Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Influensa A Virus studier i en musemodell av infeksjon

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

Influensa A virus (IAVs) er viktig human åndedretts patogener. Forstå virusets av IAVs og prekliniske teste romanen vaksine tilnærminger, kreves dyremodeller etterligne menneskelige fysiologi. Her beskriver vi teknikker for å evaluere IAV patogenesen, humoral svar og vaksinen bruker en musemodell av infeksjon.

Abstract

Influensavirus føre til over 500 000 dødsfall over hele verden1 og er knyttet til en årlig kostnad på 12-14 milliarder dollar i USA alene vurderer direkte medisinsk og sykehusinnleggelse kostnader og arbeid fravær2. Dyremodeller er avgjørende for influensa A virus (IAV) studier for å vurdere viral patogenesen, vert-patogen interaksjoner, immunreaksjoner, og effekten av nåværende og/eller romanen vaksine tilnærminger og antivirale midler. Mus er en fordel små dyr modell fordi deres immunsystem ligner evolusjonært som mennesker, de er tilgjengelige fra kommersielle leverandører som genetisk identisk fag, det er flere stammer som kan utnyttes for å evaluere genetisk grunnlag av infeksjoner, og de er relativt billig og lett å manipulere. For å recapitulate IAV infeksjon hos mennesker via luftveiene, er mus først anesthetized før intranasal inoculation med smittsomme IAVs under riktig biosikkerhet forvaring. Etter infeksjon bestemmes patogenesen av IAVs ved å overvåke daglig sykelighet (kroppen vekttap) og dødelighet (overlevelse). I tillegg kan viral patogenesen også bli vurdert ved å vurdere virus replikering i øvre (nasal slimhinner) eller nedre (lungen) luftveier infiserte mus. Humoral svar på IAV infeksjon kan evalueres raskt av ikke-invasiv blødning og sekundære antistoff oppdagelsen analyser å oppdage tilstedeværelsen av totalt eller nøytralisere antistoffer. Her beskriver vi de vanlige metodene som brukes til å infisere mus gjennom (i.n) med IAV patogenesen, humoral immunreaksjoner og beskyttelse effekt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAVs er innhyllet virus klassifisert i Orthomyxoviridae familien3. De inneholder åtte single-strandet RNA molekyler med negativ polaritet3. Hos mennesker forårsake IAVs sesongmessige epidemier og sporadiske pandemier av viktig betydning når romanen virus er innført i befolkningen4. Videre overføres sesongmessige IAVs svært og raskt mellom mennesker produserer et forhøyet økonomiske tap over hele verden hvert år2,5. IAV symptomer inkluderer hoste, nese, feber, ubehag, hodepine, anoreksi og Myalgi, men viruset kan også gi en mer alvorlig sykdom hos immunsupprimerte pasienter6. Faktisk beregner av Verdens helseorganisasjon (WHO) at sesonginfluensa virus forårsaker 300.000-500 000 dødsfall over hele verden hvert år1. Det er to klasser av stoffer som er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) for influensa profylakse og behandling hos mennesker: neuraminidase (NA) hemmere (f.eks, oseltamivir) og blokkering av M2 ion kanalen (f.eks, Amantadine); fremveksten av stoff-resistente virusvarianter er imidlertid en økende bekymring. Vaksinasjon, derfor forblir det beste medisinske alternativet å beskytte mennesker mot IAVs infeksjoner. Til dags dato, tre typer influensa vaksiner lisensiert av FDA for menneskelig bruk er tilgjengelige: rekombinant viral hemagglutinin (HA) protein vaksiner, inaktivert influensa vaksiner (IIV) og live-dempes influensa vaksiner (LAIV)5, 7. tre vaksiner er utviklet for å indusere adaptive immunrespons mot viral HA protein, store målet for nøytralisere antistoffer mot IAVs.

En godkjent musemodell å studere IAV infeksjon i vivo

Dyremodeller har blitt brukt til å studere, blant annet IAV patogenesen8,9,10,11, viral faktorer som bidrar til sykdom12 og/eller viral overføring13 ,14, og å teste effekten av nye vaksiner eller antivirale legemidler9,10,15. Mus (Mus musculus) er den mest utbredte brukt dyremodell for IAV forskning av flere grunner: 1) immunsystemet er evolutionarily lik som finnes i mennesker; 2) lave kostnader, inkludert dyr kjøp, bolig og reproduksjon; 3) liten størrelse lett manipulere og lagre; 4) minimal vert variasjon homogen svar og resultater; 5) en stor kunnskap om mus biologi, inkludert Genova orden; 6) mange tilgjengelige molekylærbiologi og/eller immunologi reagenser; 7) tilgjengelig slå ut (KO) mus å studere bidrag av et gitt vert protein på virusinfeksjon; og 8) flere musen stammer som kan utnyttes for å evaluere genetisk grunnlag av infeksjoner.

Det er flere musen stammer tilgjengelig å studere IAV i vivo. Alder, immun rang, kjønn, genetisk bakgrunn og mus belastning samt ruter infeksjon, dose og viral stammer alle påvirke utfallet av IAV infeksjon i mus. De vanligste musen stammene i IAV forskning er C57BL/6, BALB/C og, mer nylig, DBA.2 mus siden de er mer utsatt for IAV sykdom enn de to tidligere stammer16,17,18, 19 , 20. viktigst, immunforsvaret også kan være forskjellig avhengig av musen belastningen18,19,20. Dermed er det veldig viktig å gjenopprette all tilgjengelig informasjon om mus og IAV belastning å velge det beste alternativet for å bli gjennomført.

Selv om musen er en god dyr modell av infeksjon for i vivo studier med IAV, har de flere begrensninger, som må vurderes i eksperimentell design. For eksempel, er en stor begrensning av bruk av mus for i vivo studier at IAVs overfører blant mus. Dermed for overføring akseptert studier, mer dyremodeller (f.eksoppspore eller marsvin) er brukt16,17,21. I tillegg finnes det flere forskjeller mellom manifestasjoner av IAV i mus og mennesker. I motsetning til mennesker utvikle mus ikke feber på IAV infeksjon; omvendt presenterer de med nedkjøling16,17. I mus, er IAV replikering konsentrert i de nedre luftveier (lungen) i stedet for de øvre luftveiene. Dermed er virulens av IAV i mus ikke alltid korrelert til at sett i mennesker. Helt, fordi fordelene oppveier ulempene begrenset, musen representerer den første dyr modellen brukes til å evaluere influensa virus patogenesen, immunogenisitet og beskyttende effekt i vaksine og antivirale studier. Dessuten ville det ikke være etisk akseptabelt å gjennomføre studier med IAV med store dyr modeller uten tidligere bevis i en liten dyr modell av IAV infeksjon. I dette manuskriptet beskriver vi hvordan å infisere mus gjennom (i.n.) med IAV, hvordan å overvåke alvorlighetsgraden og fremdriften for viral infeksjon og utføre eksperimenter som er nødvendig for å evaluere humoral immunreaksjoner og beskyttelse effekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alle dyr protokoller beskrevet her ble godkjent av de institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) og institusjonelle Biosafety utvalget (IBC) ved Universitetet i Rochester School of Medicine og Dentistry og overholde med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr National Research Council 22. Fasiliteter og programmer Vivarium og divisjon i laboratoriet dyr medisin School of Medicine og Dentistry er akkreditert av AAALAC International og overholde statlige loven, føderal lov og National Institutes of Health (NIH) politikk. Lignende krav skal brukes på hver institusjon overholder dyr protokollene som beskrevet i dette manuskriptet.

1. Bruk av små virveldyr dyr

Merk: riktig personlig beskyttelse utstyr (PPE) kreves for å arbeide med mus. Minimumskravene omfatter fjerning coveralls, skoovertrekk, hodet panser, maske og hansker.

  1. i samsvar med IACUC-protokollen, plassere maksimalt 5 mus per bur. Etter IACUC-protokollen, euthanize mus med to metoder for euthanasia (andre må være en fysisk metode) for å sikre at dyret er død.
    Merk: I eksperimenter i hvilke IAV sykelighet og dødelighet evalueres, mus som mistet 20% av sin opprinnelige kroppsvekt ble vurdert å ha nådd eksperimentelle sluttpunktet og var euthanized med CO 2 og cervical forvridning som den fysisk sekundære metode. Denne prosenten av kroppsvekt kan være annerledes i andre institusjoner. I fremgangsmåtene der mus lungene og nasal mucosa samles inn etter IAV infeksjon, mus er euthanized med en dødelig dose av 2,2,2-tribromoethanol (TBE), og ved å kutte av hepatisk vene som fysisk sekundære metode. Kvinnelige 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus ble kjøpt og vedlikeholdes i dyr pleie anlegget ved University of Rochester School of Medicine og Dentistry ved bestemte patogen uten betingelser.

2. Biosikkerhet

Merk: I denne rapporten IAVs brukes til å infisere mus er vanlig mus-tilpasset laboratorium belastningen av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8 WT) 22 , 23 og temperatur følsom LAIV variant PR8 LAIV 8. Utfører alle prosedyrer som involverer IAV infeksjoner (i vitro eller vivo), cellekulturer og biologiske prøver, i en biologisk sikkerhet regjering under biosikkerhet nivå (BSL) -2 forhold. Bruke andre BSL passer eller forvaring forhold hvis svært virulente IAV stammer brukes.

  1. Clean biosikkerhet kabinett med klor dioxide desinfeksjonsmiddel før og etter at alle eksperimentelle fremgangsmåtene i dette manuskriptet. Sterilisere alle disseksjon materiale (saks, skalpell og dissekere tang) og Dounce homogenizer før og etter deres bruk følgende riktig IBC anbefalinger. Forkast alle materiale produsert under prosedyrer under riktig IBC og IACUC retningslinjer.

3. Intranasal infeksjon

  1. plass kvinnelige 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus ved bestemte patogen uten betingelser. Organisere og etiketten musen bur med virus og dose brukes. Identifisere musene i hver bur med en øre punch kode eller en annen godkjent metode som maleri av mynt. Plasser maksimalt 5 mus per bur.
  2. Forberede fortynning av IAV (fluorescerende danner enheter (FFU) / mus) under aseptiske forhold i et totalt volum på 30 µL/mus i sterilt 1 x fosfat buffer saltvann (PBS). Vedlikeholde viruset inoculum på is. Beregne mengden IAV legge i viral fortynning med formelen: ((X FFU per mus/30 µL) x siste volum) / lager viral titer.
  3. Veier mus med en skala og ta vekten av hver mus (dag 0). Hold musen i dorsal posisjon ved å plukke den ved scruff i halsen mellom pekefingeren og tommelen. Hold halen hånd pinky med fingeren.
  4. Bedøve musen intraperitoneally (IP) med 240-250 mg/kg av TBE ved å sette nålen i caudal 2/3 av høyre side av magen. Midlertidig kort før nålen. Returnere musen til buret og vente 5 min.
  5. Gjelder øynene for å hindre tørrhet mens musen er anesthetized sterilt ophthalmica salve. Sjekk Hvis musen er anesthetized av mangel på pedalen uttak reflex (dvs., tå snev). Hvis mus ikke er fullt anesthetized de vil hoste opp viruset.
  6. Når musen er fullt anesthetized, Plasser musen i dorsal recumbency. Sette Pipetter spissen som inneholder 30 µL av viruset inoculum på neseboret og sakte men stadig kaste ut løsningen. Pass på musen er inhaling forberedelse ved å observere inoculum slippe forsvinner.
  7. Kontroller at musen er åndedrag som TBE kan trykke ned temperaturen og puste hastigheten. Tilbake dyret til buret plassering i dorsal recumbency. Overvåke mus for tegn på luftveissykdom, og hvis observert, hjelpe musen for å puste av holde dyr vertikalt og indusere innvirkning drevet åndedrett 24. Overvåke musen til det gjenvinner bevisstheten (30-45 minutter etter at det var anesthetized).

4. Karakteristikk av Viral patogenesen ( figur 1)

  1. evaluering av sykelighet og dødelighet ( figur 1 og figur 2)
    1. Infisere i.n. 3-4 grupper av kvinnelige 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus (minst 5 mus per gruppe, n = 5) med 10 ganger doser (10, 10 2 10 3 og 10 4 FFU/mus) av PR8 WT som beskrevet i del 3.
    2. Skjermen og veie mus med en skala over de neste 14 dagene på omtrent samme tid minimere vekt variasjoner på grunn av mat inntak. Euthanize musene som miste 20% av sin opprinnelige kroppsvekt som beskrevet i Seksjon 1.
    3. Etter 14 dager euthanize musene som overleve virusinfeksjon som beskrevet i Seksjon 1.
    4. Beregner viral 50% mus dødelig dose (MLD 50) basert på den overlevelse data innhentet med metoden Reed og Muench 25. Først beregne andel avstanden (PD):
      Equation 1
      1. deretter beregne MLD 50 formelen nedenfor:
        Equation 2
  2. evaluering av viral titers i lungene og nasal mucosa ( figur 1 og figur 2. )
    1. utvinning av lungene og nasal mucosa
      1. infisere i.n. kvinnelige 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus (n = 6) med viral dosen å teste 10-10 4 FFU av PR8 WT som beskrevet i del 3.
      2. Samle musen lungene og nasal mucosa dager 2 (n = 3) og 4 (n = 3).
        1. Euthanize mus med en dødelig dose (IP) TBE (500 mg/kg). Plasser dyret i dorsal recumbency og desinfisere pelsen over thorax med 70% etanol. Kutt huden med en skalpell fra sternum til bunnen av magen. Gjøre 1 cm kutt fra bunnen av snittet til laterale deler av mus med saksen.
        2. Klippe hepatic venen med saks å blø musen som metoden sekundære euthanasia. Plassere dyret i en ventrale posisjon og vente 2 min slik at blodet ut. Dette trinnet er viktig å redusere blod i lungene.
        3. Fjern skinnet fra hele øvre delen av musen (inkludert leder) på undersiden av magen der den første snittet ble gjort ved hjelp av dissekere tang og saks. Kuttet hodet med saksen og plassere den i et sterilt tørr Petriskål.
        4. Kuttet veikryss mellom maxilla og mandible med saksen og kast mandible. Med saks, to kutt på endene av de zygomatic buer og fjerne dem. Fjerne øynene med hjelp av dissecting pinsett.
        5. Hold kraniet med dissecting tang og kuttet av kraniet langs den sagittal Sutur skalpell. Løft de to halvdelene av kraniet med hjernen å se nasal mucosa. Nasal mucosas er omgitt av fremre Ben av skallen, inkludert nese, maxilla, Palatin, zygomatic, og ethmoid ben.
        6. Bruker skalpell, kutt delen av kraniet med hjernen og kast. Plass den andre delen av kraniet med nasal mucosa i et sterilt rør. Lagre røret på is (4 ° C) hvis prøvene behandles samme dag eller på tørris fryse dem raskt hvis prøvene vil bli behandlet senere.
        7. For å unngå forurensning av prøver, rengjør og desinfiser dissecting verktøyene mellom hvert vev gjenopprettet og mellom hvert dyr disseksjon med klor dioxide desinfeksjonsmiddel.
        8. Samle lungene, plassere dyret i dorsal recumbency og kuttet pleura med saksen. Åpne ribbe buret ved å kutte ribbeina på 1 cm på begge sider av sternum. Gjøre kutt fra bunnen av ribbe buret til overlegen del med saksen.
        9. Gjør et tverrsnitt med saksen mellom de to incisions i overordnet del på ribbe buret, og fjerne brystet plate. Hold lungene med tang, klippe på slutten av luftrøret (like før lungene) med saksen og sette lungene i et sterilt rør. Lagre røret på is (4 ° C) hvis prøvene behandles samme dag eller på tørris fryse dem raskt hvis prøvene vil bli behandlet senere.
          Merk: Homogenize av vevsprøver på samme dag som de er samlet og lagre-80 ° c til å analysere viral titers senere. Det er viktig at prøver ikke gjennomgå gjentatte fryse-Tin sykluser før viruset titers bestemmes. Du kan også lagre vevsprøver ved-80 ° C før de behandles.
    2. Homogenisering av lungene og nasal mucosa
      1. plassere lungene eller nasal mucosa i et sterilt Dounce homogenizer og legge 1 mL kaldt infeksjon medier. Homogenize prøven ved å flytte støter opp og ned i omtrent 1 min ved romtemperatur (RT) til lungene er helt forstyrret. Sette homogenisert prøven i et sterilt rør og store 4 ° C. Bruk et nytt Dounce homogenizer for hver prøve.
      2. Sentrifuge prøvene på 300 x g for 5-10 minutter til RT. samle nedbryting i en ny sterilt tube. Lagre nedbryting på 4 ° C hvis viral titrering utføres samme dag og kast pellet. Du kan eventuelt fryse (-80 ° C) nedbryting av den homogenisert prøver å vurdere viral titers senere.
    3. Virus titrering av indirekte immunofluorescence
      1. dagen før titrering, frø 96-brønns plater med Madin-Darby hjørnetann nyre (MDCK) epitelceller (4 x 10 4 celler/vel) å nå ~ 80-90% samløpet i vev kultur medier. Plasser cellene i et 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Dagen for viral titrering, når cellene under mikroskop for å bekrefte et monolayer før du starter virusinfeksjon.
      2. Forberede 1:10 fortynninger av nedbryting av homogenisert prøvene (lunge eller nasal mucosa) i infeksjon medier i en 96-brønns plate. Utføre viral Serine triplicates å nøyaktig fastslå viral titers.
        1. Legge til 90 µL av infeksjon media til hver av brønnene i 96-brønnen platen. Legge til 10 µL av en nedbryting av homogenisert prøvene av brønner A1, A2 og A3 for å evaluere den viral titer av hvert utvalg i tre eksemplarer. Legge til 10 µL av en annen nedbryting av homogenisert prøvene brønner A4, A5 og A6. Utføre den samme fortynning fortløpende med resten av prøvene.
        2. Etter den tilføyer prøven supernatant rad A, bruk en flerkanals Pipetter for å blande av pipettering opp og ned. Overføre 10 µL fra rad A raden B. endre hjelp hvis du tips mellom fortynninger og bland godt. Gjenta dette til du kommer til den siste raden (H).
      3. Fjerne vev kultur medium (trinn 4.2.3.1) bruker et vakuum aspirator-kanals kort fra de MDCK cellene i 96-brønnen plater og vask to ganger med 100 µL/godt av 1 x PBS.
      4. Overføre 50 µL/vel serielt utvannet nedbryting av homogenisert prøvene til 96-brønns platen med MDCK av celler. Start overføring av høyere fortynninger (rad H) til de lavere fortynninger (linje A). I dette tilfellet, det er ikke nødvendig å endre tips mellom forskjellige rader.
      5. Oppføre en rocking plattform for 1 h på RT tillate viral adsorpsjon 96-brønns platene. Etter viral adsorpsjon, fjerner inoculum bruker et vakuum aspirator-kanals kort og legge 100 µL/godt etter infeksjon medier. Inkuber infiserte celler for 8t i en 33 ° C eller 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Fortsette å fikse, flekker, bildebehandling og viral titer beregning som beskrevet i trinn 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Fjerne vev kultur medium fra 96-brønns platene bruker et vakuum aspirator-kanals kort. Fastsette og permeabilize cellene med 100 µL/vel av fiksering/permeabilization løsning for 20 min på rett
        Advarsel: Bruk fiksering/permeabilization løsningen i avtrekksvifte for å hindre formaldehyd eksponering.
      7. Fjerne fiksering/permeabilization løsningen bruker et vakuum aspirator-kanals kort, vask med 1 x PBS, og ruge fast cellene med blokkering løsning for 1t på RT. Store cellene i blokkering løsning på 4 ° C eller fortsette til neste trinn.
      8. Fjerner blokkerende løsningen. Legge til 50 µL/godt av 1 µg/mL monoklonalt antistoff (mAb) anti-NP HB-65 fortynnet i antistoff fortynning løsning. Inkuber 1t på 37 ° C. forskjellige mAb eller polyclonAl antistoffer (pAb) anti-PR8 benyttes.
      9. i mellomtiden fortynne 1:200 fluorescein isothiocyanate (FITC)-konjugert sekundære anti-musen antistoff antistoff fortynning løsning. Sentrifuge løsningen på 1700 x g for 5-10 minutter til RT. Andre sekundære antistoffer konjugert med andre fluorophores kan brukes.
      10. Fjerne primære antistoffer og vask 3 ganger med 100 µL/godt av 1 x PBS. Legg til 50 µL/godt av sekundær antistoff fortynning og ruge i 30-45 minutter på 37 ° C. Fjern sekundær antistoffer og vask 3 ganger med 100 µL/godt av 1 x PBS. La siste vask i tallerkenen.
      11. Merke cellene under et mikroskop fluorescens å bestemme antall positive farget (grønn) celler. Beregne den viral titer ved å telle FFU/mL. Beregne den viral titer uttrykt i FFU/mL fra fortynning med 30-50 positiv farget celler ved hjelp av formelen: ((n1 n2 + n3) / 3) x 20 x 1/fortynning.

5. Evaluering av Humoral immunreaksjoner ( Figur 3)

  1. infisere i.n. 3 grupper av kvinnelige 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus (n = 5) med forskjellige doser (10 2 10 3 og 10 4 FFU / mus) av PR8 LAIV, og uekte-infisere en gruppe (n = 5) med 1 x sterilt PBS som en negativ kontroll. Utfører i.n musen infeksjoner som beskrevet i del 3.
    1. Mus blødning av submandibular punktering
      1. fjorten dager etter immunisering, samle mus blodet av submandibular blødning benytter en 4 mm lancet 26, eller bruke en annen IACUC godkjent metode.
        1. Hold musen ved å plukke den ved scruff i halsen mellom pekefingeren og tommelen. Hold halen hånd pinky med fingeren til nakkens musen.
        2. Sette musen i en lateral posisjon se kinnet. Gjør punktering tidspunktet av retro-orbital og submandibular vena jugularis. Synke lancet (4 mm) og gjenopprette blodet i et sterilt rør (ca 0,2 - 0,4 mL/mus er gjenopprettet). Legge press på punktering med en bakteriefri serviett i noen sekunder. Plasser musen tilbake i buret.
      2. Satte rørene for 1-2 h på 37 ° C og deretter virvel dem på 700 x g i 30 min på RT skille serum fra blodet. Overføre øvre laget som består av serum med en Pipetter slik ny sterilt. Kast pellet av røde blodlegemer (RBCs). Lagre serum på -20 ° C.
  2. Analyse av totale antistoffer mot virale proteiner
    1. utarbeidelse av infiserte MDCK celle ekstrakter
      1. dagen før infeksjon, frø en 100 mm rett med 4-5 x 10 6 MDCK celler (å nå ~ 80-90 % samløpet neste dag) i vev kultur medier. Plasser cellene i et 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Dagen for virusinfeksjon, når cellene under mikroskop for å bekrefte et monolayer før du starter virusinfeksjon.
      2. Forberede en viral fortynning med en lav (0,001) mangfoldighet av infeksjon (MOI) av PR8 WT i infeksjon medier i 4 mL totalt siste volum. Beregne mengden PR8 WT med formelen ((X MOI x n ° celler) x siste volum) / lager viral titer.
      3. Sug opp vev kultur medium fra MDCK celle platen og vask to ganger med 4 mL 1 x PBS. Legg til viral inoculum (4 mL) og sette platen på en rocking plattform for 1 h på RT tillate viral adsorpsjon. Fjerne det virus inoculum med vakuum og legger 8-10 mL etter infeksjon mediet som inneholder 1 µg/mL av TPCK-behandlet trypsin. Inkuber infiserte celler for 48-72 timer i en 33 ° C eller 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
      4. Koble celler ved hjelp av en celle skraper og samle celler og vev kultur medium med Pipetter i en 15-mL tube. Sentrifuge røret på 400 x g for 5-10 minutter til RT. leveringstanken nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL av RIPA buffer og legg blandingen i en 1.5-mL steril rør. Ruge på isen i 20-30 min.
      5. Sentrifuge røret 1300 x g i 20-30 minutter på 4 ° C. nøye, gjenopprette nedbryting. Store cellen trekke ut 100 µL dele på -20 ° C.
      6. Sjarmere celle ekstrakter som beskrevet av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA) før vurdere dem for tilstedeværelse av antistoffer 9 , 10 , 11 , 27. ta celle utdrag fra uekte-infiserte MDCK celler (forberedt som angitt ovenfor) som en negativ kontroll.
    2. ELISA ( Figur 4)
      1. Coat polystyren 96-brønns plater med passende fortynning av infisert MDCK celle trekke ut 1 x PBS (vanligvis mellom 1:200 - 1:1, 000). Coat en annen plate med samme fortynning av uekte-infiserte MDCK celle ekstrakt som en negativ kontroll. Ruge over natten (O/N) på 4 ° C.
      2. Fjerne nedbryting bruker et vakuum aspirator-kanals kort og vask en gang med 100 µL/godt av 1 x PBS med en flerkanals pipetter. Blokkere ikke-spesifikk bindingen ved å legge 100 µL/vel av blokkering løsning for 1 h på RT.
      3. i mellomtiden gjør 2-fold føljetong fortynninger (starter fortynning 1:50) av sera fra hver mus infisert i trinn 5.1 i antistoff fortynning løsning i en 96-brønns plate.
      4. Fjerner blokkerende løsningen fra polystyren 96-brønns platene bruker et vakuum aspirator-kanals kort. Legge til 50 µL av hver musen serum fortynning i riktig godt og ruge 1t på 37 ° C.
      5. Fjerne mus sera med vakuum aspirator-kanals adapter. Vask brønnene 3 ganger med destillert vann med en flerkanals pipetter. Legge til 50 µL/vel en anti-musen sekundære antistoff konjugert med pepperrot Peroxidase (HRP) fortynnet 1:2,000 i antistoff fortynning løsning. Inkuber 1t på 37 ° C.
      6. Fjern sekundær antistoffer med vakuum aspirator-kanals adapter. Vask brønnene 3 ganger med destillert vann med en flerkanals pipetter. Forbered den tetramethylbenzidine (TMB) ved å blande 1:1 løsning A og B. Tilsett 100 µL/vel i underlaget og Inkuber i 5-10 min på RT i mørket.
      7. Stoppe reaksjonen ved å legge 100 µL/vel 0,2 N H 24. Lese plater ved 450 nm på en ELISA plate leser.
      8. Trekker verdien i hver fortynning av MDCK mock-infiserte 96-brønns plate fra verdien i MDCK-infiserte 96-brønns plate. Beregne gjennomsnittsverdier for hver fortynning med forskjellige sera og representerer dem i en graf som viser standard avvik (SD).
  3. Analyse av nøytralisere antistoffer
    1. Hemagglutination hemming (HAI) analysen ( figur 5)
      1. før du utfører HAI analysen, behandle musen sera med reseptoren ødelegge enzym (RDE) å fjerne alle ikke-spesifikk hemmere stede i serum. Legge til 1-volum av musen serum 4 mengder RDE arbeider fortynning (serum fortynning er nå 1:5). Inkuber O/N (12- 18 h) i et 37 ° C vannbad.
      2. Varme serumprøver på 56 ° C i 30 min å deaktivere RDE.
      3. Forhånd bestemme hemagglutination aktiviteten (HAU) av PR8 WT av standard HA analysen 28. Når den viral HAU bestemmes, fortynne viral sluttvederlag til 8 HAU per 50 µL i 1 x PBS.
      4. Forberede 2-fold føljetong fortynninger (12 fortynninger) av RDE-behandlet sera i en 96-brønns V bunn plate. Bruk én rad for hver serum prøve (f.eks A1 til A12).
        1. Legge til 25 µL av 1 x PBS fra A1 A12 brønner. Test hvert av serumprøver i én rad. Legg til 25 µL av RDE-behandlet sera (1:5) 25 µL av 1 x PBS i første brønn i kolonnen (A1). Den første serum fortynning er 1:10.
        2. Når alle RDE-behandlet sera legges til den første kolonnen (f.eks A1, B1, C1), bruke en flerkanals Pipetter for å blande sera og 1 x PBS av pipettering opp og ned. Overføre 25 µL av utvannet sera fra den første kolonnen til den andre kolonnen (f.eks fra A1 til A2). Endre tips mellom fortynninger og bland.
        3. Gjenta trinn 5.3.1.4.2. fram den siste kolonnen (f.eks A12, B12, C12). Kast den 25 µL fra den siste kolonnen, holde volumet konsekvent i alle brønnene (25 µL). Ta med en rad av brønner som inneholder bare 25 µL av 1 x PBS uten noen sera som en negativ kontroll.
      5. Legge til 25 µL av IAV utvannet til 8 HAU/50 µL til hver av brønnene med sera i 96-brønnen V-bunnplaten, det siste bindet i hver godt er 50 µL, som inneholder 4 HAU av virus. Bland innholdet med gjentatte pipettering. Inkuber 1t på RT.
      6. Legge til 50 µL 0,5% Tyrkia RBCs til hver av brønnene. Bland innholdet med gjentatte pipettering. Inkuber platen i 30-45 minutter på is. Lese HAI analysen visuelt når RBCs i kontroll brønnene (1 x PBS) danner en rød utløse (dvs., pellet) på bunnen av brønnene.
        Merk: RBCs fra andre arter som kylling, marsvin eller hest kan også brukes.
      7. Beregner HAI titers ved å identifisere sist i som RBCs form røde pellets og hemagglutination oppstår ikke.
        Merk: Gjensidige verdien av dette fortynning er HAI titer. Gjensidige verdien multipliseres med en faktor på 20 korrigere 1:20 fortynning av serum i første rad.
    2. Virus microneutralization analysen (VNA) ( figur 6)
      1. dagen før VNA, forberede MDCK celler i en 96-brønns plate å nå 80-90% samløpet dagen som beskrevet i trinn 5.2.1.1. Forberede en fortynning av PR8 WT i infeksjon media å ha 200 FFU/25 µL.
      2. Inactivate mus sera på 56 ° C i 1 h. gjør 2-fold føljetong fortynninger (12 fortynning) per musen sera i tre eksemplarer bruker en 96-brønns plate.
        1. Legge til 40 µL av serum til 160 µL infeksjon medier i den første brønnen i første rad, (f.eks A1) (serum fortynning 1:5). Bland ved pipettering. Legge til 100 µL av infeksjon media andre fordelt (A2 til H12).
        2. Overføre 100 µL fra den første raden til andre rad å 1:2 fortynninger (f.eks fra A1 til A2). Endre tips mellom fortynninger og blanding av pipettering. Gjenta dette til den siste raden (f.eks A12). Forkaste 100 µL fra siste, holde volumet konsekvent i alle brønnene (100 µL).
      3. Legge 100 µL av IAV fortynning alle brønner. Inkuber 1t på RT. I mellomtiden, fjerne vev kultur medium fra de MDCK cellene i 96-brønnen platen bruker et vakuum aspirator-kanals kort og vask to ganger med 100 µL/godt av 1 x PBS.
      4. i hver 96-brønns plate av MDCK celler, la to rader for kontrollene. Én rad er negative kontrollen (celler uten virus og sera), og den andre raden er positiv kontroll av infeksjon (celler med virus i fravær av sera eller sera fra uekte-infiserte mus).
      5. Overføre 50 µL/vel fra virus-antistoff platen til 96-brønns plater MDCK celler. Sette platene på en rocking plattform for 1 h på RT tillate viral adsorpsjon.
      6. Fjerner virus-antistoff inoculum bruker et vakuum aspirator-kanals kort og legger 100 µL/godt etter infeksjon medietyper som inneholder 1 µg/mL av TPCK-behandlet trypsin.
      7. Ruge cellene ~ 3-4 dager i en 33 ° C eller 37 ° C inkubator med 5% CO 2 til cytopathic virkning (CPE) er observert i kontrollen positiv (infiserte celler i fravær av sera eller kontroll serum).
      8. Fjerner vev kultur medium bruker et vakuum aspirator-kanals kort og legge 100 µL/vel av 0,1% crystal fiolett. Inkuber 1t på rett fjerne crystal violet løsningen bruker et vakuum aspirator-kanals kort. Vask brønnene 3 ganger med destillert vann. Tørr platene på RT.
      9. Beregner VNA titers ved å identifisere de høyeste fortynning som beholder en confluent celle monolayer av MDCK celler.
        Merk: Gjensidige verdien av denne tilsvarende fortynning er den nøytraliserende antistoff titer. Gjensidige verdien multipliseres med en faktor på 10 rette 1:10 fortynning av sera i første brønn på raden.

6. Evaluering av beskyttelse effekt vaksiner ( Figur 3)

  1. vaksinere i.n. en gruppe kvinnelige 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus (n = 11) med PR8 LAIV dosen teste (FFU/mus) og uekte-vaksinere en annen gruppe mus (n = 11) 1 x sterilt PBS. Utføre musen i.n. vaksinasjoner som tidligere beskrevet i avsnitt 3.
  2. Fjorten dager etter vaksinasjon, blø mus og samle sera som beskrevet i del 3. Analysere totalt og nøytralisere antistoffer mot PR8 WT som beskrevet i delen 5.1.1.
  3. Femten dager etter vaksinasjon, mål og fortegnelse musen kroppsvekt (dag 0). Utfordre mus i.n. med en dødelig dose PR8 WT (homologe challenge) som tidligere beskrevet i avsnitt 3.
  4. Måle kroppsvekt og overlevelse (n = 5 / gruppen) innen 14 dager etter utfordring å evaluere sykelighet og dødelighet produsert av PR8 WT challenge i vaksinert mus (delen 4.1).
  5. Gjenopprette musen lungene og nasal mucosa (n = 3/day) på dag 2 og dag 4 etter utfordre med PR8 WT. Homogenize og analysere lungene og nasal mucosa som beskrevet i delen 4.2 vurderer viral replikering av PR8 WT i vaksinert mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Karakteristikk av viral patogenesen i mus

Patogenesen av IAV er knyttet til sykelighet og dødelighet forårsaket av sin infeksjon. Disse to parametere kan evalueres i mus enkelt: IAV sykelighet er knyttet til kroppen vekttap i infiserte mus og prosentandelen av overlevelse vil vise dødelighet (figur 1). Kroppsvekt og overlevelse i IAV-infiserte mus er vanligvis overvåket daglig i minst to uker etter smitte8,9,10,29. Den overlevelse data innhentet kan bestemme MLD50 ble beregnet ved hjelp av metoden Reed og Muench25. En annen indikator IAV patogenesen er knyttet til viral replikasjon i nedre (lungen) og øvre (nasal slimhinner) luftveiene (figur 1). Informasjonen med viral titer i disse organene tilsvarer sykelighet og dødelighet verdier, og samlet gir en god indikasjon på viral patogenesen. Det er kjent at IAV replikasjon i musen lungene topp mellom 2 og 4 etter infeksjon (pi), og så vi anbefaler utvinne disse organene på dager 2 og 4 p.i.

Figure 1
Figur 1: karakterisering av IAV patogenesen i mus: IAV patogenesen i mus er knyttet til sykelighet (kroppen vekttap) og dødelighet (% overlevelse) og også muligheten for IAV å gjenskape den (nasal slimhinner) og nedre (lungen) luftveier. Kort, på dagen 0 mus er veid og anesthetized intraperitoneally med 2,2,2-tribromoethanol (TBE) før de er infisert gjennom IAV. Fra dag 1 dag 14, er mus veies daglig for å evaluere kroppen vekttap (sykelighet) og % overlevelse (dødelighet) til å beregne musen dødelig dose 50 (MLD50). På dager 2 og dag 4 etter infeksjon, er mus lungene og nasal mucosa gjenopprettet og homogenisert for å evaluere viral replikasjon. Mus eksperimenter som karakteriserer IAV patogenesen bruker PR8 WT utføres under BSL-2 forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I figur 2representeres dataene innhentet i evalueringen av PR8 WT patogenesen. Fire grupper av 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus (n = 11) var infisert i.n. med de angitte doser (10, 102103 og 104 FFU/mus) av PR8 WT. Kroppsvekt og overlevelse av 5 mus per gruppe ble målt med 14 dager PI (figur 2A-B). Alle mus vaksinert med 104 FFU av PR8 WT mistet vekt raskt (figur 2A) og alle av dem døde dager 5 og 6 PI (figur 2B). Mus vaksinert med 103 FFU av PR8 WT mistet kroppsvekt på senere ganger PI (figur 2A) og alle døde av dager 7 og 8 PI (figur 2B). Alle mus vaksinert med 102 FFU av PR8 WT mistet kroppsvekt (figur 2A) men bare 2 av dem døde på dag 9 PI (figur 2B). Endelig mus vaksinert med 10 FFU av PR8 WT miste ikke vekt (figur 2A) og alle av dem overlevde infeksjon (figur 2B). MLD50 av PR8 WT i dette eksperimentet beregnet med Reed og Muench metoden25 var 1,5 x 102 FFU (figur 2C).

Å vurdere PR8 replikering i øvre og nedre luftveier tarmkanalen mus infisert i.n. med de angitte doser (10, 102103og 104 FFU/mus), lungene og nasal mucosa gjenvunnet på dager 2 og 4 PI (n = 3). Etter lunge homogenisering ble mengden av virus i dette orgelet analysert av immunofluorescence analysen (figur 2D). Viral titer oppdaget i lungene av de forskjellige mus var i slekt med dosen brukes Immunize dem: høyere viral titers ble oppdaget i lungene mus vaksinert med 104 FFU av PR8 WT i dager 2 og 4 pi, mens lavere viral titers ble oppdaget i lungene mus vaksinert med 10 FFU av PR8 WT.

Figure 2
Figur 2: representasjon av Data innhentet i evalueringen av Viral patogenesen: Analysere sykelighet og dødelighet av PR8 WT, 6-8-uke-gamle kvinnelige C57BL/6 mus (n = 5) var infisert i.n. med det angitte antallet fluorescerende-forming enheter (FFU) av PR8 WT og overvåket deretter daglig i 2 uker for kroppen-vekttap med (A) (sykelighet) og (B) overlevelse (dødelighet). Data representerer betyr og standardavvik av resultater bestemt for individuelle mus (n = 5). (C) verdier av % overlevelse vurdert over 2 uker brukes til å beregne MLD50 bruker Reed og Muench metoden25. (D) å vurdere viral replikasjon, 6-8-uke-gamle kvinnelige C57BL/6 mus (n = 6) var infisert i.n. med det angitte antallet FFU. Viral replikasjon i lungene eller nasal mucosa i infiserte mus er vanligvis vurdert på dager 2 og 4 p.i. bruker immunofocus analysen. Viral titers registreres som FFU/mL. Data representerer betyr og SDs av resultatene fra hver musen. Stiplede linjer er inkludert for å angi grensen for påvisning (200 FFU/mL) til analysen. Mus og vev kultur eksperimenter for å vurdere IAV sykelighet, dødelighet og viral titers bruker PR8 ble utført under BSL-2 forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Evaluering av humoral svar indusert etter vaksinering

Humoral svar indusert mot IAV infeksjon spille en viktig rolle i å kontrollere viral infeksjon. Derfor er det svært viktig å analysere humoral svarene skapte IAV WT infeksjoner eller nye IAV vaksiner (Figur 3). I musemodell, er 14 dager etter immunisering, mus bled for å analysere tilstedeværelse av antistoffer mot de totale virale proteinene med ELISA (Figur 4), og tilstedeværelsen av nøytralisere antistoffer målretting viral HA protein, som vanligvis er analyseres av felles serologiske tilnærminger, slik som en HAI analysen (ng class = "xfig" > figur 5) og/eller en VNA (figur 6).

Figure 3
Figur 3: ordningen med de ulike trinnene i karakterisering av sikkerhet, immunogenisitet og beskyttelse effekten av en LAIV: Når en ny LAIV er utviklet, er musemodell av IAV infeksjon vanligvis brukt å teste immunogenisitet, beskyttelse og sikkerhet effekt. I denne ordningen, eksperimenter for å vurdere sikkerheten (A), angis immunogenisitet (B) og beskyttelse effekt (C) av en kandidat LAIV. (A) å vurdere sikkerheten av en LAIV er det nødvendig å analysen de samme parametrene (sykelighet, dødelighet og viral replikasjon i øvre og nedre luftveier) beskrevet i figur 1. For å evaluere immunogenisitet, mus er vaksinert og 14 dager etter vaksinasjon er de blødd av submandibular punktering. Humoral svar er analysert ved å vurdere tilstedeværelsen av totale antistoffer mot IAV proteiner av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA) og evaluere tilstedeværelsen av nøytralisere antistoffer av hemagglutination hemming analysen (HAI) og/eller virus microneutralization analysen (VNA). (C) vurdere beskyttelse effekt, 15 dager etter vaksinasjon, mus er utfordret med IAV WT. Protection effekt er evaluert av måling av mus sykelighet, dødelighet og viral titers i lungene utfordret mus som beskrevet i figur 1 . Mus eksperimenter å karakterisere immunogenisitet, beskyttelse og sikkerhet effekten av LAIV kandidat utføres under BSL-2 forhold. Andre BSL passer eller forvaring betingelser kan være nødvendige, avhengig av den IAV stammen brukes til utfordringen med vaksinert mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Å vurdere immunogenisitet av PR8 LAIV, tre grupper av 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus (n = 5) ble vaksinert med forskjellige doser (102103og 104 FFU/mus) PR8 LAIV eller uekte vaksinert med 1 x PBS som en negativ kontroll. Fjorten dager etter vaksinasjon, ble mus sera samlet av submandibular blødning26 (Figur 3). Antistoff svar mot totalt virale proteiner ble vurdert av ELISA bruker en 1:200 fortynning av cellen ekstrakt av PR8-infiserte MDCK celler (Figur 4). Hver serum ble analysert individuelt. Resultatene tyder på at sera fra mus vaksinert med høyere dose (104 FFU) PR8 LAIV hadde høyere antistoff titers mot totalt PR8 proteiner enn sera mus vaksinert med lavere dose (102 FFU). Sera kontroll (mock-infiserte mus) viser ikke reaktivitet mot PR8 antigener.

Figure 4
Figur 4: skjematisk fremstilling av enzymet knyttet Immunosorbent analysen (ELISA) å vurdere Humoral antistoff svar: Nivåer av PR8-spesifikke antistoffer i infiserte mus bestemmes av ELISA i 96-brønnen polystyren platene belagt med cellen utdrag fra mock (kontroll) eller PR8-infiserte MDCK celler. Kort, på 14 dager PI (Figur 3), mus vaksinert med den angitte doser av PR8 LAIV var blødde av submandibular punktering og sera ble samlet. Hver serum ble evaluert individuelt ved ELISA for IgG-antistoffer mot totalt PR8 proteiner. Grafdata representerer midler og standardavvik av resultatene oppnådd fra personlige mus sera (n = 6). O.D, optisk tetthet. ELISA analyser ble utført i et BSL-2 skap. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Analysere tilstedeværelsen av nøytralisere antistoffer i musen serum ved bruk av HAI analysen, seriell 2-fold fortynninger av sera (tidligere inaktivert ved 56 ° C) for hver gruppe med mus vaksinert med forskjellige doser (102103og 104 FFU) av PR8 LAIV ble inkubert med 4 HAU av PR8 WT 1t på RT (figur 5). Deretter ble 0,5% av Tyrkia RBCs lagt til PR8-sera blandinger. Den øvre delen av figur 5 er en skjematisk fremstilling av mulig HAI resultatene: Når serum inneholder nøytraliserende antistoffer, RBCs nedbør er observert i bunnen av brønnen fordi antistoffer bundet til viral HA protein hindre hemagglutination av RBCs. På den annen side, i fravær av nøytralisere antistoffer, er hemagglutination av RBCs observert. Deretter beregnes HAI titer som resiproke av fortynning av serum i det siste også mangler hemagglutination. HAI resultatene viste i den nedre delen av figur 5 viser at serum fra musen vaksinert med mengde PR8 LAIV (104 FFU) har den høyere titer av nøytralisere antistoffer mens serum fra mus vaksinert med den lavere dose (102 FFU) har den laveste titer av nøytralisere antistoffer mot PR8. Ingen nøytraliserende antistoffer var til stede i serum kontroll (mock-infiserte mus).

Figure 5
Figur 5: Hemagglutination hemming (HAI) analysen: Nivåer av nøytralisere antistoffer mot PR8 WT i infiserte mus kan lett evalueres av HAI analysen. Kort, 2-fold føljetong fortynninger (starter fortynning 1:10) av sera fra mus vaksinert med den angitte doser av PR8 LAIV ble blandet (1:1) med 4 HAU av PR8 WT 1t på RT i en 96-brønns V bunn plate. Etter 1 h inkubasjon ble 0,5% RBCs lagt til virus-serum blandinger for 30-60 minutter på is. HAI titers bestemmes ved å identifisere sist i som RBCs danner en rød knapp og hemagglutination oppstår ikke (øverst). HAI analyser med PR8 WT ble utført i et BSL-2 skap. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I figur 6representert dataene innhentet i evalueringen av nøytralisere antistoffer i musen sera av VNA. 200 FFU av PR8 WT ble blandet med føljetong 2-fold fortynninger av sera (tidligere inactivatEd på 56 ° C) fra mus vaksinert med forskjellige doser (102103og 104 FFU) av PR8 LAIV 1t på RT. Hver serum prøve ble vurdert i tre eksemplarer. Virus-sera blandinger ble brukt til å infisere monolayers MDCK celler i en 96-brønns plate. Den øvre delen av figur 6 er en skjematisk fremstilling av mulig VNA resultatene: fravær av nøytralisere antistoffer i serum fører til CPE på ca 3-4 dager p.i. I kontrast, når nøytraliserende antistoffer er tilstede (intakt celle monolayer), de binder seg til viral HA og forebygge virusinfeksjon, og det er ingen CPE. Tilstedeværelsen av CPE er vanligvis visualisert ved farging infiserte celler med crystal fiolett og viral nøytralisering titers beregnes som den resiproke verdien av den siste fortynning som infeksjon er fullstendig blokkert. Resultatene av VNA er representert i den nedre delen av figur 6. Serum fra mus vaksinert med høy mengde PR8 LAIV (104 FFU) har den største titer av nøytraliserende antistoffer mens sera fra mus vaksinert med lavere dose eller PR8 LAIV (102 FFU) har den laveste titer av nøytralisere antistoffer, lik resultatene med HAI analysen. Ingen nøytraliserende antistoffer var til stede i serum fra uekte-infiserte mus.

Figure 6
Figur 6: Virus Microneutralization analysen (VNA): Et alternativ til HAI analysen, VNA analysen kan evaluere tilstedeværelsen av PR8 WT nøytralisere antistoffer. Kort, sera fra mus vaksinert med den angitte doser av PR8 LAIV var serielt 2-fold utvannet (start fortynning 1:5) i 96-brønnen plater og blandet 1:1 med 200 FFU av PR8 WT 1t på RT. Etter 1 h, ble virus-serum blandinger brukt til å infisere 96-brønns plater av MDCK celler. Infiserte celler var ruges i 3-4 dager før komplett cytopathic virkning. 96-brønns platene ble deretter farget med 0,1% crystal fiolett. VNA titers bestemmes ved å identifisere de høyeste fortynning beholde en confluent celle monolayer. VNA med PR8 WT ble utført under BSL-2 forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Evaluering av beskyttelse effekt IAV vaksiner i mus

Når en ny LAIV er utviklet, sikkerhet, immunogenisitet og beskyttelse effekt må være testet i vivoog musemodell er vanligvis den første dyr modellen valgt å analysere disse parameterne. Figur 3 er en av de ulike trinnene for å karakterisere en ny LAIV i mus. For å vurdere sikkerheten av en LAIV (figur 3A), mus er infisert i.n. bruker en lignende protokoll til eksperimentelle fremgangsmåtene i delen patogenesen (del 4), og kroppsvekt og overlevelse overvåking vil gi informasjon relatert til sykelighet og dødelighet av LAIV (tall 2A-2B), inkludert MLD50. I tillegg på inoculation med forskjellige vaksinedoser, replikering av LAIV nederst (lungen) og øvre (nasal slimhinner) luftveiene bør være vurdert8,9,10, 11,29 (figur 2D). For å teste immunogenisitet, samles sera fra mus vaksinert med LAIV før utfordring med PR8 WT (homologe utfordring), bruker like protokoller til beskrevet i delen immunogenisitet (del 5) (figur 3B). Totalt og nøytralisere antistoffer i sera kan oppdages ved ELISA og HAI og/eller VNA, henholdsvis.

Til slutt, for å teste beskyttelse effekt, LAIV-vaksinert mus er utfordret med PR8 WT og beskyttelse effekten er preget av overvåking sykelighet, dødelighet og tilstedeværelsen av utfordringen PR8 WT i lungene, som tidligere beskrevet i avsnitt 4 ( Figur 3 c)8,9,10,11. Hvis LAIV induserer beskyttelse mot PR8 WT utfordring, mus vil ikke miste kroppsvekt og de vil overleve dødelige utfordringen med IAV WT. Videre IAV WT viral titers i lungene vil ikke oppdages, eller vil bli vesentlig redusert sammenlignet mock (PBS) vaksinert mus8,9,10,11.

Vev kultur medier og løsninger Komposisjon Lagring Bruk Kommentarer
Vev kultur medier: Dulbecco modifiserte Eagle's medium (DMEM), 10% fosterets Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG) 445 ml DMEM, 50 ml av FBS og 5 ml av 100 x 1% Penicillin (100 enheter/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) - L - glutamin (2 mM) (PSG) Butikken på 4° C Dette mediet brukes til vedlikehold av Madin-Darby hjørnetann nyre (MDCK) epitelceller
Etter infeksjon medier: DMEM 0,3% Bovine Albumin (BA), 1% PSG (DMEM 0,3 BA 1% PSG) 491 ml DMEM, 4,2 ml av 35% BA og 5 ml av 100 x PSG Butikken på 4° C Dette mediet brukes for vedlikehold av MDCK celler etter influensa A-viruset (IAV)
10 x fosfat bufret saltvann (10 x PBS) 80 g av NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. Legge til ddH2O til 1 L. justere pH 7.3 Lagre ved romtemperatur (RT) Sterilisere av autoklav
1 x PBS Fortynne 10 x PBS 1:10 med ddH2O Butikken på RT Sterilisere av autoklav
Infeksjon media: 1 x PBS, 0,3% BA, 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1 x PBS sterilt, 4,2 ml av 35% BA og 5 ml av 100 x 1% Penicillin (100 enheter/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) (PS) Butikken på 4 ° C Dette mediet brukes for IAV infeksjoner
Fiksering/permeabilization løsning: 4% formaldehyd, 0,5% triton X-100 fortynnet i 1 x PBS 400 mL nøytrale fullbufrede Formalin 10%, 5 ml av Triton X-100 og 595 ml 1 x PBS
d > butikken på RT Denne løsningen brukes til å fastsette og permeabilize MDCK celler i viral titrering eksperimenter Forberede løsningen i avtrekksvifte å hindre eksponering for formaldehyd Blokkerer løsning: 2,5% Bovine Serum Albumin (BSA) i 1 x PBS 2.5 g av BSA i 97.5 mL 1 x PBS Butikken på 4 ° C Denne løsningen brukes som blokkerer løsning for immunofluorescence analyser og ELISAs. Sterilisere ved filtrering med 0,2 µm filter. Antistoff fortynning løsning (1% BSA på 1 x PBS) 1 g BSA i 99 mL 1 x PBS Butikken på 4 ° C Denne løsningen brukes for fortynning av primære og sekundære antistoffer i immunofluorescence analyser og ELISAs Sterilisere ved filtrering med 0,2 µm filter 0,1% crystal violet løsning 1 g av crystal fiolett i 400 ml av metanol. Legge til 600 ml ddH2O Butikken på RT Denne løsningen brukes til å fastsette og flekker MDCK cellene i viral nøytralisering analyser Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl keton (TPCK)-behandlet trypsin Forberede en 1000 x lager løsning på 1 mg/ml i ddH2O Butikken på 20 ° C TPCK-trypsin legges i IAV infeksjoner Gjøre 100 µl dele RIPA buffer 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natrium deoxycholate, 0,1% SDS, 140 mM NaCl Butikken på 4 ° C Denne løsningen brukes til å lage celle ekstrakter

Tabell 1: vev kultur medier og løsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musemodell av IAV er mye brukt for i vivo studier av IAV patogenesen, immunogenisitet og beskyttelse effekt. Den lille størrelsen på mus gjør dem lett å manipulere og lagre i forhold til andre dyr modeller som oppspore eller marsvin. Videre, enkelt i dyr koster, bolig og reproduksjon tillate bruken i pre-klinisk vaksinasjon tester som stort antall dyr er nødvendig. Spesielt siden mus har blitt brukt i flere forskning disipliner, flere molekylære og immunologi murine reagenser er tilgjengelig for å lette bruken for IAV studier. Videre minimal vert variasjon og tilstedeværelsen av en immun-system som ligner evolusjonært stede i mennesker gjør dem en robust liten dyr modell for IAV studier. Endelig er studiet av vert-viral protein interaksjoner og deres bidrag til viral patogenesen nå mulig ved tilgang til KO mus. Men foruten flere fordelene med å bruke mus for IAV studier, er de ikke nyttig for IAV overføring studier. Oppspore eller marsvin er derfor mer egnet dyremodeller å studere IAV overføring. Kliniske symptomer i mus infisert med IAV vanligvis vises 2-3 dager etter smitte, selv om dette kan variere avhengig av musen alder, immun rang, sex, genetisk bakgrunn og belastning; viral belastning og dose brukes. Symptomer inkluderer anoreksi, slapphet, sammenklynging, ruffled pels, tap av kropp vekt og død16,17.

I dette manuskriptet beskriver vi hvordan å evaluere viral patogenesen i mus infisert i.n. med IAV ved å overvåke kroppen vekttap (sykelighet), prosentandel av overlevelse (dødelighet) og ved å vurdere viral replikasjon øverst (nasal slimhinner) og lavere (lungen) luftveier (figur 1 og figur 2). Patogenesen av IAV er en svært viktig parameter ikke bare i sammenheng med nye IAV stammer, men også i trygt gjennomføringen av LAIV vaksine kandidater (Figur 3). Sesongmessige IAVs og IAVs som infisere andre pattedyr (som hester, hunder eller griser) produserer vanligvis ikke tegn på sykdom i mus11,27. I dette tilfellet er analyse av viral titers i lungene eller nasal mucosa i infiserte mus det viktigste parameteren å evaluere viral patogenesen av IAV stammer. Når lungene og nasal mucosa samles, de er homogenisert og mengden av virus i disse organene kan analyseres av plakk analysen, immunofluorescence analysen, vev kultur smittsomme dose 50 (TCID50) eller en annen godkjent metode8 ,29. Vi anbefaler evaluering viral titers bruke indirekte immunofluorescence siden plakk analysen krever et høyere antall MDCK celler (6-vel plate format) og, som de TCID50, kreves mer tid (3-4 dager) til å beregne viral titers. Men for å utføre indirekte immunofluorescence analysen, er det nødvendig å ha: 1) primære spesifikke antistoffer mot en IAV protein (anbefales det å bruke et antistoff mot IAV nucleoprotein, NP, siden det er det mest tallrike viral proteinet som produseres under viral infeksjon); 2) sekundære antistoffer konjugert til en fluorophore; og 3) fluorescens mikroskop telle fluorescerende positiv infiserte celler.

Siden immunsystemet mus ligner evolusjonært immunsystemet mennesker16 og fordi mus kan lokke fram en sterk og beskyttende humoral respons mot IAV infeksjon, kan immunogenisitet IAVs (eller vaksine kandidater) lett vurdert ved fastsettelse totalt (ELISA; Figur 4) og nøytralisere (HAI, figur 5) eller VNA (tall 6) antistoff svar. Analysere humoral svar etter immunisering, kan mus være blødde av godkjente metoder som retro-orbital punktering, hale klipp, saphenous åre punktering eller submandibular punktering. Vi valgte submandibular punktering teknikk26 fordi prosedyren ikke krever bruk av anestesi og tillater oss å få en akseptabel volum av blod for immunologiske studier; i motsetning til retro-orbital punktering er der mus bør være anesthetized, og med halen klippet eller saphenous stemning punktering, der blod volumet gjenopprettet vanligvis lav.

I dette manuskriptet beskrev vi hvordan man skal vurdere tilstedeværelse av antistoffer mot totalt virale proteiner med ELISA bruke virusinfiserte celle utdrag. Siden IAV infeksjon induserer en beskyttende immunitet formidlet, hovedsakelig av antistoffer mot viral HA (antigen viral Hovedmålet), er det sterkt anbefalt å vurdere mengden spesifikk antistoffene indusert mot HA av ELISA bruker rekombinant renset HA proteiner10. Både HAI og VNA godtas for å analysere tilstedeværelsen av nøytralisere antistoffer, men begge har fordeler og ulemper. HAI er rask (2-3 h) og godkjent av Center for sykdom og Control (CDC) å vurdere tilstedeværelsen av IAV nøytralisere antistoffer30. VNA er mer tidkrevende (3-4 dager), men er mer spesifikke siden evalueres bare antistoffer som kan nøytralisere virusinfeksjon. Spesielt har VNA vist å oppdage stengel-reaktive HA nøytralisere antistoffer31, samt NA nøytralisere antistoffer32. En annen fordel med VNA er analysen sensitivitet, siden mindre IAV (200 FFU) er nødvendig i forhold til HAU analysen som krever ca 10 ~4-105 FFU. Videre kan HAI analysen være problematisk for å oppdage nøytraliserende antistoffer mot fugleinfluensa IAVs på grunn av problemer med å tolke resultatene33,34,35. I tillegg krever VNA ikke bruk av RBCs for identifikasjon av influensa nøytralisere antistoffer.

Til slutt, vi beskrive de eksperimentelle fremgangsmåtene for å vurdere de tre viktigste aspektene som må vurderes i utviklingen av nye IAV vaksiner (Figur 3): 1) sikkerhet: vaksinen må være trygg og ikke produsere sykdom; 2) immunogenisitet: vaksinen må være immunogenic og indusere både humoral og cellulær beskyttende svar; 3) beskyttelse effekt: vaksinen må indusere beskyttelse mot utfordringen med WT homologe og/eller heterologous virus. Mus-modell er et godt valg for den første screening av en ny IAV vaksine i vivo fordi det kan evaluere ulike vaksinasjonsprogrammer og betingelser, inkludert bruk av ulike adjuvans, antigen/vaksine dose, administrasjon og bred beskyttelse mot utfordringen med homologe eller heterologous IAVs stammer16,17. Men før du går videre til kliniske studier, bør vaksine kandidater minst testes i andre i vivo modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forskning på influensavirus i LM-S laboratorium er delvis finansiert av The New York influensa Center of Excellence (NYICE), medlem av NIAID Centers of Excellence for influensa forskning og overvåking (CEIRS). Vi takker Wendy Bates for sin støtte i korreksjoner manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23, (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430, (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18, (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9, (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356, (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89, (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88, (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90, (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500, (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252, (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83, (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199, (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3, (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2, (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85, (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22, (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4, (3), e4857 (2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9, (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76, (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37, (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70, (3), 391-398 (2003).
Influensa A Virus studier i en musemodell av infeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter