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Immunology and Infection

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

Virus de l’influenza (IAVs) sont des agents pathogènes respiratoires humains importants. Pour comprendre le pouvoir pathogène de IAVs et d’effectuer des essais précliniques de nouveau vaccin approches, modèles animaux imitant la physiologie humaine sont nécessaires. Nous décrivons ici les techniques pour évaluer l’IAV pathogenèse, humorale et l’efficacité du vaccin en utilisant un modèle de souris de l’infection.

Abstract

Virus de la grippe provoquent plus de 500 000 décès dans le monde1 et sont associées à un coût annuel de 12 milliards USD aux États-Unis seul examen direct medical et frais d’hospitalisation et de l’absentéisme de travail2. Modèles animaux sont cruciaux pour l’Influenza A virus (IAV) études visant à évaluer la pathogénèse virale, les interactions hôte-pathogène, les réponses immunitaires, et l’efficacité du vaccin actuel et/ou nouvel approches ainsi que des antiviraux. Les souris sont un modèle animal petit avantageux parce que leur système immunitaire est évolutivement semblable à celle trouvée chez les humains, ils sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux comme des sujets génétiquement identiques, il existe plusieurs souches qui peuvent être exploitées pour évaluer la base génétique des infections, et ils sont relativement peu coûteux et facile à manipuler. Pour récapituler infection IAV chez l’homme via les voies respiratoires, les souris sont tout d’abord anesthésiés avant l’inoculation intranasale avec IAVs infectieuses sous confinement de biosécurité appropriées. Après l’infection, la pathogenèse de l’IAV est déterminée en surveillant quotidiennement la morbidité (perte de poids corporel) et le taux de mortalité (survie). En outre, Pathogénèse virale peut aussi être évaluée en évaluant la réplication du virus dans les voies respiratoires inférieures des (poumons) de souris infectées ou supérieur (muqueuse nasale). Les réponses humorales infectées de l’IAV peuvent être rapidement évaluées par saignement non invasif et la détection de l’anticorps secondaire essais visant à détecter la présence de total ou de présence d’anticorps neutralisants. Nous décrivons ici les méthodes couramment employées pour infecter des souris par voie intranasale (i.n) avec l’IAV et évaluer la pathogenèse, immunité humorale et l’efficacité de la protection.

Introduction

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IAVs sont des virus enveloppés, classés dans la famille Orthomyxoviridae 3. Ils contiennent huit molécules d’ARN simple brin à polarité négative3. Chez l’homme, IAVs causent des épidémies saisonnières et occasionnelles pandémies de conséquence importante lorsque de nouveaux virus sont introduits dans la population humaine4. En outre, les IAVs saisonniers sont fortement et rapidement transmis entre humains produisant une perte économique élevée dans le monde entier chaque année2,5. IAV symptômes toux, congestion nasale, fièvre, malaise, céphalées, anorexie et myalgie, mais le virus peut également produire une maladie plus grave chez les patients immunodéprimés,6. En fait, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) calcule que les virus grippaux saisonniers causent 300 000-500 000 décès dans le monde chaque année1. Il y a que deux classes de médicaments actuellement approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) pour la prophylaxie de la grippe et le traitement chez l’homme : inhibiteurs de la neuraminidase (NA) (p. ex., l’oseltamivir) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (p. ex., amantadine) ; Cependant, l’apparition de variantes de virus résistants aux médicaments est une préoccupation croissante. Vaccination, reste donc la meilleure option médicale pour protéger les humains contre les infections de l’IAV. À ce jour, trois types d’influenza vaccins autorisés par la FDA pour l’usage humain sont disponibles : vaccins de protéines de recombinaison virale hémagglutinine (HA), inactivés (IIV) vaccins contre la grippe et grippe vivant atténué vaccins (LAIV)5, 7. les trois vaccins sont conçus pour induire une réponse immunitaire adaptative contre la protéine virale de HA, la cible majeure de neutraliser les anticorps dirigés contre les IAVs.

Un modèle de souris validés pour étudier IAV infection in vivo

Des modèles animaux ont été utilisés pour étudier, entre autres, IAV pathogenèse8,9,10,11, virales facteurs favorisant la maladie12 et/ou de la transmission virale13 ,14, et pour tester l’efficacité des nouveaux vaccins ou antiviral drugs9,10,15. Souris (Mus musculus) sont le plus largement utilisé modèle animal pour la recherche de l’IAV pour plusieurs raisons : 1) le système immunitaire est évolutif similaire à qui présenter chez les humains ; 2) achat animaux de faible coût, y compris, le logement et la reproduction ; 3) petite taille de facilement manipuler et stocker ; 4) variabilité d’hôte minimale pour obtenir des réponses homogènes et résultats ; 5) une grande connaissance de la biologie de souris, y compris la séquence du génome ; 6) nombreux disponible biologie moléculaire et/ou réactifs d’immunologie ; 7) disponible knock out (KO) de souris pour étudier la contribution d’une protéine de l’hôte donné sur l’infection virale ; et, 8) plusieurs souches de souris qui peuvent être exploitées pour évaluer la base génétique des infections.

Il y a plusieurs souches de souris actuellement disponibles pour étudier IAV in vivo. Âge, statut immunitaire, sexe, souche génétique de fond et de la souris ainsi que voies d’infection, de dose et de souches virales tous influencent le résultat de l’infection IAV chez la souris. Les souches de souris plus courants utilisés dans la recherche de l’IAV sont C57BL/6, BALB/C et, plus récemment, DBA.2 souris car ils sont plus sensibles aux maladies de l’IAV que les deux souches ancien16,17,18, 19 , 20. ce qui est important, la réponse immunitaire peut également être différente selon les souris souche18,19,20. Ainsi, il est très important de récupérer toutes les informations disponibles sur la souris et la souche de l’IAV à choisir la meilleure option pour l’expérience d’être menée.

Bien que la souris est un bon modèle animal de l’infection pour des études in vivo avec IAV, ils présentent plusieurs limites, dont il faut tenir compte dans la conception expérimentale. Par exemple, une limitation majeure de l’utilisation de souris pour les études in vivo est que les IAVs ne transmettent pas chez les souris. Ainsi, pour la transmission des études, mieux accepté des modèles animaux (p. ex., furets ou cochons d’Inde) sont utilisés16,17,21. En outre, il y a plusieurs différences entre les manifestations de l’IAV chez les souris et les humains. Contrairement aux êtres humains, la souris ne développent pas fièvre après infection IAV ; en revanche, ils présentent avec hypothermie16,17. Chez les souris, réplication de l’IAV est concentrée dans les voies respiratoires inférieures (poumons) plutôt que les voies aériennes supérieures. Ainsi, virulence de IAV chez la souris n’est pas toujours corrélé à celui observé chez les humains. Au total, parce que les avantages l’emportent sur les inconvénients limitées, souris représente le premier modèle animal utilisé pour évaluer l’efficacité protectrice dans les études de vaccins et d’antiviraux, l’immunogénicité et la pathogénèse virale de la grippe. En outre, il ne serait pas éthiquement acceptable de mener des études avec l’IAV à l’aide de grands modèles animaux sans preuve précédente dans un petit modèle animal de l’infection de l’IAV. Dans ce manuscrit, nous décrivons comment infecter des souris par voie intranasale (i.n.) avec IAV, comment surveiller la sévérité et la progression de l’infection virale et comment réaliser les expériences nécessaires pour évaluer l’efficacité de protection et de l’immunité humorale.

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Protocol

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tous les protocoles animaux décrits ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de biosécurité (CIB) à l’University of Rochester School of Medicine and Dentistry et utilisation Comité (IACUC) et les institutionnels animalier et se conformer avec les recommandations du Guide pour le soin et l’Use of Laboratory Animals du 22 Conseil de recherche National. Les installations et les programmes du Vivarium et Division de la médecine des animaux de laboratoire de la faculté de médecine et de dentisterie sont accrédités par AAALAC International et se conformer à la Loi de l’État, la loi fédérale et politique National Institutes of Health (NIH). Des dispositions similaires doivent s’appliquer à chaque institution d’adhérer aux protocoles animaux décrits dans ce manuscrit.

1. utilisation des petits animaux vertébrés

Remarque : la bonne Protection équipement individuelle est requise pour travailler avec la souris. Exigences minimales comprennent des combinaisons jetables, couvre-chaussures, tête bonnet, masque et des gants.

  1. Conformément au protocole IACUC, placer un maximum de 5 souris par cage. Suivant le protocole IACUC, euthanasier souris avec deux méthodes d’euthanasie (le second doit être une méthode physique) pour s’assurer que l’animal est mort.
    Remarque : Dans les expériences qui IAV morbidité et mortalité sont évalués, souris qui a perdu 20 % de leur poids corporel initial étaient considérés ont atteint le point de terminaison expérimentale et ont été euthanasiés avec CO 2 et dislocation cervicale comme le méthode secondaire physique. Ce pourcentage du poids corporel peut être différent dans d’autres établissements. Dans les procédures où les poumons de souris et de la muqueuse nasale sont recueillis après l’infection de l’IAV, les souris sont euthanasiés avec une dose létale de 2,2,2-tribromoethanol (TBE) et en coupant l’hépatique veine comme méthode secondaire physique. Les souris C57BL/6 femelles 6 à-8-semaines ont été achetés et maintenus dans l’établissement de soins aux animaux à l’University of Rochester School of Medicine and Dentistry dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes.

2. Prévention des risques biotechnologiques

Remarque : dans le présent rapport, les IAVs servis à infecter des souris sont la souche de laboratoire adapté à la souris commune de grippe H1N1 Rico/8/34 A/Puerto (PR8 WT) 22 , 23 et une température sensible LAIV variant, PR8 LAIV 8. Effectuez toutes les procédures qui impliquent des infections de l’IAV (in vitro ou in vivo), cultures de cellules et des échantillons biologiques, dans une armoire sous niveau biosafety (BSL) -2 de sécurité biologique des conditions. Utiliser BSL costumes ou autres conditions de confinement si l'on utilise des souches très virulentes de l’IAV.

  1. Clean la biosécurité armoire avec un désinfectant de dioxyde de chlore avant et après avoir effectué toutes les procédures expérimentales décrites dans ce manuscrit. Stériliser tous les matériel de dissection (ciseaux, bistouri et dissection forceps) et l’homogénéisateur Dounce avant et après leur utilisation suivant les recommandations de GRV appropriées. Jeter tout le matériel produit pendant les procédures sous bonne directives IBC et IACUC.

3. L’Infection intranasale

  1. Place la femelle 6 à-8-week-old C57BL/6 souris dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes. Organiser et étiqueter la souris cages avec le virus et la dose utilisée. Identifier les souris dans chaque cage à l’aide d’un code de perforation d’oreille, ou par une autre méthode approuvée, telles que la peinture des queues. Placez un maximum de 5 souris par cage.
  2. Préparer la dilution de l’IAV (unités de formation Fluorescent (FFU) / souris) dans des conditions aseptiques, dans un volume total de 30 µL/souris stériles 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS). Maintenir l’inoculum de virus sur la glace. Calculer le montant de l’IAV à ajouter dans la dilution virale avec la formule : ((X FFU par souris/30 µL) x volume final) / stock titre viral.
  3. , Peser les souris avec une échelle et noter le poids de chaque souris (jour 0). Tenez la souris en position dorsale en ramassant de la peau du cou entre le pouce et l’index. Tenir la queue contre la main avec le petit doigt.
  4. Anesthésier la souris par voie intrapéritonéale (i.p.) 240-250 mg/kg d’encéphalite à tiques en insérant l’aiguille dans la caudale 2/3 du côté droit de l’abdomen. Une pause brièvement avant de retirer l’aiguille. Retourner la souris à la cage et attendre 5 min.
  5. Appliquer pommade ophtalmique stérile pour les yeux pour éviter la sécheresse alors que la souris est anesthésiée. Vérifier si la souris est anesthésiée par l’absence du réflexe de retrait pédale (c.-à-d., pincement de l’orteil). Si la souris ne sont pas complètement anesthésiés qu’ils vont cracher le virus.
  6. Lorsque la souris est totalement anesthésiée, placez votre souris en décubitus dorsal. Mettre l’embout de la pipette contenant 30 µL de l’inoculum de virus dans la narine et lentement, mais constamment éjecter la solution. Veillez à ce que la souris inhale la préparation en observant l’inoculum drop disparaissant.
  7. Vérifier que la souris est respiration TBE peut abaisser le taux de température et de la respiration. Retourner l’animal à la cage, plaçant en décubitus dorsal. Surveiller les souris pour déceler tout signe de détresse respiratoire et si observée, aider la souris à respirer par animal tenant verticalement et induire des effets axé sur la respiration, 24. Contrôler la souris jusqu'à ce qu’il reprend conscience (30-45 min après il a été anesthésié).

4. Caractérisation de la pathogénèse virale ( Figure 1)

  1. évaluation de la morbidité et de mortalité ( Figure 1 et Figure 2)
    1. Infecter i.n. 3-4 groupes de souris de C57BL/6 femelles 6 à-8-semaines (au moins 5 souris par groupe, n = 5) avec des doses 10 fois (10, 10 2, 10 3 et 10 4 FFU/souris) de WT PR8 tel que décrit à l’article 3.
    2. Moniteur et peser les souris avec une échelle au cours des 14 prochains jours à environ le même temps à minimiser les variations de poids due à l’ingestion de nourriture. Euthanasier souris qui perdent 20 % de leur poids corporel initial tel que décrit à l’article 1.
    3. Après 14 jours, euthanasier les souris qui survivent à l’infection virale tel que décrit à l’article 1.
    4. Calculer la dose virale de létale de souris de 50 % (50 de MLD) basée sur les données de survie obtenues à l’aide de la méthode de Reed et Muench 25. Tout d’abord, calculer la distance de proportion (DP) :
      Equation 1
      1. puis, calculez le MLD 50 selon la formule suivante :
        Equation 2
  2. évaluation des titres viraux dans les poumons et la muqueuse nasale ( Figure 1 et Figure 2. )
    1. récupération des poumons et de la muqueuse nasale
      1. Infect i.n. des souris de C57BL/6 femelles de 6 à-8-semaines (n = 6) avec la dose virale pour tester le 10-10 4 FFU de WT PR8 tel que décrit à l’article 3.
      2. Recueillir les poumons de souris et de la muqueuse nasale à jours 2 (n = 3) et 4 (n = 3).
        1. Euthanasier les souris avec une dose létale (i.p.) du TBE (500 mg/kg). Placez l’animal en décubitus dorsal et désinfecter la fourrure sur le thorax avec l’éthanol à 70 %. Couper la peau avec un scalpel du sternum à la base de l’abdomen. Faire des coupes de 1 cm de la base de l’incision pour les parties latérales des souris avec les ciseaux.
        2. Couper la veine hépatique avec des ciseaux à saigner la souris comme la méthode d’euthanasie secondaire. Placez l’animal en position ventrale et attendez 2 min pour permettre au sang de s’écouler. Cette étape est importante pour réduire le sang dans les poumons.
        3. Retirer la peau de toute la partie supérieure de la souris (y compris la tête) à la base de l’abdomen où la première incision a été faite à l’aide de pinces et ciseaux de dissection. Couper la tête avec les ciseaux et le placer dans une boîte de Petri stérile sec.
        4. Couper les jonctions entre le maxillaire et la mandibule avec les ciseaux et jeter la mandibule. Avec les ciseaux, faire deux incisions aux extrémités des arcs zygomatiques et supprimez-les. Retirer les yeux avec l’aide de la pince de dissection.
        5. Tenir le crâne avec la pince de dissection et couper le crâne le long de la suture sagittale avec un scalpel. Soulevez les deux moitiés du crâne avec le cerveau pour voir la muqueuse nasale. Les mucosas nasales sont entourés par les os antérieurs du crâne, y compris du nasal, maxillaire, Palatin, zygomatique et les os ethmoïdes.
        6. Utilisant le scalpel, couper la partie du crâne avec le cerveau et jeter. Placer l’autre partie du crâne avec la muqueuse nasale dans un tube stérile. Stocker le tube sur la glace (4 ° C) si les échantillons sont traités le jour même, ou sur la glace sèche pour les congeler rapidement si les échantillons seront traitées plus tard.
        7. Pour éviter la contamination des échantillons, nettoyer et désinfecter les outils de dissection entre chacun des tissus récupérés et entre chaque dissection animale avec un désinfectant de dioxyde de chlore.
        8. Pour recueillir les poumons, placez l’animal en décubitus dorsal et coupez la plèvre avec les ciseaux. Ouvrir la cage thoracique en coupant les côtes à 1 cm de chaque côté du sternum. Faire les coupes de la base de la cage thoracique à la partie supérieure avec les ciseaux.
        9. Faire une coupe avec les ciseaux entre les deux incisions dans la partie supérieure de la cage thoracique et enlever la plaque thoracique. Tenir les poumons avec la pince, coupé à la fin de la trachée (juste avant les poumons) avec les ciseaux et mettre les poumons dans un tube stérile. Stocker le tube sur la glace (4 ° C) si les échantillons sont traités le jour même, ou sur la glace sèche pour les congeler rapidement si les échantillons seront traitées plus tard.
          Remarque : Homogénéiser les échantillons de tissus sur le jour même où elles sont collectées et conserver à-80 ° C à analyser plus tard les titres viraux. Il est important que les échantillons pas subir de gel-dégel répété cycles avant que les titres de virus sont déterminés. Vous pouvez également stocker les échantillons de tissus à-80 ° C jusqu'à ce qu’elles seront traitées.
    2. Homogénéisation des poumons et de la muqueuse nasale
      1. placer des poumons ou la muqueuse nasale dans un homogénéisateur Dounce stérile et ajouter 1 mL de médias de l’infection à froid. Homogénéiser l’échantillon en déplaçant le pilon de haut en bas pendant environ 1 min à température ambiante (RT) jusqu'à ce que les poumons sont complètement perturbés. Mettre l’échantillon homogénéisé dans un tube stérile et magasin à 4 ° C. utiliser un nouveau homogénisateur Dounce pour chaque échantillon.
      2. Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 5-10 min à RT. récolter le surnageant dans un nouveau tube stérile. Stocker le surnageant à 4 ° C si le titrage viral est effectuée le jour même et jeter le culot. Vous pouvez également congeler (-80 ° C) le surnageant de la homogénéisé échantillons pour évaluer des titres viraux par la suite.
    3. Titrage de virus par immunofluorescence indirecte
      1. la veille de titrage, des graines des plaques de 96 puits avec les cellules épithéliales Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) (4 x 10 4 cellules/puits) pour atteindre le confluent de ~ 80-90 % dans les milieux de culture de tissu. Placer les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2. Le jour de titrage viral, vérifier les cellules au microscope afin de confirmer une monocouche avant le début de l’infection virale.
      2. Préparer 01:10 dilutions du surnageant des échantillons homogénéisés (poumons ou la muqueuse nasale) dans les milieux de l’infection à une plaque à 96 puits. Effectuer le titrage viral par réanalysés pour déterminer avec exactitude les titres viraux.
        1. Ajouter 90 µL des médias de l’infection à chaque puits de la plaque de 96 puits. Ajouter 10 µL d’un du liquide surnageant des échantillons homogénéisés dans puits A1, A2 et A3 pour évaluer le titre viral de chaque échantillon en triple exemplaire. Ajouter 10 µL d’un autre liquide surnageant des échantillons homogénéisés à Herbert George wells, A4, A5 et A6. Effectuer la même dilution consécutivement avec le reste des échantillons.
        2. Après l’apport le surnageant sur la ligne A, utiliser une pipette multicanaux pour mélanger par pipetage de haut en bas. Transférer 10 µL de ligne A à la ligne B. changement les pointes entre les dilutions et bien mélanger. Répétez cette opération jusqu'à la dernière rangée (H).
      3. Enlever le milieu de culture tissulaire (étape 4.2.3.1) utilisant l’adaptateur sous vide aspirateur-multicanal des cellules MDCK dans les plaques à 96 puits et laver deux fois avec 100 µL/puits de PBS 1 x.
      4. Cellules
      5. transférer 50 µL/puits de surnageant dilué en série des échantillons à la plaque à 96 puits avec MDCK homogénéisés. Commencer le transfert des dilutions plus élevées (colonne H) aux dilutions inférieures (ligne A). Dans ce cas, il n’est pas nécessaire de changer les pointes entre les différentes lignes.
      6. Mettre les plaques de 96 puits sur une plate-forme bascule pendant 1 h à RT pour permettre à adsorption virale. Après adsorption virale, retirez l’inoculum en utilisant un adaptateur aspirateur-multicanal sous vide et ajouter 100 µL/puits des médias après l’infection. Incuber les cellules infectées pendant 8 h dans un incubateur à 33 ° C ou 37 ° C avec 5 % de CO 2. Procéder à la fixation, coloration, imagerie et calcul du titre viral comme décrit aux étapes 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      7. Supprimer le milieu de culture tissulaire des plaques 96 puits utilisant l’adaptateur sous vide aspirateur-multicanale. Difficulté et permeabilize les cellules avec 100 µL/puits de la solution de fixation/perméabilisation pendant 20 min à température ambiante.
        ATTENTION : Utiliser la solution de fixation/perméabilisation sous une hotte pour éviter l’exposition au formaldéhyde.
      8. Supprimer la solution de fixation/perméabilisation utilisant l’adaptateur sous vide aspirateur-multicanale, laver avec du PBS 1 x et incuber les cellules fixes avec blocage solution pendant 1 h au magasin RT. les cellules en bloquant la solution à 4 ° C ou passez à l’étape suivante.
      9. Supprimer la solution de blocage. Ajouter 50 µL/puits de 1 µg/mL anticorps monoclonal (ACM) anti-NP HB-65 dilué dans une solution de dilution des anticorps. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Different mAb ou polyclonAl (pAb) des anticorps anti-PR8 utilisable.
      10. Pendant ce temps, diluer 1 : 200 l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-conjugués anticorps anti-souris secondaire dans la solution de dilution des anticorps. Centrifuger la solution à 1 700 x g pendant 5-10 min à température ambiante. Autres anticorps secondaires conjugués avec des autres fluorophores utilisable.
      11. Enlever l’anticorps primaire et laver 3 fois avec 100 µL/puits de PBS 1 x. Ajouter 50 µL/puits de la dilution de l’anticorps secondaire et incuber pendant 30-45 min à 37 ° C. Retirer l’anticorps secondaire et laver 3 fois avec 100 µL/puits de PBS 1 x. Laisser le dernier lavage de la plaque.
      12. Observer les cellules sous un microscope à fluorescence pour déterminer le nombre de cellules teintés (verts). Calculer le titre viral en comptant FFU/mL. Calculer le titre viral exprimé en FFU/mL de la dilution avec cellules colorées positifs de 30 à 50 à l’aide de la formule : ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/dilution.

5. Évaluation de la réponse immunitaire humorale ( Figure 3)

  1. Infect i.n. 3 groupes de souris de C57BL/6 femelles 6 à-8-semaines (n = 5) avec les différentes doses (10 2, 10 3 et 10 4 FFU / la souris) de PR8 LAIV et mock-infecter un groupe (n = 5) avec 1 x PBS stérile comme témoin négatif. Effectuer les infections de souris i.n tel que décrit à l’article 3.
    1. Souris saignement par ponction sous-maxillaire
      1. quatorze jours après la vaccination, collecter le sang de souris à l’aide de saignement de sous-maxillaire une lancette 4 mm 26, ou utilisant un autre IACUC la méthode approuvée.
        1. Maintenez la souris en ramassant de la peau du cou entre le pouce et l’index. Tenir la queue contre la main avec le petit doigt pour immobiliser la souris.
        2. , Placez la souris dans une position latérale pour voir la joue. Faire la ponction à la jonction des veines sous-maxillaires et rétro-orbitaire avec la veine jugulaire. Couler la lancette (4 mm) et de récupérer le sang dans un tube stérile (environ 0,2 - 0,4 mL/souris sont récupérés). Appliquer une pression sur la ponction avec une serviette stérile pendant quelques secondes. Replacez la souris dans la cage.
      2. Mettre les tubes pendant 1-2 h à 37 ° C et centrifuger à 700 g pendant 30 min à ta pour séparer le sérum du sang. Transférer la couche supérieure qui se compose du sérum avec une pipette dans un nouveau tube stérile. Jeter l’extrait concentré de globules rouges (hématies). Stocker le sérum à -20 ° C.
  2. Analyse de totales anticorps contre les protéines virales
    1. préparation des extraits de cellules MDCK infectés
      1. le jour avant l’infection, amorcer un plat de 100 mm avec 4-5 x 10 6 cellules MDCK (pour atteindre environ 80-90 confluence % le lendemain) dans les milieux de culture de tissu. Placer les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2. Le jour de l’infection virale, vérifier les cellules au microscope afin de confirmer une monocouche avant le début de l’infection virale.
      2. Préparer une dilution virale avec une multiplicité (0,001) faible d’infection (MOI) de PR8 WT dans les milieux de l’infection à volume final total de 4 mL. Calculer le montant de PR8 WT avec la formule ((MOI X x cellules n °) x volume final) / stock titre viral.
      3. Aspirer le milieu de culture tissulaire de la plaque de cellules MDCK et laver deux fois avec 4 mL de PBS 1 x. Ajouter l’inoculum viral (4 mL) et mettre la plaque sur une plate-forme bascule pendant 1 h à RT pour permettre à adsorption virale. Retirer l’inoculum viral avec vide et ajouter 8 à 10 mL des médias après l’infection contenant 1 µg/mL de trypsine TPCK traités. Incuber les cellules infectées pendant 48 à 72 h dans un incubateur à 33 ° C ou 37 ° C avec 5 % de CO 2.
      4. Détacher les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules et de recueillir les cellules et le milieu de culture tissulaire avec une pipette dans un tube de 15 mL. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5-10 min à RT. aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon RIPA et mettre le mélange dans un tube stérile de 1,5 mL. Incuber sur glace pendant 20-30 min.
      5. Centrifugeuse le tube à 1 300 x g pendant 20-30 min à 4 ° C. soigneusement, récupérer le surnageant. Magasin la cellule extrait dans 100 µL d’extraits à -20 ° C.
      6. Titrer les extraits cellulaires tels que décrits par dosage immunoenzymatique (ELISA) avant leur évaluation de la présence d’anticorps de 10 , 9 , 11 , 27. Include cellule extraits de cellules MDCK infectées par le mock (préparés comme indiqué ci-dessus) comme témoin négatif.
    2. ELISA ( Figure 4)
      1. manteau polystyrène plaques à 96 puits avec la dilution appropriée de cellules infectées-MDCK extraire dans du PBS 1 x (habituellement entre 1-1 / 1 : 200 000). Recouvrir d’une autre plaque avec la même dilution d’extrait de cellules MDCK mock-infectés comme témoin négatif. Incuber pendant la nuit (O/N) à 4 ° C.
      2. Enlever le surnageant utilisant l’adaptateur sous vide aspirateur-multicanal et laver une fois avec 100 µL/puits de PBS 1 x avec une pipette multicanaux. Bloquer les liaisons non spécifiques en ajoutant 100 µL/puits de bloquant la solution pendant 1 h à température ambiante.
      3. Pendant ce temps, faire des dilutions sériées 2 fois (à partir de dilution 01:50) des sérums de chacune des souris infectées à l’étape 5.1 dans la solution de dilution d’anticorps dans une plaque à 96 puits.
      4. Supprimer la solution de blocage des plaques 96 puits en polystyrène en utilisant un adaptateur aspirateur-multicanal sous vide. Ajouter 50 µL de chaque dilution de sérum de souris dans le puits correspondant et incuber 1 h à 37 ° C.
      5. Enlever les sérums de souris avec un adaptateur aspirateur-multicanal sous vide. Laver les puits 3 fois avec de l’eau distillée à l’aide d’une pipette multicanaux. Ajouter 50 µL/puits d’un anticorps secondaire anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dilué 1:2,000 dans la solution de dilution des anticorps. Incuber 1 h à 37 ° C.
      6. Enlever l’anticorps secondaire avec un adaptateur aspirateur-multicanal sous vide. Laver les puits 3 fois avec de l’eau distillée à l’aide d’une pipette multicanaux. Préparer la solution de substrat de tétraméthylbenzidine (TMB) en mélangeant 1:1 solution A et B. Ajouter 100 µL/puits de substrat et incuber pendant 5-10 min à ta dans l’obscurité.
      7. Arrêter la réaction en ajoutant 100 µL/puits de 0,2 N H 2 SO 4. Lire la plaque à 450 nm sur un lecteur de plaque ELISA.
      8. Soustraire la valeur obtenue dans chacune des dilutions de la plaque à 96 puits MDCK infectés par le simulacre de la valeur obtenue dans la plaque à 96 puits MDCK-infectés. Calculer les valeurs moyennes pour chaque dilution avec les sérums différents et de les représenter dans un graphique indiquant les déviations standard (SD).
  3. Analyse des anticorps neutralisants
    1. essai d’Inhibition de l’hémagglutination (IHA) ( Figure 5)
      1. avant d’effectuer le test HAI, traiter les sérums de souris avec récepteur détruire les enzymes (RDE) afin d’éliminer tous les inhibiteurs non spécifiques présents dans le sérum. Ajouter 1 volume de sérum de souris à 4 volumes de la dilution de travail RDE (dilution du sérum est maintenant 1:5). Incuber les O/N (12- 18 h) dans un bain-marie à 37 ° C.
      2. Chauffer les échantillons de sérum à 56 ° C pendant 30 min inactiver le RDE.
      3. Déterminez avant l’activité d’hémagglutination (HAU) de PR8 WT par norme de test HA 28. Une fois déterminée la HAU virale, diluer le stock viral à 8 HAU par 50 µL de PBS 1 x.
      4. Préparer des dilutions 2 fois (12 dilutions) des sérums RDE traités dans une plaque 96 puits à fond V. Utiliser une ligne pour chaque échantillon de sérum (p. ex., A1 à A12).
        1. Ajouter 25 µL de 1 x PBS de A1 à A12 Herbert George wells. Chacun des échantillons de sérum test en une seule ligne. Ajouter 25 µL de sérums RDE traités (1:5) à 25 µL de PBS 1 x dans le premier puits de la colonne (A1). La première dilution de sérum est 01:10.
        2. Une fois que tous les traités RDE sérums sont ajoutés à la première colonne, (p. ex., A1, B1, C1), utiliser une pipette multicanaux pour mélanger les sérums et 1 x PBS par pipetage de haut en bas. Transférer 25 µL des sérums dilués de la première colonne de la deuxième colonne (par exemple, de A1 à A2). Changer les pointes entre les dilutions et les mélanger.
        3. Répéter les étapes 5.3.1.4.2. jusqu'à atteindre la dernière colonne (par exemple, A12, B12, C12). Jeter le 25 µL dans la dernière colonne, garder le volume cohérente dans tous les puits (25 µL). Comprend une ligne de puits contenant seulement 25 µL de PBS 1 x sans n’importe quel sérum comme témoin négatif.
      5. Ajouter 25 µL de l’IAV, diluée à 8 HAU/50 µL à chaque puits avec des sérums dans la plaque de fond en V 96 puits ; le volume final de chacun est bien 50 µL, contenant 4 unités Hémagglutinantes du virus. Mélanger le contenu de pipetage répétées. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
      6. Ajouter 50 µL de la Turquie RBCs de 0,5 % pour chacun des puits. Mélanger le contenu de pipetage répétées. Incuber la plaque pendant 30-45 min sur la glace. Lire le test HAI visuellement lorsque les globules rouges dans les puits de contrôle (solution de 1 PBS x) forment un précipité rouge (c.-à-d., pellet) au fond des puits.
        NOTE : Globules rouges, d’autres espèces telles que poulet, cochon d’Inde ou de cheval peut également être utilisé.
      7. Calculer les titres HAI en identifiant la dernière bien dans lequel les globules rouges forment une pastille rouge et hémagglutination ne se produit pas.
        Remarque : La valeur réciproque de cette dilution est le titre HAI. La valeur est multipliée par un facteur 20 pour corriger le 01:20 dilution du sérum dans la première rangée.
    2. Dosage de micro-neutralisation virus (VNA) ( Figure 6)
      1. la veille VNA, préparer des cellules de MDCK dans une plaque à 96 puits pour atteindre 80-90 % confluence le lendemain comme indiqué au point 5.2.1.1. Préparer une dilution de PR8 WT dans les médias d’infection d’avoir 200 µL de FFU/25.
      2. Désactiver les sérums de souris à 56 ° C pendant 1 h. faites 2 fois des dilutions successives (dilution 12) par les sérums de souris en trois exemplaires à l’aide d’une plaque à 96 puits.
        1. Ajouter 40 µL de sérum à 160 µL de médias d’infection dans le premier puits de la première ligne, (p. ex., A1) (sérum dilution 1:5). La composition de pipetage. Ajouter 100 µL de médias de l’infection aux autres puits (A2 à H12).
        2. Transférer 100 µL de la première rangée à la deuxième rangée pour faire des dilutions de 1:2 (par exemple, de A1 à A2). Changer de conseils entre les dilutions et les mélanger en pipettant également. Répétez cette opération jusqu'à la dernière ligne (p. ex., A12). Jeter 100 µL dans la dernière ligne, garder le volume cohérente dans tous les puits (100 µL).
      3. Ajouter 100 µL de dilution IAV dans toutes les loges. Incuber 1 h à température ambiante. Pendant ce temps, retirer le milieu de culture tissulaire des cellules MDCK dans la plaque à 96 puits utilisant l’adaptateur sous vide aspirateur-multicanal et laver deux fois avec 100 µL/puits de PBS 1 x.
      4. Dans chaque plaque à 96 puits de cellules MDCK, laissez deux rangées pour les contrôles. Une ligne est le contrôle négatif (cellules sans virus et sérum) et l’autre rang est le contrôle positif d’infection (cellules par le virus en l’absence de sérums ou sérums de souris infectées par le mock).
      5. Transférer 50 µL/puits de la plaque des anticorps du virus des plaques de 96 puits de cellules MDCK. Placer les plaques sur une plate-forme bascule pendant 1 h à RT pour permettre à adsorption virale.
      6. Enlever l’inoculum de virus-anticorps utilisant un adaptateur aspirateur-multicanal sous vide et ajouter 100 µL/puits des médias après l’infection contenant 1 µg/mL de trypsine imprégnées d’insecticide TPCK.
      7. Incuber les cellules ~ 3-4 jours dans un incubateur à 33 ° C ou 37 ° C avec 5 % de CO 2 jusqu'à ce que l’effet cytopathogène (ECP) est observée dans le contrôle positif (cellules infectées en l’absence de sérums ou avec du sérum de contrôle).
      8. Retirer le milieu de culture tissulaire en utilisant un adaptateur aspirateur-multicanal sous vide et ajouter 100 µL/puits de violet de gentiane 0,1 %. Incuber pendant 1 heure à RT. enlever la solution de violet de gentiane en utilisant un adaptateur aspirateur-multicanal sous vide. Laver les puits 3 fois avec de l’eau distillée. Sécher les plaques au RT.
      9. Calculer les titres VNA en identifiant la dilution la plus élevée qui conserve une monocouche de cellules confluentes de cellules MDCK.
        Remarque : La valeur réciproque de cette dilution correspondante est le titre d’anticorps neutralisants. La valeur est multipliée par un facteur de 10 pour corriger le 01:10 dilution des sérums dans le premier puits de la ligne.

6. L’évaluation des vaccins de l’efficacité de Protection ( Figure 3)

  1. i.n. vacciner un groupe de souris de C57BL/6 femelles 6 à-8-semaines (n = 11) avec la dose de PR8 LAIV pour tester (FFU/souris) et un autre groupe de souris mock-vacciner (n = 11) avec 1 x PBS stérile. Effectuer les vaccinations i.n. de souris comme décrites précédemment dans la section 3.
  2. Quatorze jours après la vaccination, saigner les souris et recueillir les sérums tel que décrit à l’article 3. Analyser la présence de total et de neutraliser les anticorps contre PR8 WT tel que décrit au paragraphe 5.1.1.
  3. Quinze jours après la vaccination, mesurer et noter le poids de corps de la souris (jour 0). Défier i.n. souris avec une dose létale de la WT PR8 (homologue défi) comme décrite dans la section 3.
  4. Mesurer la masse corporelle et la survie (n = 5 / groupe) pendant 14 jours après le défi d’évaluer la morbidité et la mortalité produites par le défi PR8 WT chez les souris vaccinées (section 4.1).
  5. Récupérer les poumons de souris et de la muqueuse nasale (n = 3/jour) à jours 2 et 4 post-contester avec PR8 en poids homogénéiser et analyser les poumons et la muqueuse nasale comme décrit à la section 4.2 pour évalue la réplication virale du WT PR8 chez les souris vaccinées.

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Caractérisation de la pathogénèse virale chez la souris

La pathogenèse de l’IAV est liée à la morbidité et la mortalité causée par l’infection. Ces deux paramètres peuvent être évalués facilement chez les souris : morbidité IAV est reliée à la perte de poids corporel chez les souris infectées et le pourcentage de survie vous indiquera le taux de mortalité (Figure 1). Le poids corporel et la survie chez des souris infectées par IAV sont généralement surveillées quotidiennement pendant au moins deux semaines après l’infection8,9,10,29. Les données de survie obtenues peuvent déterminer le MLD50 qui a été calculé à l’aide de la méthode de Reed et Muench25. Un autre indicateur de la pathogenèse de l’IAV est lié à la réplication virale dans la partie inférieure (poumons) et dans les voies respiratoires supérieures (muqueuse nasale) (Figure 1). Les informations obtenues avec le titre viral dans ces organes correspondant aux valeurs de mortalité, morbidité et et pris ensemble donnent une bonne indication de la pathogénèse virale. On sait que la réplication IAV dans les poumons de souris pointe entre les jours 2 et 4 après l’infection (p.i.), et donc nous avons recommandé à récupérer ces organes à p.i. jours 2 et 4

Figure 1
Figure 1 : caractérisation de la pathogénèse IAV chez la souris : Pathogenèse IAV chez la souris est liée à sa morbidité (perte de poids corporel) et la mortalité (% de survie) et aussi à la capacité de l’IAV à reproduire dans l’empeigne (muqueuse nasale) et les voies respiratoires inférieures (poumons). En bref, au jour 0 souris sont pesés et anesthésiés par voie intrapéritonéale avec 2,2,2-tribromoethanol (TBE) avant qu’ils sont infectés par voie intranasale avec IAV. Du jour 1 au jour 14, les souris sont pesés chaque jours pour évaluer la perte de poids de corps (morbidité) et % de survie (mortalité) pour calculer la dose létale de souris 50 (MLD50). Les jours 2 et post-infection jour 4, les poumons de souris et de la muqueuse nasale sont récupérés et homogénéisés pour évaluer la réplication virale. Expériences de souris pour caractériser la pathogenèse IAV utilisant PR8 WT sont effectuées dans des conditions de BSL-2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans la Figure 2, les données obtenues lors de l’évaluation de la pathogénèse PR8 WT sont représentées. Quatre groupes de souris C57BL/6 de 6 à-8-semaines (n = 11) ont été infectés i.n. avec les doses indiquées (10, 102, 103 et 104 FFU/souris) de PR8 WT. Le poids corporel et la survie des 5 souris par groupe ont été mesurées par 14 jours après l’infection (Figure 2 aB). Toutes les souris immunisées avec 104 FFU de PR8 WT perdu poids rapidement (Figure 2 a) et chacun d’eux est décédé à jours 5 et 6 après l’infection (Figure 2 b). Souris immunisées avec 103 FFU de PR8 WT perdu de poids corporel à plus tard fois p.i. (Figure 2 a) et ils ont tous morts par jours 7 et 8 après l’infection (Figure 2 b). Toutes les souris immunisées avec 102 FFU de PR8 WT perdu poids (Figure 2 a), mais seulement 2 d'entre eux sont morts au jour 9 p.i. (Figure 2 b). Enfin, les souris immunisées avec 10 FFU de WT PR8 n’a pas perdu de poids (Figure 2 a) et chacun d’eux a survécu à l’infection (Figure 2 b). Le MLD50 de PR8 WT dans cette expérience, calculée avec la méthode de Reed et Muench25 était de 1,5 x 102 FFU (Figure 2).

Pour évaluer la réplication PR8 dans la partie supérieure et inférieure respiratoire des voies des souris infectées i.n. avec les doses indiquées (10, 102, 103et 104 FFU/souris), les poumons et la muqueuse nasale ont été récupérés à p.i. jours 2 et 4 (n = 3). Après homogénéisation du poumon, la quantité de virus présents dans cet organe a été analysée par le test d’immunofluorescence (Figure 2D). Le titre viral détecté dans les poumons des groupes de souris différentes était lié à la dose utilisée pour vacciner les : titres viraux plus élevés ont été détectés dans les poumons des souris immunisées avec 104 FFU de PR8 WT à p.i. des jours 2 et 4, tandis que les titres viraux inférieurs ont été détectées dans les poumons des souris immunisées avec 10 FFU de PR8 WT.

Figure 2
Figure 2 : représentation des données obtenues lors de l’évaluation de la pathogénèse virale : Pour analyser la morbidité et la mortalité de PR8 WT, souris C57BL/6 femelles de 6 à-8-semaines (n = 5) étaient i.n. infectés avec le numéro indiqué fluorescentes formant des unités (FFU) de PR8 WT et ensuite surveillé tous les jours pendant 2 semaines pour la perte de poids corporel (A) (morbidité) et (B) survie (mortalité). Les données représentent les moyennes et les écarts de résultats déterminés pour chaque souris (n = 5). (C) valeurs de survie % évalué sur une période de 2 semaines sont utilisées pour calculer le MLD50 à l’aide de la méthode de Reed et Muench25. (D) pour évaluer la réplication virale, souris C57BL/6 femelles de 6 à-8-semaines (n = 6) ont été infectés i.n. avec le nombre indiqué de FFU. La réplication virale dans les poumons ou de la muqueuse nasale des souris infectées est généralement évaluée au p.i. jours 2 et 4 à l’aide d’un test d’immunofocus. Titres viraux sont enregistrés comme FFU/mL. Les données représentent les moyens SDs des résultats obtenus dans chacune des souris. Les lignes pointillées sont inclus pour indiquer la limite de détection (200 FFU/mL) du test. Souris et des expériences de culture de tissus afin d’évaluer la morbidité, la mortalité et des titres viraux utilisant PR8 IAV ont été effectuées dans des conditions de BSL-2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Évaluation des réponses humorales induite après vaccination

Les réponses humorales induite par contre l’infection de l’IAV jouent un rôle essentiel dans le contrôle de l’infection virale. Pour cette raison, il est très important d’analyser les réponses humorales déclenchées par des infections de l’IAV WT ou de nouveaux vaccins IAV (Figure 3). Dans le modèle de souris, 14 jours après la vaccination, souris sont saignés pour analyser la présence d’anticorps dirigés contre les protéines virales totales par ELISA (Figure 4) et la présence d’anticorps ciblant la protéine virale HA, qui est habituellement neutralisants analysés par des approches communes sérologiques, comme une (dosage HAIclasse de ng = « xfig » > Figure5) et/ou un VNA (Figure 6).

Figure 3
Figure 3 : schéma des différentes étapes dans la caractérisation de l’innocuité, immunogénicité et l’efficacité de la Protection d’un LAIV : Lorsqu’on élabore un nouveau LAIV, le modèle de souris de l’infection de l’IAV est habituellement utilisé pour tester l’efficacité d’immunogénicité, de sécurité et de protection. Dans ce schéma, les expériences pour évaluer l’innocuité (A), (B) d’immunogénicité et l’efficacité de protection (C) d’un candidat LAIV sont indiqués. (A) pour évaluer l’innocuité d’un LAIV, il est nécessaire de doser les mêmes paramètres (morbidité, de mortalité et de la réplication virale dans la partie supérieure et des voies respiratoires inférieures) décrit à la Figure 1. Pour évaluer l’immunogénicité, les souris sont immunisées et 14 jours après la vaccination, ils sont saignés par ponction sous-maxillaire. Humorale est analysés en évaluant la présence d’anticorps totales contre les protéines de l’IAV en immuno enzymatique (ELISA) et en évaluant la présence d’anticorps par l’essai d’inhibition hémagglutination (IHA) et/ou virus neutralisants micro-neutralisation dosage (VNA). (C) pour évaluer les protection efficacité, 15 jours après la vaccination, à souris sont remises en cause avec l’IAV WT. Protection efficacité est évaluée par la mesure des titres viraux dans les poumons des souris contestées, la mortalité et la morbidité de la souris comme décrit dans Figure 1 . Expériences de souris pour caractériser l’immunogénicité, la sécurité et la protection de l’efficacité d’un candidat LAIV sont effectuées dans des conditions de BSL-2. BSL costumes ou autres conditions de confinement peuvent être nécessaires selon la souche de l’IAV utilisée pour relever le défi des souris vaccinées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour évaluer l’immunogénicité de PR8 LAIV, trois groupes de souris C57BL/6 de 6 à-8-semaines (n = 5) ont été immunisés avec différentes doses (102, 103et 104 FFU/souris) de PR8 LAIV ou mock vaccinés avec du PBS 1 x comme témoin négatif. Quatorze jours après la vaccination, les sérums de souris ont été recueillies par sous-maxillaire saignement26 (Figure 3). Production d’anticorps contre les protéines virales totales ont été évaluées par ELISA en utilisant une dilution de 1 : 200 d’extrait cellulaire des cellules MDCK PR8-infecté (Figure 4). Chaque sérum a été analysée individuellement. Les résultats indiquent que les sérums de souris immunisées avec la plus forte dose (104 FFU) de PR8 LAIV avait total PR8 antiprotéines les titres d’anticorps plus élevés que les sérums de souris immunisées avec la plus faible dose (102 FFU). Contrôle de sérums (souris infectées par mock) ne présentent pas de réactivité contre les antigènes PR8.

Figure 4
Figure 4 : représentation schématique de l’Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) afin d’évaluer la réponse immunitaire humorale : Taux d’anticorps spécifiques PR8 présentes chez les souris infectées est déterminées par ELISA dans des plaques 96 puits en polystyrène revêtus d’extraits cellulaires de simulacre (contrôle) ou des cellules de MDCK PR8-infectés. En bref, à 14 jours après l’infection (Figure 3), souris immunisées avec les doses indiquées de PR8 LAIV ont été saignés par ponction sous-maxillaires et sérums ont été recueillis. Chaque sérum a été évalué individuellement par ELISA IgG anticorps antiprotéines PR8 total. Données du graphique représentent les moyens et écarts-types des résultats obtenues de souris différents sérums (n = 6). O.D, densité optique. Tests ELISA ont été effectués dans une armoire de BSL-2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour analyser la présence d’anticorps chez la souris neutralisants serum utilisant le HAI assay, facteur 2 dilutions successives du sérum (précédemment inactivé à 56 ° C) de chaque groupe de souris immunisées avec différentes doses (102, 103, 10 et4 FFU) de PR8 LAIV ont été incubées avec 4 HAU de WT PR8 pendant 1 h à RT (Figure 5). Puis, 0,5 % des globules rouges de Turquie ont été ajoutés aux mélanges PR8-sérums. La partie supérieure de la Figure 5 est une représentation schématique des résultats HAI possibles : lorsque le sérum contient des anticorps neutralisants, précipitations de globules rouges sont observée dans le fond du puits parce qu’empêchent les anticorps liés la protéine virale de HA l’hémagglutination des globules rouges. En revanche, en l’absence d’anticorps neutralisants, hémagglutination de la GR est observée. Ensuite, le titre HAI est calculé comme l’inverse de la dilution du sérum dans la dernier hémagglutination bien manque. Les résultats HAI ont montré dans la partie inférieure de la Figure 5 indiquent que le sérum de souris vaccinées avec la plus grande quantité de PR8 LAIV (104 FFU) ont le plus haut titre d’anticorps neutralisants, tandis que le sérum de souris immunisées avec la plus faible dose (102 FFU) ont le titre le plus bas de neutraliser les anticorps contre PR8. Aucun anticorps neutralisants n’étaient présents dans le sérum témoin (souris infectées par mock).

Figure 5
Figure 5 : essai d’Hemagglutination Inhibition (HAI) : Niveaux de neutraliser les anticorps contre PR8 WT chez les souris infectées peuvent être facilement évaluées par dosage HAI. En bref, facteur 2 dilutions en série (à partir de dilution 01:10) des sérums de souris immunisées avec les doses indiquées de PR8 LAIV étaient mêlées (1:1) 4 HAU de WT PR8 pendant 1 h à RT dans une plaque de fond en V 96 puits. Après 1 h d’incubation, globules rouges 0,5 % ont été ajoutés aux mélanges virus-sérum pendant 30-60 min sur glace. Les titres HAI sont déterminés en identifiant la dernière bien dans lequel les globules rouges forment un bouton rouge et hémagglutination ne produit pas (en haut). Dosages de la HAI avec PR8 WT ont été effectuées dans une armoire de BSL-2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans la Figure 6, les données obtenues lors de l’évaluation de neutraliser les anticorps dans le sérum de souris par VNA sont représentées. FFU 200 de PR8 WT ont été mélangés avec le facteur 2 dilutions successives du sérum (précédemment inactivatEd à 56 ° C) de souris immunisées avec différentes doses (102, 103et 104 FFU) de PR8 LAIV pendant 1 h à température ambiante. Chaque échantillon de sérum a été évaluée en triple exemplaire. Les mélanges de sérums-virus ont servi à infecter les monocouches de cellules MDCK dans une plaque à 96 puits. La partie supérieure de la Figure 6 est une représentation schématique des résultats VNA possibles : absence d’anticorps dans les résultats de sérum dans les CPE à environ 3-4 jours après l’infection neutralisants En revanche, lorsque les anticorps neutralisants sont présents (cellule intacte monocouche), ils se lient à l’hémagglutinine virale et prévenir l’infection virale, et il n’y a aucun ECP. Présence de CPE est généralement visualisé par la coloration des cellules infectées avec cristal violet, et les titres de neutralisation virale sont calculées comme l’inverse de la dernière dilution au cours de laquelle l’infection est complètement bloquée. Les résultats de l’avi sont représentées dans la partie inférieure de la Figure 6. Le sérum de souris immunisées avec la grande quantité de PR8 LAIV (104 FFU) ont le plus grand titre des anticorps neutralisants, tandis que les sérums de souris immunisées avec la plus faible dose ou PR8 LAIV (102 FFU) ont le titre le plus bas des anticorps neutralisants, semblable aux résultats obtenus avec le test HAI. Aucun anticorps neutralisants ont été présents dans le sérum de souris infectées par mock.

Figure 6
Figure 6 : dosage de micro-neutralisation Virus (VNA) : Une alternative à l’essai HAI, le dosage VNA peut évaluer la présence de WT PR8 anticorps neutralisants. Brièvement, les sérums de souris vaccinées avec les doses indiquées de PR8 LAIV étaient en série 2 fois diluée (dilution 1:5 de départ) en plaques 96 puits et mélange 1:1 avec 200 FFU de WT PR8 pendant 1 h à température ambiante. Après 1 h, mélanges virus-sérum ont servi à infecter des plaques à 96 puits de cellules MDCK. Les cellules infectées ont été incubées pendant 3 à 4 jours jusqu'à complète effet cytopathique. Les plaques de 96 puits ont été ensuite colorés avec 0,1 % cristal violet. Titres VNA sont déterminés en identifiant la dilution la plus élevée de conserver une monocouche de cellules confluentes. VNA avec PR8 WT ont été effectuées dans des conditions de BSL-2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Évaluation de l’efficacité de la protection des vaccins IAV chez la souris

Lorsqu’on élabore un nouveau LAIV, son efficacité d’immunogénicité, de sécurité et de protection doit être testée in vivo, et le modèle de la souris est généralement le premier modèle animal choisi d’analyser ces paramètres. La figure 3 est un schéma des différentes étapes nécessaires pour caractériser une nouvelle LAIV chez la souris. Pour évaluer la sécurité d’un LAIV (Figure 3 a), les souris sont i.n. infectés à l’aide d’un protocole similaire aux procédures expérimentales décrites dans la section de pathogenèse (section 4), et le poids corporel et la survie surveillance fournira des informations liées à la morbidité et la mortalité de la LAIV (Figures 2 a2 b), y compris le MLD50. En outre, après inoculation avec des doses de vaccin différent, la réplication de LAIV dans la partie inférieure (poumons) et dans les voies respiratoires supérieures (muqueuse nasale) soient mises en recouvrement8,9,10, 11,29 (figure 2D). Pour tester l’immunogénicité, les sérums de souris vaccinées avec le LAIV sont recueillies avant défi avec PR8 WT (homologue défi), à l’aide des protocoles comparables à celles décrites dans la section de l’immunogénicité (section 5) (Figure 3 b). La présence de total et de neutraliser les anticorps dans le sérum peut être détectée par ELISA et HAI et/ou VNA, respectivement.

Enfin, pour tester l’efficacité de la protection, les souris vaccinées LAIV sont confrontés avec PR8 WT et l’efficacité de la protection se caractérise par la surveillance de la morbidité, de mortalité et de la présence du défi PR8 WT dans les poumons, comme décrit précédemment dans la section 4 ( Figure 3)8,9,10,11. Si le LAIV induit une protection contre le défi PR8 WT, souris ne perdra pas de poids corporel, et ils survivront le défi mortel avec IAV WT. En outre, les titres viraux IAV WT dans les poumons ne seront pas détectés, ou sera considérablement réduites par rapport à mock (PBS) vaccinés souris8,9,10,11.

Solutions et milieux de culture de tissus Composition Stockage Utilisation Commentaires
Milieux de culture de tissu : Dulbecco de l’aigle modifié (DMEM), 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine-L-glutamine (PSG) (DMEM 10 % BF 1 % PSG) 445 ml DMEM, 50 ml de FBS et 5 ml de 100 x 1 % pénicilline (100 unités/ml)-streptomycine (100 µg/ml) - L - glutamine (2 mM) (PSG) Conserver à 4° C Ce média est utilisé pour la maintenance des cellules épithéliales Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)
Les médias après l’infection: DMEM 0,3 % albumine Bovine (BA), 1 % PSG (DMEM 0,3 % BA% 1 % PSG) 491 ml DMEM, 4,2 ml de 35 % BA et 5 ml de 100 x PSG Conserver à 4° C Ce média est utilisé pour l’entretien des cellules MDCK après l’infection par le virus de l’Influenza A (IAV)
10 x en solution saline tamponnée au Phosphate (PBS de x 10) 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na2HPO4.7H2O, 2 g de KH2PO4. Ajouter ddH2O à 1 L. ajuster le pH à 7.3 Conserver à température ambiante (RT) Stériliser à l’autoclave
1 x PBS Diluer 10 x PBS 01:10 par ddH2O Magasin à ta Stériliser à l’autoclave
Médias de l’infection : 1 x PBS, 0,3 % BA, 1 % la pénicilline-streptomycine (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1 x PBS stérile, 4,2 ml de 35 % BA et 5 ml de 100 x 1 % pénicilline (100 unités/ml)-streptomycine (100 µg/ml) (PS) Conserver à 4 ° C Ce média est utilisé pour les infections de l’IAV
Fixation/perméabilisation de solution : formaldéhyde à 4 %, 0,5 % triton X-100 dilué dans du PBS 1 x 400 mL neutre tamponné au formol 10 %, 5 ml de Triton X-100 et 595 ml de PBS 1 x
d > magasin à ta Cette solution est utilisée pour fixer et permeabilize des cellules de MDCK dans des expériences de titrage viral Préparer la solution dans une hotte pour prévenir l’exposition au formaldéhyde Bloquant la solution : 2,5 % Bovine Serum Albumin (BSA) dans du PBS 1 x 2,5 g de BSA à 97,5 mL de PBS 1 x Conserver à 4 ° C Cette solution est utilisée comme une solution de blocage pour les tests d’immunofluorescence et ELISA. Stériliser par filtration avec filtre à 0,2 µm. Solution de dilution des anticorps (1 % de BSA dans du PBS 1 x) 1 g de BSA dans 99 mL de PBS 1 x Conserver à 4 ° C Cette solution est utilisée pour la dilution des anticorps primaires et secondaires dans les tests d’immunofluorescence et ELISA Stériliser par filtration avec filtre à 0,2 µm 0,1 % solution de violet de gentiane 1 g de cristal violet dans 400 ml de méthanol. Ajouter 600 ml de ddH2O Magasin à ta Cette solution est utilisée pour fixer et colorer des cellules de MDCK lors d’essais de neutralisation virale Tosylsulfonyl phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK)-traité de la trypsine Préparer une solution x 1 000 à 1 mg/ml en FD2O Conserver à-20 ° C La TPCK-trypsine est ajoutée dans les infections de l’IAV Faire 100 µl d’extraits Mémoire tampon RIPA 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 % X-100 Triton, désoxycholate de sodium 0.1 %, 0,1 % SDS, 140 mM NaCl Conserver à 4 ° C Cette solution est utilisée pour faire des extraits cellulaires

Tableau 1 : milieux de Culture de tissus et de Solutions.

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Discussion

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Le modèle de souris de l’IAV est employé couramment pour des études in vivo d’efficacité de protection, l’immunogénicité et la pathogenèse IAV. La petite taille des souris le rend facile à manipuler et à stocker par rapport à d’autres modèles animaux comme furet ou cochon d’Inde. En outre, la facilité en ce qui concerne les animaux coûtent, logement et reproduction permettent leur utilisation dans des essais précliniques de vaccination où un grand nombre d’animaux est nécessaires. Notamment, étant donné que les souris ont été utilisés en recherche plusieurs disciplines, plusieurs moléculaire et immunologie murine réactifs sont disponibles afin de faciliter leur utilisation pour les études de l’IAV. Par ailleurs, la variabilité de l’hôte minimale et la présence d’un système immunitaire qui est évolutif similaire à celle présentent dans les humains rendent un robuste petit modèle animal pour les études de l’IAV. Enfin, l’étude des interactions protéine virale-hôte et leur contribution à la pathogénèse virale sont actuellement possibles grâce à l’accès à des souris KO. Cependant, à côté de plusieurs avantages d’utiliser la souris pour les études de l’IAV, ils ne sont pas utiles pour les études de transmission IAV. Par conséquent, furets ou cochons d’Inde sont des modèles animaux plus appropriés pour étudier la transmission de l’IAV. Symptômes cliniques chez des souris infectées avec IAV habituellement apparaissent 2-3 jours après l’infection, même si cela peut varier selon l’âge de souris, statut immunitaire, sexe, antécédents génétiques et souche ; ainsi que la souche virale et de la dose utilisée. Les symptômes comprennent l’anorexie, léthargie, se blottir, hérissé de fourrure, perte de corps poids et la mort de16,17.

Dans ce manuscrit, nous décrivons comment évaluer Pathogénèse virale dans i.n. souris infectées avec l’IAV en surveillant la perte de poids de corps (morbidité), pourcentage de survie (mortalité) et en évaluant la réplication virale dans le coin supérieur (muqueuse nasale) et inférieur (poumons) voies respiratoires (Figure 1 et Figure 2). La pathogenèse de l’IAV est un paramètre très important non seulement dans le cadre de nouvelles souches de l’IAV, mais aussi dans la mise en œuvre sûre des vaccins LAIV (Figure 3). Saisonnier IAVs et IAVs qui infectent d’autres mammifères (comme les chevaux, les chiens ou les cochons) ne produisent pas habituellement des signes de maladie chez les souris11,27. Dans ce cas, l’analyse des titres viraux dans les poumons ou la muqueuse nasale des souris infectées est le paramètre principal pour évaluer la pathogénèse virale des souches de l’IAV. Une fois les poumons et la muqueuse nasale sont collectées, elles sont homogénéisés et la quantité de virus présente dans ces organes peut être analysée par l’essai de plaque, test d’immunofluorescence, culture de tissus infectieuse dose 50 (TCID50) ou une autre méthode validée8 ,,29. Nous vous recommandons d’évaluer les titres viraux en utilisant l’immunofluorescence indirecte puisque l’essai de plaque nécessite une plus grande quantité de cellules MDCK (format de plaque 6 puits) et, comme le TCID50, plus de temps (3-4 jours) est nécessaire pour calculer des titres viraux. Toutefois, pour effectuer le test d’immunofluorescence indirecte, il est nécessaire d’avoir : 1) primaires spécifiques anticorps contre une protéine de l’IAV (il est recommandé d’utiliser un anticorps dirigé contre la nucléoprotéine IAV, NP, puisque c’est la plus abondante protéine virale produite au cours de l’infection virale) ; 2) secondaires anticorps conjugués à un fluorophore ; et 3) microscopie à fluorescence pour compter les cellules infectées positives fluorescents.

Étant donné que le système immunitaire des souris est évolutif similaire au système immunitaire de l’homme16 et parce que les souris peuvent déclencher une réponse humorale forte et protection contre l’infection de l’IAV, l’immunogénicité de IAVs (ou vaccins candidats) peut être facilement en déterminant total (ELISA ; La figure 4) et neutralisant (HAI, Figure 5) ou anticorps VNA (6 chiffres). Pour analyser les réponses humorales après l’immunisation, souris peuvent être saignés par différentes méthodes approuvées telles que la ponction rétro-orbitaire, attache de queue, ponction de la veine saphène ou ponction sous-maxillaire. Nous avons choisi la technique de ponction sous-maxillaire26 car la procédure ne nécessite pas l’utilisation de l’anesthésie et nous permet d’obtenir un volume acceptable du sang pour les études immunologiques ; par opposition à la ponction rétro-orbitaire, où les souris devraient être anesthésiés et avec le clip de la queue ou la ponction de la veine saphène, où le volume de sang récupéré habituellement est faible.

Dans ce manuscrit, nous décrit comment évaluer la présence d’anticorps dirigés contre les protéines virales totales par ELISA utilisant des extraits de cellules infectées par le virus. Puisque l’infection IAV induit une immunité protectrice médiée, principalement, par les anticorps dirigés contre l’hémagglutinine virale (la principale cible de virale antigénique), il est fortement recommandé d’évaluer la quantité d’anticorps spécifiques contre HA par ELISA utilisant recombinante purifiée HA 10de protéines. Pour analyser la présence d’anticorps neutralisants, méthodes HAI tant VNA sont acceptées mais les deux ont des avantages et des inconvénients. Le HAI est rapid (2-3 h) et approuvé par le Center for Disease and Control (CDC) évaluer la présence de l’IAV neutraliser les anticorps30. L’AVI est plus beaucoup de temps (3-4 jours) mais plus précis car il évalue uniquement les anticorps capable de neutraliser l’infection virale. Notamment, l’AVI a été démontré pour détecter les réactifs tige HA neutraliser les anticorps31, ainsi que NA neutraliser les anticorps32. Un autre avantage de l’AVI est la sensibilité de l’éssai, depuis le moins IAV (200 FFU) est nécessaire par rapport à l’essai HAU qui nécessite environ 10 ~4-105 FFU. Par ailleurs, le dosage HAI peut être problématique pour la détection des anticorps neutralisants contre les IAVs aviaires en raison de la difficulté à interpréter les résultats33,34,35. En outre, VNA n’exige pas l’utilisation de globules rouges pour l’identification des anticorps neutralisants de la grippe.

Enfin, nous décrivons les procédures expérimentales afin d’évaluer les trois principaux aspects qui doivent être considérés dans l’élaboration de nouveaux vaccins IAV (Figure 3) : 1) sécurité : le vaccin doit être sûr et pas de produire la maladie ; 2) immunogénicité : le vaccin doit être immunogènes et induisent des réponses cellulaires et humorales protectrices ; 3) efficacité de protection : le vaccin doit induire une protection contre l’infection par des virus homologues ou hétérologues de WT. Le modèle de souris est un bon choix pour le dépistage première d’un nouveau IAV vaccin in vivo car elles peuvent évaluer les programmes de vaccination diverse et conditions, y compris l’utilisation de différents adjuvants, dose d’antigène/vaccin, administration et protection large contre l’infection avec des homologues ou hétérologues IAVs souches16,17. Toutefois, avant de procéder à des essais cliniques humains, vaccins candidats doivent au minimum être testés un deuxième modèle de in vivo .

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Recherche sur le virus de la grippe en laboratoire LM-S est partiellement financée par The New York Influenza Center of Excellence (NYICE), un membre des centres d’Excellence en recherche sur l’Influenza et de Surveillance (CEIRS) NIAID. Nous remercions Wendy Bates pour son soutien dans les corrections du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

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References

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Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection
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Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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