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Immunology and Infection

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/55898
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Summary

Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.

Abstract

Virus dell'influenza causano oltre 500.000 decessi in tutto il mondo1 e sono associati con un costo annuo di 12 miliardi USD negli Stati Uniti da solo considerando diretti medici e le spese di ospedalizzazione e lavoro assenteismo2. Modelli animali sono cruciali per l'Influenza A virus (IAV) studi per valutare patogenesi virale, interazioni ospite-patogeno, le risposte immunitarie e l'efficacia del vaccino attuale e/o romanzo si avvicina così come farmaci antivirali. I topi sono un modello animale piccolo vantaggioso perché il loro sistema immunitario è evolutivamente simile a quello trovato in esseri umani, sono disponibili dai fornitori commerciali come soggetti geneticamente identici, esistono ceppi multipli che possono essere sfruttate per valutare la base genetica delle infezioni, e sono relativamente poco costosi e facili da manipolare. Ricapitolando l'infezione in esseri umani tramite le vie aeree IAV, topi sono anestetizzati prima prima dell'inoculazione intranasale con infettive IAVs sotto biosicurezza corretto contenimento. Dopo l'infezione, la patogenesi di IAVs viene determinata monitorando quotidianamente la morbosità (perdita di peso corporeo) e tasso di mortalità (sopravvivenza). Inoltre, patogenesi virale possono anche essere valutati valutando la replicazione del virus nel tratto respiratorio inferiore (polmoni) dei topi infettati o superiore (mucosa nasale). Le risposte umorali dopo l'infezione IAV possono essere rapidamente valutate da sanguinamento non-invasivo e rilevazione dell'anticorpo secondario le analisi volte a rilevare la presenza del totale o neutralizzando gli anticorpi. Qui, descriviamo i metodi comuni utilizzati per infettare i topi per via nasale (n) con IAV e valutare la patogenesi, le risposte immunitarie umorali e l'efficacia di protezione.

Introduction

IAVs sono virus capsulati classificati nella famiglia Orthomyxoviridae 3. Essi contengono otto molecole di RNA singolo filamento con polarità negativa3. In esseri umani, IAVs causare epidemie stagionali e occasionali pandemie di conseguenza importante quando nuovi virus vengono introdotti in popolazione umana4. Inoltre, IAVs stagionale sono altamente e velocemente trasmessi tra gli esseri umani producono un'elevata perdita economica in tutto il mondo ogni anno2,5. IAV sintomi includono tosse, congestione nasale, febbre, malessere, cefalea, anoressia e mialgia, ma il virus è in grado di produrre una malattia più severa in pazienti immunocompromised6. Infatti, l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) calcola che il virus dell'influenza stagionale causare 300.000-500.000 decessi in tutto il mondo ogni anno1. Ci sono solo due classi di farmaci attualmente approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) per la profilassi dell'influenza e trattamento in esseri umani: gli inibitori della neuraminidasi (NA) (ad es., oseltamivir) e bloccanti del canale ionico M2 (ad es., amantadina); Tuttavia, l'emergere di varianti di virus resistenti ai farmaci è una crescente preoccupazione. Vaccinazione, pertanto, rimane la migliore opzione medica per proteggere l'uomo contro le infezioni IAVs. Ad oggi, tre tipi di influenza sono disponibili vaccini autorizzati dalla FDA per uso umano: i vaccini di proteina ricombinante virale emoagglutinina (HA), inattivati vaccini contro l'influenza (IIV) e live-ha attenuato l'influenza vaccini (LAIV)5, 7. i tre vaccini sono progettati per indurre la risposta immunitaria adattativa contro la proteina virale HA, l'obiettivo principale di neutralizzazione degli anticorpi contro IAVs.

Un modello del mouse convalidato per studiare IAV infezione in vivo

Modelli animali sono stati utilizzati per studiare, tra gli altri, IAV patogenesi8,9,10,11, fattori virali che contribuiscono alla malattia12 e/o trasmissione virale13 ,14, e per testare l'efficacia di nuovi vaccini o antivirali farmaci9,10,15. Topi (Mus musculus) sono il più estesamente usato modello animale per la ricerca IAV per diversi motivi: 1) il sistema immunitario è evolutivamente simile a quella presente negli esseri umani; 2) basso costo, tra cui acquisto animali, alloggiamento e riproduzione; 3) di piccola dimensione per facilmente manipolare e memorizzare; 4) variabilità di host minimo per ottenere risposte omogenee e risultati; 5) una grande conoscenza della biologia di topi, tra cui la sequenza del genoma; 6) molti disponibile biologia molecolare e/o reagenti di immunologia; 7) disponibili topi knock out (KO) per studiare il contributo di una proteina di host specificato sull'infezione virale; e, 8) più ceppi di topi che possono essere sfruttate per valutare la base genetica delle infezioni.

Ci sono diversi ceppi di topi attualmente disponibili per studiare IAV in vivo. Età, stato immunitario, sesso, ceppo genetico di sfondo e il mouse così come vie di infezione, dose e ceppi virali di tutti influenzano l'esito dell'infezione IAV in topi. I ceppi del mouse più comuni usati nella ricerca IAV sono C57BL/6, BALB/C e, più recentemente, DBA.2 topi dato che sono più suscettibili alla malattia IAV che le due ex ceppi16,17,18, 19 , 20. cosa importante, la risposta immunitaria anche può essere diversa a seconda del mouse ceppo18,19,20. Così, è molto importante recuperare tutte le informazioni disponibili circa il mouse e lo sforzo IAV per scegliere l'opzione migliore per l'esperimento deve essere effettuata.

Anche se il mouse è un buon modello animale di infezione per gli studi in vivo con IAV, hanno diverse limitazioni, che devono essere considerati nel disegno sperimentale. Per esempio, una limitazione importante dell'utilizzo di topi per studi in vivo è che IAVs non trasmettono fra i topi. Così, per la trasmissione di studi, più accettati modelli animali (ad es., furetti o porcellini d'India) sono usati16,17,21. Inoltre, ci sono molte differenze tra le manifestazioni di IAV in topi e gli esseri umani. Diversamente dagli esseri umani, i topi non sviluppano febbre dopo l'infezione IAV; al contrario essi presentano con ipotermia16,17. Nei topi, replica di IAV è concentrata nelle basse vie respiratorie (polmoni) piuttosto che le vie aeree superiori. Così, virulenza di IAV nei topi non è sempre correlato a quello visto negli esseri umani. Complessivamente, perché i vantaggi superano gli svantaggi limitati, mouse rappresenta il primo modello animale utilizzato per valutare la patogenesi virale dell'influenza, l'immunogenicità e l'efficacia negli studi di vaccini e farmaci antivirali. Inoltre, non sarebbe eticamente accettabile per condurre studi con IAV utilizzando modelli animali di grandi dimensioni senza prova precedente in un piccolo modello animale di infezione IAV. In questo manoscritto, descriveremo come infettare i topi per via nasale (i.n.) con IAV, come monitorare la gravità e il decorso dell'infezione virale e come effettuare gli esperimenti necessari per valutare le risposte immunitarie umorali e l'efficacia di protezione.

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Protocol

tutti i protocolli degli animali descritti qui sono stati approvati per la cura degli animali istituzionali ed uso Committee (IACUC) e il Comitato istituzionale biosicurezza (IBC) presso la University of Rochester School of Medicine and Dentistry e rispettare con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio di ricerca nazionale del Consiglio 22. Le strutture e i programmi del Vivarium e divisione di medicina di laboratorio animale della facoltà di medicina e odontoiatria sono accreditati da AAALAC International e conformarsi alla legge dello stato, statuto federale e politica del National Institutes of Health (NIH). Requisiti simili devono essere applicati a ciascuna istituzione di aderire ai protocolli animali descritti in questo manoscritto.

1. uso di piccoli animali vertebrati

Nota: il corretto equipaggiamento di protezione individuale (dpi) è necessaria per lavorare con i topi. Requisiti minimi includono tute USA e getta, copriscarpe, testa cofano, mascherina e guanti.

  1. Secondo il protocollo IACUC, inserire un massimo di 5 topi per gabbia. Seguendo il protocollo IACUC, eutanasia topi con due metodi di eutanasia (il secondo deve essere un metodo fisico) per garantire che l'animale è morto.
    Nota: Negli esperimenti in cui IAV morbosità e mortalità vengono valutati, topi che perso il 20% del loro peso corporeo iniziale sono stati considerati di avere raggiunto l'endpoint sperimentale e sono stati eutanasizzati con CO 2 e dislocazione cervicale come il Metodo fisico secondario. Questa percentuale di peso corporeo può essere diversa in altre istituzioni. Nelle procedure dove sono raccolti i polmoni di topi e la mucosa nasale dopo infezione IAV, topi sono euthanized con una dose letale di 2,2,2-tribromoethanol (TBE) e tagliando l'epatico della vena come il metodo fisico secondario. I topi C57BL/6 a-8-week-old 6 femminili sono stati acquistati e mantenuti nella struttura di cura degli animali presso l'Università di Rochester School of Medicine and Dentistry esenti da patogeni in specifiche condizioni.

2. Biosicurezza

Nota: In questo rapporto, il IAVs usato per infettare i topi sono il comune sforzo del laboratorio del mouse-adattato di influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8 WT) 22 , 23 e una temperatura sensibili LAIV variante, PR8 LAIV 8. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono infezioni IAV (in vitro o in vivo), colture cellulari e campioni biologici, in un armadietto sotto livello di biosicurezza (BSL) -2 di sicurezza biologica condizioni. Utilizzare altri BSL tute o condizioni di contenimento, se vengono utilizzati ceppi altamente virulenti IAV.

  1. Pulire la cappa di biosicurezza con disinfettante di biossido di cloro prima e dopo aver eseguito tutte le procedure sperimentali descritte in questo manoscritto. Sterilizzare tutto il materiale di dissezione (forbici, bisturi e dissezione forcipe) e l'omogeneizzatore lisata prima e dopo il loro utilizzo corretto IBC raccomandazioni. Scartare tutto il materiale prodotto durante le procedure sotto la Guida di riferimento adeguata IBC e IACUC.

3. Intranasale infezione

  1. posto la femmina 6-a-week-old 8 C57BL/6 topi in condizioni da organismi patogeni specifici. Organizzare ed etichettare il mouse gabbie con il virus e la dose utilizzata. Identificare i topi in ogni gabbia utilizzando un codice di pugno di orecchio o con un altro metodo approvato come la pittura delle code. Inserire un massimo di 5 topi per gabbia.
  2. Preparare la diluizione di IAV (fluorescente che formano unità (FFU) / mouse) in condizioni di asepsi in un volume totale di 30 µ l/mouse sterile 1 x soluzione salina tampone fosfato (PBS). Mantenere l'inoculo di virus sul ghiaccio. Calcolare la quantità di IAV aggiungere nella diluizione virale con la formula: ((X FFU per topo/30 µ l) x volume finale) / stock titolo virale.
  3. Pesare i topi con una scala e registrare il peso di ogni topo (giorno 0). Tenere il mouse in posizione dorsale raccoglierlo per la collottola del collo tra il dito indice e il pollice. Tenere la coda contro la mano con il dito mignolo.
  4. Anestetizzare il mouse intraperitonealmente (i.p.) con 240-250 mg/kg di TBE inserendo l'ago in 2/3 caudale del lato destro dell'addome. Mettere in pausa brevemente prima di ritirare l'ago. Restituire il mouse alla gabbia e attendere 5 min.
  5. Applicare pomata oftalmica sterile agli occhi per prevenire la secchezza mentre il mouse è anestetizzato. Verifica se il mouse è anestetizzato dalla mancanza del riflesso di ritiro pedale (cioè, punta pizzico). Se i topi non sono completamente anestetizzati essi sarà tirar fuori il virus.
  6. Quando il mouse è completamente anestetizzato, posizionare il mouse in decubito dorsale. Mettere il puntale contenente 30 µ l di inoculo virus nella narice e lentamente ma costantemente espellere la soluzione. Assicurarsi che il mouse sta inalando la preparazione osservando l'inoculo goccia scomparendo.
  7. Verifica che il mouse è respirare come TBE possa deprimere il tasso di temperatura e la respirazione. Restituire l'animale alla gabbia ponendolo in decubito dorsale. Monitorare i topi per eventuali segni di afflizione respiratoria e se osservate, aiutare il topo a respirare da animale che tiene verticalmente e indurre impatto guidato respirazione 24. Controllare il mouse fino a quando si riacquista coscienza (30-45 min dopo che esso è stato anestetizzato).

4. Caratterizzazione della patogenesi virale ( Figura 1)

  1. valutazione di morbilità e mortalità ( Figura 1 e Figura 2)
    1. Infettare i.n. 3-4 gruppi di topi femminili di C57BL/6 a-8-week-old 6 (almeno 5 topi per ogni gruppo, n = 5) con dosi 10 volte (10, 10 2, 10 3 e 10 4 FFU/mouse) di WT PR8 come descritto nella sezione 3.
    2. Monitor e pesare i topi con una scala i prossimi 14 giorni contemporaneamente circa per minimizzare le variazioni di peso a causa di ingestione di cibo. Eutanasia di topi che perdono il 20% del loro peso corporeo iniziale, come descritto nella sezione 1.
    3. Dopo 14 giorni, eutanasia i topi che sopravvivono l'infezione virale, come descritto nella sezione 1.
    4. Calcolare la dose letale di virale del mouse 50% (MLD 50) sulla base dei dati di sopravvivenza ottenuti utilizzando il metodo di Reed e Muench 25. In primo luogo, calcolare la distanza di proporzione (PD):
      Equation 1
      1. successivamente, calcolare il MLD 50 dalla seguente formula:
        Equation 2
  2. valutazione di titoli virali nei polmoni e mucosa nasale ( Figura 1 e Figura 2. )
  3. recupero dei polmoni e mucosa nasale
    1. infettare i topi C57BL/6 a-8-week-old 6 i.n. femminili (n = 6) con la dose virale per testare 10-10 4 FFU di PR8 WT come descritto nella sezione 3.
    2. Raccogliere i polmoni del mouse e la mucosa nasale a giorni 2 (n = 3) e 4 (n = 3).
      1. Eutanasia i topi con una dose letale (i.p.) di TBE (500 mg/kg). Metti l'animale in decubito dorsale e disinfettare la pelliccia sopra il torace con etanolo al 70%. Tagliare la pelle con un bisturi dallo sterno alla base dell'addome. Effettuare tagli di 1 cm dalla base dell'incisione per le parti laterali dei topi con le forbici.
      2. Tagliare la vena epatica con le forbici a sanguinare il mouse come il metodo secondario di eutanasia. Mettere l'animale in posizione ventrale e attendere 2 minuti per permettere al sangue di defluire. Questo passaggio è importante per ridurre il sangue nei polmoni.
      3. Togliere la pelle da tutta la parte superiore del mouse (compresa la testa) alla base dell'addome dove la prima incisione è stata effettuata con l'ausilio di pinze e le forbici di dissezione. Tagliare la testa con le forbici e posizionarlo in una capsula di Petri sterile asciutto.
      4. Tagliare le giunzioni tra la mascella e la mandibola con le forbici e scartare la mandibola. Con le forbici, fare due tagli alle estremità degli archi zigomatici e rimuoverli. Rimuovere gli occhi con l'aiuto delle pinze per dissezione.
      5. Tenere il cranio con il forcipe di dissezione e il taglio del cranio lungo la sutura sagittale con un bisturi. Sollevare le due metà del cranio con il cervello per vedere la mucosa nasale. Le mucose nasali sono circondati da anteriore ossa del cranio, compresi il nasale, mascella superiore, Palatino, degli zigomi e ossa ethmoid.
      6. Utilizzando il bisturi, tagliare la parte del cranio con il cervello e scartare. Inserire l'altra parte del cranio con la mucosa nasale in una provetta sterile. Conservare la provetta sul ghiaccio (4 ° C) se i campioni vengono processati il giorno stesso, o il ghiaccio secco di congelarli rapidamente se i campioni saranno trattati successivamente.
      7. Per evitare la contaminazione dei campioni, pulire e disinfettare gli strumenti per dissezione tra ciascun tessuto recuperato e tra ogni dissezione animale con disinfettante di biossido di cloro.
      8. Per raccogliere i polmoni, mettere l'animale in decubito dorsale e tagliare la pleura con le forbici. Aprire la gabbia toracica tagliando le costole a 1 cm su entrambi i lati dello sterno. Fare i tagli dalla base della gabbia toracica nella parte superiore con le forbici.
      9. Fare una sezione trasversale con la forbice tra le due incisioni nella parte superiore della gabbia toracica e rimuovere la lastra del torace. Tenere i polmoni con il forcipe, tagliato all'estremità della trachea (appena prima i polmoni) con le forbici e mettere i polmoni in una provetta sterile. Conservare la provetta sul ghiaccio (4 ° C) se i campioni vengono processati il giorno stesso, o il ghiaccio secco di congelarli rapidamente se i campioni saranno trattati successivamente.
        Nota: Omogeneizzare i campioni di tessuto sullo stesso giorno che sono stati raccolti e conservare a-80 ° C per analizzare titoli virali più tardi. È importante che i campioni non sottoposti a ripetuti di congelamento-scongelamento cicli prima che i titoli del virus sono determinati. In alternativa, conservare i campioni di tessuto a-80 ° C fino a quando non saranno trattati.
  4. Omogeneizzazione dei polmoni e mucosa nasale
    1. inserire i polmoni o la mucosa nasale di un omogeneizzatore lisata sterile e aggiungere 1 mL di media raffreddore infezione. Omogeneizzare il campione spostando il pestello su e giù per circa 1 min a temperatura ambiente (TA) fino a quando i polmoni sono completamente sconvolta. Mettere il campione omogeneizzato in un tubo sterile e conservare a 4 ° C. uso un nuovo Omogeneizzatore lisata per ciascun campione.
    2. Centrifugare i campioni a 300 x g per 5-10 min a RT. raccogliere il surnatante in una nuova provetta sterile. Conservare il supernatante a 4 ° C se la titolazione virale viene eseguita lo stesso giorno e scartare il pellet. In alternativa, congelare i campioni (-80 ° C) il surnatante dell'omogeneizzato per valutare titoli virali seguito.
  5. Titolazione del virus mediante immunofluorescenza indiretta
    1. il giorno prima titolazione, piastre da 96 pozzetti con cellule epiteliali del rene canino Madin-Darby (MDCK) (4 x 10 4 cellule/pozzetto) per raggiungere la confluenza di ~ 80-90% in terreni di coltura del tessuto del seme. Posizionare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2. Il giorno della titolazione virale, controllare le cellule al microscopio per confermare un monostrato prima di iniziare l'infezione virale.
    2. 01:10 di preparare diluizioni del surnatante dei campioni omogeneizzati (polmone o mucosa nasale) nei mezzi di infezione in una piastra a 96 pozzetti. Eseguire la titolazione virale triplici copie per determinare con precisione i titoli virali.
      1. Aggiungere 90 µ l di media di infezione per ciascuno dei pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 µ l di uno del surnatante dei campioni omogeneizzati pozzetti A1, A2 e A3 per valutare il titolo virale di ciascun campione in triplice copia. Aggiungere 10 µ l del surnatante di un altro dei campioni omogeneizzati per pozzetti A4, A5 e A6. Eseguire la stessa diluizione consecutivamente con il resto dei campioni.
      2. Dopo l'aggiunta del surnatante campione alla riga A, utilizzare una pipetta multicanale per miscelare pipettando su e giù. Trasferire 10 µ l da riga A riga b modifica le punte tra diluizioni e mescolare bene. Ripetere questa operazione fino a raggiungere l'ultima riga (H).
    3. Rimuovere il mezzo di coltura tissulare (punto 4.2.3.1) utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale dalle cellule MDCK nella piastre da 96 pozzetti e lavare due volte con 100 µ l/pozzetto di PBS 1X.
    4. Trasferire 50 µ l/pozzetto del surnatante diluito in serie dei campioni omogeneizzati per la piastra a 96 pozzetti con MDCK cells. Cominciare a trasferire le diluizioni superiori (fila H) per le diluizioni inferiori (riga A). In questo caso, non è necessario cambiare le punte tra diversi file.
    5. Mettere le piastre da 96 pozzetti su una piattaforma a dondolo per 1h a RT per consentire adsorbimento virale. Dopo adsorbimento virale, rimuovere l'inoculo utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale e aggiungere 100 µ l/pozzetto di post-infezione media. Incubare le cellule infettate per 8 h in un incubatore a 33 ° C o 37 ° C con 5% CO 2. Procedere al fissaggio, colorazione, imaging e calcolo del titolo virale come descritto nei passaggi 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
    6. Rimuovere il mezzo di coltura del tessuto dalle piastre da 96 pozzetti utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale. Difficoltà e permeabilize le cellule con 100 µ l/pozzetto di soluzione di fissazione/permeabilizzazione per 20 min a RT.
      Attenzione: Utilizzare la soluzione di fissazione/permeabilizzazione in una cappa aspirante per evitare l'esposizione formaldeide.
    7. Rimuovere la soluzione di fissazione/permeabilizzazione utilizzando un adattatore per aspiratore-multicanale aspirazione, lavaggio con PBS 1X e incubare le cellule fisse con soluzione per 1h a RT. Store che blocca le cellule nella soluzione a 4 ° C di blocco o procedere al passaggio successivo.
    8. Rimuovere la soluzione bloccante. Aggiungere 50 µ l/pozzetto di 1 µ g/mL anticorpo monoclonale (mAb) anti-NP HB-65 diluito in soluzione di diluizione di anticorpo. Incubare per 1 h a 37 ° C. Different mAb o polyclonpuò essere utilizzato al (personale pAb) di anticorpi anti-PR8.
    9. Nel frattempo, diluire 1: 200 l'isotiocianato di fluorescina (FITC)-anticorpo secondario coniugato di anti-topo in soluzione di diluizione di anticorpo. Centrifughi la soluzione a 1.700 x g per 5-10 minuti a TA. Possono essere utilizzati altri anticorpi secondari coniugati con altri fluorofori.
    10. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte con 100 µ l/pozzetto di PBS 1X. Aggiungere 50 µ l/pozzetto della diluizione di anticorpo secondario ed incubare per 30-45 min a 37 ° C. Rimuovi l'anticorpo secondario e lavare 3 volte con 100 µ l/pozzetto di PBS 1X. Lasciare l'ultimo lavaggio nella piastra.
    11. Osservare le cellule con un microscopio a fluorescenza per determinare il numero di positivi cellule marcate (verde). Calcolare il titolo virale contando FFU/mL. Calcolare il titolo virale espresso in FFU/mL dalla diluizione con 30-50 cellule marcate positive utilizzando la formula: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/diluizione.

5. Valutazione delle risposte immunitarie umorali ( Figura 3)

  1. infettare i.n. 3 gruppi di topi C57BL/6 di 6-a-week-old 8 femminili (n = 5) con le dosi differenti (10 2, 10 3 e 10 4 FFU / mouse) di PR8 LAIV e mock-infettare un gruppo (n = 5) con 1x PBS sterile come controllo negativo. Eseguire le infezioni di ordine del mouse come descritto nella sezione 3.
    1. Mouse sanguinamento dalla puntura sottomandibolare
      1. quattordici giorni dopo l'immunizzazione, raccogliere il sangue di topi sottomandibolare spurgo usando una lancetta 4 mm 26, o con un altro IACUC metodo approvato.
        1. Tenere premuto il mouse raccoglierlo per la collottola del collo tra il dito indice e il pollice. Tenere la coda contro la mano con il dito mignolo per immobilizzare il mouse.
        2. Mettere il mouse in posizione laterale per vedere la guancia. Fare la puntura alla giuntura delle vene retro-orbitale e sottomandibolare con la vena giugulare. Affondare il lancet (4 mm) e recuperare il sangue in una provetta sterile (circa 0,2 - 0,4 mL/mouse vengono recuperati). Applicare una pressione sulla puntura con un tovagliolo sterile per pochi secondi. Posizionare il mouse indietro nella gabbia.
      2. Mettere i tubi per 1-2 h a 37 ° C e poi li Centrifugare a 700 x g per 30 min a RT per separare il siero dal sangue. Trasferire lo strato superiore che consiste del siero con una pipetta in una nuova provetta sterile. Scartare il pellet di globuli rossi (RBCs). Conservare il siero a -20 ° C.
  2. Analisi di totali anticorpi contro le proteine virali
    1. preparazione di estratti di cellule MDCK infetti
      1. il giorno prima dell'infezione, un piatto di 100 mm con 4-5 x 10 6 cellule MDCK (raggiungere ~ 80-90 del seme confluenza di % il giorno successivo) in terreno di coltura del tessuto. Posizionare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2. Il giorno di infezione virale, controllare le cellule al microscopio per confermare un monostrato prima di iniziare l'infezione virale.
      2. Preparare una diluizione virale con una molteplicità (0,001) basso di infezione (MOI) di PR8 WT in media di infezione in 4 mL di volume finale per totale. Calcolare la quantità di PR8 WT con la formula ((X MOI x cellule n °) x volume finale) / stock titolo virale.
      3. Il terreno di coltura del tessuto dalla piastra delle cellule MDCK di aspirare e lavare due volte con 4 mL di PBS 1X. Aggiungere l'inoculo virale (4 mL) e mettere la piastra su una piattaforma a dondolo per 1h a RT per consentire adsorbimento virale. Rimuovere l'inoculo virale con vuoto e aggiungere 8-10 mL di post-infezione supporto contenente 1 µ g/mL di tripsina TPCK-trattati. Incubare le cellule infettate per 48-72 h in un incubatore a 33 ° C o 37 ° C con 5% CO 2.
      4. Staccare le cellule con l'aiuto di un raschietto di cella e raccogliere le cellule e il terreno di coltura del tessuto con una pipetta in un tubo di 15 mL. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5-10 min a RT. aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone RIPA e mettere il composto in una provetta sterile da 1,5 mL. Incubare in ghiaccio per 20-30 min.
      5. Centrifugare la provetta a 1.300 x g per 20-30 min a 4 ° C. con attenzione, recuperare il surnatante. Negozio cella estrarre in aliquote di 100 µ l a -20 ° C.
      6. Titolo estratti delle cellule come descritto dall'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) prima la loro valutazione per la presenza di anticorpi 9 , 10 , 11 , 27. cella Include estratti da cellule MDCK mock-infettate (preparate come sopra indicato) come controllo negativo.
    2. ELISA ( Figura 4)
      1. cappotto polistirolo piastre da 96 pozzetti con la diluizione appropriata di cellule MDCK infettati estrarre in PBS 1X (di solito tra 1: 200 - 1:1, 000). Rivestire un altro piatto con la stessa diluizione dell'estratto di cellule MDCK mock-infettati come controllo negativo. Incubare per una notte (O/N) a 4 ° C.
      2. Rimuovere il supernatante utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale e lavare una volta con 100 µ l/pozzetto di PBS 1x con una pipetta multicanale. Bloccare il legame non specifico aggiungendo 100 µ l/pozzetto di blocco soluzione per 1h a RT.
      3. Nel frattempo, fare 2 volte diluizioni seriali (a partire da diluizione 01:50) dei sieri da ogni mouse infettati nel passaggio 5.1 in soluzione di diluizione dell'anticorpo in una piastra a 96 pozzetti.
      4. Rimuovere la soluzione bloccante dal polistirolo piastre da 96 pozzetti utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale. Aggiungere 50 µ l di ciascuna diluizione di siero del mouse nel pozzetto corrispondente e Incubare 1h a 37 ° C.
      5. Rimuovere i sieri di topi con un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale. Lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata, utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere 50 µ l/pozzetto di un anticorpo secondario anti-topo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito 1:2,000 in soluzione di diluizione di anticorpo. Incubare 1h a 37 ° C.
      6. Rimuovere l'anticorpo secondario con un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale. Lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata, utilizzando una pipetta multicanale. Preparare la soluzione di substrato tetrametilbenzidina (TMB) con soluzione di 1:1 A e B. aggiungere 100 µ l/pozzetto di substrato e incubare per 5-10 min a RT al buio.
      7. Fermare la reazione aggiungendo 100 µ l/pozzetto di 0,2 N H 2 così 4. Leggere le piastre a 450 nm in un lettore di piastra ELISA.
      8. Sottrarre il valore ottenuto in ogni diluizione della piastra 96 pozzetti MDCK mock-infettati dal valore ottenuto nella piastra a 96 pozzetti MDCK-infettati. Calcolare i valori medi per ogni diluizione con i sieri diversi e rappresentarli in un grafico che Mostra deviazioni standard (SD).
  3. Analisi di anticorpi neutralizzanti
    1. saggio di inibizione di emagglutinazione (HAI) ( Figura 5)
      1. prima di eseguire il test di know, trattare i sieri del mouse con il ricevitore distruggendo l'enzima (RDE) per eliminare tutti gli inibitori non specifici presenti nel siero. Aggiungere 1 volume di siero di topo 4 volumi di diluizione di lavoro RDE (diluizione del siero è ora 1:5). Incubare O/N (12- 18 ore) a bagnomaria a 37 ° C.
      2. Riscaldare i campioni di siero a 56 ° C per 30 minuti inattivare il RDE.
      3. Pre-determinare l'attività di emagglutinazione (HAU) di PR8 WT di standard di analisi HA 28. Una volta determinata la HAU virale, diluire lo stock virale per 8 unità di emoagglutinazione per 50 µ l di PBS 1X.
      4. Preparare diluizioni seriali 2 volte (12 diluizioni) dei sieri RDE-trattati in una piastra a 96 pozzetti fondo V. Utilizzare una riga per ogni campione di siero (ad esempio, A1-A12).
        1. Aggiungere 25 µ l di 1X PBS da A1 A12 pozzetti. Prova ciascuno dei campioni di siero in una riga. Aggiungere 25 µ l di sieri RDE-trattati (1:5) a 25 µ l di PBS 1X nel primo pozzetto della colonna (A1). La prima diluizione di siero è 01:10.
        2. Una volta che tutti i sieri RDE-trattati vengono aggiunti alla prima colonna, (ad esempio, A1, B1, C1), utilizzare una pipetta multicanale per miscelare i sieri e 1x PBS pipettando su e giù. Trasferire 25 µ l del siero diluito dalla prima colonna nella seconda colonna (ad esempio, tra A1 e A2). Cambiare le punte tra diluizioni e mescolare.
        3. Ripetere i passaggi 5.3.1.4.2. fino a raggiungere l'ultima colonna (ad esempio, A12, B12, C12). Scartare il 25 µ l dall'ultima colonna, mantenendo il volume costante in tutti i pozzetti (25 µ l). Includere una riga di pozzetti contenenti solo 25 µ l di PBS 1X senza qualsiasi sera come controllo negativo.
      5. Aggiungere 25 µ l della IAV diluito a 8 HAU/50 µ l di ciascuno dei pozzetti con sieri nella piastra 96 pozzetti fondo V; il volume finale in ciascuna è ben 50 µ l, contenente 4 HAU del virus. Mescolare il contenuto pipettando ripetute. Incubare per 1 h a RT.
      6. Aggiungere 50 µ l di 0,5% Turchia RBCs a ciascuno dei pozzi. Mescolare il contenuto pipettando ripetute. Incubare la piastra per 30-45 min sul ghiaccio. Leggere il saggio di know visivamente quando i globuli rossi nei pozzetti di controllo (1x PBS) formano un precipitato rosso (cioè, pellet) presso il fondo dei pozzetti.
        Nota: RBCs da altre specie come pollo, cavia o cavallo può anche essere usato.
      7. Calcolare i titoli HAI identificando l'ultimo in cui i globuli rossi formano una pallina rossa ed emagglutinazione non si verifica.
        Nota: Il valore reciproco di questa diluizione è il titolo di know. Il valore reciproco viene moltiplicato per un fattore di 20 per correggere il 01:20 diluizione del siero nella prima riga.
    2. Analisi di virus microneutralization (VNA) ( Figura 6)
      1. preparare il giorno prima VNA, cellule MDCK in una piastra a 96 pozzetti per raggiungere la confluenza di 80-90% il giorno successivo come descritto al punto 5.2.1.1. Preparare una diluizione di PR8 WT in media di infezione ad avere 200 FFU/25 µ l.
      2. Inactivate i sieri di mouse a 56 ° C per 1 h. effettuare diluizioni seriali 2 volte (12 diluizione) per sieri del mouse in triplice copia utilizzando una piastra a 96 pozzetti.
        1. Aggiungere 40 µ l di siero a 160 µ l di media di infezione nel primo pozzetto della prima riga, (ad esempio, A1) (siero diluizione 1:5). Mescolare pipettando. Aggiungere 100 µ l di media di infezione per gli altri pozzi (da A2 a H12).
        2. Trasferire 100 µ l dalla prima riga nella seconda riga per effettuare diluizioni 1:2 (ad es., tra A1 e A2). Cambiare suggerimenti tra diluizioni e mix di pipettaggio. Ripetere questa operazione fino a quando l'ultima riga (ad es., A12). Eliminare 100 µ l dall'ultima fila, mantenendo il volume costante in tutti i pozzetti (100 µ l).
      3. Aggiungere 100 µ l della diluizione di IAV in tutti i pozzetti. Incubare 1h a RT. Nel frattempo, rimuovere il terreno di coltura del tessuto dalle cellule MDCK nella piastra 96 pozzetti utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale e lavare due volte con 100 µ l/pozzetto di PBS 1X.
      4. In ogni piastra a 96 pozzetti delle cellule MDCK, lasciare due righe per i controlli. Una riga è il controllo negativo (cellule senza virus e sieri), e l'altra riga è il controllo positivo dell'infezione (cellule con virus in assenza di sieri o sieri da topi infettati mock).
      5. Trasferire 50 µ l/pozzetto dalla piastra di virus-anticorpo per le piastre da 96 pozzetti delle cellule MDCK. Mettere le piastre su una piattaforma a dondolo per 1h a RT per consentire adsorbimento virale.
      6. Rimuovere l'inoculo di virus-anticorpo utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale e aggiungere 100 µ l/pozzetto di post-infezione media contenente 1 µ g/mL di tripsina trattati TPCK.
      7. Incubare le cellule in un incubatore di 33 ° C o 37 ° C con 5% CO 2 ~ 3-4 giorni fino a quando l'effetto citopatico (CPE) è osservata nel controllo positivo (cellule infettate in assenza dei sieri o con siero di controllo).
      8. Rimuovere il mezzo di coltura del tessuto utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale e aggiungere 100 µ l/pozzetto di 0,1% cristallo viola. Incubare per 1 h a RT. Remove la soluzione di cristalvioletto utilizzando un adattatore per aspirazione aspiratore-multicanale. Lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata. Asciugare le piastre a RT.
      9. Calcolare i titoli VNA identificando la diluizione più elevata che mantiene un monostrato di cellule confluenti di cellule MDCK.
        Nota: Il valore reciproco di questa diluizione corrispondente è il titolo dell'anticorpo neutralizzante. Il valore reciproco viene moltiplicato per un fattore 10 per correggere il 01:10 diluizione dei sieri nel primo pozzetto della riga.

6. Valutazione di protezione efficacia vaccini ( Figura 3)

  1. i.n. vaccinare un gruppo di topi C57BL/6 di 6-a-week-old 8 femminili (n = 11) con la dose di PR8 LAIV per verificare (FFU/mouse) e mock-vaccinare un altro gruppo di topi (n = 11) con 1x PBS sterile. Eseguire le vaccinazioni di i.n. del mouse come precedentemente descritte nella sezione 3.
  2. Quattordici giorni dopo la vaccinazione, sanguinare i topi e raccogliere i sieri, come descritto nella sezione 3. Analizzare la presenza di totale e neutralizzando gli anticorpi contro PR8 WT come descritto nella sezione 5.1.1.
  3. Quindici giorni dopo la vaccinazione, misurare e registrare il peso del corpo del mouse (giorno 0). Sfida i topi i.n. con una dose letale del WT PR8 (omologa sfida) come precedentemente descritta nella sezione 3.
  4. Misurare il peso corporeo e la sopravvivenza (n = 5 / gruppo) durante 14 giorni dopo la sfida di valutare la morbosità e la mortalità prodotta dalla sfida PR8 WT in topi vaccinati (sezione 4.1).
  5. Recuperare i polmoni del mouse e mucosa nasale (n = 3/giorno) al giorno 2 e giorno 4 Post-sfida con PR8 WT omogeneizzare e analizzare i polmoni e mucosa nasale come descritto nella sezione 4.2 per valuta la replicazione virale di PR8 WT in topi vaccinati.

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Representative Results

Caratterizzazione della patogenesi virale in topi

La patogenesi di IAV è legata alla morbosità ed alla mortalità causata tramite l'infezione. Questi due parametri possono essere valutati in topi facilmente: IAV morbosità è associato con perdita di peso corporeo in topi infettati e la percentuale di sopravvivenza indicherà il tasso di mortalità (Figura 1). Il peso corporeo e la sopravvivenza in topi infettati IAV solitamente sono monitorate giornalmente per almeno due settimane dopo l'infezione8,9,10,29. I dati di sopravvivenza ottenuti possono determinare il MLD50 che è stata calcolata utilizzando il metodo di Reed e Muench25. Un altro indicatore della patogenesi IAV è relativo alla replicazione virale in basso (polmoni) e nel tratto respiratorio superiore (mucosa nasale) (Figura 1). Le informazioni ottenute con il titolo virale in questi organi corrispondono ai valori di mortalità, morbilità ed e presi insieme forniscono una buona indicazione della patogenesi virale. È noto che replica IAV nei polmoni del mouse picco tra post-infezione giorni 2 e 4 (p.i.), e quindi si consiglia di recuperare questi organi a giorni 2 e 4 p.i.

Figure 1
Figura 1: caratterizzazione della patogenesi IAV in topi: IAV patogenesi nei topi è legata alla sua morbilità (perdita di peso corporeo) e mortalità (% di sopravvivenza) e anche per la capacità di IAV di replicare nel tratto respiratorio (polmoni) inferiore e superiore (mucosa nasale). Brevemente, il giorno 0 topi sono pesati e anestetizzati per via intraperitoneale con 2,2,2-tribromoethanol (TBE) prima che sono infettati per via nasale con IAV. Dal giorno 1 al giorno 14, topi vengono pesati ogni giorni per valutare la perdita di peso corporeo (morbosità) e % sopravvivenza (mortalità) per calcolare la dose letale 50 (MLD50) di mouse. Nei giorni 2 e post-infezione giorno 4, polmoni di topi e mucosa nasale sono recuperati e omogeneizzati per valutare la replicazione virale. Esperimenti di topi per caratterizzare la patogenesi IAV utilizzando PR8 WT avvengano in condizioni di BSL-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In Figura 2, i dati ottenuti nella valutazione della patogenesi PR8 WT sono rappresentati. Quattro gruppi di topi C57BL/6 a-8-week-old 6 (n = 11) sono stati infettati i.n. con le dosi indicate (10, 102, 103 e 104 FFU/mouse) di PR8 WT. Il peso corporeo e la sopravvivenza dei 5 topi per ogni gruppo sono stati misurati da 14 giorni p.i. (Figura 2A–B). Tutti i topi immunizzati con 104 FFU di PR8 WT perso peso rapidamente (Figura 2A) e tutti loro morì a giorni 5 e 6 p.i. (Figura 2B). Topi immunizzati con il peso corporeo di FFU di PR8 WT perso3 10 a tempi successivi p.i. (Figura 2A) e sono tutti morto da giorni 7 e 8 p.i. (Figura 2B). Tutti i topi immunizzati con 102 FFU di PR8 WT perso peso corporeo (Figura 2A) ma solo 2 di loro sono morti al giorno 9 p.i. (Figura 2B). Infine, topi immunizzati con 10 FFU di PR8 WT non ha perso peso (Figura 2A) e tutti loro sono sopravvissuti infezione (Figura 2B). La MLD50 di PR8 WT in questo esperimento calcolato con il metodo Reed e Muench25 era 1.5 x 102 FFU (Figura 2).

Per valutare la replica PR8 nella parte superiore e inferiore respiratorie tratto dei topi infettati i.n. con le dosi indicate (10, 102, 103e 104 FFU/mouse), i polmoni e la mucosa nasale sono stati recuperati a giorni 2 e 4 p.i. (n = 3). Dopo omogeneizzazione del polmone, la quantità di virus presente in questo organo è stata analizzata da analisi di immunofluorescenza (Figura 2D). Il titolo virale rilevato nei polmoni dei gruppi differenti di topi è stato collegato con la dose utilizzata per immunizzare li: più alti titoli virali sono stati rilevati nei polmoni dei topi immunizzati con 104 FFU di PR8 WT a p.i. giorni 2 e 4, mentre i titoli virali più bassi sono stati rilevati in i polmoni di topi immunizzati con 10 FFU di PR8 WT.

Figure 2
Figura 2: rappresentazione dei dati ottenuti nella valutazione della patogenesi virale: Per analizzare la morbosità e la mortalità di PR8 WT, topi C57BL/6 femminili a-8-week-old 6 (n = 5) erano infetti i.n. con il numero indicato di fluorescente-formare unità (FFU) di PR8 WT e quindi monitorate giornalmente per 2 settimane per la perdita di peso corporeo (A) (morbosità) e (B) sopravvivenza (mortalità). I dati rappresentano i mezzi e le deviazioni standard di risultati determinati per singoli topi (n = 5). (C) valori di sopravvivenza % valutati oltre 2 settimane sono utilizzati per calcolare il MLD50 usando il metodo Reed e Muench25. (D) per valutare la replicazione virale, i topi C57BL/6 femminili a-8-week-old 6 (n = 6) erano infetti i.n. con il numero indicato di FFU. Replicazione virale nei polmoni o mucosa nasale dei topi infettati solitamente viene valutata a giorni 2 e 4 p.i. usando un'analisi di immunofocus. Titoli virali sono registrati come FFU/mL. I dati rappresentano i mezzi e la SDs dei risultati ottenuti in ogni mouse. Le linee tratteggiate sono incluse per indicare il limite di rilevazione (FFU 200ml) del test. Topi ed esperimenti di coltura del tessuto per valutare IAV morbosità, mortalità e titoli virali utilizzando PR8 sono stati effettuati in condizioni di BSL-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione delle risposte umorali indotte dopo la vaccinazione

Le risposte umorali indotte dall'infezione IAV svolgono un ruolo essenziale nel controllo di infezione virale. Per questo motivo, è molto importante analizzare le risposte umorali suscitate da infezioni IAV WT o da nuovi vaccini IAV (Figura 3). Nel modello del topo, 14 giorni dopo l'immunizzazione, topi sono bled per analizzare la presenza di anticorpi contro le proteine virali totali da ELISA (Figura 4) e la presenza degli anticorpi la proteina virale HA, che di solito è il targeting di neutralizzazione analizzati da approcci sierologici comuni, ad esempio un know dosaggio (Classe ng = "xfig" > figura 5) e/o un VNA (Figura 6).

Figure 3
Figura 3: schema dei diversi passi nella caratterizzazione della sicurezza, immunogenicità e l'efficacia di protezione di un LAIV: Quando viene sviluppato un nuovo LAIV, modello murino di infezione di IAV è solitamente utilizzato per testare l'efficacia di sicurezza, immunogenicità e protezione. In questo schema, gli esperimenti di sicurezza (A), di valutare l'immunogenicità (B) e (C) l'efficacia di protezione di un candidato LAIV sono indicati. (A) per valutare la sicurezza di un LAIV è necessario analizzare gli stessi parametri (morbilità, mortalità e replicazione virale nella tomaia vie respiratorie inferiori e) descritto nella Figura 1. Per valutare l'immunogenicità, topi sono immunizzati e 14 giorni dopo la vaccinazione essi sono sanguinati dalla puntura sottomandibolare. Le risposte umorali sono analizzate valutando la presenza di totale anticorpi contro le proteine di IAV di analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) e valutando la presenza degli anticorpi da analisi di inibizione di emagglutinazione (HAI) e/o virus di neutralizzazione microneutralization test (VNA). (C) per valutare l'efficacia di protezione, 15 giorni dopo la vaccinazione, topi sono sfidati con IAV WT. Protection efficacia viene valutata tramite la misura di topi morbilità, mortalità e titoli virali nei polmoni dei topi sfidati come descritto in figura 1 . Esperimenti di topi per caratterizzare l'efficacia di sicurezza, immunogenicità e la protezione di un candidato LAIV avvengano in condizioni di BSL-2. Altri Tute BSL o condizioni di contenimento possono essere richieste a seconda del ceppo IAV utilizzato per la sfida dei topi vaccinati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per valutare l'immunogenicità di PR8 LAIV, tre gruppi di topi C57BL/6 a-8-week-old 6 (n = 5) sono stati immunizzati con differenti dosi (102, 103e 104 FFU/mouse) di PR8 LAIV o derisione vaccinati con PBS 1X come controllo negativo. Quattordici giorni dopo la vaccinazione, sieri di topi sono stati raccolti da spurgo sottomandibolare26 (Figura 3). Le risposte dell'anticorpo contro le proteine virali totale sono state valutate da ELISA utilizzando una diluizione di 1: 200 di Estratto delle cellule delle cellule MDCK PR8-infettati (Figura 4). Ogni siero è stato analizzato singolarmente. I risultati indicano che i sieri dai topi immunizzati con la dose elevata (104 FFU) di PR8 LAIV hanno avuti più alti titoli dell'anticorpo contro proteine totali PR8 di sieri di topi immunizzati con la dose più bassa (102 FFU). Controllo di sieri (topi infettati mock) non hanno mostrato reattività contro gli antigeni PR8.

Figure 4
Figura 4: rappresentazione schematica dell'enzima-ha collegato l'analisi dell'immunosorbente (ELISA) per valutare le risposte dell'anticorpo umorale: Livelli di anticorpi PR8-specifici presenti in topi infettati sono determinati da ELISA in polistirene 96 pozzetti piastre rivestite con estratti di cellule da mock (controllo) o cellule MDCK PR8-infettati. Brevemente, a 14 giorni p.i. (Figura 3), topi immunizzati con le dosi indicate di LAIV PR8 erano bled dalla puntura sottomandibolare e sieri sono stati raccolti. Ogni siero è stato valutato singolarmente da ELISA per gli anticorpi di IgG contro le proteine totali PR8. Dati del grafico rappresentano il mezzo e deviazioni standard dei risultati ottenuti dai singoli topi sieri (n = 6). O. d, densità ottica. I test ELISA sono stati eseguiti in un armadio di BSL-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per analizzare la presenza di neutralizzazione degli anticorpi nel topo siero usando il know analizzare, diluizioni seriali 2 volte di sieri (precedentemente inattivati a 56 ° C) di ogni gruppo di topi immunizzati con differenti dosi (102, 103e 104 FFU) di PR8 LAIV sono state incubate con 4 HAU di PR8 WT per 1h a RT (Figura 5). Poi, 0,5% di RBCs in Turchia sono stati aggiunti alle miscele PR8-sieri. La parte superiore della Figura 5 è una rappresentazione schematica dei possibili risultati know: quando il siero contiene anticorpi neutralizzanti, RBCs precipitazione è osservato nella parte inferiore del pozzo perché gli anticorpi associati alla proteina virale HA prevenire l'emagglutinazione dei globuli rossi. D'altra parte, in assenza di anticorpi neutralizzanti, emoagglutinazione dei globuli rossi è osservato. Quindi, il titolo di know è calcolato come il reciproco della diluizione del siero nell'ultimo emagglutinazione bene carente. I risultati di know ha mostrati nella parte inferiore della Figura 5 indicano che il siero da mouse vaccinati con la maggior quantità di LAIV PR8 (104 FFU) hanno il più alto titolo di anticorpi neutralizzanti, mentre il siero da un mouse immunizzato con il dose più bassa (102 FFU) hanno il più basso titolo di neutralizzazione degli anticorpi contro PR8. Anticorpi neutralizzanti non erano presenti in siero controllo (topi mock-infettati).

Figure 5
Figura 5: test di emoagglutinazione (HAI): Livelli di neutralizzazione degli anticorpi contro PR8 WT in topi infettati possono essere facilmente valutati dall'analisi di know. Brevemente, 2 volte diluizioni seriali (a partire da diluizione 01:10) di sieri di topi immunizzati con le dosi indicate di LAIV PR8 erano misti (1:1) con 4 HAU di PR8 WT per 1h a RT in una piastra a 96 pozzetti fondo V. Dopo 1 h di incubazione, 0,5% globuli rossi sono stati aggiunti alle miscele virus-siero per 30-60 min sul ghiaccio. I titoli know sono determinati individuando l'ultimo in cui i globuli rossi formano un pulsante rosso ed emagglutinazione non si verifica (in alto). HAI analisi con PR8 WT sono state eseguite in un armadio di BSL-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In Figura 6, i dati ottenuti nella valutazione di neutralizzazione degli anticorpi nel siero del mouse da VNA sono rappresentati. FFU 200 di PR8 WT sono stati mescolati con diluizioni seriali 2 volte di sieri (precedentemente inactivated a 56 ° C) da topi immunizzati con differenti dosi (102, 103e 104 FFU) di PR8 LAIV per 1 h a TA. Ogni campione di siero è stato valutato in triplice copia. Le miscele virus-sieri sono state utilizzate per infettare monostrati di cellule MDCK in una piastra a 96 pozzetti. La parte superiore della Figura 6 è una rappresentazione schematica dei possibili risultati VNA: assenza di neutralizzazione degli anticorpi nei risultati del siero in CPE a circa 3-4 giorni p.i. Al contrario, quando sono presenti anticorpi neutralizzanti (monostrati di cellule intatte), si legano all'HA virale e prevenire l'infezione virale, e non c'è nessun CPE. Presenza di CPE è solitamente visualizzata tramite colorazione le cellule infettate con cristalvioletto e i titoli di neutralizzazione virale sono calcolati come il reciproco della diluizione ultimo in cui l'infezione è completamente bloccato. I risultati del VNA sono rappresentati nella parte inferiore di Figura 6. Il siero da topi immunizzati con l'elevata quantità di LAIV PR8 (104 FFU) sono il più grande titolo degli anticorpi neutralizzanti mentre i sieri di topi immunizzati con la più bassa dose o PR8 LAIV (102 FFU) hanno il più basso titolo di neutralizzazione degli anticorpi, simile ai risultati ottenuti con il dosaggio di know. Anticorpi neutralizzanti non erano presenti nel siero da topi infettati mock.

Figure 6
Figura 6: analisi di Virus Microneutralization (VNA): Un'alternativa per il dosaggio di know, il dosaggio VNA può valutare la presenza di WT PR8 anticorpi neutralizzanti. Brevemente, i sieri da topi vaccinati con le dosi indicate di LAIV PR8 erano in serie 2 volte diluito (inizio diluizione 1:5) in piastre da 96 pozzetti e misto 1:1 con 200 FFU di PR8 WT per 1 h a TA. Dopo 1 h, le miscele virus-siero sono state utilizzate per infettare piastre da 96 pozzetti delle cellule MDCK. Cellule infette sono state incubate per 3-4 giorni fino al completo effetto citopatico. Le piastre da 96 pozzetti quindi erano macchiate con cristalvioletto di 0.1%. I titoli VNA sono determinati identificando la diluizione più alta a conservare un monostrato di cellule confluenti. VNA con PR8 WT sono stati effettuati in condizioni di BSL-2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione dell'efficacia di protezione di vaccini IAV in topi

Quando viene sviluppato un nuovo LAIV, sua efficacia sicurezza, immunogenicità e protezione dovrà essere testati in vivo, e il modello del mouse di solito è il primo modello animale scelto di analizzare questi parametri. Figura 3 è una combinazione delle diverse fasi necessarie per caratterizzare un nuovo LAIV nei topi. Per valutare la sicurezza di un LAIV (Figura 3A), i topi sono infetti i.n. utilizzando un protocollo simile alle procedure sperimentali descritti nella sezione patogenesi (sezione 4), e il peso corporeo e sopravvivenza monitoraggio fornirà informazioni relazionati al la morbosità e la mortalità di LAIV (figure 2A–2B), tra cui il MLD50. Inoltre, al momento dell'inoculazione con dosi di vaccino diverso, la replica di LAIV in basso (polmoni) e nel tratto respiratorio superiore (mucosa nasale) dovrebbe essere valutati8,9,10, 11,29 (Figura 2D). Per testare l'immunogenicità, sieri di topi vaccinati con il LAIV sono raccolti prima della sfida con PR8 WT (omologa sfida), utilizzando protocolli simili a quelle descritte nella sezione immunogenicità (sezione 5) (Figura 3B). La presenza di totale e neutralizzando gli anticorpi nel siero può essere rilevata da ELISA e HAI e/o VNA, rispettivamente.

Infine, per testare l'efficacia di protezione, topi vaccinati LAIV sono sfidati con PR8 WT e l'efficacia di protezione è caratterizzata da monitoraggio morbosità, mortalità e la presenza di sfida PR8 WT nei polmoni, come descritto in precedenza nella sezione 4 ( Figura 3)8,9,10,11. Se il LAIV induce protezione contro la sfida PR8 WT, topi non perderà peso corporeo e sopravvivranno la sfida letale con IAV WT. Inoltre, il titoli virali IAV WT nei polmoni non verranno rilevato o sarà notevolmente ridotta rispetto al mock (PBS) vaccinati topi8,9,10,11.

Soluzioni e terreni di coltura del tessuto Composizione Deposito Uso Commenti
Terreni di coltura del tessuto: Dulbecco s modified esente Eagle (DMEM), 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina-streptomicina-L-Glutammina (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG) 445 DMEM, 50 ml di FBS e 5 ml di 100 x 1% penicillina (100 unità/ml)-streptomicina (100 µ g/ml) - L - Glutammina (2 mM) (PSG) Conservare a 4° C Questo supporto viene utilizzato per la manutenzione delle cellule epiteliali del rene canino Madin-Darby (MDCK)
Post-infezione media: DMEM 0,3% albumina bovina (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG) 491 ml DMEM, 4,2 ml di 35% BA e 5 ml di 100 x PSG Conservare a 4° C Questo supporto viene utilizzato per la manutenzione delle cellule MDCK dopo l'infezione con il virus di riossidazione A (IAV)
10x tamponato fosfato salino (PBS x 10) 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na2HPO4.7h2O, 2 g di KH2PO4. Aggiungere ddH2O fino a 1 L. Adjust pH 7,3 Conservare a temperatura ambiente (TA) Sterilizzare in autoclave
1x PBS Diluire 10 x PBS 01:10 con ddH2O Conservare a RT Sterilizzare in autoclave
Infezione media: 1X PBS, 0,3% BA, 1% penicillina-streptomicina (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1x PBS sterile, 4,2 ml di 35% BA e 5 ml di 100 x 1% penicillina (100 unità/ml)-streptomicina (100 µ g/ml) (PS) Conservare a 4 ° C Questo supporto viene utilizzato per le infezioni IAV
Soluzione di fissazione/permeabilizzazione: formaldeide 4%, 0,5% triton X-100 diluito in PBS 1X 400 mL neutra tamponata Formalina 10%, 5 ml di Triton X-100 e 595 ml di PBS 1X
d > Store presso RT Questa soluzione viene utilizzata per difficoltà e permeabilize le cellule MDCK negli esperimenti di Titolazione virale Preparare la soluzione in una cappa per evitare l'esposizione alla formaldeide Soluzione di blocco: 2,5% albumina di siero bovino (BSA) in PBS 1X 2,5 g di BSA in 97,5 mL di PBS 1X Conservare a 4 ° C Questa soluzione è utilizzata come soluzione di blocco per Elisa e analisi di immunofluorescenza. Sterilizzare mediante filtrazione con filtro di 0,2 µm. Soluzione di diluizione dell'anticorpo (1% BSA in PBS 1X) 1 g di BSA in 99 mL di PBS 1X Conservare a 4 ° C Questa soluzione viene utilizzata per la diluizione degli anticorpi primari e secondari in Elisa e analisi di immunofluorescenza Sterilizzare mediante filtrazione con filtro di 0,2 µm 0,1% soluzione viola di cristallo 1 g di cristalvioletto in 400 ml di metanolo. Aggiungere 600 ml di ddH2O Conservare a RT Questa soluzione viene utilizzata per difficoltà e macchiare le cellule MDCK nelle analisi di neutralizzazione virale Tosylsulfonyl phenylalanyl clorometil chetone (TPCK)-trattata tripsina Preparare una soluzione di riserva 1.000 x a 1 mg/ml in ddH2O Conservare a-20 ° C TPCK-tripsina viene aggiunto nelle infezioni IAV Rendere le aliquote di 100 µ l Buffer di RIPA 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% sodio desossicolato, 0.1% SDS, 140 mM NaCl Conservare a 4 ° C Questa soluzione è usata per fare cella estratti

Tabella 1: tessuto di coltura e soluzioni.

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Discussion

Modello del topo di IAV è ampiamente usato per in vivo gli studi di efficacia di patogenesi, immunogenicità e protezione IAV. Le piccole dimensioni dei topi li rende facili da manipolare e memorizzare rispetto agli altri modelli animali come furetti o porcellini d'India. Inoltre, la facilità in termini di costo di animale, alloggiamento e riproduzione permettono loro uso nelle prove di vaccinazione pre-clinici in cui sono necessarie grandi quantità di animali. In particolare, dal momento che i topi sono stati utilizzati in discipline di ricerca multiple, diversi molecolare e immunologia murino reagenti sono disponibili per facilitarne l'utilizzo per gli studi IAV. Inoltre, la variabilità di host minima e la presenza di un sistema immunitario che è evolutivamente simile a quella presente in esseri umani li rendono un robusto piccolo modello animale per gli studi IAV. Infine, lo studio delle interazioni ospite-virale della proteina e il loro contributo alla patogenesi virale sono attualmente realizzabili dall'accesso ai topi KO. Tuttavia, accanto a molteplici vantaggi di usando topi per studi IAV, non sono utili per gli studi di trasmissione IAV. Di conseguenza, furetti o porcellini d'India sono più adatti modelli animali per studiare la trasmissione IAV. I sintomi clinici in topi infettati con IAV solitamente compaiono 2-3 giorni post-infezione, anche se questo può variare a seconda della età del mouse, lo stato immunitario, sesso, patrimonio genetico e ceppo; così come ceppo virale e dose utilizzata. I sintomi includono anoressia, letargia, rannicchiato, arruffato pelliccia, perdita di corpo peso e morte16,17.

In questo manoscritto, descriviamo come valutare la patogenesi virale in topi infettati i.n. con IAV monitorando la perdita di peso corporeo (morbosità), percentuale di sopravvivenza (mortalità) e valutando la replicazione virale in alto (mucosa nasale) e inferiore (polmoni) delle vie respiratorie (Figura 1 e Figura 2). La patogenesi di IAV è un parametro molto importante non solo nel contesto di nuovi ceppi di IAV, ma anche nell'implementazione sicura di candidati vaccinali LAIV (Figura 3). Stagionale IAVs e IAVs che infettano altri mammiferi (come cavalli, cani o maiali) non producono solitamente segni di malattia in topi11,27. In questo caso, l'analisi dei titoli virali nei polmoni o mucosa nasale dei topi infettati è il parametro principale per valutare la patogenesi virale dei ceppi IAV. Una volta che i polmoni e la mucosa nasale sono raccolti, essi sono omogeneizzati e la quantità di virus presente in questi organi possa essere analizzata dall'analisi di placca, immunofluorescenza, coltura tissutale infettiva dose 50 (TCID50) o un altro metodo convalidato8 ,29. Si consiglia di valutare i titoli virali mediante immunofluorescenza indiretta poiché il saggio della placca richiede una maggiore quantità di cellule MDCK (formato piastra a 6 pozzetti) e, come il TCID50, è necessario più tempo (3-4 giorni) per calcolare i titoli virali. Tuttavia, per eseguire il test di immunofluorescenza indiretta, è necessario disporre di: 1) primari specifici anticorpi contro una proteina IAV (si raccomanda di usare un anticorpo contro la nucleoproteina IAV, NP, dal momento che è la più abbondante proteina virale prodotta durante l'infezione virale); 2) secondari anticorpi coniugati ad un fluorophore; e 3) un microscopio a fluorescenza per contare le cellule infettate positive fluorescente.

Poiché il sistema immunitario dei topi è evolutivamente simile al sistema immunitario di esseri umani16 ed topi possono suscitare una risposta umorale forte e protettiva contro l'infezione IAV, l'immunogenicità di IAVs (o vaccini candidati) può essere facilmente valutato determinando totale (ELISA; Figura 4) e neutralizzare (know, Figura 5) o risposte anticorpali VNA (figure 6). Per analizzare le risposte umorali dopo immunizzazione, topi possono essere effettuati da diversi metodi approvati come puntura retro-orbitale, clip coda, puntura della vena safena o puntura sottomandibolare. Abbiamo scelto la tecnica di puntura sottomandibolare26 perché la procedura non richiede l'uso dell'anestesia e permette di ottenere un volume accettabile di sangue per gli studi immunologici; in contrasto con la puntura di retro-orbitale, dove topi devono essere sottoposto ad anestesia e con la coda clip o la puntura della vena safena, dove il volume di sangue recuperato solitamente è basso.

In questo manoscritto, abbiamo descritto come valutare la presenza di anticorpi contro le proteine virali totale da ELISA utilizzando estratti cellulari infetti da virus. Poiché l'infezione IAV induce un'immunità protettiva mediata, principalmente, dagli anticorpi contro l'HA virale (che sono la principale destinazione antigenica virale) si consiglia vivamente di valutare la quantità di specifici anticorpi indotti contro HA da ELISA utilizzando ricombinante purificata HA proteine10. Per analizzare la presenza di anticorpi neutralizzanti, sono accettati metodi HAI sia VNA ma entrambi hanno vantaggi e svantaggi. L'HAI è rapida (2-3 h) e approvato dal centro per la malattia e Control (CDC) per valutare la presenza di IAV neutralizzando gli anticorpi30. La VNA è più molto tempo (3-4 giorni) ma è più specifico, poiché restituisce solo gli anticorpi che possono neutralizzare l'infezione virale. In particolare, la VNA è stato indicato per rilevare gambo-reattiva HA neutralizzando gli anticorpi31, come pure NA neutralizzando gli anticorpi32. Un altro vantaggio del VNA è la sensibilità del test, dal meno IAV (200 FFU) è necessario rispetto al dosaggio HAU che richiede circa 10 ~4-105 FFU. Inoltre, il dosaggio HAI può essere problematico per la rilevazione di anticorpi neutralizzanti contro aviaria IAVs a causa di difficoltà con l'interpretazione di risultati33,34,35. Inoltre, VNA non richiede l'uso di globuli rossi per l'identificazione di anticorpi neutralizzanti l'influenza.

Infine, descriviamo le procedure sperimentali per valutare i tre aspetti principali che devono essere considerati nello sviluppo di nuovi vaccini IAV (Figura 3): 1) sicurezza: il vaccino deve essere sicuro e non produrre malattia; 2) immunogenicità: il vaccino deve essere immunogenico e indurre risposte protettive sia umorale e cellulare; 3) l'efficacia di protezione: il vaccino deve indurre protezione contro la sfida con i virus omologo o eterologo WT. Il modello del mouse è una buona scelta per la prima proiezione di un nuovo IAV vaccino in vivo , perché può valutare diversi di vaccinazione e condizioni, compreso uso di adiuvanti differenti, dose di antigene e i vaccini, amministrazione e ampia protezione contro sfida con omologa o eterologa IAVs ceppi16,17. Tuttavia, prima di procedere al test clinici umani, vaccini candidati dovrebbero come minimo essere testati in un secondo modello in vivo .

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ricerca sul virus dell'influenza in laboratorio LM-S è parzialmente finanziata dal The New York Influenza Center of Excellence (NYICE), un membro dei NIAID centri di eccellenza per la ricerca sull'Influenza e sorveglianza (CEIRS). Ringraziamo Wendy Bates per il suo sostegno nelle correzioni del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

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References

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Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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