحييد موجودة (خلية سليمة أحادي الطبقة)، ربط ها الفيروسية، والوقاية من العدوى الفيروسية، وهناك لا CPE. عادة هو تصور وجود CPE بالخلايا المصابة المصبوغة مع الكريستال البنفسجي، وتحييد الفيروسية التتر تحسب معكوس التخفيف الأخير الذي العدوى محظور تماما. يتم تمثيل نتائج الفيتنامية في الجزء السفلي من الشكل 6. المصل من الفئران تحصين مع كمية عالية من ليف PR8 (104 فو) بعيار أكبر من تحييد الأجسام المضادة حين الأمصال من الفئران تحصين بجرعة أقل أو ليف PR8 (102 فو) بعيار أدنى من تحييد الأجسام المضادة، مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها مع المقايسة هاي. لا الأجسام المضادة لتحييد كانوا حاضرين في المصل من الفئران المصابة بوهمية.

Figure 6
رقم 6: فيروس درياقي المقايسة (الفيتنامية): بديل للمقايسة هاي، يمكن تقييم مقايسة الفيتنامية وجود WT PR8 تحييد الأجسام المضادة. باختصار، كانت الأمصال من الفئران تم تطعيمهم بجرعات المشار إليها من ليف PR8 متسلسل إضعاف المخفف (تمييع ابدأ 1:5) في لوحات 96-جيدا وتخلط 1:1 مع فو 200 من وزن PR8 ح 1 في الرايت بعد ح 1، استخدمت الخلائط مصل فيروس لتصيب لوحات 96-جيدا من الخلايا مدك. تم تحضين الخلايا المصابة لمدة 3-4 أيام حتى تأثير سيتوباثيك الكامل. 96-جيدا لوحات كانت ملطخة ثم 0.1% الكريستال البنفسجي. تتحدد التتر الفيتنامية إلى تحديد إضعاف أعلى الاحتفاظ خلية المتلاقية أحادي الطبقة. الفيتنامية مع PR8 WT أجريت تحت ظروف BSL-2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تقييم فعالية الحماية من اللقاحات إياف في الفئران

عندما يتم وضع ليف جديد، فعاليته السلامة، الاستمناع وحماية يجب اختبارها في فيفو، والطراز الماوس عادة أول نموذج الحيوان المختار لتحليل هذه المعلمات. الرقم 3 مخطط لمختلف الخطوات اللازمة لتوصيف ليف جديد في الفئران. لتقييم سلامة ليف (الشكل 3 ألف)، الفئران المصابة i.n. باستخدام بروتوكول مماثل للإجراءات التجريبية المبينة في القسم المرضية (القسم 4)، ووزن الجسم وبقاء الرصد سيوفر المعلومات المتصلة معدلات الاعتلال والوفيات من ليف (2A الأرقام–2B)، بما في ذلك MLD50. وبالإضافة إلى ذلك، عند التطعيم بجرعات اللقاحات المختلفة، ينبغي أن يكون تكرار لايف في السفلي (الرئتين) وفي الجهاز التنفسي العلوي (الغشاء المخاطي للأنف) المقررة8،،من910، 11،29 (الشكل 2D). لاختبار الاستمناع، يتم جمع الأمصال من الفئران تلقيح مع لايف قبل التحدي مع PR8 WT (تحدي مثلى)، باستخدام بروتوكولات مماثلة للتي ورد وصفها في المقطع الاستمناع (القسم 5) (الشكل 3B). ويمكن الكشف عن وجود مجموعة وتحييد الأجسام المضادة في سيرا أليسا وهاي و/أو الفيتنامية، على التوالي.

وأخيراً، لاختبار فعالية الحماية، وتحدي ليف تحصين الفئران بوزن PR8 وفعالية الحماية يتسم برصد معدلات الاعتلال والوفيات ووجود التحدي PR8 WT في الرئتين، كما هو موضح سابقا في القسم 4 ( الشكل 3)8،9،،من1011. إذا كان يدفع ليف الحماية ضد التحدي PR8 WT، الفئران لن تفقد وزن الجسم، وأنهم سوف البقاء على قيد الحياة تحدي قاتلة مع WT عياف. وعلاوة على ذلك، سوف لا يتم الكشف عن التتر WT عياف الفيروسية في الرئتين، أو سيخفض إلى حد كبير مقارنة بتطعيم وهمية (PBS) الفئران8،9،،من1011.

وسائط زراعة الأنسجة والحلول تكوين تخزين استخدام تعليقات
وسائط زراعة الأنسجة: تعديل دولبيكو المتوسطة النسر (دميم)، 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 1% البنسلين والستربتوميسين-L-الجلوتامين (باريس سان جيرمان) (دميم 10% FBS 1% باريس سان جيرمان) 445 مل دميم، 50 مل من FBS و 5 مل من 100 × 1% البنسلين (100 وحدة/مل)-ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)-L-الجلوتامين (2 مم) (باريس سان جيرمان) مخزن في 4 درجات مئوية يتم استخدام هذه الوسائط للحفاظ على الخلايا الظهارية داربي مدين الكلاب الكلي (مدك)
وسائل الإعلام ما بعد الإصابة: دميم 0.3% الزلال البقري (BA)، 1% باريس سان جيرمان (دميم 0.3% 1% با باريس سان جيرمان) 491 مل دميم، مل 4.2% 35 درجة البكالوريوس و 5 مل من 100 x PSG مخزن في 4 درجات مئوية يتم استخدام هذه الوسائط للحفاظ على الخلايا مدك بعد الإصابة بفيروس الإنفلونزا أ (عياف)
10 × الفوسفات مخزنة المالحة (10 x PBS) 80 جرام من كلوريد الصوديوم، ز 2 من بوكل، ز 11.5 من Na2هبو4.7H2س، ز 2 خ2ص4. إضافة ddH2س حتى 1 ل. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.3 تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT) تعقيم اﻷوتوكﻻف
1 x برنامج تلفزيوني تمييع برنامج تلفزيوني x 10 01:10 مع ddH2س مخزن في RT تعقيم اﻷوتوكﻻف
وسائط العدوى: 1 x برنامج تلفزيوني، 0.3% با، 1% البنسلين والستربتوميسين (PS) (برنامج تلفزيوني/BA/PS) مل 487 1 x PBS العقيمة، مل 4.2% 35 درجة البكالوريوس و 5 مل من 100 × 1% البنسلين (100 وحدة/مل)-ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) (PS) مخزن في 4 درجات مئوية يتم استخدام هذه الوسائط للالتهابات عياف
حل التثبيت/بيرميبيليزيشن: 4% فورمالدهايد، 0.5% triton X-100 المخفف في برنامج تلفزيوني 1 x مخزنة المحايدة 400 مل فورمالين 10%، 5 مل من Triton X-100 ومل 595 من برنامج تلفزيوني 1 x
د > مخزن في RT يتم استخدام هذا الحل لإصلاح وبيرميبيليزي الخلايا مدك في تجارب المعايرة الفيروسية إعداد الحل في غطاء دخان لمنع التعرض فورمالدهايد عرقلة الحل: 2.5% ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني 1 x 2.5 g لجيش صرب البوسنة في 97.5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x مخزن في 4 درجات مئوية يتم استخدام هذا الحل كحل حظر لفحوصات الفلورة والساس. تعقيم بالترشيح مع 0.2 ميكرون فلتر. جسم تمييع الحل (1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني 1 x) ز 1 لجيش صرب البوسنة في مل 99 من برنامج تلفزيوني 1 x مخزن في 4 درجات مئوية يتم استخدام هذا الحل للتخفيف من الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي في فحوصات الفلورة والساس تعقيم بالترشيح مع 0.2 ميكرون فلتر 0.1 الحل البنفسجي كريستال % 1 غ من الكريستال البنفسجي في 400 مل ميثانول. إضافة 600 مل من ddH2س مخزن في RT يتم استخدام هذا الحل إصلاح ووصمة عار الخلايا مدكك في فحوصات تحييد الفيروسية توسيلسولفونيل فينيلالانيل ثاني ميثيل كيتون (تبكك)-معاملة التربسين إعداد حل 1,000 x أسهم في 1 ملغ/مل في ddH2س مخزن في-20 درجة مئوية وأضاف تبكك-التربسين في التهابات IAV جعل 100 ميليلتر مختبرين المخزن المؤقت للمعهد الملكي 10 مم تريس-Cl (pH 8.0)، 1 مم يدتا، 1% X-100 تريتون، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.1%، 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي، 140 ملم كلوريد الصوديوم مخزن في 4 درجات مئوية يتم استخدام هذا الحل لجعل الخلية مقتطفات

الجدول 1: وسائط زراعة الأنسجة والحلول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نموذج الماوس عياف يستخدم على نطاق واسع في فيفو الدراسات فعالية عياف المرضية، الاستمناع والحماية. الحجم الصغير للفئران يجعلها سهلة لمعالجة وتخزين مقارنة بنماذج حيوانية أخرى مثل النموس أو خنازير غينيا. وعلاوة على ذلك، السهولة من حيث تكلفة الحيوان، السكن والإنجاب السماح باستخدامها في الاختبارات السريرية قبل التطعيم التي تحتاج إلى إعداد كبيرة من الحيوانات. جدير بالذكر أن منذ الفئران قد استخدمت في البحوث المتعددة التخصصات، عدة الجزيئية والكواشف مورين علم المناعة متاحة لتيسير استخدامها للدراسات عياف. وعلاوة على ذلك، تقلب المضيف الحد الأدنى، ووجود نظام المناعة التي تقحم مماثلة لتلك الموجودة في البشر جعلها نموذجا حيوانات صغيرة قوية للدراسات عياف. وأخيراً، دراسة التفاعلات بين البروتينات الفيروسية المضيف ومساهمتها في نشوء المرض الفيروسي حاليا ممكناً قبل الوصول إلى الفئران كو. ومع ذلك، أنها ليست مفيدة للدراسات انتقال عياف بجانب العديد من المزايا لاستخدام الفئران للدراسات عياف،. ولذلك، فرت أو خنازير غينيا أنسب نماذج حيوانية لدراسة انتقال IAV. الأعراض السريرية في الفئران المصابة مع عياف عادة ما تظهر الإصابة بعد 2-3 أيام، على الرغم من أن هذا قد تختلف حسب السن الماوس والحالة المناعية، والجنس، والخلفية الوراثية والسلالة؛ وكذلك السلالة الفيروسية والجرعة المستخدمة. وتشمل الأعراض فقدان الشهية، الخمول، التكويم، تكدرت الفراء، فقدان الجسم الوزن ووفاة16،17.

في هذه المخطوطة، ونحن تصف كيفية تقييم المرضية الفيروسية في الفئران المصابة i.n. مع عياف برصد فقدان الوزن الجسم (المرض)، النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة (معدل الوفيات) وتقييم النسخ المتماثل الفيروسية في الجزء العلوي (الغشاء المخاطي للأنف) والسفلي (الرئتين) الجهاز التنفسي (الشكل 1 و الشكل 2). أمراض ال عياف معلمة هامة جداً ليس فقط في سياق عياف سلالات جديدة ولكن أيضا في تنفيذ آمنة ليف لقاح المرشحين (الشكل 3). موسمي IAVs و IAVs التي تصيب الثدييات الأخرى (مثل الخيول أو الكلاب أو الخنازير) لا تنتج عادة علامات المرض في الفئران11،27. في هذه الحالة، يتم تحليل التتر الفيروسية في الرئتين أو الغشاء المخاطي للأنف من الفئران المصابة المعلمة الرئيسية لتقييم أمراض فيروسية من سلالات عياف. حالما يتم جمعها في الرئتين والغشاء المخاطي للأنف وأنها هي تجانس وكمية الفيروس الموجودة في هذه الأجهزة يمكن تحليلها باللوحة المقايسة، الفلورة المقايسة، زراعة الأنسجة المعدية جرعة 50 (تسيد50) أو أسلوب آخر مصادق عليه8 ،29. من المستحسن تقييم التتر الفيروسية باستخدام الفلورة غير المباشرة نظراً للمقايسة اللوحة يتطلب كمية أعلى من مدك الخلايا (الشكل 6-جيدا لوحة)، ومثل تسيد50، يلزم المزيد من الوقت (3-4 أيام) لحساب التتر الفيروسية. ومع ذلك، لإجراء الفحص الفلورة غير المباشرة، من الضروري أن يكون: 1) أجسام مضادة محددة الأولية ضد بروتين عياف (من المستحسن استخدام جسم مضاد ضد البروتين النووي عياف، NP، نظراً لأنه البروتين الفيروسي الأكثر وفرة إنتاجها خلال العدوى الفيروسية)؛ 2) الثانوي الأجسام المضادة مترافق فلوروفوري؛ و 3) مجهر الأسفار عد الخلايا المصابة إيجابية فلورسنت.

نظراً للجهاز المناعي للفئران تقحم مشابهة للنظام المناعي من البشر16 ، ونظرا لأن الفئران يمكن الحصول على استجابة خلطيه قوية والحماية ضد العدوى IAV، الاستمناع IAVs (أو المرشحين لقاح) يمكن بسهولة تقييم بواسطة تحديد إجمالي (أليسا؛ الشكل 4) وتحييد (هاي، الرقم 5) أو استجابات جسم الفيتنامية (6 أرقام). لتحليل استجابات خلطيه بعد التحصين، يمكن نزفت الفئران بمختلف الأساليب المعتمدة مثل ثقب الرجعية-المداري، ومقطع الذيل، وثقب الوريد الصافن أو ثقب اللهاة. لقد اخترنا تقنية ثقب اللهاة26 لأن الإجراء لا تتطلب استخدام التخدير، ويسمح لنا بالحصول على زيادة في حجم مقبول للدم من أجل الدراسات المناعية؛ بدلاً من ثقب الرجعية-المداري، حيث ينبغي أن تكون تخديره من الفئران، ومع ذيل القصاصة أو ثقب الوريد الصافن، حيث استعادت حجم الدم عادة منخفضة.

في هذه المخطوطة، وصفت لنا كيفية تقييم وجود أجسام مضادة ضد مجموع البروتينات الفيروسية بإليزا استخدام مقتطفات الخلية المصابين بالفيروس. منذ الإصابة عياف الحث حصانة واقية، أساسا، بوساطة أجسام مضادة ضد ها الفيروسية (مستضدي الفيروسية الهدف الرئيسي)، فإنه ينصح بشدة لتقييم كمية الأجسام المضادة المحددة الناجمة عن أليسا استخدام ها المنقي المؤتلف ضد ها 10من البروتينات. يتم قبول أساليب هاي والفيتنامية لتحليل وجود تحييد الأجسام المضادة، ولكن كلا من مزايا وعيوب. هاي يكون سريعاً (2-3 ح) ووافق عليها المركز للمرض والتحكم (CDC) لتقييم وجود عياف تحييد الأجسام المضادة30. الفيتنامية هو أكثر مضيعة للوقت (3-4 أيام) ولكن هو أكثر تحديداً حيث أنه يقيم فقط الأجسام المضادة التي يمكن تحييد العدوى الفيروسية. جدير بالذكر أن ثبت الفيتنامية للكشف عن رد الفعل ساق ها تحييد الأجسام المضادة31، فضلا عن تحييد الأجسام المضادة32غ. ميزة أخرى للفيتنامية هو حساسية المقايسة، منذ أقل عياف المسبق (200 فو) مقارنة بمقايسة هاو الذي يتطلب حوالي 10 ~4-105 فو. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون مقايسة هاي إشكالية بالنسبة للكشف عن تحييد الأجسام المضادة ضد إنفلونزا الطيور IAVs نظراً لصعوبة مع تفسير النتائج33،،من3435. بالإضافة إلى ذلك، لا تتطلب الفيتنامية استخدام كرات الدم الحمراء للتعرف على تحييد الأجسام المضادة للأنفلونزا.

وأخيراً، نحن تصف الإجراءات التجريبية لتقييم الجوانب الثلاثة الرئيسية التي يتعين النظر فيها في تطوير لقاحات جديدة إياف (الشكل 3): 1) السلامة: اللقاح يجب أن تكون آمنة ولا تنتج من المرض؛ 2) الاستمناع: اللقاح يجب أن يكون مكسبه والحث على استجابات وقائية خلطيه وخلوية على حد سواء؛ 3) فعالية الحماية: يجب حمل اللقاح حماية ضد التحدي مع فيروسات WT مثلى و/أو مغايرة. نموذج الفأر خيار جيد للفرز الأولى لجديد عياف اللقاح في فيفو نظراً لأنه يمكن تقييم برامج التطعيم المختلفة والظروف، بما في ذلك استخدام المواد المختلفة والجرعة مستضد/اللقاح، والإدارة وحماية واسعة ضد التحدي مع مثلى أو مغايرة IAVs سلالات16،17. ومع ذلك، قبل الشروع في التجارب السريرية البشرية، المرشحين لقاح ينبغي كحد أدنى اختبار في نموذج في فيفو ثانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

أبحاث على فيروس الإنفلونزا في مختبر LM-S تموله جزئيا "نيويورك الإنفلونزا مركز التميز" (نيس)، عضو نييد مراكز التميز "الإنفلونزا للبحث" والمراقبة (سيرس). ونحن نشكر بيتس يندى لها الدعم في تصويبات المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23 (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. , 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430 (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18 (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9 (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356 (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89 (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88 (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90 (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500 (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252 (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83 (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199 (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3 (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85 (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22 (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4 (3), e4857 (2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. , (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. , Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76 (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37 (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70 (3), 391-398 (2003).

Tags

علم المناعة، 127 قضية، فيروس الإنفلونزا أ، الإصابة بالإنفلونزا، والفئران، التلقيح داخل الآنف، الإمراضية، السلامة، الاستمناع، فعالية الحماية، التحدي الفيروسي، التطعيم، استجابات خلطيه
فيروس الإنفلونزا أ الفيروس دراسات في نموذج ماوس للإصابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, L., Nogales, A.,… More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter