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Immunology and Infection

इंफ्लूएंजा संक्रमण के एक माउस मॉडल में एक वायरस अध्ययन

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/55898
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Summary

इंफ्लूएंजा एक वायरस (IAVs) महत्वपूर्ण मानव श्वसन रोगजनकों हैं । IAVs के pathogenicity को समझने के लिए और उपंयास वैक्सीन दृष्टिकोण के नैदानिक परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए, मानव शरीर क्रिया विज्ञान नकल उतार पशु मॉडल की आवश्यकता है । यहां, हम तकनीकों का वर्णन करने के लिए IAV रोगजनन, विनोदी प्रतिक्रियाओं और टीके का मूल्यांकन प्रभावकारिता संक्रमण के एक माउस मॉडल का उपयोग कर ।

Abstract

इंफ्लूएंजा वायरस ५००,००० से अधिक की मृत्यु के कारण दुनिया भर में1 और संयुक्त राज्य अमेरिका अकेले में 12-14 अरब अमरीकी डालर की वार्षिक लागत के साथ जुड़े प्रत्यक्ष चिकित्सा और अस्पताल में भर्ती खर्च और कामअनुपस्थिति2 पर विचार कर रहे हैं । पशु मॉडल इंफ्लूएंजा में महत्वपूर्ण है एक वायरस (IAV) के अध्ययन के लिए वायरल रोगजनन, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन, और वर्तमान और/या उपंयास टीका दृष्टिकोण के रूप में अच्छी तरह से antivirals की प्रभावकारिता । चूहों एक लाभप्रद छोटे जानवर मॉडल है क्योंकि उनकी प्रतिरक्षा प्रणाली है कि मानव में पाया के समान evolutionarily है, वे आनुवंशिक रूप से समान विषयों के रूप में वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं, कई उपभेदों कि मूल्यांकन करने के लिए शोषण किया जा सकता है संक्रमण के आनुवंशिक आधार है, और वे अपेक्षाकृत सस्ती और हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं । वायुमार्ग के माध्यम से मनुष्यों में IAV संक्रमण को दोहराऊंगा करने के लिए, चूहों को पहले anesthetized intranasal टीका के साथ संक्रामक IAVs के तहत कर रहे हैं । संक्रमण के बाद, IAVs की रोगजनन दैनिक रुग्णता (शरीर के वजन में कमी) और मृत्यु दर (अस्तित्व) की निगरानी द्वारा निर्धारित किया जाता है । इसके अलावा, वायरल रोगजनन भी ऊपरी (नाक म्यूकोसा) या कम (फेफड़ों) संक्रमित चूहों के श्वसन तंत्र में वायरस प्रतिकृति का आकलन करके मूल्यांकन किया जा सकता है । IAV संक्रमण पर हास्य प्रतिक्रियाओं तेजी से गैर इनवेसिव रक्तस्राव और माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने परख कुल या बेअसर एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के उद्देश्य से मूल्यांकन किया जा सकता है । यहां, हम IAV और मूल्यांकन रोगजनन, विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और संरक्षण प्रभावकारिता के साथ चूहों intranasally (i. n) संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया आम तरीकों का वर्णन ।

Introduction

IAVs Orthomyxoviridae परिवार3में वर्गीकृत वायरस को ढंक रहे हैं । वे नकारात्मक ध्रुवीकरण3के साथ आठ एकल फंसे आरएनए अणु होते हैं । मनुष्य में, IAVs मौसमी महामारी और महत्वपूर्ण परिणाम की सामयिक महामारियां जब उपंयास वायरस मानव जनसंख्या4में शुरू कर रहे है कारण । इसके अलावा, मौसमी IAVs उच्च और तेजी से एक ऊंचा आर्थिक नुकसान दुनिया भर में हर साल2,5उत्पादन मानव के बीच संचारित कर रहे हैं । IAV लक्षण खांसी, नाक की भीड़, बुखार, अस्वस्थता, सिर दर्द, आहार और मांसलता शामिल हैं, लेकिन वायरस भी प्रतिरक्षा रोगियों में एक और अधिक गंभीर बीमारी का उत्पादन कर सकते हैं6. वास्तव में, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) की गणना करता है कि मौसमी इंफ्लूएंजा वायरस के कारण ३००,०००-५००,००० मौतों दुनिया भर में हर साल1। वहां केवल दवाओं के दो वर्गों वर्तमान में इंफ्लूएंजा प्रोफिलैक्सिस और मानव में उपचार के लिए खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं: neuraminidase (एनए) अवरोधकों (जैसे, oseltamivir) और M2 आयन चैनल के ब्लॉकर्स (जैसे, amantadine); हालांकि, दवा प्रतिरोधी वायरस वेरिएंट के उद्भव एक बढ़ती चिंता का विषय है । टीकाकरण, इसलिए, IAVs संक्रमण के खिलाफ मनुष्यों की रक्षा के लिए सबसे अच्छा चिकित्सा विकल्प रहता है । तारीख करने के लिए, इंफ्लूएंजा मानव उपयोग के लिए एफडीए द्वारा लाइसेंस टीके के तीन प्रकार उपलब्ध हैं: संयोजक वायरल hemagglutinin (हा) प्रोटीन टीके, निष्क्रिय इंफ्लूएंजा टीके (IIV), और रहते है क्षीणन इंफ्लूएंजा टीके (LAIV)5, 7. तीन टीके वायरल हा प्रोटीन, IAVs के खिलाफ एंटीबॉडी बेअसर का प्रमुख लक्ष्य के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए तैयार कर रहे हैं ।

एक मांय माउस मॉडल vivo में IAV संक्रमण का अध्ययन करने के लिए

पशु मॉडल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, दूसरों के बीच में, IAV रोगजनन8,9,10,11, वायरल कारक है कि रोग में योगदान12 और/या वायरल संचरण13 ,14, और नए टीकों या एंटीवायरल दवाओं9,10,15की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए । चूहों (मस musculus) कई कारणों के लिए IAV अनुसंधान के लिए सबसे बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया पशु मॉडल हैं: 1) प्रतिरक्षा प्रणाली evolutionarily है कि मानव में मौजूद के समान है; 2) कम लागत, पशु खरीद, आवास और प्रजनन सहित; 3) आसानी से हेरफेर और स्टोर करने के लिए छोटे आकार; 4) सजातीय प्रतिक्रियाओं और परिणामों को प्राप्त करने के लिए ंयूनतम मेजबान परिवर्तनशीलता; 5) चूहों जीव विज्ञान का एक बड़ा ज्ञान, जीनोम अनुक्रम सहित; 6) कई उपलब्ध आणविक जीवविज्ञान और/या इम्यूनोलॉजी रिएजेंट; 7) उपलब्ध दस्तक (KO) चूहों वायरल संक्रमण पर एक दिया मेजबान प्रोटीन के योगदान का अध्ययन करने के लिए; और, 8) एकाधिक माउस उपभेदों कि संक्रमण के आनुवंशिक आधार का मूल्यांकन करने के लिए शोषण किया जा सकता है ।

वहां कई माउस उपभेदों वर्तमान में vivo मेंIAV अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं । उंर, प्रतिरक्षा स्थिति, लिंग, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और माउस तनाव के साथ ही संक्रमण, खुराक और वायरल उपभेदों के मार्गों सभी चूहों में IAV संक्रमण के परिणाम को प्रभावित करते हैं । सबसे आम माउस IAV अनुसंधान में इस्तेमाल किया उपभेदों है C57BL/6, बालब/सी और, हाल ही में, DBA .2 चूहों के बाद से वे अधिक दो पूर्व उपभेदों की तुलना में IAV रोग के लिए अतिसंवेदनशील हैं,17,18, 19 , 20. महत्वपूर्ण बात, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया भी माउस तनाव18,19,20के आधार पर अलग हो सकता है । इस प्रकार, यह प्रयोग के लिए सबसे अच्छा विकल्प का चयन करने के लिए माउस और IAV तनाव के बारे में सभी उपलब्ध जानकारी को पुनर्प्राप्त करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है आयोजित किया जाना है ।

हालांकि माउस IAV के साथ vivo अध्ययन में के लिए संक्रमण का एक अच्छा पशु मॉडल है, वे कई सीमाएं हैं, जो प्रयोगात्मक डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, vivo में अध्ययन के लिए चूहों का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा है कि IAVs चूहों के बीच संचारित नहीं है. इस प्रकार, पारेषण अध्ययन के लिए, और अधिक स्वीकार किए जाते है पशु मॉडल (जैसे, ferrets या गिनी सूअरों)16,17,21इस्तेमाल कर रहे हैं । इसके अलावा, चूहों और मनुष्यों में IAV की अभिव्यक्तियों के बीच कई मतभेद हैं । मनुष्यों के विपरीत, चूहों IAV संक्रमण पर बुखार का विकास नहीं है; इसके विपरीत वे हाइपोथर्मिया१६,१७के साथ उपस्थितहुए. चूहों में, IAV प्रतिकृति ऊपरी वायुमार्ग के बजाय निचले श्वसन तंत्र (फेफड़ों) में केंद्रित है. इस प्रकार, चूहों में IAV के डाह हमेशा मानव में देखा है कि करने के लिए संबंधित नहीं है. कुल मिलाकर, क्योंकि लाभ सीमित नुकसान पल्ला झुकना, माउस पहले पशु को इंफ्लूएंजा वायरल रोगजनन, immunogenicity और वैक्सीन और एंटीवायरल अध्ययन में सुरक्षात्मक प्रभावकारिता का मूल्यांकन किया मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा, यह नैतिक रूप से IAV संक्रमण का एक छोटा सा जानवर मॉडल में पिछले सबूत के बिना बड़े पशु मॉडल का उपयोग IAV के साथ अध्ययन आचरण स्वीकार्य नहीं होगा । इस पांडुलिपि में, हम कैसे IAV के साथ चूहों intranasally (i.n.) संक्रमित करने के लिए का वर्णन, कैसे गंभीरता और वायरल संक्रमण की प्रगति की निगरानी करने के लिए और कैसे बाहर विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और संरक्षण प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक प्रयोगों को ले जाने के लिए.

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Protocol

< p class = "jove_content" > यहां वर्णित सभी पशु प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और चिकित्सा और दंत चिकित्सा के रोचेस्टर स्कूल के विश्वविद्यालय में संस्थागत सुरक्षा समिति (IBC) द्वारा अनुमोदित किया गया है, और अनुपालन राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद 22 के प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका में सिफारिशों के साथ । सुविधाओं और Vivarium और चिकित्सा और दंत चिकित्सा के स्कूल की प्रयोगशाला पशु चिकित्सा के विभाजन के कार्यक्रमों AAALAC इंटरनेशनल द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे है और राज्य के कानून, संघीय क़ानून और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) नीति का पालन । इस पांडुलिपि में वर्णित पशु प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए प्रत्येक संस्था में समान आवश्यकताएं लागू की जानी चाहिए ।

< p class = "jove_title" > 1. छोटे हड्डीवाला जानवरों का प्रयोग

< p class = "jove_content" > नोट: चूहों के साथ काम करने के लिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) की आवश्यकता है । न्यूनतम आवश्यकताओं डिस्पोजेबल coveralls, जूता कवर, सिर बोनट, मुखौटा, और दस्ताने शामिल हैं ।

  1. IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार, पिंजरे के प्रति अधिकतम 5 चूहों को रखें । IACUC प्रोटोकॉल के बाद, euthanize चूहों इच्छामृत्यु के दो तरीकों के साथ (दूसरा एक भौतिक विधि होना चाहिए) सुनिश्चित करें कि पशु मर चुका है ।
    नोट: प्रयोगों में जो IAV रुग्णता और मृत्यु दर का मूल्यांकन कर रहे हैं, चूहों कि उनके प्रारंभिक शरीर के वजन के 20% खो प्रायोगिक समापन बिंदु पर पहुंच गए थे माना जाता है, और सह 2 के साथ euthanized थे, और गर्भाशय ग्रीवा के रूप में विस्थापन भौतिक द्वितीयक पद्धति । शरीर के वजन का यह प्रतिशत अन्य संस्थानों में अलग हो सकता है । प्रक्रियाओं में जहां चूहों फेफड़ों और नाक म्यूकोसा IAV संक्रमण के बाद एकत्र कर रहे हैं, चूहों के एक घातक खुराक के साथ euthanized हैं 2, 2, 2-tribromoethanol (TBE), और द्वारा भौतिक माध्यमिक विधि के रूप में यकृत नस काटने. महिला 6-to-8-सप्ताहीय C57BL/6 चूहों खरीदे गए थे और विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत चिकित्सा और दंत चिकित्सा के विश्वविद्यालय रोचेस्टर स्कूल में पशु देखभाल की सुविधा में बनाए रखा.
< p class = "jove_title" > 2. ' jove_content ' > नोट:-सुरक्षा

< p class = "इस रिपोर्ट में, चूहों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया IAVs आम माउस-इंफ्लूएंजा की प्रयोगशाला तनाव अनुकूलित कर रहे है/8/34 H1N1 (PR8 WT) < सुप वर्ग =" xref "> 22 , < सुप वर्ग =" xref "> 23 आणि एक तापमान संवेदनशील LAIV वेरियंट, PR8 LAIV < सुप क्लास = "xref" > 8 . IAV संक्रमण ( इन विट्रो या में vivo ), सेल संस्कृतियों, और जैविक नमूनों में शामिल सभी कार्यविधियों को निष्पादित करें, जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) के तहत एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में-2 शर्तें. अगर अत्यधिक विषमय IAV उपभेदों उपयोग किया जाता है अन्य बीएसएल सूट या रोकथाम की स्थिति का उपयोग.

  1. इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को पूरा करने से पहले और बाद में क्लोरीन डाइऑक्साइड से युक्त सुरक्षा कैबिनेट को साफ करें । सभी विच्छेदन सामग्री (कैंची, स्केलपेल और विदारक संदंश) और Dounce homogenizer से पहले और उनके प्रयोग के बाद उचित IBC सिफारिशों के बाद निष्फल । उचित IBC और IACUC दिशानिर्देशों के अंतर्गत प्रक्रियाओं के दौरान उत्पादित सभी सामग्री को छोड़ें.
< p class = "jove_title" > 3. Intranasal संक्रमण

  1. जगह महिला 6 करने के लिए 8 सप्ताह पुरानी C57BL/6 चूहों के तहत विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों । संगठित और वायरस और खुराक इस्तेमाल के साथ माउस पिंजरों लेबल । एक कान पंच कोड का उपयोग कर या पूंछ की पेंटिंग के रूप में एक और अनुमोदित विधि के साथ प्रत्येक पिंजरे में चूहों की पहचान करें । पिंजरे प्रति 5 चूहों की एक अधिकतम प्लेस ।
  2. 30 & #181 की कुल मात्रा में रोकनेवाला शर्तों के तहत IAV (फ्लोरोसेंट बनाने इकाइयों (FFU)/mouse) के कमजोर पड़ने की तैयारी; L/माउस बाँझ 1x फास्फेट में बफर खारा (पंजाब). बर्फ पर वायरस इनोक्युलम बनाए रखें । सूत्र के साथ वायरल कमजोर पड़ने में जोड़ने के लिए IAV की राशि की गणना: (((x FFU प्रति माउस/30 & #181; L) x अंतिम मात्रा)/स्टॉक viral titer.
  3. एक पैमाने के साथ चूहों तौलना और प्रत्येक माउस का वजन रिकॉर्ड (0 दिन). माउस को तर्जनी उंगली और अंगूठे के बीच गर्दन के कूड़ा से उठा कर एक पृष्ठीय स्थिति में रखें । गुलाबी रंग की उंगली से हाथ के खिलाफ पूंछ पकड़ो ।
  4. Anesthetize माउस intraperitoneally (आईएफसआई) के साथ २४०-२५० मिलीग्राम/TBE के पेट के दाहिनी ओर के caudal 2/3 में सुई डालने से. सुई वापस लेने से पहले संक्षेप में रोकें । पिंजरे में माउस लौटें और 5 min.
    5. प्रतीक्षा करें
  5. लागू बाँझ आंखें सूखापन को रोकने के लिए नेत्र मरहम जबकि माउस anesthetized है । माउस पेडल वापसी पलटा ( यानी , पैर की अंगुली चुटकी) की कमी से anesthetized है, तो जाँच करें । यदि चूहे पूरी तरह नहीं anesthetized वे वायरस को खांसी होगा ।
  6. जब माउस पूरी तरह anesthetized है, माउस पृष्ठीय recumbency में जगह है । प्लास्टिक टिप डाल 30 & #181; नाक में वायरस इनोक्युलम के एल और धीरे से, लेकिन लगातार हल निकालने । सुनिश्चित करें कि माउस इनोक्युलम छोड़ गायब देख द्वारा तैयारी श्वास है ।
  7. जांच करें कि माउस TBE के रूप में सांस ले रहा है तापमान और श्वास दर दबाना कर सकते हैं । पिंजरे में यह पृष्ठीय recumbency में रखने के लिए पशु लौटें । श्वसन संकट के किसी भी लक्षण के लिए चूहों की निगरानी और अगर मनाया, जानवर खड़ी पकड़ से सांस लेने के लिए माउस मदद और प्रेरित प्रभाव प्रेरित श्वसन < सुप वर्ग = "xref" > २४ . माउस की निगरानी जब तक यह चेतना (30-45 मिनट के बाद यह anesthetized था) ।
< p class = "jove_title" > 4. वायरल रोगजनन का लक्षण वर्णन (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ )

  1. रुग्णता और मृत्युदर का मूल्यांकन (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 र < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ )
    1. संक्रमित i.n. 3-4 समूह की महिला 6-to-8-सप्ताहीय C57BL/6 चूहों (प्रति समूह कम से कम 5 चूहों, n = 5) के साथ 10 गुना खुराक (10, 10 2 , 10 3 और 10 4 FFU/माउस) की PR8 WT के रूप में वर्णित धारा 3.
    2. मॉनिटर और भोजन घूस के कारण वजन विविधताओं को कम करने के लिए लगभग एक ही समय में अगले 14 दिनों में एक पैमाने के साथ चूहों का वजन. Euthanize चूहों कि धारा 1 में वर्णित के रूप में अपने प्रारंभिक शरीर के वजन के 20% खो देते हैं ।
    3. 14 दिनों के बाद, euthanize खंड 1 में वर्णित के रूप में वायरल संक्रमण जीवित है कि चूहों को.
    4. वायरल ५०% माउस की गणना घातक खुराक (ढाली ५० ) जीवन रक्षा डेटा के आधार पर रीड और Muench की विधि का उपयोग कर प्राप्त < सुप वर्ग = "xref" > २५ . सबसे पहले, अनुपात दूरी (पीडी) की गणना:
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55898/55898eq0.jpg"/>
      1. अगला, ढाली ५० निम्नलिखित सूत्र द्वारा परिकलित करें:
        < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55898/55898eq2.jpg"/>
  2. फेफड़ों और नाक के श्लेष्म में वायरल titers का मूल्यांकन (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ र < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ )
    1. फेफड़ों और नाक के श्लेष्म की वसूली
      1. संक्रमित i.n. मादा 6-से-8 सप्ताहीय C57BL/6 चूहों (एन = 6) वायरल खुराक के साथ परीक्षण करने के लिए 10-10 के 4 FFU के रूप में वर्णित PR8 WT की धारा 3.
      2. 2 (n = 3) और 4 (n = 3) पर दिन में माउस फेफड़ों और नाक म्यूकोसा इकट्ठा ।
        1. Euthanize चूहों को घातक खुराक (आईएफसआई) के साथ TBE (५०० मिलीग्राम/ पृष्ठीय recumbency में पशु प्लेस और ७०% इथेनॉल के साथ छाती पर फर को संक्रमित । उरोस्थि से एक स्केलपेल के साथ त्वचा को पेट के आधार पर काटें । कैंची के साथ चूहों के पार्श्व भागों को चीरा के आधार से 1 सेमी कटौती करें.
        2. कैंची के साथ यकृत नस में कटौती करने के लिए माध्यमिक इच्छामृत्यु विधि के रूप में माउस भरो । एक ventral स्थिति में पशु प्लेस और 2 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए रक्त बाहर पलायन की अनुमति । फेफड़ों में रक्त को कम करने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है ।
        3. (सिर सहित) माउस के पूरे ऊपरी भाग से त्वचा को निकालने के पेट के आधार पर जहां पहला चीरा विदारक संदंश और कैंची की सहायता से बनाया गया था. सिर को कैंची से काट लें और उसे बाँझ सूखी पेट्री डिश में रखें ।
        4. ने जबडा और mandible के बीच के जंक्शनों को कैंची से काट डाला और mandible को त्यागा । कैंची के साथ, zygomatic आर्क्स के सिरों पर दो कटौती करते हैं और उन्हें हटा दें । विदारक संदंश की मदद से आंखों को हटाएं ।
        5. को cranium के साथ धारण करें और cranium को sagittal के साथ स्केलपेल सीवन में काट लें । नाक के म्यूकोसा को देखने के लिए मस्तिष्क के साथ cranium के दो हिस्सों लिफ्ट । नाक म्यूकोसा, खोपड़ी के पूर्वकाल हड्डियों से घिरा हुआ है, नाक, जबडा, तालव्य, zygomatic, और सलाखें हड्डियों सहित ।
          6. स्केलपेल का प्रयोग
        6. , cranium के भाग को मस्तिष्क से काट कर त्याग दें । एक बाँझ ट्यूब में नाक म्यूकोसा के साथ cranium के अन्य भाग रखें । बर्फ पर ट्यूब की दुकान (4 & #176; ग) यदि नमूनों को एक ही दिन संसाधित किया जाता है, या उंहें जल्दी से फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर यदि नमूने बाद में संसाधित किए जाएंगे ।
        7. नमूनों के संदूषण से बचने के लिए, प्रत्येक ऊतक बरामद के बीच और एक पशु विच्छेदन क्लोरीन डाइऑक्साइड से संक्रमित के बीच साफ और विच्छेदन उपकरण को संक्रमित.
        8. फेफड़ों को इकट्ठा करने के लिए, पृष्ठीय recumbency में पशु जगह और कैंची के साथ फुस्फुस काट । उरोस्थि के दोनों किनारों पर 1 सेमी में पसलियों काटने से रिब पिंजरे खोलें । कैंची के साथ बेहतर भाग के लिए रिब पिंजरे के आधार से कटौती बनाओ ।
        9. रिब पिंजरे के बेहतर हिस्से में दो चीरा के बीच कैंची के साथ एक क्रॉस सेक्शन बनाने के लिए और छाती की थाली को हटा दें । संदंश के साथ फेफड़ों पकड़ो, श्वासनली के अंत में कटौती (सिर्फ फेफड़ों से पहले) कैंची के साथ और एक बाँझ ट्यूब में फेफड़ों डाल दिया । बर्फ पर ट्यूब की दुकान (4 & #176; ग) यदि नमूनों को एक ही दिन संसाधित किया जाता है, या उंहें जल्दी से फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर यदि नमूने बाद में संसाधित किए जाएंगे ।
          नोट: एक ही दिन में ऊतक के नमूनों को Homogenize कि वे एकत्र कर रहे हैं, और पर स्टोर-८० & #176; ग वायरल titers विश्लेषण करने के लिए बाद में । यह महत्वपूर्ण है कि नमूने दोहराया फ्रीज-गल चक्र से पहले वायरस titers निर्धारित कर रहे है नहीं गुजरना है । वैकल्पिक रूप से, ऊतक नमूनों की दुकान पर-८० & #176; C तक उन पर कार्रवाई की जाएगी ।
    2. फेफड़ों और नाक के म्यूकोसा Homogenization
        फेफड़ों या नाक म्यूकोसा एक बाँझ
      1. Dounce में जगह और ठंडे संक्रमण मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें । Homogenize के लिए ऊपर और नीचे लगभग 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में जब तक फेफड़ों पूरी तरह से बाधित कर रहे है ले जाकर नमूना । homogenized नमूना एक बाँझ ट्यूब और स्टोर में डाल 4 & #176; C. प्रत्येक नमूने के लिए एक नया Dounce homogenizer का उपयोग करें.
      2. ३०० आरटी में 5-10 मिनट के लिए एक्स जी पर नमूने केंद्रापसारक एक नया बाँझ ट्यूब में supernatant इकट्ठा । supernatant पर 4 & #176; C यदि वायरल अनुमापन एक ही दिन में किया जाता है और गोली त्यागें । वैकल्पिक रूप से, फ्रीज (-८० & #176; ग) supernatant के homogenized नमूनों का मूल्यांकन वायरल titers बाद में.
    3. विषाणु अनुमापन अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस
      1. से पहले दिन अनुमापन, बीज ९६-मडि़हान-डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) उपकला कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से प्लेटें (4 x 10 4 कोशिकाओं/) तक पहुंचने के लिए ~ ८०-९०% ऊतक संस्कृति मीडिया में संगम । कोशिकाओं को एक ३७ & #176 में रखें; सी मशीनर 5% कं 2 के साथ । वायरल अनुमापन के दिन, माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करने के लिए वायरल संक्रमण शुरू करने से पहले एक monolayer की पुष्टि करें ।
      2. एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट में संक्रमण मीडिया में homogenized नमूनों (फेफड़े या नाक म्यूकोसा) के supernatant के 1:10 कमजोर पड़ने तैयार करते हैं । वायरल titers को सही तरीके से निर्धारित करने के लिए triplicates द्वारा वाइरल अनुमापन का प्रदर्शन करें ।
        1. Add ९० & #181; ९६-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएँ को इंफेक्शन मीडिया के एल. तपसिल में प्रत्येक नमूने के वायरल titer का मूल्यांकन करने के लिए वेल्स A1, A2 और A3 को homogenized नमूनों के supernatant में से एक के 10 & #181; एल जोड़ें । homogenized नमूनों की एक और supernatant के वेल्स A4, A5 और A6 के लिए 10 & #181; L जोड़ें । नमूने के बाकी के साथ लगातार एक ही कमजोरियां प्रदर्शन करते हैं ।
        2. एक पंक्ति के लिए नमूना supernatant जोड़ने के बाद, pipetting ऊपर और नीचे से मिश्रण करने के लिए एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग करें । अंतरण 10 & #181; L से पंक्ति A से पंक्ति B. कमजोर पड़ने के बीच सुझावों को बदलें और अच्छी तरह से मिलाएं । अंतिम पंक्ति (H) तक पहुंचने तक इसे दोहराएं ।
      3. ९६ में aspirator कोशिकाओं से एक वैक्यूम मल्टीचैनल-MDCK एडाप्टर का उपयोग टिशू कल्चर मीडियम (स्टेप 4.2.3.1) को हटा दें और १०० & #181 के साथ दो बार धोएं, 1x पंजाबियों का L/
      4. Transfer ५० & #181; L/supernatant के प्रश्नपत्र पतला करने वाले homogenized नमूनों में से ९६-MDCK कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से प्लेट. (पंक्ति A) कम कमजोर पड़ने के लिए उच्च कमजोर पड़ने (पंक्ति एच) स्थानांतरित करना शुरू करें । इस स्थिति में, यह आवश्यक नहीं है विभिंन पंक्तियों के बीच युक्तियों को परिवर्तित करने के लिए ।
      5. ९६-अच्छी तरह प्लेटें 1 ज के लिए एक घोड़ा मंच पर पर डाल करने के लिए वायरल सोखना अनुमति देते हैं । वायरल सोखना के बाद, एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडेप्टर का उपयोग कर इनोक्युलम निकालें और १०० & #181 जोड़ने के लिए, पोस्ट संक्रमण मीडिया के एल/ एक ३३ & #176; c या ३७ & #176; c मशीन के साथ 5% कं 2 के लिए संक्रमित कोशिकाओं की मशीन । कदम में वर्णित के रूप में फिक्सिंग, धुंधला, इमेजिंग, और वायरल titer गणना करने के लिए आगे बढ़ें 4.2.3.6 & #8211; 4.2.3.12.
      6. ९६-अच्छी तरह से एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल अनुकूलक का उपयोग कर प्लेटों से ऊतक संस्कृति माध्यम निकालें । फिक्स और permeabilize के साथ कोशिकाओं को १०० & #181; L/निर्धारण के permeabilization/
        पर 20 मिनट के लिए समाधान/ चेतावनी: formaldehyde एक्सपोजर को रोकने के लिए एक धुएं डाकू में निर्धारण/permeabilization समाधान का प्रयोग करें ।
      7. /permeabilization समाधान एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडाप्टर का उपयोग कर निकालें, 1x पंजाबियों के साथ धो, और 1 के लिए समाधान ब्लॉकिंग के साथ तय कोशिकाओं की मशीन में आरटी. संग्रह 4 & #176; C पर समाधान ब्लॉक कर रहा है या अगले चरण के लिए आगे बढ़ें ।
      8. अवरोध समाधान निकालें । Add ५० & #181; L 1 & #181/g/मब मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) विरोधी एनपी एचबी-६५ एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान में पतला । ३७ & #176 पर 1 ज के लिए मशीन; C. भि मॉब या polyclonअल एंटीबॉडी (pAb) विरोधी PR8 इस्तेमाल किया जा सकता है.
      9. इस बीच, पतला 1:200 fluorescein isothiocyanate (FITC)-संयुग्मित माध्यमिक विरोधी माउस एंटीबॉडी में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान । १,७०० आरटी पर 5-10 मिनट के लिए एक्स जी पर समाधान केंद्रापसारक । अंय fluorophores के साथ अंय माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      10. को प्राथमिक एंटीबॉडी से धोकर 3 बार धो लें १०० & #181; 1x पंजाब के एल/ Add ५० & #181; एल/ठीक है माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए और 30-45 मिनट के लिए मशीन ३७ & #176; C. द्वितीयक एंटीबॉडी निकालें और 3 बार धो लें १०० & #181 के साथ, 1x पंजाबियों के एल/ लास्ट वॉश को प्लेट में छोड़ दें ।
      11. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए सकारात्मक दाग (हरा) कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं । FFU/एमएल गिनती द्वारा वायरल titer की गणना । 30-50 सकारात्मक सना हुआ कोशिकाओं सूत्र का उपयोग कर के साथ कमजोर पड़ने से FFU/एमएल में व्यक्त वायरल titer की गणना: ((n1 + n2 + n3)/3) x 20 x 1/
< p class = "jove_title" > 5. विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ )

  1. संक्रमित i.n. 3 समूह की महिला 6-to-8 सप्ताहीय C57BL/6 चूहे (n = 5) अलग खुराक के साथ (10 2 , 10 3 , व 10 4 FFU/ माउस) के PR8 LAIV, और नकली-संक्रमित एक समूह (n = 5) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1x बाँझ पंजाबियों के साथ. अनुभाग 3. में बताए अनुसार i. n माउस संक्रमणों को निष्पादित करें
    1. माउस अवअधोहनुज पंचर
      1. द्वारा रक्तस्राव चौदह दिनों के प्रतिरक्षण के बाद, एक 4 मिमी अवअधोहनुज का उपयोग कर खून बह रहा द्वारा चूहों रक्त एकत्र करें < सुप वर्ग = "नुकीला" > 26 xref, या अन्य अनुमोदित विधि का उपयोग कर.
        1. को तर्जनी अंगुली और अंगूठे के बीच गर्दन के कूड़ा के ऊपर से उठा कर माउस को पकड़ लें । गुलाबी रंग की उंगली के साथ हाथ के खिलाफ पूंछ पकड़ो माउस को स्थिर करने के लिए ।
        2. गाल को देखने के लिए एक पार्श्व स्थिति में माउस डाल दिया । jugular नस के साथ रेट्रो कक्षीय और अवअधोहनुज नसों के मोड़ पर पंचर बनाओ । नुकीला (4 मिमी) सिंक और एक बाँझ ट्यूब में रक्त की वसूली (लगभग ०.२-०.४ एमएल/माउस बरामद कर रहे हैं). कुछ सेकंड के लिए एक बाँझ नैपकिन के साथ पंचर पर दबाव लागू करें । माउस को पिंजरे में वापस रखें ।
      2. 1-2 ज के लिए ट्यूबों डाल ३७ & #176; सी और फिर उन्हें ७०० x जी पर 30 मिनट के लिए RT में रक्त से सीरम अलग करने के लिए उन्हें केंद्रापसारक. एक नए बाँझ ट्यूब के लिए एक प्लास्टिक के साथ सीरम के होते हैं कि ऊपरी परत स्थानांतरण. लाल रक्त कोशिकाओं (कोशिकाओं) की गोली त्यागें । सीरम का संग्रह-20 & #176; C.
  2. वायरल प्रोटीन के खिलाफ कुल एंटीबॉडी का विश्लेषण
    1. संक्रमित MDCK कोशिका अर्क की
      1. दिन पहले संक्रमण, बीज १ १०० मिमी डिश 4-5 एक्स 10 6 MDCK कोशिकाओं के साथ (तक पहुंचने के लिए ~ ८०-९० % संगम अगले दिन) टिशू कल्चर मीडिया में । कोशिकाओं को एक ३७ & #176 में रखें; सी मशीनर 5% कं 2 के साथ । वायरल संक्रमण के दिन, माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करने के लिए वायरल संक्रमण शुरू करने से पहले एक monolayer की पुष्टि करें ।
      2. संक्रमण मीडिया में 4 मिलीलीटर कुल अंतिम मात्रा में PR8 WT की एक कम (०.००१) बहुलता के साथ एक वायरल कमजोर पड़ने की तैयारी (मुि) । सूत्र के साथ PR8 WT की मात्रा की गणना करें ((x मुि x n & #176; कक्ष) x अंतिम मात्रा)/स्टॉक viral titer.
      3. महाप्राण टिशू कल्चरल मीडियम को MDCK सेल प्लेट से और 4 एमएल का 1x पंजाबियों के साथ दो बार धोएं । वायरल इनोक्युलम (4 एमएल) जोड़ें और 1 एच पर आरटी के लिए एक कमाल की मंच पर प्लेट वायरल सोखना अनुमति देते हैं । वायरल इनोक्युलम को वैक्यूम के साथ निकालें और 1 & #181; g/ml के TPCK-स्वास्थ्यकर्मी trypsin से युक्त पोस्ट-इंफेक्शन मीडिया के 8-10 एमएल जोड़ें । ४८ के लिए संक्रमित कोशिकाओं की मशीन-७२ एच में एक ३३ & #176; c या ३७ & #176; ग मशीन के साथ 5% कं 2 .
      4. एक सेल खुरचनी की सहायता के साथ कोशिकाओं को अलग और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक प्लास्टिक के साथ कोशिकाओं और ऊतक संस्कृति के माध्यम इकट्ठा । महाप्राण supernatant पर 5-10 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक और RIPA बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड और एक १.५ मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में मिश्रण डाल दिया । 20-30 min.
        5. के लिए बर्फ पर मशीन
      5. केंद्रापसारक ट्यूब पर १,३०० x g के लिए 20-30 मिनट में 4 & #176; C. ध्यान से, supernatant पुनर्प्राप्त करें । सेल निकालने में स्टोर १०० & #181; L aliquots पर-20 & #176; ग.
      6. अनुमापन एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा वर्णित के रूप में कोशिका निष्कर्षों को एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन < सुप वर्ग = "xref" > ९ , < सुप class = "xref" > 10 , < सुप class = "xref" > 11 , < सुप वर्ग = "xref" > २७ . एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नकली संक्रमित MDCK कोशिकाओं (ऊपर संकेत के रूप में तैयार) से सेल निष्कर्षों को शामिल करें ।
    2. एलिसा (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 )
      1. कोट polystyrene ९६-अच्छी तरह से संक्रमित-MDCK सेल निकालने का उचित कमजोर पड़ने के साथ प्लेट 1x पंजाब में (आमतौर पर 1:200-1:1000) के बीच । कोट एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नकली संक्रमित MDCK सेल निकालने के एक ही कमजोर पड़ने के साथ एक और थाली । रात भर की मशीन (O/N) पर 4 & #176; C.
      2. एक निर्वात aspirator-मल्टीचैनल एडेप्टर का उपयोग कर supernatant को हटाने और १०० & #181 के साथ एक बार धोने, एक मल्टीचैनल प्लास्टिक के साथ 1x पंजाबियों के एल/ १०० & #181 को जोड़कर गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को अवरोधित करना; L/ब्लॉकिंग समाधान के ठीक 1 के लिए RT.
        3. पर h
      3. इस बीच, बनाने के 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने (शुरू कमजोर पड़ने 1:50) प्रत्येक माउस से सीरा के एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान में एक ९६-अच्छी तरह से थाली में ५.१ कदम में संक्रमित ।
      4. polystyrene ९६-अच्छी तरह से एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडाप्टर का उपयोग कर प्लेटों से अवरुद्ध समाधान निकालें । Add ५० & #181; प्रत्येक माउस के रूप में सीरम कमजोर पड़ने उपयुक्त अच्छी तरह से और मशीन 1 h at ३७ & #176; C.
      5. एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडेप्टर के साथ चूहों सीरा निकालें । एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर आसुत जल के साथ 3 बार कुओं धो लो । Add ५० & #181; एल/ठीक है एक विरोधी माउस के माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ सहिजन Peroxidase (एचआरपी) पतला 1:2000 में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान । की मशीन 1 ज पर ३७ & #176; ग.
      6. द्वितीयक एंटीबॉडी वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडेप्टर के साथ निकालें । एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग कर आसुत जल के साथ 3 बार कुओं धो लो । मिश्रण से tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट समाधान तैयार करें 1:1 समाधान A और B. Add १०० & #181; L/ठीक है सब्सट्रेट और पर 5-10 मिनट के लिए के लिए मशीन अंधेरे में आरटी.
      7. को जोड़कर रिएक्शन बंद कर १०० & #181; L/०.२ के एन एच 2 सू 4 . एक एलिसा प्लेट रीडर पर ४५० एनएम पर प्लेटें पढ़ें ।
      8. के प्रत्येक कमजोर पड़ने में प्राप्त मूल्य घटाना MDCK नकली-संक्रमित ९६-अच्छी तरह से प्लेट MDCK-संक्रमित ९६ में प्राप्त मूल्य से अच्छी तरह से थाली. अलग सीरा के साथ प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए औसत मूल्यों की गणना और एक मानक विचलन (एसडी) दिखा ग्राफ में उन्हें प्रतिनिधित्व करते हैं.
  3. बेअसर एंटीबॉडी का विश्लेषण
    1. Hemagglutination अवरोध (hai) परख (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 )
      1. है कि हाई परख प्रदर्शन से पहले, रिसेप्टर के साथ माउस सीरा का इलाज नष्ट एंजाइम (रडे) सीरम में मौजूद सभी गैर विशिष्ट अवरोधकों को खत्म करने के लिए. रडे काम कमजोर पड़ने के 4 संस्करणों के लिए माउस सीरम के 1 मात्रा जोड़ें (सीरम कमजोर पड़ने अब 1:5 है). मशीन O/N (12- 18 ज) मे एक ३७ & #176; ग जल स्नान क ֩
      2. में सीरम के नमूनों को हीट ५६ & #176; ग के लिए 30 मिनट रडे.
        3. को निष्क्रिय करने के लिए
      3. पूर्व निर्धारित hemagglutination गतिविधि (हाओ) के PR8 WT द्वारा मानक हा परख < सुप वर्ग = "xref" > २८ . एक बार वायरल हाओ का निर्धारण हो जाने के बाद वायरल स्टॉक को पतला कर 8 हाओ प्रति ५० & #181; L 1x पंजाबियों में.
      4. एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे थाली में रडे-इलाज सीरा के 2 गुना सीरियल कमजोर पड़ने (12 कमजोर पड़ने) तैयार करते हैं । प्रत्येक सीरम नमूने के लिए एक पंक्ति का उपयोग करें ( उदा , A1 to A12).
        1. Add 25 & #181; 1x पंजाबस के एल A1 से A12 वेल्स तक । एक पंक्ति में सीरम नमूनों में से प्रत्येक का परीक्षण । Add 25 & #181; l of रडे-स्वास्थ्यकर्मी सीरा (1:5) को 25 & #181; का. एल. कॉलम (A1) के पहले वेल में 1x पंजाबस का l. पहले सीरम कमजोर पड़ने 1:10 है.
        2. एक बार सभी रडे-इलाज सीरा को पहले कॉलम में जोड़ दिया जाता है, ( उदा. , A1, B1, C1), मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग करके सीरा और 1x पंजाबियों को ऊपर और नीचे की pipetting में मिलाएं । पहले कॉलम से दूसरे कॉलम ( जैसे , A1 से A2) तक पतला सीरा के 25 & #181; L का अंतरण । कमजोर पड़ने और मिश्रण के बीच युक्तियां बदलें ।
        3. दोहराएँ चरण 5.3.1.4.2. अंतिम स्तंभ तक पहुँचने तक ( जैसे , A12, बी १२, C12). सभी कुओं (25 & #181; l) में मात्रा अनुरूप रखते हुए अंतिम कॉलम से 25 & #181; l को त्यागें । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किसी भी सीरा के बिना केवल 25 & #181; 1x पंजाबियों के एल युक्त की एक पंक्ति शामिल करें ।
      5. Add 25 & #181; के l IAV पतला करने के लिए 8 हाओ/50 & #181; l प्रत्येक कुएं को ९६ में सीरा के साथ-साथ वी-नीचे की थाली; प्रत्येक कुआं में अंतिम मात्रा ५० & #181; l, युक्त 4 वायरस की हाओ. दोहराया pipetting द्वारा सामग्री मिक्स । RT.
        6. में 1 एच के लिए मशीन
      6. Add ५० & #181; L का ०.५% टर्की कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं को. दोहराया pipetting द्वारा सामग्री मिक्स । बर्फ पर 30-45 मिनट के लिए थाली मशीन । पढ़ें हाई परख नेत्रहीन जब कोशिकाओं वेल्स (1x पंजाब) में एक लाल वेग ( अर्थात् , गोली) के फार्म के कुएं के नीचे ।
        नोट: चिकन, गिनी पिग या हॉर्स जैसे अन्य प्रजातियों से कोशिकाओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
      7. पिछले अच्छी तरह से जिसमें कोशिकाओं फार्म एक लाल गोली और hemagglutination नहीं होती है की पहचान करके HAI titers की गणना ।
        नोट: इस कमजोर पड़ने के पारस्परिक मूल्य HAI titer है । पारस्परिक मूल्य 20 के एक कारक से गुणा है पहली पंक्ति में सीरम के 1:20 कमजोर पड़ने के लिए सही है ।
    2. Virus microneutralization परख (VNA) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 6 )
      1. दिन VNA पहले, एक ९६-well थाली में MDCK कोशिकाओं को तैयार करने के लिए अगले दिन 80-90% संगम तक पहुंचने के रूप में चरण 5.2.1.1 में वर्णित है । संक्रमण मीडिया में PR8 WT के एक कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए २०० FFU/25 & #181; L.
      2. निष्क्रिय करने पर माउस सीरा को ५६ & #176; ग के लिए 1 ज. एक ९६-well प्लेट का उपयोग कर तपसिल में माउस सीरा प्रति 2-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने (12 कमजोर पड़ने) बनाओ ।
        1. Add ४० & #181; ल. के सीरम को १६० & #181; पहली पंक्ति के पहले well में संक्रमण मीडिया के एल, ( उदा , A1) (सीरम कमजोर पड़ने 1:5). pipetting द्वारा मिश्रण । अन्य कुओं (A2 से H12) तक संक्रमण मीडिया के १०० & #181; L को जोड़ें.
        2. Transfer १०० & #181; L पहली पंक्ति से दूसरी पंक्ति में 1:2 कमजोर पड़ने ( जैसे , A1 से A2) बनाने के लिए. pipetting द्वारा कमजोर पड़ने और मिश्रण के बीच युक्तियां बदलें । अंतिम पंक्ति ( जैसे , A12) तक यह दोहराएं । सभी कुओं (१०० & #181; l) में संगत मात्रा को दृष्टिगत रखते हुए अंतिम पंक्ति से १०० & #181; l को छोड़ें.
      3. जोड १०० & #181; IAV कमजोर पड़ने के सभी कुओं के लिए एल. आर टी पर 1 ज. इस बीच, एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडेप्टर का उपयोग कर ९६-well थाली में MDCK कोशिकाओं से ऊतक संस्कृति माध्यम को हटाने और १०० & #181 के साथ दो बार धोने, 1x पंजाबियों के एल/
        4. MDCK कोशिकाओं के प्रत्येक ९६-well प्लेट में
      4. , नियंत्रण के लिए दो पंक्तियों छोड़ दें । एक पंक्ति नकारात्मक नियंत्रण (वायरस और सीरा के बिना कोशिकाओं) है, और दूसरी पंक्ति संक्रमण के सकारात्मक नियंत्रण (नकली संक्रमित चूहों से सीरा या सीरा के अभाव में वायरस के साथ कोशिकाओं) है ।
      5. Transfer ५० & #181; एल/अच्छी तरह से वायरस-एंटीबॉडी प्लेट से ९६-MDCK कोशिकाओं की अच्छी तरह से प्लेटों के लिए । आरटी में 1 ज के लिए एक कमाल की मंच पर प्लेटों रखो वायरल सोखना.
      6. एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडेप्टर का उपयोग कर वायरस-एंटीबॉडी इनोक्युलम निकालें और जोड़ें १०० & #181; L/पोस्ट-इंफेक्शन मीडिया के ठीक 1 & #181; g/एमएल ऑफ TPCK-स्वास्थ्यकर्मी trypsin.
      7. के लिए कोशिकाओं की मशीन ~ 3-4 दिनों में एक ३३ & #176; c या ३७ & #176; सी मशीन के साथ 5% कं 2 जब तक cytopathic प्रभाव (सीपीई) सकारात्मक नियंत्रण में मनाया (सीरा के अभाव में या नियंत्रण सीरम के साथ संक्रमित कोशिकाओं).
      8. एक निर्वात aspirator-मल्टीचैनल अनुकूलक का उपयोग कर ऊतक संस्कृति मध्यम निकालें और जोड़ें १०० & #181; एल ०.१% क्रिस्टल वायलेट के/ आरटी पर 1 ज के लिए मशीन एक वैक्यूम aspirator-मल्टीचैनल एडेप्टर का उपयोग कर क्रिस्टल वायलेट समाधान निकालें । आसुत जल के साथ 3 बार कुओं धो लो । RT.
        9. पर प्लेटें सूखी
      9. VNA titers की गणना उच्चतम कमजोर पड़ने कि MDCK कोशिकाओं के एक धाराप्रवाह सेल monolayer बरकरार रखती है की पहचान करके ।
        नोट: यह इसी कमजोर पड़ने के पारस्परिक मूल्य बेअसर एंटीबॉडी titer है । पारस्परिक मूल्य 10 के एक पहलू से गुणा है के लिए पंक्ति के पहले कुआं में सीरा के 1:10 कमजोर पड़ने को सही ।
< p class = "jove_title" > 6. संरक्षण प्रभावकारिता टीकों का मूल्यांकन (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 3 )

  1. लगवा i.n. महिला 6-से-8-सप्ताहीय एक समूह C57BL/6 चूहों (n = 11) PR8 LAIV खुराक के साथ परीक्षण (FFU/माउस) और नकली टीका चूहों का एक और समूह (n = 11) 1x बाँझ पंजाबियों के साथ । पहले खंड 3 में वर्णित के रूप में माउस i.n. प्रतिरक्षण निष्पादित करें ।
  2. चौदह दिन बाद टीकाकरण, चूहों को भरो और खंड 3 में बताए गए सीरा को एकत्रित करें । धारा 5.1.1 में वर्णित PR8 WT के विरुद्ध कुल और बेअसर एंटीबॉडी की उपस्थिति का विश्लेषण करें.
  3. पंद्रह दिनों के बाद टीकाकरण, उपाय और माउस शरीर के वजन रिकॉर्ड (0 दिन) । चैलेंज चूहों PR8 WT (मुताबिक़ चैलेंज) की एक घातक खुराक के साथ i.n. पहले खंड 3 में वर्णित के रूप में.
  4. टीके (धारा ४.१) में PR8 WT चुनौती द्वारा उत्पादित रुग्णता और मृत्यु दर का मूल्यांकन करने के लिए चुनौती के बाद 14 दिनों के दौरान शरीर के वजन और अस्तित्व (n = 5/
    5. को मापने ।
  5. ठीक माउस फेफड़ों और नाक की श्लेष्मा झिल्ली (n = 3/दिन) 2 दिन और 4 के बाद PR8 WT. Homogenize के साथ चुनौती और फेफड़ों और नाक के श्लेष्म का विश्लेषण के रूप में ४.२ खंड में वर्णित के रूप में PR8 WT के वायरल प्रतिकृति का आकलन करने के लिए टीके लगाए चूहों में ।

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Representative Results

चूहों में वायरल रोगजनन का लक्षण वर्णन

IAV का रोगजनन इसके संक्रमण के कारण होने वाली रुग्णता और मृत्युदर से संबंधित है । इन दो मापदंडों चूहों में आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है: IAV रुग्णता संक्रमित चूहों में शरीर के वजन घटाने के साथ जुड़ा हुआ है और अस्तित्व का प्रतिशत मृत्यु दर (चित्रा 1) का संकेत होगा. IAV-संक्रमित चूहों में शरीर के वजन और जीवन रक्षा आमतौर पर संक्रमण के8,9,10,29के बाद कम से कम दो सप्ताह के लिए दैनिक निगरानी कर रहे हैं । अस्तित्व डेटा प्राप्त ढाली५० है कि ईख और Muench25की विधि का उपयोग कर गणना की गई थी निर्धारित कर सकते हैं. IAV रोगजनन का एक अन्य संकेतक कम (फेफड़ों) में और ऊपरी (नाक म्यूकोसा) श्वसन तंत्र (चित्रा 1) में वायरल प्रतिकृति करने के लिए संबंधित है । इन अंगों में वायरल titer के साथ प्राप्त जानकारी रुग्णता और मृत्यु दर मूल्यों के अनुरूप है, और एक साथ लिया वायरल रोगजनन का एक अच्छा संकेत प्रदान करते हैं । यह ज्ञात है कि IAV 2 और 4 दिनों के बाद संक्रमण (p.i.) के बीच माउस फेफड़ों पीक में प्रतिकृति, और इसलिए हम 2 और 4 दिनों में इन अंगों को ठीक करने की सिफारिश की p.i.

Figure 1
चित्रा 1: चूहों में IAV रोगजनन का लक्षण वर्णन: चूहों में IAV रोगजनन अपनी रुग्णता (शरीर के वजन घटाने) और मृत्यु दर (% अस्तित्व) से संबंधित है, और यह भी IAV की क्षमता को ऊपरी (नाक म्यूकोसा) और कम (फेफड़ों) श्वसन तंत्र में दोहराने के लिए । संक्षेप में, दिन पर 0 चूहों तौला और anesthetized intraperitoneally के साथ 2, 2, 2-tribromoethanol (TBE) से पहले वे intranasally के साथ संक्रमित IAV हैं । 1 दिन से 14 दिन के लिए, चूहों को शरीर के वजन घटाने (रुग्णता) और% अस्तित्व (मृत्यु) के लिए माउस घातक खुराक ५० (ढाली५०) की गणना मूल्यांकन करने के लिए दैनिक तौला जाता है । दिनों में 2 और दिन 4 के बाद संक्रमण, चूहों फेफड़ों और नाक म्यूकोसा और वायरल प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए homogenized बरामद कर रहे हैं । चूहों PR8 WT का उपयोग कर IAV रोगजनन विशेषताएं करने के लिए प्रयोग बीएसएल-2 शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 2में, PR8 WT रोगजनन के मूल्यांकन में प्राप्त आंकड़ों का प्रतिनिधित्व किया है । 6 के चार समूहों-8 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों (एन = 11) संकेत खुराक के साथ संक्रमित i.n. थे (10, 102, 103 और 104 FFU/माउस) PR8 WT की । शरीर के वजन और प्रति समूह 5 चूहों की उत्तरजीविता 14 दिनों p.i. (चित्रा 2a-B) द्वारा मापा गया । सभी चूहों प्रतिरक्षित के 104 FFU के साथ PR8 WT जल्दी खो वजन (चित्रा 2a) और उन सभी को 5 दिनों में मृत्यु हो गई और 6 p.i. (चित्रा बी2). चूहों PR8 WT के 103 FFU के साथ प्रतिरक्षित बाद के समय में शरीर के वजन खो दिया है p.i. (चित्रा 2a) और वे सब 7 दिनों और 8 p.i. (चित्रा बी2) द्वारा मृत्यु हो गई । सभी चूहों PR8 WT के 102 FFU के साथ प्रतिरक्षित शरीर का वजन (चित्रा 2a) खो दिया लेकिन उनमें से केवल 2 दिन में 9 p.i. (चित्रा 2 बी) मर गया । अंत में, चूहों प्रतिरक्षित PR8 WT के 10 FFU के साथ वजन (चित्रा 2a) खो नहीं किया और उन सभी संक्रमण (चित्रा बी8) बच गया । इस प्रयोग में PR8 WT की ढाली५० की गणना ईख और Muench विधि25 से १.५ x 102 FFU (चित्रा 2c) के साथ की गई ।

चूहों के ऊपरी और निचले श्वसन तंत्र में PR8 प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए संकेत खुराक के साथ i.n. संक्रमित (10, 102, 103, और 104 FFU/माउस), फेफड़ों और नाक के म्यूकोसा दिनों में बरामद किए गए 2 और 4 p.i. (n = 3) । फेफड़ों homogenization के बाद, इस अंग में मौजूद वायरस की मात्रा इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (चित्रा 2d) द्वारा विश्लेषण किया गया था । वायरल titer अलग चूहों समूहों के फेफड़ों में पाया उन्हें छुटकारा करने के लिए इस्तेमाल किया खुराक के साथ संबंधित था: उच्च वायरल titers चूहों के फेफड़ों में पाए गए प्रतिरक्षित के 104 FFU के साथ PR8 WT के दिनों में 2 और 4 p.i., जबकि लोअर वायरल titers में पाया गया चूहों के फेफड़े PR8 WT के १० FFU के साथ प्रतिरक्षित.

Figure 2
चित्रा 2: वायरल रोगजनन के मूल्यांकन में प्राप्त आंकड़ों का प्रतिनिधित्व: PR8 WT की रुग्णता और मृत्युदर का विश्लेषण करने के लिए, 6-to-8-सप्ताहीय महिला C57BL/6 चूहों (एन = 5) PR8 WT की फ्लोरोसेंट बनाने इकाइयों (FFU) की संकेत संख्या के साथ संक्रमित i.n. थे और फिर (एक) शरीर-वजन घटाने (रुग्णता) के लिए 2 सप्ताह के लिए दैनिक निगरानी और (ख) अस्तित्व (मृत्युदर) । डेटा व्यक्तिगत चूहों (n = 5) के लिए निर्धारित परिणामों के साधन और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग)% जीवित रहने के मूल्यों का मूल्यांकन 2 सप्ताह से अधिक का उपयोग किया जाता है ढाली५० की गणना करने के लिए रीड और Muench विधि25का प्रयोग । (D) वायरल प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए, 6-8-सप्ताहीय महिला C57BL/6 चूहों (n = 6) FFU की संकेत संख्या के साथ i.n. संक्रमित थे । संक्रमित चूहों के फेफड़ों या नाक म्यूकोसा में वायरल प्रतिकृति आम तौर पर एक immunofocus परख का उपयोग कर 2 और 4 p.i. दिनों में मूल्यांकन किया जाता है । वायरल titers FFU/एमएल के रूप में दर्ज हैं । डेटा प्रत्येक माउस में प्राप्त परिणामों के साधन और एसडीएस का प्रतिनिधित्व करता है । डैश्ड लाइनों का पता लगाने की सीमा का संकेत करने के लिए शामिल किए गए हैं (२०० FFU/एमएल) की परख । चूहों और ऊतक संस्कृति के प्रयोगों IAV रुग्णता, मृत्यु दर और वायरल titers का आकलन करने के लिए PR8 का उपयोग बीएसएल-२ की शर्तों के तहत किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

टीकाकरण के बाद प्रेरित हास्य प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन

IAV संक्रमण के खिलाफ प्रेरित विनोदी प्रतिक्रियाएं वायरल संक्रमण को नियंत्रित करने में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं । इस कारण से, यह बहुत IAV WT संक्रमण द्वारा या नए IAV टीकों (चित्रा 3) द्वारा बटोरी गई प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण महत्वपूर्ण है । माउस मॉडल में, 14 दिनों के प्रतिरक्षण के बाद, चूहों को एलिसा द्वारा कुल वायरल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति का विश्लेषण करने के लिए लहूलुहान कर रहे हैं (चित्रा 4), और वायरल हा प्रोटीन है, जो आम तौर पर लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी बेअसर की उपस्थिति ऐसे एक हाई परख के रूप में आम serologic दृष्टिकोण, द्वारा विश्लेषण (एनजी वर्ग = "xfig" > चित्रा 5) और/या एक VNA (चित्रा 6) ।

Figure 3
चित्र 3: सुरक्षा, Immunogenicity और एक LAIV की सुरक्षा प्रभावकारिता के लक्षण वर्णन में विभिंन चरणों की योजना: जब एक नया LAIV विकसित किया जाता है, IAV संक्रमण के माउस मॉडल आमतौर पर सुरक्षा, immunogenicity और सुरक्षा प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल होता है । इस योजना में, सुरक्षा (ए), immunogenicity (ख) और संरक्षण प्रभावकारिता (सी) के एक उंमीदवार LAIV का आकलन करने के लिए प्रयोगों के संकेत दिए हैं । (क) एक LAIV की सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए यह एक ही पैरामीटर परख आवश्यक है (रुग्णता, मृत्यु और ऊपरी और निचले श्वसन तंत्र में वायरल प्रतिकृति) चित्रा 1में वर्णित है । immunogenicity का मूल्यांकन करने के लिए चूहे प्रतिरक्षित हैं और टीकाकरण के 14 दिन बाद वे अवअधोहनुज पंचर होने से लहूलुहान हो जाते हैं । हास्य प्रतिक्रियाओं IAV प्रोटीन के खिलाफ एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा कुल एंटीबॉडी की उपस्थिति का आकलन और hemagglutination अवरोध परख (HAI) और/या वायरस द्वारा एंटीबॉडी बेअसर की उपस्थिति का मूल्यांकन द्वारा विश्लेषण कर रहे है microneutralization परख (VNA) । (ग) संरक्षण प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, टीकाकरण के 15 दिनों के बाद, चूहों को IAV WT के साथ चुनौती दी जाती है । संरक्षण प्रभावकारिता चूहों की माप द्वारा मूल्यांकन किया है रुग्णता, चुनौती दी चूहों के फेफड़ों में मृत्यु दर और वायरल titers में वर्णित के रूप में चित्रा 1 . चूहों को सुरक्षा, immunogenicity और एक LAIV उंमीदवार की सुरक्षा प्रभावकारिता विशेषताएं के लिए प्रयोग बीएसएल-2 शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं । अन्य बीएसएल सूट या रोकथाम की स्थिति टीका चूहों की चुनौती के लिए इस्तेमाल किया IAV तनाव के आधार पर आवश्यक हो सकता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

PR8 LAIV के immunogenicity का आकलन करने के लिए, 6-से-8-सप्ताहीय C57BL के तीन समूह/6 चूहों (n = 5) अलग खुराक के साथ प्रतिरक्षित थे (102, 103, और PR8 LAIV के 104 FFU/माउस) या एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1x पंजाबियों के साथ नकली टीका लगाया । टीकाकरण के चौदह दिन बाद चूहों सीरा अवअधोहनुज रक्तस्राव26 (चित्रा 3) द्वारा एकत्र किया गया । कुल वायरल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं PR8-संक्रमित MDCK कोशिकाओं (चित्रा 4) के सेल निकालने के एक 1:200 कमजोर पड़ने का उपयोग एलिसा द्वारा मूल्यांकन किया गया । प्रत्येक सीरम व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया गया था । नतीजे बताते हैं कि PR8 LAIV की उच्चतर खुराक (104 FFU) के साथ चूहों प्रतिरक्षित से सीरा को निचली खुराक (102 एंटीबॉडी) के साथ चूहों titers के सीरा की तुलना में कुल PR8 प्रोटीन के मुकाबले उच्च प्रतिरक्षित FFU था । सीरा नियंत्रण (नकली-संक्रमित चूहों) PR8 एंटीजन के खिलाफ जेट नहीं दिखा था ।

Figure 4
चित्रा 4: एंजाइम से जुड़े Immunosorbent परख (एलिसा) के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के लिए विनोदी एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन: संक्रमित चूहों में मौजूद PR8-विशिष्ट एंटीबॉडी का स्तर ९६ में एलिसा द्वारा निर्धारित कर रहे हैं-अच्छी तरह से polystyrene नकली (नियंत्रण) या PR8 संक्रमित MDCK कोशिकाओं से सेल निष्कर्षों के साथ लेपित प्लेटें । संक्षेप में, 14 दिनों में p.i. (चित्रा 3), चूहों PR8 LAIV के संकेत खुराक के साथ प्रतिरक्षित अवअधोहनुज पंचर और सीरा एकत्र किया गया द्वारा ब्लेड थे । प्रत्येक सीरम व्यक्तिगत रूप से कुल PR8 प्रोटीन के खिलाफ आईजीजी एंटीबॉडी के लिए एलिसा द्वारा मूल्यांकन किया गया था । ग्राफ़ डेटा व्यक्तिगत चूहों सीरा (n = 6) से प्राप्त परिणामों के साधन और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है । ओ. डी, ऑप्टिकल घनत्व । एलिसा परख एक बीएसएल-2 कैबिनेट में प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

करने के लिए माउस सीरम में निष्क्रिय एंटीबॉडी की उपस्थिति का विश्लेषण करने के लिए है हाई परख, धारावाहिक 2-सीरा के कमजोर पड़ने वालों (पहले ५६ डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय) चूहों के प्रत्येक समूह के विभिंन खुराकों के साथ प्रतिरक्षित (102, 103, और 104 FFU) के PR8 LAIV के 4 PR8 WT के साथ 1 ज पर आरटी (चित्रा 5) के लिए मशीन थे । तब, तुर्की कोशिकाओं के ०.५% PR8-सीरा मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया । चित्रा 5 के ऊपरी भाग संभव HAI परिणाम का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है: जब सीरम बेअसर एंटीबॉडी शामिल है, कोशिकाओं वर्षा अच्छी तरह से नीचे में मनाया जाता है क्योंकि वायरल हा प्रोटीन के लिए बाध्य एंटीबॉडी रोकने hemagglutination का कोशिकाओं । दूसरी ओर, एंटीबॉडी बेअसर के अभाव में, कोशिकाओं के hemagglutination मनाया जाता है । फिर, HAI titer पिछले अच्छी तरह से hemagglutination कमी में सीरम के कमजोर पड़ने के पारस्परिक के रूप में गणना की है. HAI परिणाम चित्रा 5 के निचले हिस्से में दिखाया गया है संकेत मिलता है कि माउस से सीरम PR8 LAIV (104 FFU) की सबसे बड़ी राशि के साथ टीका लगाया एंटीबॉडी बेअसर के उच्च titer है, जबकि एक माउस से सीरम प्रतिरक्षित के साथ कम खुराक (102 FFU) PR8 के खिलाफ एंटीबॉडी बेअसर की सबसे कम titer है। कोई बेअसर एंटीबॉडी सीरम नियंत्रण में मौजूद थे (नकली-संक्रमित चूहों).

Figure 5
चित्रा 5: Hemagglutination अवरोध (हाई) परख: संक्रमित चूहों में PR8 WT के खिलाफ एंटीबॉडी को बेअसर करने के स्तर को आसानी से है द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । संक्षेप में, 2-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने (शुरू कमजोर पड़ने 1:10) PR8 LAIV के संकेत खुराक के साथ प्रतिरक्षित चूहों से सीरा के (1:1) मिश्रित थे 4 PR8 WT के लिए हाओ पर 1 एच के लिए एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे की थाली में । 1 एच की मशीन के बाद, ०.५% कोशिकाओं बर्फ पर 30-60 मिनट के लिए वायरस सीरम मिश्रण करने के लिए जोड़ रहे थे । हाई titers पिछले अच्छी तरह से जिसमें कोशिकाओं फार्म एक लाल बटन और hemagglutination (ऊपर) नहीं होती है की पहचान करके निर्धारित कर रहे हैं । PR8 WT के साथ HAI परख एक बीएसएल में प्रदर्शन किया गया-2 कैबिनेट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 6में, VNA द्वारा माउस सीरा में एंटीबॉडी बेअसर के मूल्यांकन में प्राप्त डेटा का प्रतिनिधित्व किया है. २०० FFU के PR8 WT के साथ मिलाया गया था धारावाहिक 2-गुना कमजोर पड़ने के साथ सीरा (पहले inactivat५६ ° c पर एड) चूहों प्रतिरक्षित से अलग खुराक के साथ (102, 103, और 104 FFU) PR8 LAIV के लिए 1 ज पर आरटी । प्रत्येक सीरम नमूना तपसिल में मूल्यांकन किया गया था । वायरस-सीरा मिश्रण को ९६-well प्लेट में MDCK कोशिकाओं के monolayers को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 6 के ऊपरी भाग के संभावित VNA परिणामों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है: सीपीई में सीरम परिणाम में लगभग 3-4 दिन p.i. में एंटीबॉडी बेअसर की अनुपस्थिति इसके विपरीत, जब एंटीबॉडी बेअसर (बरकरार सेल monolayer) मौजूद हैं, वे वायरल हा को बांध और वायरल संक्रमण को रोकने, और कोई सीपीई है । सीपीई की उपस्थिति आमतौर पर क्रिस्टल वायलेट के साथ संक्रमित कोशिकाओं धुंधला द्वारा कल्पना की है, और वायरल बेअसर titers संक्रमण पूरी तरह से अवरुद्ध है, जिस पर पिछले कमजोर पड़ने के पारस्परिक रूप में गणना कर रहे हैं । VNA के परिणाम चित्रा 6के निचले भाग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । PR8 LAIV (104 FFU) की उच्च राशि के साथ चूहों प्रतिरक्षित से सीरम को बेअसर करने की सबसे बड़ी titer है जबकि कम खुराक या प्रतिरक्षित PR8 (102 LAIV) के साथ चूहों FFU से सीरा बेअसर एंटीबॉडी के सबसे कम titer है, इसी तरह के परिणाम के साथ प्राप्त की है । कोई बेअसर एंटीबॉडी नकली संक्रमित चूहों से सीरम में मौजूद थे.

Figure 6
चित्रा 6: वायरस Microneutralization परख (VNA): एक विकल्प है कि हाई परख, VNA परख PR8 WT की उपस्थिति का मूल्यांकन कर सकते है एंटीबॉडी बेअसर । संक्षेप में, PR8 LAIV के संकेत खुराक के साथ टीके लगाए चूहों से सीरा 2-गुना पतला (शुरू कमजोर पड़ने 1:5) ९६ में अच्छी तरह से प्लेटें और २०० FFU के साथ 1:1 PR8 WT के लिए 1 ज पर आरटी के लिए मिश्रित । 1 घंटे के बाद, वायरस सीरम मिश्रण MDCK कोशिकाओं की ९६-अच्छी तरह से प्लेटों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. संक्रमित कोशिकाओं को 3-4 दिनों तक पूरा cytopathic प्रभाव के लिए मशीन थे । ९६-अच्छी तरह से प्लेटें तो ०.१% क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग थे । VNA titers एक धाराप्रवाह कोशिका monolayer को बरकरार रखने के लिए उच्चतम कमजोर पड़ने की पहचान करके निर्धारित किए जाते हैं । PR8 WT के साथ VNA के तहत बीएसएल-2 की स्थिति का निष्पादन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चूहों में IAV टीकों की सुरक्षा प्रभावकारिता का मूल्यांकन

जब एक नई LAIV विकसित की है, इसकी सुरक्षा, immunogenicity और सुरक्षा प्रभावकारिता vivo मेंपरीक्षण किया जाना चाहिए, और माउस मॉडल आमतौर पर इन मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए चुना पहला पशु मॉडल है. चित्र 3 चूहों में एक नई LAIV को चिह्नित करने के लिए आवश्यक विभिंन चरणों की एक योजना है । एक LAIV की सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए (चित्र 3), चूहों रोगजनन खंड (खंड 4) में वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग i.n. संक्रमित हैं, और शरीर के वजन और जीवन रक्षा निगरानी से संबंधित जानकारी प्रदान करेगा LAIV की रुग्णता और मृत्युदर (आंकड़े 2a-b), ढाली५०सहित । इसके अलावा, विभिंन वैक्सीन खुराक के साथ टीका पर, कम (फेफड़ों में LAIV की प्रतिकृति) और ऊपरी (नाक म्यूकोसा) श्वसन तंत्र का मूल्यांकन किया जाना चाहिए8,9,10, 11,29 (चित्रा 2d) । immunogenicity परीक्षण करने के लिए, LAIV के साथ टीके लगाए चूहों से सीरा PR8 WT (मुताबिक़ चैलेंज) के साथ चुनौती से पहले एकत्र कर रहे हैं, immunogenicity खंड (खंड 5) (चित्र3) में वर्णित करने के लिए इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग कर. सीरा में कुल और बेअसर एंटीबॉडी की उपस्थिति एलिसा और HAI और/या VNA, क्रमशः द्वारा पता लगाया जा सकता है ।

अंत में, सुरक्षा परीक्षण करने के लिए प्रभावकारिता, LAIV-टीके लगाए चूहों PR8 WT के साथ चुनौती दी है और संरक्षण प्रभावकारिता रुग्णता निगरानी, मृत्यु दर और फेफड़ों में चुनौती PR8 WT की उपस्थिति की विशेषता है, जैसा कि पहले खंड 4 में वर्णित है ( आरेख 3सी)8,9,10,11. LAIV PR8 WT चैलेंज के खिलाफ संरक्षण लाती है, चूहों शरीर के वजन को खोना नहीं होगा, और वे IAV WT के साथ घातक चुनौती बच जाएगा । इसके अलावा, फेफड़ों में IAV WT वायरल titers का पता नहीं लगाया जाएगा, या नकली (पंजाबियों) टीके लगाए चूहों8,9,10,11की तुलना में काफी कम हो जाएगा ।

टिशू कल्चर मीडिया और समाधान संयोजन भंडारण उपयोग टिप्पणियां
टिशू कल्चर मीडिया: Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-Streptomycin-L-glutamine (पीएसजी) (DMEM 10% FBS 1% पीएसजी) ४४५ मिलीलीटर DMEM, ५० मिलीलीटर की FBS और 5 मिलीलीटर की 100x 1% पेनिसिलिन (१०० इकाइयों/एमएल)-Streptomycin (१०० µ g/ml)-L-glutamine (2 मिमी) (पीएसजी) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर यह मीडिया मडि़हान-डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) उपकला कोशिकाओं के रखरखाव के लिए प्रयोग किया जाता है
पोस्ट-संक्रमण मीडिया: DMEM ०.३% गोजातीय एल्ब्युमिन (ba), 1% पीएसजी (DMEM ०.३% बा 1% पीएसजी) ४९१ एमएल DMEM, ४.२ एमएल के ३५% बीए और 5 एमएल के 100x पीएसजी 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर यह मीडिया इंफ्लूएंजा के साथ संक्रमण के बाद MDCK कोशिकाओं के रखरखाव के लिए प्रयोग किया जाता है एक वायरस (IAV)
10x फास्फेट बफर खारा (10x पंजाबियों) ८० g च्या NaCl, 2 g च्या KCl, ११.५ g च्या ना2HPO4. 7H2O, 2 g च्या KH2PO4. जोड़ें ddH2O ऊपर 1 L के लिए पीएच समायोजित ७.३ कमरे के तापमान पर स्टोर (आरटी) बंध्याकरण द्वारा आटोक्लेव
1x पंजाब पतला 10x पंजाबियों 1:10 ddH2ओ के साथ RT पर स्टोर बंध्याकरण द्वारा आटोक्लेव
संक्रमण मीडिया: 1x पंजाबियों, ०.३% ba, 1% पेनिसिलिन-Streptomycin (ps) (पंजाबियों/बीए/ ४८७ एमएल 1x पंजाबी बाँझ, ४.२ मिलीलीटर की ३५% बीए और 5 मिलीलीटर की 100x 1% पेनिसिलिन (१०० इकाइयों/एमएल)-Streptomycin (१०० µ g/एमएल) (पी एस) 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर यह मीडिया IAV संक्रमण के लिए प्रयोग किया जाता है
निर्धारण/permeabilization समाधान: 4% formaldehyde, ०.५% ट्राइटन X-१०० 1x पंजाब में पतला ४०० एमएल तटस्थ बफर Formalin 10%, ट्राइटन एक्स के 5 मिलीलीटर-१०० और 1x पंजाब के ५९५ मिलीलीटर
d > स्टोर पर आरटी इस घोल को ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है और वायरल अनुमापन प्रयोगों में MDCK कोशिकाओं permeabilize formaldehyde के लिए जोखिम को रोकने के लिए एक धुएं डाकू में समाधान तैयार समाधान अवरुद्ध: 1x पंजाब में २.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) 1x पंजाब के ९७.५ मिलीलीटर में BSA के २.५ ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर इस समाधान इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख और एलिसा के लिए एक अवरुद्ध समाधान के रूप में प्रयोग किया जाता है । ०.२ µm फिल्टर के साथ निस्पंदन द्वारा निष्फल । एंटीबॉडी कमजोर पड़ने समाधान (1% BSA 1x पंजाब में) 1x पंजाब के ९९ मिलीलीटर में BSA का 1 ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर इस समाधान इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख और एलिसा में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है ०.२ µm फिल्टर के साथ निस्पंदन द्वारा बंध्याकरण ०.१% क्रिस्टल वायलेट समाधान मेथनॉल के ४०० मिलीलीटर में क्रिस्टल वायलेट के 1 जी । ddH2O का ६०० ml जोड़ें RT पर स्टोर इस समाधान के लिए ठीक है और वायरल बेअसर परख में MDCK कोशिकाओं दाग प्रयोग किया जाता है Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl कीटोंन (TPCK)-स्वास्थ्यकर्मी trypsin एक 1, 000x शेयर समाधान में 1 मिलीग्राम/एमएल में ddH2ओ में तैयार पर स्टोर-20 ° c TPCK-trypsin में जोड़ा जाता है IAV संक्रमण बना १०० µ l aliquots RIPA बफर 10 एमएम Tris-सीएल (pH ८.०), 1 mm EDTA, 1% ट्राइटन X-१००, ०.१% सोडियम deoxycholate, ०.१% एसडीएस, १४० mm NaCl 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर यह समाधान सेल अर्क बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है

तालिका 1: टिशू कल्चर मीडिया और समाधान ।

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Discussion

IAV के माउस मॉडल व्यापक रूप से IAV रोगजनन, immunogenicity और संरक्षण प्रभावकारिता के vivo अध्ययन में के लिए प्रयोग किया जाता है । चूहों के छोटे आकार के लिए उन्हें हेरफेर करने के लिए आसान बनाता है और ferrets या गिनी सूअरों जैसे अन्य जानवरों के मॉडल की तुलना में दुकान. इसके अलावा, पशु की लागत, आवास और प्रजनन के मामले में आसानी पूर्व नैदानिक टीकाकरण परीक्षणों में उनके उपयोग की अनुमति है जिसमें पशुओं की बड़ी संख्या की जरूरत है । विशेष रूप से, के बाद से चूहों एकाधिक अनुसंधान विषयों में इस्तेमाल किया गया है, कई आणविक और इम्यूनोलॉजी murine एजेंट IAV अध्ययन के लिए उनके उपयोग की सुविधा के लिए उपलब्ध हैं. इसके अलावा, ंयूनतम मेजबान परिवर्तनशीलता और एक प्रतिरक्षा प्रणाली है कि मानव में मौजूद है कि evolutionarily के समान है की उपस्थिति उंहें IAV अध्ययन के लिए एक मजबूत छोटे जानवर मॉडल बनाते हैं । अंत में, मेजबान वायरल प्रोटीन बातचीत के अध्ययन और वायरल रोगजनन के लिए उनके योगदान वर्तमान में KO चूहों को उपयोग द्वारा व्यवहार्य हैं । हालांकि, IAV अध्ययन के लिए चूहों का उपयोग करने के कई फायदे के बगल में, वे IAV ट्रांसमिशन अध्ययन के लिए उपयोगी नहीं हैं. इसलिए, ferrets या गिनी सूअरों IAV संचरण का अध्ययन करने के लिए और अधिक उपयुक्त पशु मॉडल हैं । IAV से संक्रमित चूहों में नैदानिक लक्षण आमतौर पर दिखाई देते हैं 2-3 दिनों के बाद संक्रमण, हालांकि यह माउस उम्र के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, प्रतिरक्षा स्थिति, सेक्स, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और तनाव; साथ ही वायरल तनाव और खुराक का इस्तेमाल किया । लक्षण आहार, सुस्ती, huddling, व्याकुल फर, शरीर के वजन और मौत16,17के नुकसान शामिल हैं ।

इस पांडुलिपि में, हम वर्णन कैसे चूहों में वायरल रोगजनन मूल्यांकन करने के लिए IAV के साथ संक्रमित i.n. शरीर के वजन घटाने (रुग्णता), अस्तित्व का प्रतिशत (मृत्यु) और ऊपरी (नाक म्यूकोसा) और कम (फेफड़ों) में वायरल प्रतिकृति का आकलन द्वारा निगरानी द्वारा श्वसन तंत्र (चित्रा 1 और चित्रा 2) । IAV का रोगजनन न केवल नए IAV उपभेदों के संदर्भ में बल्कि LAIV वैक्सीन उम्मीदवारों (चित्रा 3) के सुरक्षित कार्यान्वयन में भी बहुत महत्वपूर्ण पैरामीटर है. मौसमी IAVs और IAVs कि अंय स्तनधारियों (घोड़े, कुत्ते या सूअर की तरह) को संक्रमित आमतौर पर चूहों में रोग के लक्षण11उत्पादन नहीं है,27। इस मामले में, संक्रमित चूहों के फेफड़ों या नाक म्यूकोसा में वायरल titers के विश्लेषण IAV उपभेदों के वायरल रोगजनन का मूल्यांकन करने के लिए मुख्य पैरामीटर है । एक बार फेफड़ों और नाक म्यूकोसा एकत्र कर रहे हैं, वे homogenized और इन अंगों में मौजूद वायरस की मात्रा पट्टिका परख द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख, ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक ५० (TCID५०) या किसी अन्य मान्य विधि8 ,29. हम वायरल titers का मूल्यांकन अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने की सिफारिश के बाद से पट्टिका परख MDCK कोशिकाओं की एक उच्च मात्रा की आवश्यकता है (6 अच्छी तरह प्लेट प्रारूप) और, जैसे TCID५०, अधिक समय (3-4 दिन) वायरल titers की गणना करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख करने के लिए, यह आवश्यक है: 1) एक IAV प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक विशिष्ट एंटीबॉडी (यह IAV nucleoprotein, NP के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करने की सिफारिश की है, क्योंकि यह सबसे प्रचुर मात्रा में वायरल प्रोटीन का उत्पादन किया है वायरल संक्रमण के दौरान); 2) माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित एक fluorophore करने के लिए; और 3) एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट सकारात्मक संक्रमित कोशिकाओं की गणना करने के लिए ।

चूहों की प्रतिरक्षा प्रणाली के बाद से मानव की प्रतिरक्षा प्रणाली के समान evolutionarily है16 और क्योंकि चूहों IAV संक्रमण के खिलाफ एक मजबूत और सुरक्षात्मक विनोदी प्रतिक्रिया में लाना कर सकते हैं, IAVs (या वैक्सीन उंमीदवारों) के immunogenicity आसानी से किया जा सकता है कुल निर्धारित करके मूल्यांकित (एलिसा; चित्रा 4) और बेअसर (HAI, figure 5) या VNA (आंकड़े 6) एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं । प्रतिरक्षण के बाद हास्य प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए चूहों को विभिन्न अनुमोदित विधियों जैसे रेट्रो-कक्षीय पंचर, पूंछ क्लिप, saphenous शिरा पंचर या अवअधोहनुज पंचर के द्वारा लहूलुहान किया जा सकता है. हम अवअधोहनुज पंचर तकनीक26 चुना क्योंकि प्रक्रिया संज्ञाहरण के उपयोग की आवश्यकता नहीं है और हमें प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए रक्त की एक स्वीकार्य मात्रा प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है; के रूप में रेट्रो कक्षीय पंचर, जहां चूहों anesthetized होना चाहिए के खिलाफ विरोध किया, और पूंछ क्लिप या saphenous नस पंचर, जहां रक्त की मात्रा आमतौर पर बरामद के साथ कम है ।

इस पांडुलिपि में, हमने बताया कि कैसे वायरस संक्रमित कोशिका निष्कर्षों का उपयोग कर एलिसा द्वारा कुल वायरल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए । चूंकि IAV संक्रमण एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा मध्यस्थता प्रेरित, मुख्य रूप से, वायरल हा (मुख्य प्रतिजनी वायरल लक्ष्य) के खिलाफ एंटीबॉडी द्वारा, यह अत्यधिक विशेष रूप से एलिसा के खिलाफ प्रेरित एंटीबॉडी की राशि का आकलन करने के लिए सिफारिश की है संयोजक का उपयोग कर शुद्ध हा प्रोटीन्स10. को बेअसर एंटीबॉडी की उपस्थिति का विश्लेषण, दोनों और VNA तरीके स्वीकार किए जाते है लेकिन दोनों फायदे और नुकसान है । HAI तेजी से (2-3 ज) है और रोग और नियंत्रण (सीडीसी) के लिए केंद्र द्वारा अनुमोदित IAV की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए30एंटीबॉडी बेअसर. VNA अधिक समय लेने (3-4 दिन) है, लेकिन अधिक विशिष्ट है क्योंकि यह केवल एंटीबॉडी कि वायरल संक्रमण बेअसर कर सकते है मूल्यांकन । विशेष रूप से, VNA डंठल का पता लगाने के लिए दिखाया गया है-प्रतिक्रियाशील,31एंटीबॉडी बेअसर है, साथ ही ना३२बेअसर एंटीबॉडी. VNA का एक अंय लाभ परख संवेदनशीलता है, के बाद से कम IAV (२०० FFU) की जरूरत है के रूप में हाओ परख कि लगभग ~ 104-105 FFU की आवश्यकता है । इसके अलावा, HAI परख एवियन IAVs परिणाम की व्याख्या३३,३४,३५के साथ कठिनाई के कारण के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, VNA इंफ्लूएंजा बेअसर एंटीबॉडी की पहचान के लिए कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता नहीं है ।

अंत में, हम प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए तीन मुख्य पहलुओं है कि नए IAV टीके के विकास में विचार किया जाना है का मूल्यांकन (चित्रा 3): 1) सुरक्षा: वैक्सीन सुरक्षित होना चाहिए और रोग का उत्पादन नहीं; 2) immunogenicity: टीका immunogenic होना चाहिए और दोनों विनोदी और सेलुलर सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं प्रेरित; 3) संरक्षण प्रभावकारिता: वैक्सीन WT मुताबिक़ और/या heterologous वायरस के साथ चुनौती के खिलाफ संरक्षण प्रेरित करना चाहिए । माउस मॉडल vivo में एक नए IAV वैक्सीन की पहली स्क्रीनिंग के लिए एक अच्छा विकल्प है क्योंकि यह विभिंन adjuvants, प्रतिजन/वैक्सीन खुराक, प्रशासन और व्यापक संरक्षण के उपयोग सहित विभिंन टीकाकरण योजनाओं और शर्तों, मूल्यांकन कर सकते है मुताबिक़ या heterologous IAVs उपभेदों16,17के साथ चुनौती के खिलाफ । हालांकि, मानव नैदानिक परीक्षणों के लिए आगे बढ़ने से पहले, वैक्सीन उंमीदवारों को कम से कम एक vivo मॉडल में एक दूसरे में परीक्षण किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एल एम एस प्रयोगशाला में इंफ्लूएंजा वायरस पर अनुसंधान आंशिक रूप से ंयूयॉर्क इंफ्लूएंजा उत्कृष्टता के केंद्र (NYICE), इंफ्लूएंजा अनुसंधान और निगरानी (CEIRS) के लिए उत्कृष्टता के NIAID केंद्रों के एक सदस्य द्वारा वित्त पोषित है । हम पांडुलिपि के सुधार में उसके समर्थन के लिए वेंडी Bates धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

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References

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Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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