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Immunology and Infection

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

インフルエンザ A ウイルス (IAVs) は、重要な人間の呼吸器病原体です。IAVs の病原性を理解して新しいワクチン接種のアプローチの臨床テストを実行するには、人間の生理を模倣した動物モデルが必要です。ここでは、IAV 病因、体液性応答および感染症のマウスモデルを用いたワクチンの有効性を評価する手法について述べる。

Abstract

インフルエンザ ウイルスは引き起こす以上 500,000 の死世界1と単独で直接医療と入院費と仕事欠勤2を考慮した米国の 120 億ドルの年間コストに関連付けられています。動物モデルはウイルスの病原性、宿主-病原体相互作用、免疫反応を評価する A 型インフルエンザ ウイルス (経年) 研究で重要な現在および/または新規ワクチンの効果は抗ウイルス薬だけでなく、アプローチします。彼らの免疫システムは進化的人間に似ているので、マウスが有利な小さな動物モデル、彼らが遺伝的に同一科目として商用ベンダーから利用できる、複数の系統を評価するために悪用される可能性があります。感染症の遺伝的な根拠、比較的安価で操作が容易です。IAV 感染気道を介して人間を要約するには、マウスはバイオ セーフティの適切な抑制の下で伝染性の IAVs 鼻腔内接種前に麻酔最初。感染後 IAVs の病因は毎日 (体重) の罹患率と死亡率 (生存率) 率を監視することによって決定されます。さらに、ウイルスの病因は上 (鼻粘膜) または下 (肺) 感染マウスの気道でウイルスの複製を評価することによっても評価できます。IAV 感染体液性反応を非侵襲的な出血、二次抗体の検出によって急速に評価できる合計の存在を検出または中和抗体アッセイ向け。ここでは、方法について述べる、一般的なマウスの鼻腔内感染するために使用 (i.n) IAV とし、病因、液性免疫応答と保護の有効性を評価。

Introduction

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IAVs は、オルトミクソ ウイルス科の家族3に分類されるエンベロープ ウイルスです。負の極性3と 8 の単一座礁させた RNA の分子が含まれます。ヒトでは、IAVs は、新規ウイルスは人間の人口4で導入されたときに、季節性のエピデミックおよび重要な結果の時折パンデミックを引き起こします。また、季節 IAVs は、生産の世界的な高い経済損失毎年2,5人間高と急速に送信されます。IAV 症状咳、鼻づまり、発熱、倦怠感、頭痛、食欲不振、筋肉痛、しかし、ウイルス免疫不全患者6のより深刻な病気を引き起こすことができます。実際には、世界保健機関 (WHO) は、季節性インフルエンザのウイルスは、毎年1300,000-500,000 死亡、世界を引き起こすことを計算します。現在のインフルエンザ予防とヒトの治療食品医薬品局 (FDA) によって承認された医薬品の唯一の 2 つのクラスがある: ノイラミニダーゼ (NA) 阻害剤 (例えばオセルタミビル) と (は例えば、M2 イオン チャネルのブロッカーアマンタジン);ただし、薬剤耐性ウイルスの亜種の出現は、関心の高まりです。予防接種は、したがって、IAVs 感染症から人間を守る最良の医療の選択肢になります。までに、インフルエンザの 3 つのタイプ人間の使用のために FDA によって認可されるワクチンが利用可能な: 組換えウイルス赤血球凝集素 (HA) 蛋白ワクチン、不活化インフルエンザ ワクチン (IIV) とライブ弱毒インフルエンザ ワクチン (LAIV)5,7. 3 つのワクチンは、ウイルスの HA 蛋白質、IAVs に対する中和抗体の主要なターゲットに対する適応免疫応答を誘導するために設計されています。

IAV 感染研究生体内で検証済みのマウス ・ モデル

要因を検討し、とりわけ、IAV 病態8,9,10,11, ウイルス病12および/またはウイルス伝送13 に貢献する動物モデルを使用されています。 ,14,9,10,15を薬新しいワクチンや抗ウイルス剤の有効性をテスト。マウス (ハツカネズミ) は、いくつかの理由 IAV 研究の最も広く使用された動物モデル: 1) 免疫系は進化的に似たような人間の存在を2) 低コストなど動物の購入、住宅再生;簡単に操作および格納; 3) 小型サイズ均一な反応と結果を取得する 4) 最小ホスト変動5) マウス生物学、ゲノム シーケンスを含む大規模な知識6) 多くの利用可能な分子生物学や免疫学の試薬;7) 使用可能なノックアウト (KO) マウス ウイルス感染の特定のホスト蛋白質の貢献を研究するには8) 感染症の遺伝的な根拠を評価するために利用できる複数のマウス系統。

体内IAV 勉強する現在利用可能ないくつかのマウスの系統があります。感染症, 線量, ウイルス株は、すべてのルートと同様、年齢、免疫状態、セックス、遺伝的背景とマウスひずみ IAV 感染マウスの結果に影響します。彼らは元系統16,17,18,より IAV 病気にかかりやすいので、IAV 研究で使用される最も一般的なマウス系統は BALB/C および、もっと最近、DBA.2 マウス C57BL/619,20します。 重要なことは、免疫反応も異なることがありますマウスひずみ18,19,20によって。したがって、マウスの IAV 緊張が行われる実験に最適なオプションを選択するすべての入手可能な情報を回復する非常に重要です。

マウスは、IAV と研究生体内で感染症の動物モデルは、実験的なデザインで考慮する必要があるいくつかの制限がある.例えば、マウスを用いた生体内での研究の主な制限は、IAVs をマウスの間で送信しないことです。したがって、伝送の研究より受け入れられる動物モデル (例えばフェレット、モルモット) が使用される16,17,21。さらに、マウスで経年の症状と人間のいくつかの違いがあります。人間と違って、マウスを開発しない IAV 感染時に発熱逆に、彼らは低体温症16,17を提示します。マウス、IAV レプリケーションは上気道ではなく下気道 (肺) に集中しています。したがって、IAV のマウスに対する病原性は人間に見られるように常に相関しません。完全に、メリットが限られている不利な点を上回る、のでマウスはインフルエンザ ウイルスの病原性、免疫原性およびワクチンと抗ウイルス剤の研究で予防効果を評価するために使用する最初の動物モデルを表します。さらに、それは IAV IAV 感染の小さな動物モデルで以前証拠なし大動物モデルを使用して、研究を実施する倫理的に許容できません。本稿で述べるマウスの鼻腔内感染する方法 (i.n と) IAV、重大度とウイルス感染の進行状況を監視する方法および液性免疫応答と保護の有効性を評価するために必要な実験を実施する方法。

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Protocol

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ここで説明したすべての動物のプロトコル制度動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ロチェスター大学医学部・歯学部、大学の制度的バイオ セーフティ委員会 (IBC) によって承認され、遵守ケアと国立研究評議会 22 の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項。設備とビバリウムと実験動物医学医学部・歯学部のプログラムの AAALAC インターナショナルによって認定されている州法、連邦法、国立衛生研究所 (NIH) ポリシーを遵守します。本稿で説明した動物のプロトコルに準拠する各機関に適用される類似した要件

1。 小さな脊椎動物の使用

注: 適切な個人保護装置 (PPE) はマウスを操作するため必要です。使い捨てつなぎ服、靴カバー、ヘッドのボンネット、マスク、手袋、最小要件が含まれます

  1. IACUC プロトコールに従ったケージあたり最大 5 マウスを配置します。動物は死んでいるように安楽死 (2 番目は物理的なメソッドである必要があります) の 2 つの方法でマウスを安楽死させる IACUC プロトコルに続く
    。 注: 罹患率と死亡率の評価を経年で実験、初期体重の 20% を失ったマウス実験的エンドポイントに達したと考えられていたし、CO 2 ととして頚部転位を安楽死させ、セカンダリの物理的な方式です。この体重の割合は、他の機関で異なる場合があります。IAV 感染後のマウス肺と鼻粘膜の収集場所の手順でマウス 2,2,2 tribromoethanol (TBE) の致命的な線量を安楽死させたし、物理の第 2 の方法として静脈、肝を切断することによって。女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスが購入し、特定病原体フリーの条件の下でロチェスター大学医学部・歯学部大学で動物のケア施設で維持します

2。バイオ セーフティ

注: このレポートの IAVs マウスに感染するために使用、A/Puerto リコ/8/34 新型インフルエンザ a/h1n1 (PR8 WT) 22 , 23 の一般的な実験室のマウスに適応したひずみと温度敏感な LAIV バリアント、PR8 LAIV 8。IAV 感染症 (生体外で または 生体内で)、細胞培養、生物学的安全キャビネット [バイオ セーフティ レベル (BSL)-2 での生体試料を含むすべての手順を実行の条件。猛毒 IAV 系統を使用している場合、他の BSL のスーツまたは包含条件を利用します

  1. クリーン バイオ セーフティ キャビネット塩素二酸化消毒する前に、この原稿で説明したすべての実験手順を実行した後。適切な IBC 推奨事項に従って使用の前後にすべての解剖素材 (はさみ、メス、解剖鉗子) と Dounce ホモジナイザーを消毒します。IBC と IACUC の適切なガイドラインの下で手続き中に生成されるすべての材料破棄します

3。鼻腔内感染

特定病原体フリーの条件の下で
  1. 場所女性 6-に-8 週齢 C57BL/6 マウス。整理し、ラベルをマウスにウイルスと用量使用ケージ。マウスの耳パンチ コードを用いた各ケージや尾の絵画などの別の承認方法を識別します。1 檻あたり最大 5 マウスを配置します
  2. 準備 IAV の希釈 (蛍光形成単位 (FFU)/マウス) 滅菌 1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 30 μ L/マウスの総量無菌条件の下で。氷の上のウイルスの接種材料を維持します。式でウイルスの希釈を追加する IAV の量を計算: ((マウスあたり X FFU/30 μ L) 最終巻 x)/ウイルス力価を株価します
  3. はスケールでマウスの重量を量る、各マウス (0 日目) の体重を記録します。仰臥位でマウスを押したまま、人差し指と親指の間に首の首筋でピックアップしています。小指で手に対して尾を保持します
  4. マウスの腹腔内麻酔 (i. p.) TBE の腹部の右側の尾の 2/3 に針を挿入することで 240 250 mg/kg とします。簡単に針を撤回する前に一時停止します。マウスをケージに戻り、5 分を待つ
  5. は、マウスを麻酔しながら乾燥を防ぐため目に滅菌の眼軟膏を適用します。(すなわち、つま先ピンチ) ペダル逃避反射の欠如によってマウスを麻酔かどうかチェックしてください。彼らは、ウイルスまで咳がマウスは完全に麻酔がない場合
  6. マウス完全に麻酔をかけられときに、背の臥床にマウスを置きます。ピペット先端部が、鼻孔、ゆっくりとウイルスの接種材料の 30 μ L を含むを置くが、常にソリューションを取り出します。マウスがドロップ消える菌を観察することによって準備を吸入してください
  7. は、マウスは TBE の温度と呼吸の率を低下させることが、呼吸をチェックしてください。動物を背臥床に置いて、ケージに戻ります。呼吸困難の兆候のマウスを監視し、, 垂直に保持している動物に息をし、呼吸 24 を駆動への影響を誘発するのには、マウスを助けます。(30-45 分それで麻酔された後) の意識が回復するまでマウスを監視します

4。ウイルスの病因 ( 図 1) の特性

  1. の罹患率と死亡率 ( 図 1 および 図 2) 評価
    1. 感染 i.n と女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスの 3-4 グループ (グループ、n あたり少なくとも 5 マウス = 5) 10 倍用量 (10、10 2 10 3 と 10 4 FFU/マウス) PR8 WT 3 で説明したようの
    2. モニター約食物摂取による体重変化を最小限に抑えるために同時に次の 14 日間スケールを持つマウスの重量を量る。セクション 1 で説明したように最初の体重の 20% を失うマウスを安楽死させる
    3. 14 日後、セクション 1 で説明したように、ウイルス感染を生き残るためマウスを安楽死させる
    4. は、ウイルス マウスの 50% 致死量 (MLD 50) リードと Muench 25 の方法を使用して得られた生存データに基づいて計算します。まず、計算割合距離 (PD):
      Equation 1
      1. は次に、次の数式によって MLD 50 を計算:
        Equation 2
  2. 肺と鼻粘膜でウイルス抗体の評価 ( 図 1 図 2。)
    1. 肺と鼻粘膜
        の回復
      1. i.n と女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスに感染する (n = 6) テスト 10 10 4 PR8 WT FFU のセクション 3 で説明したようにウイルスの線量と
      2. 日 2 のマウス肺と鼻粘膜の収集 (n = 3) と 4 (n = 3)。
        1. TBE (500 mg/kg) の致死量 (i. p.) を持つマウスを安楽死させます。背臥床に動物を配置し、70% エタノールで胸郭の上毛皮を消毒します。腹部の基部を胸骨からメスで皮膚を切る。はさみで切開の基地からマウスの横の部分を 1 cm カットを作る
        2. は、セカンダリの安楽死方法としてマウスを出血するハサミで肝静脈をカットしました。腹位置に動物を配置し、流出する血液を許可する 2 分を待ちます。この手順は肺で血液を減らすことが重要です
        3. は、鉗子、はさみを解剖の助けを借りて最初の切開をした腹部のベースにマウス (頭部を含む) の全体の上の部分から皮膚を削除します。頭をハサミでカットし、乾燥滅菌シャーレ
        4. は、上顎骨と下顎骨の間の接合をはさみでカットし、下顎骨を破棄します。はさみで頬骨の円弧の両端に 2 つのカットを行いそれらを削除します。解離性の鉗子の助けを借りて目を削除します
        5. 解離性の鉗子で頭蓋骨を保持し、メスと矢状縫合線に沿って頭蓋骨をカットします。鼻の粘膜を確認するため脳と頭蓋の 2 つの半分を持ち上げて取り外します。鼻高は篩骨と鼻、上顎骨、口蓋, 頬骨, を含む頭蓋骨の前部の骨によって囲まれている
        6. メスを使用して、脳と頭蓋の一部をカットし、破棄します。生殖不能の管に鼻粘膜と頭蓋の他の部分を配置します。サンプルは同じ日に処理される場合はドライアイスを迅速に凍結することは、場合に、サンプルはその後に処理されます氷 (4 ° C) の上のチューブを格納します
        7. サンプルの汚染を避けるためには、きれいにし消毒回復各組織間、および塩素ガスの消毒剤と各動物解剖解剖ツール
        8. 肺を収集し背臥床に動物を配置、胸膜をはさみでカットします。胸骨の両側に 1 cm で肋骨を切断することによって胸郭を開きます。はさみで優れた部分を胸郭の基地からカットを作る
        9. 胸郭の優れた部分の 2 つの切開とハサミで断面、胸のプレートを外します。鉗子で肺を保持、(肺) の直前に気管の終わりをハサミで切って、肺生殖不能の管に。サンプルは同じ日に処理される場合はドライアイスを迅速に凍結することは、場合に、サンプルはその後に処理されます氷 (4 ° C) の上のチューブを格納します
          。 注: 組織サンプルを収集、同じ日に均質化し、ウイルス抗体価を後で分析する-80 ° C で保存します。サンプルなく受けること繰り返し凍結融解サイクル ウイルス力価を決定する前に重要です。また、処理するまで-80 ° C で組織サンプルを格納します
    2. 肺と鼻粘膜の均質化
      1. 滅菌 Dounce ホモジナイザーに肺や鼻粘膜を配置し、かぜメディアの 1 つの mL を追加。肺が完全に崩壊するまで室温 (RT) で約 1 分の杵を上下に移動することによってサンプルを均質化します。4 生殖不能の管とストアで均質化されたサンプルを置く ° C. 使用各サンプルの新しい Dounce ホモジナイザー
      2. は、収集した新しい滅菌チューブに上清を 5-10 分の 300 x g でサンプルを遠心分離機します。ウイルスの滴定が同じ日に実行される場合、4 ° C で上清を保存し、ペレットを破棄します。また、(-80 ° C)、均質化の上清凍結後ウイルス力価を評価する
    3. 間接蛍光抗体法によるウイルス滴定
      1. 滴定、前日シード マディン-ダービー犬腎臓 (MDCK) 上皮細胞 (4 × 10 4 細胞/ウェル) ティッシュ文化メディアで 80 〜 90% の合流点に到達すると 96 ウェルのプレート。5% CO 2 と 37 ° C の定温器にセルを配置します。ウイルスの滴定の日がウイルス感染を開始する前に、単分子膜の確認を顕微鏡下で細胞をチェックします
      2. 準備 1:10 96 ウェル プレートの感染媒体の均質化試料 (肺や鼻粘膜) の上澄みの希薄。ウイルスの滴定を実行するには、ウイルス抗体価を正確に判断をトリプリケートします。
        1. 96 ウェル プレートで井戸のそれぞれに感染メディアの追加 90 μ L。A1、A2、A3 の 3 通の各サンプルのウイルス力価を評価するための井戸に 10 μ L の均質化試料の上澄みのいずれかを追加します。A4、A5、A6 の井戸に均質化試料の上澄みを別の 10 μ L を追加します。サンプルの残りの部分で連続して同じ希釈を実行します
        2. 、A の行に上清のサンプルを追加した後は、上下にピペッティングして混合するマルチ チャンネル ピペットを使用します。10 μ L A の行から行 * 変更するヒント間転送希釈とよく混ぜます。(H) の最後の行に到達するまでこの手順を繰り返します
      3. 組織培養培地 (ステップ 4.2.3.1) を取り除き 96 ウェル プレートでの 1x PBS 100 μ L/ウェルで二回洗う MDCK 細胞から真空吸引器マルチ アダプターを使用します
      4. 転送 50 μ L/ウェル MDCK と 96 ウェル プレートに均質化試料の希釈した上清のセルです。低い希釈 (列 A) により高い希釈 (列 H) を転送を開始します。この場合、別の行の間ヒントを変更する必要はありません
      5. は、ウイルス吸着できるように RT で 1 h のロッキング プラットフォーム上 96-ウェル プレートを置きます。ウイルス吸着後真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用して接種を削除し、感染後メディアの 100 μ L/ウェルを追加します。5% CO 2 の 33 ° C または 37 ° C の定温器で 8 h の感染細胞を孵化させなさい。4.2.3.6 の手順で説明するよう、固定、染色、イメージング、およびウイルス力価計算に進む – 4.2.3.12
      6. は、真空吸引器マルチ チャンネル アダプターを使用して 96 ウェルのプレートから組織培養培地を削除します。修正し、室温に 20 分間固定/透過液の 100 μ L/ウェルとセルを permeabilize
        注意: ホルムアルデヒド曝露を防ぐために発煙のフード固定/透過ソリューションを使用しています
      7. 真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用して固定/透過ソリューションを削除、1x PBS で洗浄しインキュベートした店で 1 時間のためのソリューションを 4 ° C でソリューションをブロック内のセル ブロックと固定セルまたは次のステップに進んでください
      8. は、ブロックのソリューションを削除します。1 μ G/ml モノクローナル抗体 (mAb) 抗 NP HB の 50 μ L/ウェルを追加-65 抗体希釈液で希釈しました。37 ° c. の異なる mAb または polyclon で 1 時間インキュベートします。アル抗体 (pAb) アンチ PR8 を使用できます
      9. 一方、希釈 1: 200 (FITC) かに-共役二次抗マウス抗体の抗体希釈液で。ソリューション ルートで 5-10 分の 1,700 × g で遠心分離します。その他 fluorophores が付いているその他二次抗体を使用できます
      10. は一次抗体を削除し、1 × pbs 100 μ L/ウェルで 3 回を洗います。二次抗体希釈の 50 μ L/ウェルを追加し、37 ° c. 削除二次抗体と 1 × pbs 100 μ L/ウェルで 3 回洗浄で 30-45 分間インキュベートします。プレートの最後の洗浄のままにします
      11. は、肯定的なステンド グラス (緑) の細胞の数を決定する蛍光顕微鏡下で細胞を観察します。FFU/mL をカウントすることによってウイルスの力価を計算します。数式を使用して 30 50 陽性染色細胞で希釈から FFU/mL の表現ウイルス力価を計算: ((n1 + n2 + n3)/3) x 20 x 1/希釈

5。評価の体液性免疫応答 ( 図 3)

  1. 女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスの i.n と 3 グループに感染 (n = 5) の異なる投与量 (10 2 10 3、および 10 4 FFU/マウス) PR8 LAIV のモック感染する 1 つのグループ (n = 5) 陰性対照として滅菌 PBS × 1。セクション 3 で説明どおり i.n マウス感染。 顎下出血使って 4 mm のランセット 26, マウスの血液を収集
    1. マウス顎下腺穿刺
      1. 14 日予防接種後出血または別 IACUC を使用してメソッドを承認します。
        1. ホールドで人差し指と親指の間に首の首筋で拾ってマウス。マウスを固定する小指と手に対して尾を保持します
        2. は、側臥位で頬を参照してくださいにマウスを置きます。レトロな軌道および顎下静脈内頚静脈との合流点で穿刺を行います。ランセット (4 mm) をシンクし、生殖不能の管に血液を回復 (約 0.2 - 0.4 mL/マウスが回復)。数秒間滅菌ナプキンによる穿刺に圧力を適用します。ケージにマウスを配置します
      2. 37 ° C で 1-2 時間の管を入れ、血液から血清を分離する RT で 30 分のための 700 × g で遠心分離します。新しい生殖不能の管にピペットを使い、血清の上層に転送します。赤い血球 (赤血球) のペレットを破棄します。-20 で血清を保存 ° C
  2. ウイルス蛋白質に対する抗体の解析
    1. 感染 MDCK 細胞抽出液の準備
      1. 感染、前日シードの 4-5 倍の 10 の 6 MDCK 細胞 (80 ~ 90 に到達する 1 つの 100 mm ディッシュ% 次の日合流点) 組織文化メディアで。5% CO 2 と 37 ° C の定温器にセルを配置します。ウイルス感染の日ウイルス感染を開始する前に、単分子膜の確認を顕微鏡下で細胞を確認してください
      2. 4 mL 合計最終巻の感染媒体の PR8 WT の感染 (MOI) の低い (0.001) 多様性のウイルスの希釈を準備します。式で PR8 WT の量を計算 ((n ° セル x X MOI) 最終巻 x)/ウイルス力価を株価します
      3. は MDCK 細胞板から組織培養培地を吸引し、4 mL の 1x PBS で 2 回洗ってください。ウイルス接種 (4 mL) を追加し、ロッキング ウイルス吸着できるように RT で 1 h 用のプレートを入れてください。真空接種ウイルスを削除し、TPCK 扱われるトリプシンの 1 μ g/mL を含む感染後メディアの 8-10 mL を追加します。5% CO 2 の 33 ° C または 37 ° C の定温器で 48-72 時間感染細胞をインキュベートします
      4. 細胞スクレーパーを用いて細胞を分離、細胞・組織培養培地 15 mL チューブにピペットを使いを収集しています。吸引した上清で 5-10 分のための 400 の x g でチューブを遠心分離機、RIPA バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mL の生殖不能の管にミックスを入れてください。氷上で 20-30 分の間孵化させなさい
      5. 4 で 20-30 分間遠心する 1,300 x g でチューブ ° C. 慎重に上清を回復します。セル抽出 100 μ 因数-20 でストア ° C
      6. 抗体 9 , 10 , 11 の存在のためにそれらを評価する前に酵素免疫測定法 (ELISA) で説明されているように細胞抽出液を滴定します。, 27. (上記のように準備) モック感染 MDCK 細胞からネガティブ コントロールとして含めるセルを抽出します
    2. Elisa 法 ( 図 4)
      1. 96 ウェル感染 MDCK 細胞の適切な希釈抽出 (1: 200 - 1:1, 000) の間に通常の 1x PBS でポリスチレンをコートします。モック感染 MDCK 細胞抽出物の同じ希釈陰性対照として別板をコートします。孵化 4 宿泊 (O/N) ° C
      2. は、真空吸引器マルチ チャンネル アダプターを使用して上澄みを除去し、100 μ L/ウェルのマルチ チャンネル ピペットを使い、1 × PBS で 1 回洗浄します。100 μ L/ウェル室温 1 時間解決を妨げるを追加することで非特異的結合をブロック
      3. 一方、各マウス手順 5.1 96 ウェル プレートでの抗体希釈液で感染から血清中の (希釈 1:50 開始) 2 倍のシリアル希薄を作る
      4. は、真空吸引器マルチ アダプターを使用したポリスチレン 96 ウェルのプレートからブロッキング ソリューションを削除します。適切な井戸の各マウス血清希釈の 50 μ L を追加し、37 で 1 時間インキュベート ° C
      5. は、真空吸引器マルチ アダプターとマウス血清を削除します。マルチ チャンネル ピペットを使用して蒸留水で 3 回の井戸を洗ってください。抗体希釈液で希釈する西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 1:2,000 と抱合抗マウス抗体の 50 μ L/ウェルを追加します。37 ° C で 1 時間孵化させなさい
      6. は、真空吸引器マルチ アダプターと二次抗体を削除します。マルチ チャンネル ピペットを使用して蒸留水で 3 回の井戸を洗ってください。B. 追加 100 μ L/ウェル基板の 1:1 溶液を混合してテトラメチルベンジジン (TMB) 基板ソリューションを準備し、暗闇の中で常温の 5-10 分間インキュベートします
      7. は、だから 0.2 N H 2 の 100 μ L/ウェルの追加によって反作用を停止 4。450 でプレートを読む ELISA プレート リーダーに nm
      8. は、MDCK 感染 96 ウェル プレートで得られた値から MDCK モック感染 96 ウェル プレートの各希釈で取得した値を減算します。それぞれ異なる血清希釈の平均値を計算し、標準偏差 (SD) を示すグラフで表す
  3. 中和抗体の解析
    1. 赤血球凝集抑制 (ハイ) 試金 ( 図 5)
      1. 受容体とマウス血清を扱うハイ分析を実行する前に(RDE) 血清中にすべての非特異的阻害剤を除去するために酵素を破壊します。RDE 作業希釈の 4 巻にマウス血清の 1 ボリュームを追加 (血清希釈は 1:5)。O/N (12 - インキュベートします。18 h) 37 ° C の水浴中です
      2. 熱、RDE を不活化する 30 分の 56 ° c 血清
      3. はあらかじめ標準 HA アッセイ 28 PR8 WT の赤血球凝集活性 (天后) を判別します。ウイルスのハウが決定される希釈ウイルス株式の 1x PBS で 50 μ L あたり 8 天后
      4. は、96 ウェル V 底プレート RDE 治療血清の 2 倍のシリアル希薄 (12 希釈) を準備します。各血清サンプルを (例えば A12 に A1) の 1 つの行を使用します。
        1. 1 x の追加 25 μ L の PBS は、A1 から A12 井戸。1 つの行にそれぞれの血清サンプルをテストします。25 μ L の列 (A1) の最初の井戸の 1 × PBS に RDE 治療血清 (1:5) 25 μ L を追加します。最初の血清希釈は 1:10 します
        2. 。 最初の列に追加するすべての RDE 治療血清
        3. (例えば A1, B1, C1)、マルチ チャンネル ピペットを使用して上下にピペッティングによる血清および 1x PBS をミックスします。2 番目の列 (たとえば、A1 A2 からから) 最初の列から 25 μ L の希釈血清を転送します。希薄の間ヒントを変更し、ミックスします
        4. 繰り返し手順 5.3.1.4.2。 最後の列を (例えば、A12、B12、C12) に到達するまで。最後の列は、すべての井戸 (25 μ L) でボリュームの整合性を保つから 25 μ L を破棄します。負の制御として、血清なし 1 × PBS ののみ 25 μ L を含む井戸の 1 つの行が含まれます
      5. 96 ウェル V 底プレートの血清と井戸のそれぞれに 8 天后/50 μ L に希釈して、IAV の追加 25 μ L; それぞれの最終巻も 50 μ L、ウイルスの 4 天后を含みます。内容を繰り返しピペッティングで混ぜます。室温 1 時間孵化させなさい
      6. 井戸のそれぞれに 0.5% トルコ赤血球の追加 50 μ L。内容を繰り返しピペッティングで混ぜます。氷の上の 30-45 分のプレートを孵化させなさい。読まれたハイ試金視覚制御井戸 (1 x PBS) における赤血球形成の井戸の底で赤い沈殿 (すなわち ペレット).
        注: 鶏の赤血球などの他の種から、モルモットや馬も使用できます
      7. は、最後も、赤血球は赤いペレットを形成され、赤血球凝集が発生しませんを識別することによってハイ価を計算します
        。 注: この希釈の相互価値はハイ価です。相互の値が 20、1:20 を補正するための係数で乗算されます最初の行で血清の希釈します
    2. ウイルス中和試験 (VNA) ( 図 6)
      1. VNA 前日準備 5.2.1.1 の手順で説明するよう次の日 80-90% の合流点を到達する 96 ウェル プレートで MDCK 細胞。200 FFU/25 μ L を持っている感染メディアで PR8 WT の希釈を準備します
      2. 不活性化 1 h. 56 ° C でマウス血清は、マウス血清 96 ウェル プレートを使用して帳票あたり 2 倍連続希釈 (12 希釈) を確認します。 (たとえば A1) 最初の行の最初のよく感染メディアの
        1. 追加 40 μ L の血清 160 μ L (血清希釈 1:5)。ピペッティングで混ぜます。他の井戸に感染メディアの 100 μ L を追加 (H12 に A2).
        2. (例えば、A1 A2 からから) 1:2 の希釈液を作るための 2 番目の行を最初の行から転送 100 μ L。ピペッティングで希薄とミックスのヒントを変更します。最後の行 (例えば A12) までこれを繰り返します。最後の行は、すべての井戸 (100 μ L) でボリュームの整合性を保つから 100 μ L を破棄します
      3. すべてのウェルに IAV 希釈の追加 100 μ L。室温 1 時間インキュベートします。一方、真空吸引器マルチ チャンネル アダプターを使用して 96 ウェル プレートで MDCK 細胞から組織培養培地を削除し、1 × pbs 100 μ L/ウェルで二回洗う
      4. MDCK 細胞の各 96 ウェル プレートでコントロールの 2 つの行のままにします。1 つの行は否定的な制御 (細胞ウイルスと血清なし) とその他の行は感染症 (血清またはモック感染マウス血清の不在でウイルスと細胞) の肯定的な制御します
      5. 転送 50 μ L/ウェル ウイルス抗体プレートから MDCK 細胞の 96 ウェルのプレートに。ウイルス吸着できるように RT で 1 時間揺動のプラットフォーム上に皿を置いています
      6. 真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用してウイルス抗体菌を削除し、TPCK 扱われるトリプシンの 1 μ g/mL を含む感染後メディアの 100 μ L/ウェルを追加します
      7. 肯定的な制御 (コントロール血清、血清の不在で感染細胞) の細胞変性効果 (CPE) が観察されるまで 5% CO 2 の 33 ° C または 37 ° C の定温器で 3 〜 4 日の細胞をインキュベートします
      8. 真空アスピレータ マルチ チャンネル アダプターを使用して組織培養培地を取り除き、0.1% クリスタル バイオレットの 100 μ L/ウェルを追加します。真空吸引器マルチ アダプターを使用したクリスタル ・ バイオレット液ルート削除で 1 時間インキュベートします。蒸留水で 3 回洗浄します。乾燥室温プレート
      9. は MDCK 細胞の単層でコンフルエントの細胞を保持する最高の希釈を識別することによって VNA 価を計算します
        。 注: この対応する希釈の相互価値は中和抗体価です。相互の価値は、1:10 を修正する 10 の係数で乗算されます行の最初も血清の希釈します

6。保護の有効性ワクチン ( 図 3) の評価

  1. 予防接種 i.n と女性 6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスのグループ (n = 11) PR8 LAIV 線量 (FFU/マウス) をテストし、模擬接種マウスの別のグループ (n = 11)滅菌 PBS × 1。第 3 節で前述したようにマウス i.n と予防接種を実行します
  2. 14 日後ワクチン接種、マウスを出血し、セクション 3 で説明したように、血清を収集します。合計とに対する中和抗体 PR8 WT セクション 5.1.1 で前述の存在を分析します
  3. 15 日後予防接種を測定し、マウスの体重 (0 日) を記録します。チャレンジ 3 のセクションで前述したように PR8 WT (相同の挑戦) の致命的な線量をマウス i.n と
  4. 体重と生存率を測定する (n = 5/グループ) の罹患率と死亡率はワクチン接種マウス (セクション 4.1) PR8 WT チャレンジ プロデュース評価への挑戦後 14 日間です
  5. マウス肺と鼻粘膜を回復 (n = 3/日) 2 日目に 4 後 PR8 重量の均質化に挑戦し、肺を分析し、鼻粘膜にセクション 4.2 で説明されているよう評価ワクチン接種マウスで PR8 WT のウイルス複製します

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Representative Results

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マウスにおけるウイルスの病因の評価

IAV の病因罹患率とその感染による死亡率に関連しています。これらの 2 つのパラメーターをマウスで簡単に評価できる: IAV 罹患率は感染マウスの体重減少と関連し、生存率は死亡率 (図 1) を示します。体重、IAV 感染マウスの生存率は通常感染8,9,10,29後少なくとも 2 週間毎日監視対象します。得られた生存率データは、リードと Muench25の方法で算出された MLD50を確認できます。IAV 病因の別の指標は低い (肺)、上 (鼻粘膜) 上気道 (図 1) ウイルスの複製に関連します。これらの臓器におけるウイルス力価で得られた情報は、罹患率と死亡率の値に対応し、一緒に取られてウイルスの病因の良い指標を提供します。感染後 2-4 日 (探偵)、間マウス肺 IAV レプリケーションにピーク、2 と 4 日探偵でこれらの臓器を回復するお勧めしますので知られています。

Figure 1
図 1: マウスの IAV 病態の評価:マウス IAV 病因 (体重) の罹患率と死亡率 (% 生存率)、また上下 (鼻粘膜) 下 (肺) 気道に複製する IAV の機能に関連しています。簡単に言えば、0 日目にマウスを秤量し、IAV と鼻腔内感染前に 2,2,2 tribromoethanol (TBE) 腹腔内麻酔。14 日目に 1 日からマウス、秤量する体重減少 (罹患率) とマウス致死量 50 (MLD50) を計算する % 生存率 (死亡率) を評価する毎日。日 2、感染後 4 日目にマウス肺と鼻粘膜を回復し、ウイルスの複製を評価する均質化します。BSL 2 条件下で PR8 WT を使用して IAV 病因を特徴付けるマウス実験を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

図 2, PR8 WT 病態の評価で得られたデータが表されます。6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスの 4 つのグループ (n = 11) 示された用量で感染した i.n とされた (10、102103と 104 FFU/マウス) PR8 WT の。体重とグループごと 5 マウスの生存率は、14 日探偵 (図 2 a-B) により測定しました。すべてマウス 104を失った PR8 WT の FFU 重量迅速免疫 (図 2 a) とそれらのすべては、5 と 6 日探偵 (図 2 b) で死去しました。103を失った PR8 WT の FFU 体重探偵 (図 2 a) 時間後で、それらはすべて 7 と 8 の日探偵 (図 2 b) によって死んだで免疫したマウス。すべてのマウス免疫 102を失った PR8 WT の FFU 体重 (図 2 a) (図 2 b) 9 日目探偵で死んだそれらの 2 だけが。最後に、10 で免疫したマウス PR8 WT FFU 減量していない (図 2 a) と、それらのすべて生き残った感染症 (図 2 b)。リードと Muench 法25で計算されるこの実験で PR8 WT の MLD50は 1.5 × 102 FFU (図 2)。

上にある PR8 レプリケーションを評価し、呼吸器を下げるマウスの感染 i.n と示された用量で (10、102103、および 104 FFU/マウス)、肺や鼻粘膜が 2 と 4 日探偵回収 (n = 3)。肺の均質化後、この器官に存在するウイルスの量は、蛍光抗体法 (図 2 D) によって分析されました。それらを予防接種に使用される線量と関連していた別のマウス グループの肺で検出されたウイルスの力価: 10 で免疫したマウスの肺で高いウイルス抗体を認めた4 PR8 WT FFU 2 と 4 日探偵、低いウイルス抗体が検出された中で PR8 WT の 10 FFU で免疫したマウスの肺。

Figure 2
図 2: ウイルスの病因の評価で得られたデータの表現:PR8 WT、6-に-8 週齢女性 c57bl/6 マウスの死亡率と罹患率を分析する (n = 5) が示された蛍光形成数と感染 i.n と PR8 WT の単位 (FFU)、(A) 体重 (罹患率) を 2 週間毎日監視(B) の生存率 (死亡率)。データを表す手段と個々 のマウスの決定結果の標準偏差 (n = 5)。% 生存期間は 2 週間以上の評価の (C) 値は、MLD50 25リードと Muench メソッドを使用しての計算に使用されます。(D) 6-に-8 週齢女性 c57bl/6 マウス ウイルス複製を評価する (n = 6) 感染 i.n と FFU の示された数をしました。肺または感染マウスの鼻の粘膜でウイルスの複製が通常 immunofocus アッセイを用いた 2 と 4 日探偵で評価されます。ウイルス価は、FFU/mL として記録されます。データ各マウスで得られた結果の意味を表しています。破線がアッセイの検出 (200 FFU/mL) の限界を示すために含まれています。BSL 2 条件下でマウスと IAV 罹患率、死亡率および PR8 を使用してウイルスの抗体価を評価するために組織培養実験を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

ワクチン接種後による体液性応答の評価

IAV 感染に対する体液性反応は、ウイルス感染を制御するに重要な役割を再生します。このため、新しい IAV ワクチン (図 3)、IAV WT 感染によって誘発される体液性応答を分析する非常に重要です。マウス モデルにおける予防接種後 14 日マウスがブレッド (図 4) elisa 法による総ウイルス蛋白質に対する抗体の存在と中和抗体は通常、ウイルスの HA 蛋白質をターゲットの存在を分析するにはハイの試金 (などの一般的な血清学的手法による分析ng クラス ="xfig"> 図 5) および/または VNA (図 6)。

Figure 3
図 3: 安全性、免疫原性と、LAIV の保護効果の特性のさまざまなステップの方式:新しい LAIV を開発、IAV 感染症のマウスモデルは安全性、免疫原性と保護の有効性をテストする通常使用されます。この方式では、(A) の安全性を評価する実験で免疫原性 (B) と LAIV の候補物質の保護効果 (C) が示されます。(A) 安全性の評価、LAIV の同じパラメーターを分析する必要がある (罹患率、死亡率およびウイルスの複製上と下気道)図 1に示した。マウスの免疫免疫原性を評価して顎下穿刺でブレッドがワクチン接種後 14 日間。酵素結合抗体法 (ELISA) と中和凝集阻害アッセイ (海) および/またはウイルスの抗体の存在を評価することによって、IAV タンパク質に対する抗体の存在を評価することによって体液性応答を分析します。中和の試金 (VNA)。(C) マウスに挑戦、保護効果、予防接種後 15 日間を評価するの図 1 で説明したよう IAV 重量保護効果、マウスの罹患率、死亡率と障害マウスの肺でウイルス抗体価の測定によって評価されます.BSL 2 条件下で LAIV 候補の安全性、免疫原性と保護の有効性を特徴付けるためのマウス実験を行った。他の BSL のスーツまたは包含条件 IAV 株接種マウスの挑戦のための使用に応じて必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

PR8 LAIV、6-に-8 週齢の c57bl/6 マウスの 3 つのグループの免疫原性を評価するために (n = 5) 別の用量で免疫 (102103、および 104 FFU/マウス) PR8 LAIV のネガティブ コントロールとして 1x PBS でモック。ワクチン接種後 14 日顎下出血26 (図 3) マウス血清を採取されました。総ウイルス蛋白に対する抗体は、1: 200 希釈 PR8 感染 MDCK 細胞 (図 4) の細胞抽出液を用いた elisa 法によって評価されました。個別にそれぞれの血清を調べた。高用量で免疫したマウスの血清を示唆 (104 FFU) PR8 LAIV の低用量で免疫したマウスの血清より合計 PR8 タンパク質に対して高い抗体価を持っていた (102 FFU)。コントロール血清 (モック感染マウス) は PR8 抗原に対する反応性を示さなかった。

Figure 4
図 4: 酵素免疫測定法 (ELISA) 抗体応答を評価するための模式図:PR8 特異的抗体感染マウスの現在のレベルは、モック (コントロール) または PR8 感染 MDCK 細胞から細胞抽出液をコーティングしたポリスチレン 96 ウェル プレートで elisa 法によって決定されます。簡単に言えば、14 日探偵 (図 3)、PR8 LAIV の示された用量で免疫したマウス顎下腺穿刺によって血を流したが、血清を採取しました。各血清は、合計 PR8 蛋白質に対する IgG 抗体の elisa 法による個別に評価しました。グラフのデータを表す手段と血清個体から得られた結果の標準偏差 (n = 6)。外径、光学濃度。ELISA の試金は BSL 2 内閣で行われました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

マウスの抗体を中和の存在を分析する、ハイを用いる血清アッセイ、グループ別の用量で免疫したマウスの血清 (56 ° C で不活化以前) の 2 倍希釈液シリアル (102103、および 104FFU) PR8 LAIV の RT (図 5) で 1 時間 PR8 WT の 4 天后を添加します。その後、トルコの赤血球の 0.5% は PR8 血清の混合物に追加されました。図 5の上の部分は海の可能な結果の概略: ウイルスの HA 蛋白質に結合する抗体を防ぐために、赤血球沈殿物が井戸の底で観察される血清中和抗体が含まれている、赤血球の凝集。その一方で、中和抗体のない場合は、赤血球の凝集が観察されます。その後、ハイ価は、最後も欠けている赤血球凝集血清の希釈の逆数として計算されます。図 5の下部に示したハイ結果を示すマウスから血清が PR8 LAIV の最大量のワクチンを接種 (104 FFU) で免疫したマウスの血清中の中和抗体価の高いがある、低用量 (102 FFU) ある PR8 に対する中和抗体の最低価.中和抗体が血清コントロール (モック感染マウス) に存在しません。

Figure 5
図 5: 赤血球凝集抑制 (ハイ) 試金:PR8 WT 感染マウスの抗体を中和することのレベルは、ハイ アッセイによって簡単に評価できます。簡単に言えば、PR8 LAIV の示された用量で免疫したマウス血清の 2 倍のシリアル希薄 (希釈 1:10 開始) 96 ウェル V 底プレートに RT で 1 時間 PR8 WT の 4 天后と (1:1) 混合。1 時間培養後 0.5% 赤血球は、氷の上の 30-60 分のウイルス血清の混合物に追加されました。ハイ価は最後においても、赤血球が赤いボタンを形成し、血球凝集反応 (top) は発生しませんを識別することによって決定されます。PR8 WT でハイ アッセイは、BSL 2 内閣で行われました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

図 6、VNA によるマウス血清中の抗体を中和することの評価で得られたデータが表されます。PR8 WT の 200 FFU は、シリアルの 2 倍希釈血清 (以前 inactivat で混合されました。56 ° C で ed) 別の用量で免疫したマウス (102103、および 104 FFU) 室温 1 時間 PR8 LAIV の各血清サンプルを 3 通で評価しました。96 ウェル プレートに MDCK 細胞の単分子膜に感染するウイルス血清の混合物が使用されました。図 6の上部は VNA の可能な結果の概略: 中和抗体約 3-4 日探偵で CPE の血清の結果の不在対照的に、中和抗体が存在する場合 (そのまま細胞膜)、彼らはウイルスの HA にバインドし、ウイルス感染を防ぐため、CPE は無い。CPE の存在は通常クリスタル バイオレットによる感染細胞の染色によって可視化し、ウイルス中和抗体価は、感染が完全にブロックされている最後の希釈の逆数として計算されます。VNA の結果は、図 6の下の部分で表されます。PR8 LAIV の高い金額で免疫したマウス血清 (104 FFU) 最大低用量または PR8 LAIV で免疫したマウス血清中の中和抗体価がある (102 FFU) 中和抗体の最低の価があります。海試験で得られた結果に似ています。中和抗体が血清中にモック感染マウスから存在しません。

Figure 6
図 6: ウイルス中和試験 (VNA):ハイ アッセイする代わりに、VNA の試金は PR8 WT 中和抗体の存在を評価できます。PR8 LAIV の指定された用量を接種マウスの血清が直列 2 倍簡単に、96 ウェル プレートで (開始希釈 1:5) を希釈し、1:1 を混ぜ室温 1 時間 PR8 WT の 200 FFU1 時間後 MDCK 細胞の 96 ウェル プレートに感染するウイルス血清の混合物が使用されました。感染細胞培養し, 完全な細胞変性効果まで 3-4 日。96 ウェル プレート、0.1% クリスタル バイオレットで染色。VNA 抗体は、コンフルエントの細胞膜を維持する最高希釈の識別によって決定されます。PR8 WT で VNA は、BSL 2 条件下で行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

マウスの IAV ワクチンの保護効果の評価

新しい LAIV が開発され、その安全性、免疫原性と保護の有効性がテスト生体内で、ある必要があり、マウス モデルは、通常、これらのパラメーターを分析する最初の動物モデル。図 3は、マウスで新しい LAIV を特徴付けるために必要な手順が異なる方式です。LAIV (図 3 a) の安全性を評価するマウスの病態セクション (セクション 4)、実験手順に類似したプロトコルを使用して感染した i.n と、体重と生存監視に関連する情報を提供MLD50を含む LAIV (図 2 a-2 b) 死亡・罹患率。さらに、異なるワクチンの投与で接種時に低い (肺)、上 (鼻粘膜) 上気道 LAIV のレプリケーションは評価8,9,10,をする必要があります11,29 (図 2 D)。免疫原性をテストするため、LAIV を接種マウスの血清はこれらに免疫原性セクション (セクション 5) のようなプロトコル (図 3 b) を使用して PR8 WT (相同の挑戦) と挑戦の前に収集されます。合計と、血清中の抗体を中和の存在はそれぞれ VNA やハイ ELISA で検出できます。

最後に、PR8 WT で挑戦される LAIV 接種マウスの保護の有効性をテストするため、保護効果は、罹患率、死亡率および挑戦 PR8 WT 4 (のセクションで説明したとおり、肺でのプレゼンスを監視することによって特徴付けられる図 3)8,9,10,11。LAIV PR8 WT チャレンジに対する保護を誘導する、マウスは、体重を失うことはありませんし、IAV WT で致命的な課題を生き残るでしょう。さらに、肺の IAV WT ウイルス抗体検出されませんまたはに比べて大幅に削減されますモック (PBS) 接種マウス8,9,10,11

ティッシュ文化メディアとソリューション 組成 ストレージ 使用 コメント
組織培養メディア:ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン (PSG) (DMEM 10% FBS 1 %psg) 445 ml DMEM、50 ml の FBS と 5 ml 100 × 1% ペニシリン (100 単位/ml)-ストレプトマイシン (100 μ g/ml) - L - グルタミン (2 mM) (PSG) 4 ° C でのストア このメディアはマディン-ダービー犬腎臓 (MDCK) 上皮細胞のメンテナンス用します。
感染後メディア: DMEM 0.3% 牛アルブミン (BA)、1 %psg (DMEM 0.3% BA 1 %psg) 491 ml DMEM、4.2 ml 35% の学士号と 100 の 5 ml x PSG 4 ° C でのストア A 型インフルエンザ ウイルス (経年) 感染後 MDCK 細胞の維持のためこのメディアを使用します。
リン酸緩衝生理食塩水 (10 x PBS) x 10 80 g の NaCl、KCl、Na2HPO4.7H2O、KH2PO4の 2 g の 11.5 g の 2 g。DdH2O 1 l. 調整 pH まで 7.3 を追加します。 常温 (RT) オートクレーブ滅菌します。
1x PBS 希釈 10 x PBS 1:10 ddH2O RT でストア オートクレーブ滅菌します。
感染メディア: 1 × PBS、0.3% 1 %ba ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1x PBS 滅菌、4.2 ml 35% の学士号と 5 ml 100 × 1% ペニシリン (100 単位/ml)-ストレプトマイシン (100 μ g/ml) (PS) 4 ° C でのストア このメディアは、IAV 感染症用します。
1x PBS で希釈した固定/透過ソリューション: 4% ホルムアルデヒド 0.5% トリトン X-100 400 mL 中性緩衝ホルマリン 10%、5 ml のトリトン X-100 と 595 ml の 1x PBS
d > 常温ストア このソリューションを使用して、修正し、ウイルスの滴定実験で MDCK 細胞を permeabilize ホルムアルデヒドへの暴露を防ぐために発煙のフード ソリューションを準備します。 解決を妨げる: 2.5% ウシ血清アルブミン (BSA) 1x PBS で 97.5 の mL の 1x PBS で BSA の 2.5 g 4 ° C でのストア このソリューションは、蛍光抗体法、Elisa のブロッキング液として使用されます。 0.2 μ m フィルターでろ過滅菌します。 抗体希釈液 (1 × PBS で 1 %bsa) 99 mL の 1x PBS で BSA の 1 g 4 ° C でのストア このソリューションを使用して蛍光アッセイおよび Elisa の第一次および二次抗体の希釈用 0.2 μ m フィルターでろ過滅菌します。 0.1% クリスタル バイオレット溶液 400 ml のメタノールでクリスタル バイオレットの 1 g。DdH2O の 600 ml を追加します。 RT でストア このソリューションを使用して、修正し、ウイルス中和アッセイの MDCK 細胞を染色 Tosylsulfonyl phenylalanyl クロロメチル ケトン (TPCK)-トリプシン処理 DdH2O で 1 mg/ml で 1,000 x 貯蔵液を準備します。 -20 ° C でストア TPCK トリプシンが IAV 感染症に追加されます。 100 μ l の因数を作る RIPA バッファー 10 mM Tris Cl (pH 8.0)、1 mM EDTA、1% トリトン X-100, 0.1 %sds、140 mM の NaCl デオキシ コール酸ナトリウム 0.1% 4 ° C でのストア このソリューションを使用してセルを抽出する

表 1: 組織文化メディアとソリューション。

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Discussion

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IAV マウス モデル広く IAV 病態、免疫原性と保護の有効性のvivo の研究のため。マウスのサイズが小さいため簡単に操作して、フェレット、モルモットなど他の動物モデルと比較して保存します。また、動物がコストの面で使いやすさ、ハウジングおよび再生に使用できる多数の動物が必要となる予防接種前臨床テストで。とりわけ、マウスが使用されているので複数の研究分野は、いくつかの分子、免疫マウス試薬 IAV 研究の彼らの使用を容易にすることがあります。最小ホスト可変性とは進化的に類似している免疫システムの存在の存在また、人間がそれらに IAV 研究する堅牢な小さな動物モデルを作る。最後に、ホスト ウイルス蛋白質の相互作用の研究、ウイルス病態への貢献は、KO マウスへのアクセスによって現在実行可能です。ただし、IAV 研究のためのマウスを使用していくつかの利点の横にある彼らはありません IAV 伝送研究に有用です。したがって、フェレット、モルモットは、IAV 伝送を勉強するより適切な動物モデルです。通常 IAV 感染マウスにおける臨床症状感染、2-3 日後を表示は、これはマウスの年齢、免疫状態、性別、遺伝的背景、ひずみ; によって異なります性ウイルスの菌株とは使用していません。症状は、食欲不振、倦怠感、拠り所、フリル毛皮、ボディ重量と死16,17の損失。

本稿で述べる体重 (罹患率)、およびウイルスの複製上 (鼻粘膜) を評価することによって生存率 (死亡率) の割合を監視することによって、IAV 感染マウス i.n とウイルス病態を評価し、(肺) を下げる方法上気道 (図 1 および図 2)。IAV の病因は、IAV 新種のコンテキストのみならず LAIV ワクチン候補 (図 3) の安全な実装では非常に重要なパラメーターです。IAVs と (のような馬、犬や豚など他の哺乳類に感染する IAVs の季節では、通常マウス11,27で病気の兆候を生成されません。この場合、肺でウイルス抗体の解析または感染マウスの鼻の粘膜は、IAV 系統のウイルスの病態を評価する主なパラメーターです。組織培養感染用量 50 (TCID50) または別の検証済みメソッド8 肺と鼻粘膜を収集、彼らは均質化し、プラクの試金、蛍光抗体法によりこれらの器官に存在するウイルスの量を分析できます。 ,29。プラクの試金は MDCK 細胞 (6 ウェル プレート形式) の高い量を必要とし、TCID50のようなより多くの時間 (3-4 日)、ウイルス抗体価を計算に必要なので間接蛍光抗体法を用いたウイルス抗体の評価をお勧めします。しかし、間接蛍光抗体法を実行するが必要だ: 1) (それは NP、IAV 蛋白に対する抗体を使用するので、最も豊富なウイルス蛋白質の生産を推奨、IAV 蛋白に対する特異抗体を主ウイルス感染)。2) 二次抗体標識蛍光体;・ 3) 蛍光顕微鏡蛍光陽性感染細胞をカウントします。

IAVs (またはワクチン候補) の免疫原性が簡単にすることができますマウスの免疫系は進化的人間16の免疫システムに似ているので、マウスは、IAV 感染に対して強いと保護体液性応答を引き出すことができるので、合計 (ELISA; の決定によって評価図 4)(ハイ、図 5) を中和や抗体の VNA (図 6)。予防接種後、体液性応答を分析するには、マウスはレトロ軌道穿刺、尾クリップ、伏在静脈穿刺または顎下穿刺などの別の承認された方法によってブレッドできます。私たちを選んだ顎下穿刺技術26手順麻酔の使用を必要としないし、免疫学的研究のための血の許容可能なボリュームを取得することができます。レトロ軌道穿刺ではなくマウスを麻酔する必要がありますと尾クリップや伏在静脈穿刺で血液量が通常回復は低い。

本稿では、我々 はウイルスに感染した細胞抽出液を用いた elisa 法による総ウイルス蛋白質に対する抗体の存在を評価する方法を説明します。HA に対する組換え精製した HA を用いた elisa 法による抗体の量を評価するために強くお勧めします IAV 感染媒介の主に、ウイルスの HA (主な抗原ウイルス ターゲット) に対する抗体による防御免疫を誘導するのでタンパク質10。中和抗体の存在を分析するハイと VNA の両方の方法が受け入れられるが、メリットとデメリット両方があります。ハイは急速 (2-3 h)、病や制御 (CDC) 中和抗体30IAV の存在を評価するための中心によって承認します。VNA はより時間がかかる (3-4 日) がウイルス感染を中和することができる抗体のみが評価されるので、固有のものです。特に、VNA は、中和中和抗体32NA と同様に抗体31、茎反応 HA を検出する示されています。VNA のもう一つの利点はアッセイの感度以下 IAV 以来約 10 〜4-105 FFU を必要と天后の試金と比較して (200 FFU) が必要です。また、海の試金は結果33,34,35の解釈の難しさのため鳥 IAVs に対する中和抗体を検出するため問題となります。また、VNA は、インフルエンザ中和抗体の同定のための赤血球の使用を必要ありません。

最後に、我々 は新しい IAV ワクチン (図 3) の開発で考慮されなければならない 3 つの主要な側面を評価する実験の手順を説明します: 1) 安全: ワクチンが安全でない農産物の病気をする必要があります2) 免疫原性: ワクチンは免疫原性、体液性および細胞保護応答を誘発する必要があります3) 保護効果: ワクチンは WT の同種または異種のウイルス防御を誘導する必要があります。マウス モデルですので多様な予防接種計画を評価することなどの条件を使用して、広範な保護管理、抗原/ワクチン用量の異なるアジュバントに対する新しい IAV ワクチン体内の最初のスクリーニングに適して同種または異種 IAVs 系統16,17の攻撃。ただし、臨床試験の前に、ワクチン候補必要があります少なくともテストする 2 番目の体内モデル。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

LM S 研究室でインフルエンザ ウイルスに関する研究が部分的に、ニューヨーク インフルエンザ センターの卓越性 (NYICE)、インフルエンザ研究と監視 (CEIRS) のための卓越性の NIAID センターのメンバーによって資金を供給します。ウェンディ ・ ベイツは、原稿の修正に彼女のサポートを感謝いたします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

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References

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感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究
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Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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