Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Influenza A Virus undersøgelser i en musemodel af infektion

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

Influenza A virus (IAVs) er vigtige menneskelige respiratorisk patogener. At forstå IAVs patogenicitet og Udfør præklinisk afprøvning af nye vaccine tilgange er dyremodeller efterligne menneskelige fysiologi påkrævet. Her, beskriver vi teknikker til vurdering af IAV patogenese, humorale svar og vaccine virkning ved hjælp af en musemodel af infektion.

Abstract

Influenzavirus forårsager over 500.000 dødsfald på verdensplan1 og er forbundet med en årlig omkostning på 12-14 milliarder dollars i USA alene overvejer direkte medicinsk og indlæggelse udgifter og arbejde fravær2. Dyremodeller er afgørende i Influenza A virus (IAV) undersøgelser at vurdere viral patogenese, vært-patogen interaktioner, immunrespons, og effekten af nuværende og/eller roman vaccine tilgange og antivirale lægemidler. Mus er en fordelagtig lille dyremodel, fordi deres immunsystem er evolutionært magen til, findes i mennesker, de er tilgængelige fra kommercielle leverandører som genetisk identiske emner, der er flere stammer, der kan udnyttes til at evaluere det genetiske grundlag for infektioner, og de er forholdsvis billig og let at manipulere. For at sammenfatte IAV infektion hos mennesker via luftvejene, bedøvede mus først før intranasal podning med smitsomme IAVs under ordentlig biosikkerhed indeslutning. Efter infektion bestemmes patogenesen af IAVs overvågning dagligt sygelighed (krop vægttab) og dødelighed (overlevelse). Viral patogenese kan derudover også evalueres ved at vurdere virus replikering i øvre (næseslimhinden) eller lavere (lungerne) luftveje af inficerede mus. Humorale svar på IAV infektion hurtigt kan vurderes af non-invasiv blødning og påvisning af sekundær antistof assays sigter mod at påvise forekomst af total eller neutraliserende antistoffer. Her beskriver vi de almindelige metoder bruges til at inficere mus intranasalt (i.n) med IAV og evaluere patogenese, humorale immunrespons og beskyttelse virkning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAVs er kappebærende virus klassificeret i Orthomyxoviridae familien3. De indeholder otte enkeltstrenget RNA molekyler med negativ polaritet3. Hos mennesker forårsage IAVs årstidens epidemier og lejlighedsvis pandemier af vigtig konsekvens når romanen vira er indført i den menneskelige befolkning4. Derudover overføres sæsonbetonede IAVs højt og hurtigt mellem mennesker producerer en forhøjet økonomiske tab på verdensplan hvert år2,5. IAV symptomer er hoste, tilstoppet næse, feber, utilpashed, hovedpine, anoreksi og myalgi, men virus kan også producere en mere alvorlig sygdom i immunkompromitterede patienter6. I virkeligheden, beregner World Health Organization (WHO), at sæsonbestemt influenzavirus forårsager 300.000-500.000 dødsfald på verdensplan hvert år1. Der er kun to klasser af narkotika i øjeblikket godkendt af Food and Drug Administration (FDA) for influenza profylakse og behandling hos mennesker: neuraminidasetypen (NA) hæmmere (fx, oseltamivir) og blokkere M2 ion kanal (f.eks., amantadin); fremkomsten af resistente virus varianter er imidlertid en stigende bekymring. Vaccination, derfor, stadig den bedste medicinske mulighed for at beskytte mennesker mod IAVs infektioner. Til dato har tre typer af influenza vacciner licenseret af FDA til human brug er tilgængelige: rekombinant viral hemagglutinin (HA) protein vacciner, inaktiverede vacciner mod influenza (& Videoside) og live-svækkede influenza vacciner (LAIV)5, 7. de tre vacciner er designet til at fremkalde adaptive immunrespons mod viral HA protein, det store mål af neutraliserende antistoffer mod IAVs.

En valideret musemodel at studere IAV infektion i vivo

Dyremodeller har været brugt til at studere, blandt andre, IAV patogenese8,9,10,11, viral faktorer, der bidrager til sygdom12 og/eller viral transmission13 ,14, og til at teste effekten af nye vacciner og antivirale lægemidler9,10,15. Mus (Mus musculus) er den mest omfattende brugte dyremodel for IAV forskning af flere grunde: 1) immunsystemet er evolutionært svarende til at præsentere i mennesker; 2) lave omkostninger, herunder animalske køb, bolig og reproduktion; 3) lille størrelse nemt manipulere og gemme; 4) minimal vært variation at opnå homogen svar og resultater; 5) et stort kendskab til mus biologi, herunder genomet sekvens; 6) mange tilgængelige Molekylærbiologi og/eller immunologi reagenser; 7) tilgængelige knock out (KO) mus at studere bidrag af en given vært protein på viral infektion; og 8) flere mus stammer, der kan udnyttes til at evaluere det genetiske grundlag for infektioner.

Der er flere mus-stammer, der er i øjeblikket tilgængelig at studere IAV i vivo. Alder, immunstatus, sex, genetiske baggrund og mus stamme samt ruter af infektion, dosis og viral stammer alle påvirke resultatet af IAV infektion i mus. De mest almindelige mus stammer anvendes i IAV forskning er C57BL/6, BALB/C og mere for nylig, DBA.2 mus, da de er mere modtagelige for IAV sygdom end de to tidligere stammer16,17,18, 19 , 20. vigtigere, immunresponset også kan være anderledes afhængigt af mus stamme18,19,20. Det er således meget vigtigt at inddrive alle de tilgængelige oplysninger om mus og IAV stamme til at vælge den bedste løsning for forsøget skal gennemføres.

Selv om mus er en god dyremodel af infektion i vivo undersøgelser med IAV, har de flere begrænsninger, der skal overvejes i den eksperimentelle design. For eksempel, er en stor begrænsning ved at bruge mus i vivo undersøgelser, at IAVs ikke overfører blandt mus. Således, for transmission studier, mere accepteret dyremodeller (fx, fritter eller marsvin) er anvendte16,17,21. Derudover er der adskillige forskelle mellem manifestationer af IAV i mus og mennesker. I modsætning til mennesker udvikler mus ikke feber efter IAV infektion; omvendt præsenterer de med hypotermi16,17. I mus, er IAV replikering koncentreret i de nedre luftveje (lungerne) i stedet for de øvre luftveje. Således er virulens af IAV i mus ikke altid korreleret til den, set hos mennesker. Helt, fordi fordelene, der opvejer de begrænsede ulemper, mus repræsenterer det første dyr model anvendes til at evaluere influenza viral patogenese, immunogenicitet og beskyttende effekt i undersøgelser af vaccine og antivirale. Desuden ville det ikke være etisk acceptabelt at udføre undersøgelser med IAV bruger store dyremodeller uden foregående beviser i en lille dyremodel af IAV infektion. I dette manuskript, vi beskriver, hvordan at inficere mus intranasalt (i.n.) med IAV, hvordan man kan overvåge sværhedsgraden og fremskridt af viral infektion og hvordan man udfører eksperimenter skal vurdere humorale immunrespons og beskyttelse effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alle animalske protokoller er beskrevet her blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) og institutionelle biosikkerhed Udvalget (IBC) på University of Rochester School of Medicine og tandpleje, og i overensstemmelse med anbefalinger i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af den nationale forskning Rådet 22. Faciliteter og programmer af Vivarium og Division of laboratorium animalsk Medicine School of Medicine og tandpleje er akkrediteret af AAALAC International og i overensstemmelse med statens lovgivning, føderale statut og National Institutes of Health (NIH) politik. Tilsvarende krav bør finde anvendelse på hver institution til at overholde de animalske protokoller er beskrevet i dette håndskrift.

1. anvendelse af små hvirveldyr

Bemærk: ordentlig personlig beskyttelse udstyr (PPE) er påkrævet for at arbejde med mus. Minimum krav omfatter engangs overtræksdragt, skoovertræk, hoved motorhjelm, maske og handsker.

  1. i henhold til IACUC protokollen, placere et maksimum på 5 mus pr. bur. Efter IACUC protokol, aflive mus med to metoder til dødshjælp (andet skal være en fysisk metode) for at sikre, at dyret er dødt.
    Bemærk: I eksperimenter som IAV sygelighed og dødelighed skal evalueres, mus, der mistede 20% af deres oprindelige kropsvægt blev anset for at have nået den eksperimentelle slutpunkt, og blev aflivet med CO 2 og cervikal dislokation som den fysiske sekundære metode. Denne procentdel af kropsvægt kan være anderledes i andre institutioner. I de procedurer, hvor musene lungerne og næseslimhinden er indsamlet efter IAV infektion, mus er euthanized med en dødelig dosis af 2,2,2-tribromoethanol (TBE), og ved at skære hepatisk vene som det fysiske sekundært metode. 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 hunmus blev købt og vedligeholdes i dyrs pleje facilitet på University of Rochester School of Medicine og tandpleje på specifikt patogenfrie betingelser.

2. Biosikkerhed

NOTE: I denne betænkning, IAVs bruges til at inficere mus er den fælles mus-tilpasset laboratorium stamme af influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8 WT) 22 , 23 og en temperatur følsom LAIV variant, PR8 LAIV 8. Udføre alle procedurer, der involverer IAV infektioner (in vitro- eller vivo), cellekulturer og biologiske prøver, i en biologisk sikkerhed kabinet under biosikkerhed niveau (BSL) -2 betingelser. Udnytte andre BSL jakkesæt eller indeslutningsbetingelser hvis stærkt virulente IAV stammer bruges.

  1. Rene biosikkerhed kabinet med klor kuldioxid desinfektionsmiddel før og efter udførelse af alle de eksperimentelle procedurer beskrives i dette håndskrift. Sterilisere alle dissektion materiale (saks, skalpel og dissekere pincet) og Dounce homogeniseringsapparat før og efter deres brug følgende ordentlig IBC anbefalinger. Kassér alle materiale produceret under procedurer under ordentlig IBC og IACUC retningslinjer.

3. Intranasal infektion

  1. sted den kvindelige 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 mus på specifikt patogenfrie betingelser. Organisere og etiket musen bure med virus og dosis anvendes. Identificere mus i hvert bur ved hjælp af en øre punch kode eller med en anden godkendt metode som maleri af haler. Placere et maksimum på 5 mus pr. bur.
  2. Laves fortynding af IAV (fluorescerende danner enheder (FFU) / mus) under aseptiske forhold i en samlet maengde paa 30 µL/mus i sterile 1 x fosfat buffer saltvand (PBS). Opretholde virus inokulat på is. Beregningen af IAV at tilføje i den virale fortynding med formlen: ((X FFU pr. mus/30 µL) x endelige rumfang) / lager viral titer.
  3. Vejer mus med en skala og vægt af hver mus (dag 0). Hold musen i ryggens stilling ved at samle det harmoniske af halsen mellem pegefinger og tommelfinger. Hold hale mod hånden med pinky finger.
  4. Bedøver musen intraperitoneal (i.p.) med 240-250 mg/kg af TBE ved at indsætte nålen i den caudale 2/3 af den højre side af maven. Pause kort før tilbagetrækning af nålen. Returnere musen til buret og vent 5 min.
  5. Gælder sterile oftalmologiske salve øjnene at forhindre tørhed, mens musen er bedøvede. Kontrollere, om musen er bedøvede ved manglende pedal tilbagetrækning refleks (dvs., tå knivspids). Hvis mus ikke er fuldt bedøvede de vil hoste op virus.
  6. Når musen er fuldt bedøvede, placere musen i dorsal recumbency. Sætte afpipetteres spidsen indeholdende 30 µL af virus inokulum i næsebor og langsomt, men konstant skub løsningen. Være sikker på, at musen er indånde forberedelsen ved at observere inokulum drop forsvinder.
  7. Kontrollere, at musen vejrtrækning som TBE kan trykkes temperatur og vejrtrækning satsen. Returnere dyret til buret placere det i dorsal recumbency. Overvåge mus for tegn i respiratory bedrøve og hvis observeret, hjælpe musen til at trække vejret holder dyr vertikalt og fremkalde indvirkning drevet respiration 24. Overvåge musen, indtil det kommer til bevidsthed (30-45 min efter at det var anesthetized).

4. Karakterisering af Viral patogenese ( figur 1)

  1. evaluering af sygelighed og dødelighed ( figur 1 og figur 2)
    1. Inficere i.n. 3-4 grupper af 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 hunmus (mindst 5 mus pr. gruppe, n = 5) med 10-fold doser (10, 10 2, 10 3 og 10 4 FFU/mus) af PR8 WT som beskrevet i afsnit 3.
    2. Skærm og vejer mus med en skala over de næste 14 dage på omtrent samme tidspunkt at minimere vægt variationer på grund af fødevarer indtagelse. Aflive mus der mister 20% af deres oprindelige kropsvægt, som beskrevet i afsnit 1.
    3. Efter 14 dage, aflive de mus, der overlever viral infektion som beskrevet i afsnit 1.
    4. Beregner den virale 50% musen dødelige dosis (MLD 50) baseret på overlevelsesdata opnået ved hjælp af metoden Reed og Muench 25. Først beregne andelen afstand (PD):
      Equation 1
      1. Næste, beregne MLD 50 ved følgende formel:
        Equation 2
  2. evaluering af viral titers i lungerne og næseslimhinden ( figur 1 og figur 2. )
    1. inddrivelse af lungerne og næseslimhinden
      1. inficere i.n. kvindelige 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 mus (n = 6) med den virale dosis til 10-10 4 FFU af PR8 WT-prøven som beskrevet i afsnit 3.
      2. Indsamle mus lungerne og næseslimhinden dage 2 (n = 3) og 4 (n = 3).
        1. Aflive mus med en dødelig dosis (i.p.) TBE (500 mg/kg). Placere dyret i dorsal recumbency og desinficere skind over brystkassen med 70% ethanol. Skær huden med en skalpel fra brystbenet til bunden af maven. Skære 1 cm fra bunden af indsnit til de laterale dele af musene med saksen.
        2. Skæres i leverens vene med saks bløder mus som metoden sekundær aktiv dødshjælp. Placere dyret i en ventrale holdning og vente 2 min til at tillade blodet at løbe ud. Dette trin er vigtigt at reducere blod i lungerne.
        3. Fjern skindet fra hele den øverste del af musen (inkl. hovedet) i bunden af maven hvor de første snit blev lavet ved hjælp af dissekere saks og pincet. Skære hovedet med saksen og placere det i en steril tør petriskål.
        4. Skære kryds mellem maxilla og underkæbe med saksen og kassér underkæbe. Med en saks, to nedskæringer i enderne af de zygomatic buer og fjerne dem. Fjerne øjne ved hjælp af dissekere pincet.
        5. Hold af kraniet med dissekere pincet og skære kranium langs den sagittal sutur med en skalpel. Løfte de to halvdele af kraniet med hjerne at se næseslimhinden. De nasale mucosas er omgivet af den forreste knogler i kraniet, herunder nasal, maxilla, Palatinerhøjen, zygomatic, og ethmoid knogler.
        6. Ved hjælp af en skalpel, skåret del af kraniet med hjernen og kassér. Placer anden del af kraniet med næseslimhinden i sterile rør. Gemme røret på is (4 ° C), hvis prøverne behandles den samme dag, eller på tøris til at fryse dem hurtigt, hvis prøverne vil blive behandlet senere.
        7. For at undgå kontaminering af prøver, rengøre og desinficere de dissekere værktøjer mellem hver væv genvundet og mellem hvert dyr dissektion med klor kuldioxid desinfektionsmiddel.
        8. At indsamle lungerne, placere dyret i dorsal recumbency og skar i lungehinden med saksen. Åbne brystkassen ved at skære ribbenene på 1 cm på begge sider af brystbenet. Foretage nedskæringer fra bunden af brystkassen til den overlegne del med saksen.
        9. Gøre et tværsnit med saks mellem de to indsnit i den overlegne del af brystkassen og fjerne brystet plade. Hold lungerne med pincet, skære enden af luftrøret (lige før lungerne) med saksen og sætte lungerne ind i en steril rør. Gemme røret på is (4 ° C), hvis prøverne behandles den samme dag, eller på tøris til at fryse dem hurtigt, hvis prøverne vil blive behandlet senere.
          Bemærk: Homogenisere vævsprøver på samme dag, som de er indsamlet og opbevares ved-80 ° C til at analysere viral titers senere. Det er vigtigt, at prøverne ikke undergår gentagne fryse-tø cykler før virus titers bestemmes. Alternativt kan du gemme vævsprøver ved-80 ° C, indtil de vil blive behandlet.
    2. Homogenisering af lungerne og næseslimhinden
      1. placere lunger eller næseslimhinden i en steril Dounce homogeniseringsapparat og tilsættes 1 mL koldt infektion medier. Homogeniseres prøven ved at flytte pistil op og ned til ca. 1 min. ved stuetemperatur (RT) indtil lungerne er helt forstyrret. Læg den homogeniserede prøve i en steril tube og butik på 4 ° C. Brug en ny Dounce homogeniseringsapparat for hver proeve.
      2. Centrifugeres prøver på 300 x g for 5-10 min. ved RT. indsamle supernatanten i en ny steril tube. Gemme supernatanten ved 4 ° C, hvis viral titrering udføres på den samme dag og kassér pelleten. Alternativt, fryse (-80 ° C) supernatanten af det homogeniserede prøver for at vurdere viral titers senere.
    3. Virus titrering af indirekte immunfluorescens
      1. dagen før titrering, frø 96-brønd plader med Madin-Darby Canine nyre (MDCK) epitelceller (4 x 10 4 celler/brønd) at nå ~ 80-90% sammenløbet i vævskultur medier. Marker cellerne i et 37 ° C kuvøse med 5% CO 2. Dagen for viral titrering, se celler under mikroskop til at bekræfte en éncellelag før du starter den virusinfektion.
      2. Forberede 1:10 fortyndinger af supernatanten af de homogeniserede prøver (lunge eller næseslimhinden) i infektion medier i en 96-brønd plade. Udføre den virale titrering af tre at præcist bestemme viral titers.
        1. Tilføje 90 µL af infektion medier til hver af brønde i 96-brønd plade. Tilføje 10 µL af en af supernatanten af de homogeniserede prøver til brøndene A1, A2 og A3 til at evaluere den virale titer af hver prøve i tre eksemplarer. Tilføje 10 µL af en anden supernatanten af de homogeniserede prøver til brøndene A4, A5 og A6. Udføre den samme fortynding fortløbende med resten af prøverne.
        2. Efter at tilføje prøven supernatanten til række A, bruge en multikanals pipette til mix af pipettering op og ned. Overfør 10 µL fra række A til række B. ændring tips mellem fortyndinger og bland godt. Gentag dette indtil du når den sidste række (H).
      3. Fjerner væv næringssubstratet (trin 4.2.3.1) ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter fra MDCK celler i 96-brønd plader og vaskes to gange med 100 µL/brønd af 1 x PBS.
      4. Overføre 50 µL/brønd af seriefremstillede fortyndet supernatanten af de homogeniserede prøver til 96-brønd pladen med MDCK celler. Begynde at overføre de højere fortyndinger (række H) til lavere koncentrationer (linje A). I dette tilfælde er det ikke nødvendigt at ændre tips mellem forskellige rækker.
      5. Sætte 96-brønd plader på en vuggende platform for 1 h i RT at tillade viral adsorption. Efter viral adsorption, Fjern inokulum ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter og tilsæt 100 µL/brønd efter infektionen medier. Inkuber inficerede celler for 8 h i en 33 ° C og 37 ° C kuvøse med 5% CO 2. Videre til fastsættelse, farvning, billedbehandling og viral titer beregning som beskrevet i trin 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Fjerne vævskultur medium fra 96-brønd plader ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter. Fix og permeabilize celler med 100 µL/brønd af fiksering/permeabilization løsning for 20 min på RT.
        Forsigtig: Brug fiksering/permeabilization løsning i et stinkskab for at forhindre formaldehyd eksponering.
      7. Fjern fiksering/permeabilization løsning ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter, vask med 1 x PBS, og Inkuber de faste celler med blokering løsning for 1 h på RT. Store celler i blokerende løsning ved 4 ° C eller gå videre til næste trin.
      8. Fjerner blokerende løsningen. Tilføje 50 µL/brønd af 1 µg/mL monoklonalt antistof (mAb) anti-NP HB-65 fortyndet i antistof fortynding løsning. Inkuber i 1 timer ved 37 ° C. forskellige mAb eller polyclonAl antistoffer (pAb) anti-PR8 kan bruges.
      9. i mellemtiden fortyndes 1:200 fluorescein isothiocyanat (FITC)-konjugeret sekundære anti-mus antistof i antistof fortynding løsning. Centrifugeres løsning på 1.700 x g for 5-10 min. ved RT. Andre sekundære antistoffer konjugeret med andre fluorophores kan bruges.
      10. Fjerne den primære antistof og vask 3 gange med 100 µL/brønd af 1 x PBS. Tilsæt 50 µL/brønd af sekundær antistof fortynding og der inkuberes i 30-45 min. ved 37 ° C. Fjern den sekundær antistof og vask 3 gange med 100 µL/brønd af 1 x PBS. Forlader den sidste vask i pladen.
      11. Iagttage cellerne under et fluorescens mikroskop til at bestemme antallet af positive farvede (grøn) celler. Beregne den virale titer ved at tælle FFU/mL. Beregne viral titer udtrykkes i FFU/mL fra fortyndingen med 30-50 positive farvede celler ved hjælp af formlen: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/fortynding.

5. Evaluering af humorale immunrespons ( figur 3)

  1. inficere i.n. 3 grupper af 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 hunmus (n = 5) med de forskellige doser (10 2, 10 3 og 10 4 FFU / mus) af PR8 LAIV, og mock-smitte en gruppe (n = 5) med 1 x steril PBS som en negativ kontrol. Udføre i.n mus infektioner som beskrevet i afsnit 3.
    1. Mus blødning af submandibulære punktering
      1. fjorten dage efter immunisering, indsamle mus blod submandibulære blødende via en 4 mm lancet 26, eller ved hjælp af en anden IACUC godkendt metode.
        1. Hold musen ved at samle det harmoniske af halsen mellem pegefinger og tommelfinger. Hold hale mod hånden med pinky finger til at immobilisere musen.
        2. Sætte musen i en lateral position at se kinden. Gøre en punktering på tidspunkt af retro-orbital og submandibulære vener med halsfedt. Synke lancet (4 mm) og genoprette blod i sterile rør (cirka 0,2 - 0,4 mL/mus er genoprettet). Lægge pres på punktering med et sterile serviet i et par sekunder. Placer musen tilbage ind i buret.
      2. Sætte rørene i 1-2 timer ved 37 ° C og derefter centrifugeres dem på 700 x g i 30 min på RT for at separere serum fra blod. Overføre det øverste lag, der består af serum med en pipette til en ny steril tube. Kassér pellet af røde blodlegemer (RBC). Gemme serum på -20 ° C.
  2. Analyse af samlede antistoffer mod virusproteiner
    1. forberedelse af inficerede MDCK celle uddrag
      1. dagen før infektionen, frø en 100-mm fad med 4-5 x 10 6 MDCK celler (at nå ~ 80-90 % sammenløbet næste dag) i vævskultur medier. Marker cellerne i et 37 ° C kuvøse med 5% CO 2. Dagen for virusinfektion, se celler under mikroskop til at bekræfte en éncellelag før du starter den virusinfektion.
      2. Laves en viral fortynding med en lav (0.001) mangfoldighed af infektion (MOI) af PR8 WT i infektion medier i 4 mL samlede endelige rumfang. Beregning af PR8 WT med formlen ((X MOI x n ° celler) x endelige rumfang) / lager viral titer.
      3. Opsug vævskultur medium fra MDCK celle plade og vaskes to gange med 4 mL 1 x PBS. Tilføj den virale inokulum (4 mL) og sætte pladen på en vuggende platform for 1 h i RT at tillade viral adsorption. Fjerne den virale inokulum med vakuum og tilføje 8-10 mL af efter infektionen medier indeholdende 1 µg/mL af TPCK-behandlet trypsin. Inkuber inficerede celler i 48-72 timer i en 33 ° C og 37 ° C kuvøse med 5% CO 2.
      4. Frigør celler ved hjælp af en celle skraber og indsamle de celler og væv dyrkningsmedium med en pipette i en 15 mL tube. Centrifugeres tube på 400 x g for 5-10 min. ved RT. aspirat supernatanten og celle resuspenderes i 1 mL af RIPA buffer og læg blandingen i en 1,5 mL sterilt tube. Der inkuberes i isbad i 20-30 min.
      5. Centrifugeres tube på 1.300 x g i 20-30 min. ved 4 ° C. omhyggeligt genoprette supernatanten. Butik cellen ekstrakt i 100 µL alikvoter ved -20 ° C.
      6. Titreres celle ekstrakter som beskrevet af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) før evaluere dem for tilstedeværelsen af antistoffer 9 , 10 , 11 , 27. Medtag celle ekstrakter fra mock-inficeret MDCK celler (forberedt som angivet ovenfor) som negativ kontrol.
    2. ELISA ( figur 4)
      1. frakke polystyren 96-brønd plader med den passende fortynding af inficeret MDCK celle ekstrakt i 1 x PBS (normalt mellem 1:200 - 1:1, 000). Coat en anden plade med den samme fortynding af mock-inficeret MDCK celle ekstrakt som en negativ kontrol. Der inkuberes natten over (O/N) på 4 ° C.
      2. Fjern supernatanten ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter og vaske en gang med 100 µL/brønd af 1 x PBS med en multikanal pipette. Blokere ikke-specifik binding ved at tilføje 100 µL/brønd for at blokere løsning for 1 h på RT.
      3. i mellemtiden gøre 2-fold serielle fortyndinger (begyndende fortynding 1:50) af sera fra hver mus inficeret i trin 5.1 i antistof fortynding løsning i en 96-brønd plade.
      4. Fjerner blokerende løsningen fra 96-brønd polystyren plader ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter. Tilsæt 50 µL af hver mus serumfortynding i den passende godt og Inkubér 1 h 37 ° C.
      5. Fjerne mus sera med en vakuum indsugningsventil-multikanal adapter. Brøndene vaskes 3 gange med destilleret vand ved hjælp af en multikanals pipette. Tilsæt 50 µL/brønd af et anti-mus sekundær antistof konjugeret med peberrod peberrodsperoxidase (HRP) fortyndet 1:2,000 i antistof fortynding løsning. Inkubér 1 h ved 37 ° C.
      6. Fjerne den sekundær antistof med en vakuum indsugningsventil-multikanal adapter. Brøndene vaskes 3 gange med destilleret vand ved hjælp af en multikanals pipette. Forberede substratopløsning tetramethylbenzidine (TMB) ved at blande 1:1 opløsning A og B. tilsættes 100 µL/brønd af substrat og Inkuber i 5-10 min. ved RT i mørke.
      7. Stoppe reaktionen ved at tilføje 100 µL/brønd af 0,2 N H 24. Læs plader ved 450 nm på en ELISA-Pladelæser.
      8. Trækker værdien opnået i hver fortynding af MDCK mock-inficerede 96-brønd plade fra værdien opnået i MDCK-smittede 96-brønd plade. Beregner de gennemsnitlige værdier for hver fortynding med de forskellige sera og repræsentere dem i en graf, der viser standardafvigelserne (SD).
  3. Analyse af neutraliserende antistoffer
    1. Hemagglutination hæmning (HAI) assay ( figur 5)
      1. før du udfører HAI assay, behandle mus sera med receptor ødelægge enzym (RDE) til at fjerne alle uspecifikke inhibitorer stede i serum. Tilføje 1 volumen af musen serum til 4 bind af RDE arbejdsfortynding (serumfortynding er nu 1:5). Inkuber O/N (12- 18 h) i et 37 ° C vandbad.
      2. Varme serumprøver ved 56 ° C i 30 min til at inaktivere RDE.
      3. Forud bestemme hemagglutination aktivitet (HAU) af PR8 WT ved standard HA assay 28. Når de virale HAU bestemmes, fortyndes viral bestanden til 8 HAU pr. 50 µL i 1 x PBS.
      4. Tilberedes 2-fold serielle fortyndinger (12 fortyndinger) af RDE-behandlede sera i V-bundplade med 96 brønde. Bruge én række for hver serumprøven (fx A1 til A12).
        1. Tilføje 25 µL 1 x PBS fra A1 til A12 brønde. Test hver af serumprøver i én række. Tilsæt 25 µL af RDE-behandlede sera (1:5) til 25 µL 1 x PBS i de første godt af kolonnen (A1). Den første serumfortynding er 1:10.
        2. Når alle RDE-behandlede sera er føjet til den første kolonne (fx A1, B1, C1), bruger en multikanals afpipetteres for at blande seraene og 1 x PBS af pipettering op og ned. Overføre 25 µL af de fortyndede sera fra den første kolonne til den anden kolonne (f.eks. fra A1 til A2). Ændre tips mellem fortyndinger og bland.
        3. Gentag trin 5.3.1.4.2. indtil nå den sidste kolonne (f.eks., A12, B12, C12). Kassér den 25 µL fra den sidste kolonne, holde volumen konsekvent i alle brønde (25 µL). Omfatter en række af brønde, der indeholder kun 25 µL 1 x PBS uden nogen sera som en negativ kontrol.
      5. Tilføje 25 µL af IAV fortyndet til 8 HAU/50 µL til hver af brøndene med sera i 96-brønd V-bundplade; den endelige mængden i hver er godt 50 µL, som indeholder 4 HAU af virus. Bland indholdet af gentagne pipettering. Inkuber i 1 time på RT.
      6. Tilsættes 50 µL af 0,5% Tyrkiet røde blodlegemer til hver af brøndene. Bland indholdet af gentagne pipettering. Inkuber plade i 30-45 min på is. Læs HAI assay visuelt, når de røde blodlegemer i kontrolhullerne (1 x PBS) danner et rødt bundfald (dvs., pellet) i bunden af brøndene.
        Bemærk: Røde blodlegemer fra andre arter såsom kylling, guinea gris eller hest kan også bruges.
      7. Beregne HAI titers ved at identificere de sidste godt, hvor de røde blodlegemer danner en rød pellet og hemagglutination forekommer ikke.
        Bemærk: Den gensidige værdien af denne fortynding er HAI titer. Den gensidige værdi ganges med en faktor 20 at korrigere for 1:20 fortynding af serum i første række.
    2. Virus microneutralization assay (VNA) ( figur 6)
      1. dagen før VNA, forberede MDCK celler i en 96-brønd plade at nå 80-90% sammenløbet næste dag, som beskrevet i trin 5.2.1.1. Forberede en fortynding af PR8 WT i infektion medier at have 200 FFU/25 µL.
      2. Deaktiver mus sera ved 56 ° C i 1 h. gøre 2-fold serielle fortyndinger (12 fortynding) pr. mus sera i tredobbelt ved hjælp af en 96-brønd plade.
        1. Tilføje 40 µL serum til 160 µL af infektion medier i de første godt for den første række, (fx A1) (serum fortynding 1:5). Mix af pipettering. Tilføj 100 µL af infektion medier andre brønde (A2 til H12).
        2. Overføres 100 µL fra første række til den anden række 1:2 fortyndinger (f.eks. fra A1 til A2). Ændre tips mellem fortyndinger og mix af pipettering. Gentag dette indtil den sidste række (fx A12). Kassér 100 µL fra den sidste række, holde volumen konsekvent i alle brønde (100 µL).
      3. Tilsættes 100 µL af IAV fortynding i alle pladens huller. Inkubér 1 h på RT. I mellemtiden fjerne vævskultur medium fra MDCK cellerne i 96-brønd plade ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter og vaskes to gange med 100 µL/brønd af 1 x PBS.
      4. i hver 96-brønd plade af MDCK celler, efterlader to rækker for kontrolelementerne. En række er den negative kontrol (celler uden virus og sera), og anden rækken er den positive kontrol af infektion (celler med virus i mangel af sera eller sera fra mock-inficerede mus).
      5. Overføre 50 µL/brønd fra virus-antistof plade til 96-brønd plader af MDCK celler. Sætte pladerne på en vuggende platform for 1 h i RT at tillade viral adsorption.
      6. Fjern virus-antistof inokulum ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter og tilsæt 100 µL/brønd af efter infektionen medier indeholdende 1 µg/mL af TPCK-behandlet trypsin.
      7. Inkuberes cellerne i ~ 3-4 dage i en 33 ° C og 37 ° C kuvøse med 5% CO 2 indtil cytopatisk effekt (CPE) er observeret i den positive kontrol (inficerede celler i mangel af sera eller med kontrolserummet).
      8. Fjern væv dyrkningsmediet ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter og tilsæt 100 µL/brønd af 0,1% krystalviolet. Inkuber i 1 time på RT. Fjern krystalviolet løsning ved hjælp af et vakuum indsugningsventil-multikanal adapter. Brøndene vaskes 3 gange med destilleret vand. Tørre plader på RT.
      9. Beregne i VNA titers ved at identificere den højeste fortynding, der bevarer en sammenflydende celle éncellelag af MDCK celler.
        Bemærk: Den gensidige værdien af denne tilsvarende fortynding er neutraliserende antistof titer. Den gensidige værdi ganges med en faktor på 10 for at rette op på 1:10 fortynding af sera i den første brønd i rækken.

6. Evaluering af beskyttelse effekten vacciner ( figur 3)

  1. vacciner i.n. en gruppe af 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 hunmus (n = 11) med PR8 LAIV dosis til test (FFU/mus) og mock-vaccinere en anden gruppe af mus (n = 11) med 1 x steril PBS. Udføre mus i.n. immuniseringer som tidligere beskrevet i afsnit 3.
  2. 14 dage efter vaccination, bløder mus og indsamle seraene, som beskrevet i afsnit 3. Analysere forekomsten af total og neutraliserende antistoffer mod PR8 WT som beskrevet i afsnit 5.1.1.
  3. 15 dage efter vaccination, måle og registrere mus kropsvægt (dag 0). Udfordre mus i.n. med en dødelig dosis af PR8 WT (homologe udfordring) som tidligere beskrevet i afsnit 3.
  4. Måling af kropsvægt og overlevelse (n = 5 / gruppe) i løbet af 14 dage efter udfordring at evaluere sygelighed og dødelighed produceret af PR8 WT udfordring i vaccinerede mus (afsnit 4.1).
  5. Genoprette mus lungerne og næseslimhinden (n = 3/dag) på dag 2 og dag 4 post udfordre med PR8 WT. homogenisere og analysere lungerne og næseslimhinden som beskrevet i afsnit 4.2 til vurderer viral replikation af PR8 WT i vaccinerede mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Karakterisering af viral patogenese i mus

Patogenesen af IAV er relateret til sygelighed og dødelighed forårsaget af sin infektion. Disse to parametre kan evalueres i mus let: IAV sygelighed er forbundet med kroppen vægttab i inficerede mus og procentdelen af overlevelse vil angive dødelighed (figur 1). Kropsvægt og overlevelse i IAV-inficerede mus er normalt overvåges dagligt i mindst to uger efter infektionen8,9,10,29. Overlevelsesdata indhentet kan bestemme MLD50 , der blev beregnet ved hjælp af metoden Reed og Muench25. En anden indikator for IAV patogenesen er relateret til viral replikation i lavere (lungerne) og i de øverste (næseslimhinden) luftveje (figur 1). De oplysninger, der er opnået med den virale titer i disse organer svarer til sygelighed og dødelighed værdier, og tilsammen give en god indikation af viral patogenese. Det er kendt at IAV replikering i mus lungerne peak mellem dage 2 og 4 efter infektionen (PI), og så anbefaler vi at inddrive disse organer på dage 2 og 4 p.i.

Figure 1
Figur 1: karakterisering af IAV patogenese i mus: IAV patogenese i mus er relateret til dens sygelighed (krop vægttab) og dødelighed (% overlevelse), og også til IAV evne til at formere sig i de øverste (næseslimhinden) og lavere (lungerne) luftveje. Kort, på dag 0 mus vejes og bedøvede intraperitoneal med 2,2,2-tribromoethanol (TBE), før de er smittet intranasalt med IAV. Fra dag 1 til dag 14 vejes mus dagligt for at evaluere krop vægttab (sygelighed) og % overlevelse (dødelighed) til at beregne den mus dødelige dosis 50 (MLD50). På dage 2 og dag 4 efter infektionen, er musene lungerne og næseslimhinden genvundet og homogeniseret for at evaluere viral replikation. Mus eksperimenter til at karakterisere IAV patogenesen ved hjælp af PR8 WT udføres BSL-2 betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I figur 2, er at oplysninger indhentet i evalueringen af PR8 WT patogenesen repræsenteret. Fire grupper af 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 mus (n = 11) blev inficeret i.n. med de angivne doser (10, 102, 103 og 104 FFU/mus) af PR8 WT. Kropsvægt og overlevelse af 5 mus pr. gruppe blev målt ved 14 dage p.i. (figur 2A-B). Alle mus immuniseret med 104 FFU af PR8 WT mistede vægt hurtigt (figur 2A) og alle af dem døde dage 5 og 6 p.i. (figur 2B). Mus immuniseret med 103 FFU af PR8 WT mistede vægt på senere tidspunkter p.i. (figur 2A), og de alle døde af dage 7 og 8 p.i. (figur 2B). Alle mus immuniseret med 102 FFU af PR8 WT mistet kropsvægt (figur 2A) men kun 2 af dem døde i dag 9 p.i. (figur 2B). Endelig, mus immuniseret med 10 FFU af PR8 WT tabe ikke vægt (figur 2A) og alle af dem overlevede infektion (figur 2B). MLD50 af PR8 WT i dette eksperiment, beregnet med Reed og Muench metode25 var 1,5 x 102 FFU (figur 2 c).

At evaluere PR8 replikering i øvre og lavere respiratorisk tarmkanalen af mus inficeret i.n. med de angivne doser (10, 102, 103og 104 FFU/mus), lungerne og næseslimhinden blev genoprettet på dage 2 og 4 p.i. (n = 3). Efter lungekræft homogenisering, blev mængden af virus til stede i dette organ analyseret ved immunfluorescens assay (figur 2D). Viral titer opdaget i lungerne af grupperne forskellige mus var beslægtet med den dosis, der er brugt til immun dem: højere viral titers blev opdaget i lungerne på mus immuniseret med 104 FFU af PR8 WT på dage 2 og 4 p.i., mens lavere viral titers blev opdaget i lungerne på mus immuniseret med 10 FFU af PR8 WT.

Figure 2
Figur 2: repræsentation af Data indhentet i evalueringen af Viral patogenese: At analysere sygelighed og dødelighed af PR8 WT, 6-til-8-uge-forhenværende kvindelig C57BL/6 mus (n = 5) blev inficeret i.n. med det angivne antal fluorescerende-dannende enheder (FFU) af PR8 WT og derefter overvåges dagligt i 2 uger for (A) kropsvægt tab (sygelighed) og (B) overlevelse (dødelighed). Data repræsenterer de midler og standardafvigelser af resultaterne fastlægges for individuelle mus (n = 5). (C) værdier af % overlevelse vurderet over 2 uger bruges til at beregne MLD50 ved hjælp af Reed og Muench metode25. (D) at evaluere viral replikation, 6-til-8-uge-forhenværende kvindelig C57BL/6 mus (n = 6) blev inficeret i.n. med det angivne antal FFU. Viral replikation i lungerne eller næseslimhinden af inficerede mus vurderes normalt på dage 2 og 4 p.i. ved hjælp af en immunofocus analyse. Viral titers registreres som FFU/mL. Data repræsenterer de midler og SDs af resultaterne i hvert mus. Stiplede linjer er medtaget for at angive detektionsgrænsen (200 FFU/mL) af analysen. Mus og vævskultur eksperimenter til at vurdere IAV sygelighed, dødelighed og viral titers bruger PR8 blev udført BSL-2 betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Evaluering af de humorale svar induceret efter vaccinationen

Humorale svar induceret mod IAV infektion spille en afgørende rolle i at kontrollere viral infektion. Derfor er det meget vigtigt at analysere de humorale svar fremkaldt af IAV WT infektioner eller nye IAV vacciner (figur 3). I musemodel, er 14 dage efter immunisering, mus blødte for at analysere tilstedeværelsen af antistoffer mod de samlede virale proteiner af ELISA (figur 4), og tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer rettet mod viral HA protein, som normalt er analyseret af fælles serologiske metoder, såsom en HAI assay (NG class = "xfig" > figur 5) og/eller en VNA (figur 6).

Figure 3
Figur 3: ordning af de forskellige trin i karakterisering af sikkerheden, immunogenicitet og beskyttelse virkningen af et LAIV: Når en ny LAIV er udviklet, er musemodel af IAV infektion normalt bruges til at teste sikkerhed, immunogenicitet og effektivitet. I denne ordning, forsøg at vurdere sikkerhed (A), er immunogenicitet (B) og en kandidat LAIV beskyttelse effektivitet, (C) angivet. (A) at evaluere sikkerheden af et LAIV er det nødvendigt at assay de samme parametre (sygelighed, dødelighed og viral replikation i øvre og nedre luftveje) beskrevet i figur 1. For at evaluere immunogenicitet, mus er immuniseret og 14 dage efter vaccination er de blødte af submandibulære punktering. Humorale svar der analyseres ved at vurdere tilstedeværelsen af samlede antistoffer mod IAV proteiner af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) og ved at vurdere forekomsten af neutraliserende antistoffer af hemagglutination hæmning assay (HAI) og virus microneutralization analyse (VNA). (C) at evaluere beskyttelse effektivitet, 15 dage efter vaccination, mus bliver udfordret med IAV WT. Protection effekten evalueres ved måling af mus sygelighed, dødelighed og viral titers i lunger angrebne mus som beskrevet i figur 1 . Mus eksperimenter til at karakterisere sikkerhed, immunogenicitet og effekten af et LAIV kandidat udføres BSL-2 betingelser. Andre BSL jakkesæt eller indeslutningsbetingelser kan være påkrævet afhængigt af IAV stamme bruges til udfordring af vaccinerede mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

At vurdere immunogenicitet af PR8 LAIV, tre grupper af 6-til-8-uge-forhenværende C57BL/6 mus (n = 5) blev immuniseret med forskellige doser (102, 103og 104 FFU/mus) af PR8 LAIV eller mock vaccineret med 1 x PBS som en negativ kontrol. Fjorten dage efter vaccination, blev mus sera indsamlet af submandibulære blødende26 (figur 3). Antistof reaktioner mod samlede virusproteiner blev evalueret af ELISA med anvendelse af en 1:200 fortynding af celle ekstrakt af PR8-inficeret MDCK celler (figur 4). Hvert serum blev analyseres individuelt. Resultaterne tyder på, at sera fra mus immuniseret med højere dosis (104 FFU) af PR8 LAIV havde højere antistof titers mod samlede PR8 proteiner end sera af mus immuniseret med den lavere dosis (102 FFU). Sera kontrol (mock-inficerede mus) viste ikke reaktivitet mod PR8 antigener.

Figure 4
Figur 4: skematisk fremstilling af enzym-forbundet Immunosorbent Assay (ELISA) at evaluere humorale antistof svar: Niveauer af PR8-specifikke antistoffer til stede i inficerede mus bestemmes af ELISA i 96-brønd polystyren plader overtrukket med celle ekstrakter fra mock (kontrol) eller PR8-inficeret MDCK celler. Kort, på 14 dage p.i. (figur 3), mus immuniseret med de anførte doser af PR8 LAIV var bled af submandibulære punktering og sera blev indsamlet. Hvert serum blev vurderet individuelt ved ELISA for IgG antistoffer mod samlede PR8 proteiner. Grafdata repræsenterer midlerne og standardafvigelser af resultaterne opnået fra individuelle mus sera (n = 6). Rooney, optisk tæthed. ELISA assays blev udført i en BSL-2 kabinet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at analysere forekomsten af neutraliserende antistoffer i musen serum ved hjælp af HAI assay, seriel 2-fold fortyndinger af sera (tidligere inaktiveres ved 56 ° C) i hver gruppe af mus immuniseret med forskellige doser (102, 103og 104 FFU) af PR8 LAIV blev inkuberet med 4 HAU af PR8 WT for 1 h i RT (figur 5). Derefter, 0,5% af Tyrkiet RBC blev føjet til PR8-sera blandinger. Den øverste del af figur 5 er en skematisk fremstilling af de mulige HAI resultater: når serum indeholder neutraliserende antistoffer, røde blodlegemer nedbør er observeret i bunden af brønden fordi antistoffer bundet til viral HA protein forhindre hemagglutination af de røde blodlegemer. På den anden side, i mangel af neutraliserende antistoffer, er hemagglutination af de røde blodlegemer observeret. Derefter, HAI titer beregnes som reciprokke af fortyndingen af serum i de sidste godt mangler hemagglutination. HAI resultaterne viste i den nederste del af figur 5 viser, at serum fra mus vaccineret med den største mængde af PR8 LAIV (104 FFU) har højere titer af neutraliserende antistoffer, mens serum fra en mus immuniseret med den lavere dosis (102 FFU) har den laveste titer af neutraliserende antistoffer mod PR8. Ingen neutraliserende antistoffer var til stede i serumkontrol (mock-inficerede mus).

Figure 5
Figur 5: Hemagglutination hæmning (HAI) Assay: Niveauer af neutraliserende antistoffer mod PR8 WT i inficerede mus kan evalueres let af HAI assay. 2-fold serielle fortyndinger (begyndende fortynding 1:10) af sera fra mus immuniseret med de anførte doser af PR8 LAIV var kortvarigt, blandet (1:1) med 4 HAU af PR8 WT for 1 h i RT i V-bundplade med 96 brønde. Efter 1 h inkubation, blev 0,5% RBC føjet til virus-serumblandingerne for 30-60 min på is. HAI titers bestemmes ved at identificere de sidste godt, hvor de røde blodlegemer danner en rød knap og hemagglutination forekommer ikke (øverst). HAI assays med PR8 WT blev udført i en BSL-2 kabinet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I figur 6, er oplysninger indhentet i evalueringen af neutraliserende antistoffer i mus sera af VNA repræsenteret. 200 FFU af PR8 WT blev blandet med seriel 2-fold fortyndinger af sera (tidligere inactivatEd ved 56 ° C) fra mus immuniseret med forskellige doser (102, 103og 104 FFU) af PR8 LAIV for 1 h på RT. Hver serumprøven blev vurderet i tre eksemplarer. Virus-sera blandinger blev brugt til at inficere encellelag af MDCK celler i en 96-brønd plade. Den øverste del af figur 6 er en skematisk fremstilling af de mulige VNA resultater: fravær af neutraliserende antistoffer i serum medfører CPE på ca 3-4 dage pi Derimod når neutraliserende antistoffer er til stede (intakt celle éncellelag), de binder sig til viral HA og forhindre viral infektion, og der er ingen CPE. Tilstedeværelsen af CPE er normalt visualiseres ved farvning inficerede celler med krystalviolet, og viral neutralisering titers beregnes som reciprokke af den sidste fortynding som infektion er helt blokeret. Resultaterne af VNA er repræsenteret i den nederste del af figur 6. Serum fra mus immuniseret med PR8 LAIV høj mængde (104 FFU) har den største titer af neutraliserende antistoffer mens sera fra mus immuniseret med en lavere dosis eller PR8 LAIV (102 FFU) har den laveste titer af neutraliserende antistoffer, ligner resultaterne med HAI assay. Ingen neutraliserende antistoffer var til stede i serum fra mock-inficerede mus.

Figure 6
Figur 6: Virus Microneutralization Assay (VNA): Et alternativ til HAI assay, VNA assay kan vurdere tilstedeværelsen af PR8 WT neutraliserende antistoffer. Kort, sera fra mus vaccineret med de anførte doser af PR8 LAIV var seriefremstillede 2-fold fortyndet (starten fortynding 1:5) i 96-brønd plader og blandes 1:1 med 200 FFU af PR8 WT i 1 time på RT. Efter 1 time, blev virus-serumblandingerne brugt til at inficere 96-brønd plader af MDCK celler. Inficerede celler blev udruget i 3-4 dage indtil komplet cytopatisk effekt. 96-brønd plader blev derefter farves med 0,1% krystalviolet. VNA titers bestemmes ved at identificere den stoerste fortynding til at bevare en sammenflydende celle éncellelag. VNA med PR8 WT blev udført BSL-2 betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Evaluering af beskyttelse effekten af IAV vacciner i mus

Når en ny LAIV er udviklet, dens sikkerhed, immunogenicitet og effektivitet skal være testet i vivo, og musen model er normalt den første dyremodel valgt at analysere disse parametre. Figur 3 er en ordning af de forskellige nødvendige skridt for at karakterisere en ny LAIV i mus. For at vurdere sikkerheden af et LAIV (figur 3A), musene er inficeret i.n. ved hjælp af en lignende protokol til de eksperimentelle procedurer beskrevet i afsnittet patogenese (afsnit 4), og kropsvægt og overlevelse overvågning vil give informationer relateret til sygelighed og dødelighed af LAIV (tal 2A-2B), herunder MLD50. Derudover efter podning med forskellige vaccinedoser, replikering af LAIV i lavere (lungerne) og i de øverste (næseslimhinden) luftveje bør være vurderet8,9,10, 11,29 (figur 2D). For at teste immunogenicitet, er sera fra mus vaccineret med LAIV indsamlet før udfordring med PR8 WT (homologe udfordring), ved hjælp af lignende protokoller til disse beskrevet i afsnittet immunogenicitet (afsnit 5) (figur 3B). Tilstedeværelsen af total og neutraliserende antistoffer i seraene kan påvises ved ELISA og HAI og/eller VNA, henholdsvis.

Endelig, for at teste beskyttelse effektivitet, LAIV-vaccinerede mus bliver udfordret med PR8 WT og beskyttelse effekten er karakteriseret ved overvågning af sygelighed, dødelighed og tilstedeværelsen af udfordring PR8 WT i lungerne, som tidligere beskrevet i afsnit 4 ( Figur 3 c)8,9,10,11. Hvis LAIV inducerer beskyttelse mod PR8 WT udfordring, mus vil ikke miste kropsvægt, og de vil overleve den dødbringende udfordring med IAV WT. Derudover IAV WT viral titers i lungerne vil ikke blive opdaget, eller vil blive væsentligt reduceret i forhold til mock (PBS) vaccineret mus8,9,10,11.

Vævskultur medier og løsninger Sammensætning Opbevaring Brug Kommentarer
Vævskultur medier: Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM), 10% føtal bovin Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG) 445 ml DMEM, 50 ml FBS og 5 ml af 100 x 1% Penicillin (100 enheder/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) - L - glutamin (2 mM) (PSG) Opbevares ved 4° C Dette medie bruges til vedligeholdelse af Madin-Darby Canine nyre (MDCK) epitelceller
Efter infektionen medier: DMEM 0,3% kvæg Albumin (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG) 491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA og 5 ml af 100 x PSG Opbevares ved 4° C Dette medie bruges til vedligeholdelse af MDCK celler efter infektion med Influenza A virus (IAV)
10 x fosfatbufferet saltopløsning (10 x PBS) 80 g af NaCl, 2 g af KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. Tilføje ddH2O op til 1 L. Juster pH til 7,3 Opbevares ved stuetemperatur (RT) Sterilisere af autoklave
1 x PBS Fortynde 10 x PBS 1:10 med ddH2O Butik på RT Sterilisere af autoklave
Infektion medier: 1 x PBS, 0,3% BA, 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1 x PBS sterile, 4,2 ml 35% BA og 5 ml af 100 x 1% Penicillin (100 enheder/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) (PS) Opbevares ved 4 ° C Dette medie bruges til IAV infektioner
Fiksering/permeabilization: 4% formaldehyd, 0,5% triton X-100 fortyndingen i 1 x PBS 400 mL Neutral Buffered Formalin 10%, 5 ml Triton X-100 og 595 ml PBS, 1 x
d > butik på RT Denne løsning bruges til at lave og permeabilize MDCK celler i viral titrering eksperimenter Forberede løsning i et stinkskab at forhindre eksponering for formaldehyd Blokering løsning: 2,5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS 2,5 g af BSA i 97.5 mL PBS, 1 x Opbevares ved 4 ° C Denne løsning bruges som en blokerende løsning for immunofluorescens assays og ringprøver. Sterilisere ved filtrering med 0,2 µm filter. Antistof fortynding løsning (1% BSA i 1 x PBS) 1 g af BSA i 99 mL PBS, 1 x Opbevares ved 4 ° C Denne løsning bruges til fortynding af primære og sekundære antistoffer i immunofluorescens assays og ringprøver Sterilisere ved filtrering med 0,2 µm filter 0,1% krystalviolet-opløsning 1 g af krystalviolet i 400 ml methanol. Tilføje 600 ml af Hedeselskabet2O Butik på RT Denne løsning bruges til at lave og pletten MDCK celler i viral neutralisering assays Tosylsulfonyl phenylalanyl chlormethyl keton (TPCK)-behandlet trypsin Forberede en 1.000 x stamopløsning på 1 mg/ml i ddH2O Opbevares ved-20 ° C TPCK-trypsin er tilføjet i IAV infektioner Gøre 100 µl delprøver RIPA buffer 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natrium deoxycholate, 0,1% SDS, 140 mM NaCl Opbevares ved 4 ° C Denne løsning bruges til at gøre celle ekstrakter

Tabel 1: vævskultur medier og løsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musemodel af IAV er almindeligt brugt til i vivo studier af IAV patogenese, immunogenicitet og beskyttelse effektivitet. Den lille størrelse af mus gør dem nemme at manipulere og gemme i forhold til andre dyremodeller såsom fritter eller marsvin. Derudover lethed i form af dyr koster, boliger og reproduktion tillader deres brug i prækliniske vaccination tests hvor stort antal dyr, der er brug for. Især da mus har været brugt i flere forskning discipliner, adskillige molekylære og Immunologi murine reagenser er til rådighed for at lette anvendelsen for IAV undersøgelser. Derudover minimal vært variabilitet og tilstedeværelsen af et immunsystem, der er evolutionært svarer til stede i mennesker gøre dem en robust lille dyremodel for IAV undersøgelser. Endelig, undersøgelse af vært-viral protein interaktioner og deres bidrag til viral patogenese er i øjeblikket muligt ved adgang til KO mus. Men ved siden af de flere fordele ved at bruge mus for IAV undersøgelser, de er ikke nyttigt for IAV transmission studier. Derfor, fritter eller marsvin er mere egnet dyremodeller for at studere IAV transmission. Kliniske symptomer i mus inficeret med IAV normalt vises 2-3 dage efter infektionen, selvom dette kan variere afhængigt af den mus alder, immunstatus, sex, genetiske baggrund og stamme; viral belastning og dosis anvendes. Symptomer omfatter anoreksi, sløvhed, huddling, pjusket pels, tab af kroppens vægt og død16,17.

I dette manuskript beskriver vi, hvordan du vurderer viral patogenese i mus inficeret i.n. med IAV på overvågning krop vægttab (sygelighed), procentdel af overlevelse (dødelighed) og ved at vurdere viral replikation i øvre (næseslimhinden) og lavere (lungerne) luftveje (figur 1 og figur 2). Patogenesen af IAV er en meget vigtig parameter i forbindelse med nye IAV stammer, men også i en sikker gennemførelse af LAIV vaccine kandidater (figur 3). Årstidens IAVs og IAVs, der inficerer andre pattedyr (som heste, hunde eller svin) producerer normalt ikke tegn på sygdom i mus11,27. I dette tilfælde er analyse af viral titers i lungerne eller næseslimhinden af inficerede mus det vigtigste parameter at vurdere viral patogenese af IAV stammer. Når lungerne og næseslimhinden er indsamlet, de er homogeniseret og mængden af virus til stede i disse organer kan analyseres af plaque assay, immunofluorescens assay, væv kultur infektiøse dosis 50 (TCID50) eller en anden godkendt metode8 ,29. Vi anbefaler, vurderingen af viral titers ved hjælp af indirekte immunfluorescens siden plaque analysen kræver et højere antal MDCK celler (6-godt plade format), og ligesom TCID50, mere tid (3-4 dage) er forpligtet til at beregne viral titers. For at udføre indirekte immunfluorescens assay, er det imidlertid nødvendigt at have: 1) primære specifikke antistoffer mod en IAV protein (det anbefales at bruge et antistof mod IAV nucleoprotein, NP, da det er den mest rigelige viral protein produceret under virusinfektion); 2) sekundær antistoffer konjugeret med et fluorophore; og 3) et fluorescens mikroskop til at tælle fluorescerende positive inficerede celler.

Da immunsystemet hos mus er evolutionært svarende til immunsystemet hos mennesker16 og fordi mus kan fremkalde en stærk og beskyttende humorale respons mod IAV infektion, immunogenicitet af IAVs (eller vaccine kandidater) kan være let evalueret ved at bestemme alt (ELISA; Figur 4) og neutralisere (HAI, figur 5) eller VNA (tal 6) antistof reaktioner. For at analysere de humorale svar efter immunisering, kan mus afblødes ved forskellige godkendte metoder som retro-orbital punktering, hale klippet, saphenous vene punktering eller submandibulære punktering. Vi valgte submandibulære punktering teknik26 , fordi proceduren ikke kræver brug af anæstesi og giver mulighed for at opnå en acceptabel mængde blod for immunologiske undersøgelser; i modsætning til retro-orbital punktering er hvor mus bør være bedøvede, og med halen klip eller saphenous vene punktering, hvor blodvolumen inddrives normalt lav.

I dette manuskript beskrev vi, hvordan man vurdere tilstedeværelsen af antistoffer mod samlede virale proteiner af ELISA med anvendelse af virus inficerede celle ekstrakter. Da IAV infektion fremkalder en beskyttende immunitet, som hovedsagelig, medieret af antistoffer mod det virale HA (vigtigste antigen viral målet), anbefales det at vurdere mængden af specifikke antistoffer fremkaldt mod HA af ELISA ved hjælp af rekombinante oprenset HA proteiner10. For at analysere forekomsten af neutraliserende antistoffer, både HAI og VNA metoder accepteres, men begge har fordele og ulemper. HAI er hurtig (2-3 h) og godkendes af Center for sygdom og Control (CDC) at vurdere tilstedeværelsen af IAV neutraliserende antistoffer30. VNA er mere tidskrævende (3-4 dage) men er mere specifikke, da det evalueres kun antistoffer, der kan neutralisere viral infektion. Især, har VNA vist sig at opdage stilk-reaktiv HA neutraliserende antistoffer31, samt NA neutraliserende antistoffer32. En anden fordel ved VNA er assay følsomhed, siden mindre IAV (200 FFU) er nødvendig i forhold til HAU analysen, der kræver ca ~ 104-105 FFU. Derudover kan HAI analysen være problematisk for påvisning af neutraliserende antistoffer mod aviær IAVs på grund af vanskeligheder med at fortolke resultater33,34,35. Derudover kræver VNA ikke brug af røde blodlegemer til identifikation af influenza neutraliserende antistoffer.

Endelig vil vi beskrive de eksperimentelle procedurer for at evaluere de tre vigtigste aspekter, der skal overvejes i udvikle nye IAV vacciner (figur 3): 1) sikkerhed: vaccinen skal være sikker og ikke producere sygdom; 2) immunogenicitet: vaccinen skal være immunogen og fremkalde både humorale og cellulære beskyttende svar; 3) beskyttelse effektivitet: vaccinen skal fremkalde beskyttelse mod udfordring med WT homologe og/eller heterolog vira. Musen model er et godt valg for den første screening af en ny IAV vaccine i vivo , fordi det kan vurdere forskelligartet vaccination ordninger og betingelser, herunder anvendelse af forskellige adjuvanser, antigen/vaccine dosis, administration og bred beskyttelse mod udfordring med homolog eller heterolog IAVs stammer16,17. Dog, før du fortsætter til humane kliniske forsøg, vaccine kandidater som minimum afprøves i en anden model, i vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forskning på influenzavirus i LM-S laboratorium er delvist finansieret af The New York Influenza Center of Excellence (NYICE), et medlem af NIAID Centers of Excellence for Influenza forskning og overvågning (CEIRS). Vi takker Wendy Bates for hendes støtte i korrektioner af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23, (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430, (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18, (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9, (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356, (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89, (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88, (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90, (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500, (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252, (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83, (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199, (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3, (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2, (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85, (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22, (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4, (3), e4857 (2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9, (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76, (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37, (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70, (3), 391-398 (2003).
Influenza A Virus undersøgelser i en musemodel af infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter