Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion

doi: 10.3791/55898 Published: September 7, 2017

Summary

Influensa A virus (IAVs) är viktiga mänskliga luftvägspatogener. Att förstå patogenicitet av IAVs att utföra prekliniska tester av nya vaccin metoder och, djurmodeller härma mänsklig fysiologi krävs. Här beskriver vi tekniker för att utvärdera IAV patogenes, humorala svar och vaccinets effekt med hjälp av en musmodell av infektion.

Abstract

Influensavirus orsakar över 500 000 dödsfall i världen1 och är associerade med en årlig kostnad på 12-14 miljarder USD i USA ensam fundera direkt sjukvård och sjukhusvård kostnader och arbetsfrånvaro2. Djurmodeller är avgörande för influensa A-virus (IAV) studier för att utvärdera viral patogenes, värd-patogen interaktioner, immunsvar, och effekten av nuvarande eller nya vaccin närmar sig liksom antivirala läkemedel. Möss är en fördelaktig små djurmodell eftersom deras immunförsvar är evolutionärt liknande som finns i människor, de är tillgängliga från kommersiella leverantörer som genetiskt identiska individer, det finns flera stammar som kan utnyttjas för att utvärdera den genetiska grunden för infektioner, och de är relativt billiga och lätta att manipulera. För att sammanfatta IAV infektion hos människa via luftvägarna, är möss först bedövas före intranasalt inympning med infektiös IAVs korrekt biosäkerhet inneslutna. Efter infektion bestäms patogenesen av IAVs genom att övervaka dagligen sjukligheten (viktminskning) och dödlighet (överlevnad). Dessutom kan viral patogenes också utvärderas genom att bedöma virusreplikation i övre (nässlemhinnan) eller nedre (lungor) luftvägarna hos infekterade möss. Humorala svar på IAV infektion kan utvärderas snabbt av icke-invasiva blödning och påvisande av sekundära antikroppar analyser som syftar till att påvisa förekomst av totalt eller neutraliserande antikroppar. Här beskriver vi de vanliga metoder att infektera möss intranasalt (i.n) med IAV och utvärdera patogenes, humorala immunsvar och skydd effekt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IAVs är höljeförsedda virus som klassificerade i Orthomyxoviridae familj3. De innehåller åtta enkelsträngat RNA-molekyler med negativ polaritet3. I människor orsaka IAVs säsongsbetonade epidemier och enstaka pandemier av viktig konsekvens när nya virus introduceras i den mänskliga befolkning4. Dessutom överförs säsongsbetonade IAVs mycket och snabbt mellan människor producerar en förhöjd ekonomisk förlust i världen varje år2,5. IAV symtomen är hosta, nästäppa, feber, allmän sjukdomskänsla, huvudvärk, anorexi och myalgi, men viruset kan också producera en mer allvarlig sjukdom hos immunsupprimerade patienter6. I själva verket beräknar den Världshälsoorganisationen (WHO) att säsongsbunden influensavirus orsaka 300 000-500 000 dödsfall i världen varje år1. Det finns bara två klasser av läkemedel som för närvarande godkänts av Food and Drug Administration (FDA) för influensa profylax och behandling hos människa: (NA)-neuraminidashämmare (t.ex., oseltamivir) och blockerare av M2 Jonen kanaliserar (t.ex., amantadin); uppkomsten av resistenta virusvarianter är dock en ökande oro. Vaccination, därför förblir det bästa medicinska alternativet för att skydda människor mot IAVs infektioner. Hittills har tre typer av influensa vacciner licensierad av FDA för humant bruk finns tillgängliga: rekombinant viral hemagglutinin (HA) protein vacciner, inaktiverat vaccin mot influensa (IIV) och levande försvagade influensa vaccin (LAIV)5, 7. de tre vaccinerna är utformade för att inducera adaptiva immunsvaret mot viral HA proteinet, stora målet av neutraliserande antikroppar mot IAVs.

En validerad musmodell att studera IAV infektion i vivo

Djurmodeller har använts för att studera, bland annat IAV patogenes8,9,10,11, viral faktorer som bidrar till sjukdom12 eller virusöverföring13 ,14, och att testa effekten av nya vacciner eller antivirala läkemedel9,10,15. Möss (Mus musculus) är den mest omfattande används djurmodell för IAV forskning av flera skäl: 1) immunförsvaret är evolutionärt liknar som förekommer i människor; (2) låg kostnad, inklusive animaliska inköp, bostäder och fortplantning. (3) liten storlek enkelt manipulera och lagra; (4) minimal värd variabilitet att få homogena svaren och resultat. (5) en stor kunskap om möss biologi, inklusive genomsekvens; (6) många tillgängliga molekylärbiologi och immunologi reagenser. (7) tillgängliga knock-out (KO) möss att studera bidrag av en given värd protein på virusinfektion; och 8) flera mus-stammar som kan utnyttjas för att utvärdera den genetiska grunden för infektioner.

I området i närheten finns det flera mus stammar tillgängliga att studera IAV in-vivo. Ålder, immunstatus, kön, genetiska bakgrund och mus stam samt rutter av infektion, dos och viral stammar alla påverka utfallet av IAV infektion hos möss. De vanligaste mus stammar används i IAV forskning är C57BL/6, BALB/C och, mer nyligen, DBA.2 möss eftersom de är mer mottagliga för IAV sjukdom än de två tidigare stammar16,17,18, 19 , 20. allt immunsvaret kan också olika beroende på mus stam18,19,20. Det är således mycket viktigt att återvinna all tillgänglig information om musen och IAV stam att välja det bästa alternativet för experimentet ska genomföras.

Även musen är en bra djurmodell av infektion för in-vivo studier med IAV, har de flera begränsningar, som måste beaktas i experimentell design. Exempelvis är en större begränsning av med möss för in-vivo studier att IAVs inte sänder bland möss. Således för överföring accepterade studier, mer djurmodeller (t.ex., frettar eller marsvin) är begagnade16,17,21. Dessutom finns det flera skillnader mellan manifestationer av IAV i möss och människor. Till skillnad från människor utvecklar möss inte feber vid IAV infektion; omvänt närvarande de med hypotermi16,17. Hos möss, är IAV replikering koncentrerad i de nedre luftvägarna (lungor) snarare än de övre luftvägarna. IAV virulens hos möss är således inte alltid korrelerar till som ses hos människa. Helt och hållet, eftersom fördelarna överväger de begränsa nackdelarna, mus representerar den första djurmodell som används för att utvärdera influensa viral patogenes, immunogenicitet och skyddande effekt i vaccin och antivirala studier. Dessutom skulle det inte vara etiskt försvarbart att genomföra studier med IAV använder stora djurmodeller utan föregående tecken i en liten djurmodell av IAV infektion. I detta manuskript, beskriver vi hur man infekterar möss intranasalt (i.n.) med IAV, hur att övervaka svårighetsgrad och progress av virusinfektion och hur man utför de experiment som krävs för att utvärdera humorala immunsvar och skydd effekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alla djur protokoll som beskrivs här godkändes av den institutionella Animal Care och användning kommittén (IACUC) och den institutionella biosäkerhet kommittén (IBC) vid University of Rochester School of Medicine och tandvård och överensstämmer med rekommendationer i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i nationell forskning rådet 22. Faciliteterna och program av Vivarium och Division av försöksdjursmedicin School of Medicine och tandvård är ackrediterade av AAALAC International och följa statens lag, federala lagar och National Institutes of Health (NIH) politik. Liknande krav ska tillämpas på varje institution att följa de animaliska protokoll som beskrivs i detta manuskript.

1. användning av små ryggradsdjur

Obs: korrekt utrustning för personligt skydd (PPE) krävs för att arbeta med möss. Minimikrav inkluderar engångsoveraller, skoskydd, huvudet bonnet, mask och handskar.

  1. Enligt IACUC protokoll, placera högst 5 möss per bur. Följande IACUC protokoll, eutanasi möss med två metoder för dödshjälp (andra måste vara en fysisk metod) för att säkerställa att djuret är dött.
    Obs: I experiment i vilka IAV sjuklighet och dödlighet utvärderas, möss som förlorat 20% av sin initiala kroppsvikt ansågs ha nått slutpunkten experimentella och var euthanized med CO 2, och cervikal dislokation som den fysiska sekundär metod. Denna andel av kroppsvikten kan vara annorlunda i andra institutioner. I förfaranden där möss lungor och nässlemhinnan samlas efter IAV infektion, möss är euthanized med en dödlig dos av 2,2,2-tribromoethanol (TBE), och genom att skära nedsatt ven som fysiska sekundära metod. Kvinnliga 6-till-8-vecka-gammal C57BL/6 möss köptes och underhålls i djurvård anläggningen vid University of Rochester School of Medicine och tandvård särskilda villkor patogenfria.

2. Biosäkerhet

Observera: I detta betänkande de IAVs används att infektera möss är vanliga mus-anpassad laboratorium stam av influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8 WT) 22 , 23 och en temperatur känslig LAIV variant, PR8 LAIV 8. Utför alla procedurer som involverar IAV infektioner (in vitro- eller in-vivo), cellkulturer och biologiska prover, i biologiska säkerhetsdragskåp under biosäkerhet nivå (BSL) -2 villkor. Utnyttja andra BSL kostymer eller inneslutningsförhållandena om högvirulent IAV stammar används.

  1. Rena biosäkerhet skåp med klor koldioxid desinfektionsmedel före och efter att utföra alla de experimentella procedurer som beskrivs i detta manuskript. Sterilisera alla dissektion material (sax, skalpell och dissekera tången) och den Dounce homogenisatorn före och efter deras användning efter ordentlig IBC rekommendationer. Släng allt material som producerats under förfarandena i enlighet med lämpliga riktlinjer för IBC och IACUC.

3. Intranasala infektion

  1. plats den kvinnliga 6-till-8-vecka-gammal C57BL/6 möss särskilda villkor patogenfria. Organisera och etiketten musen burar med virus och dos används. Identifiera möss i varje bur med ett öra punch kod eller med någon annan godkänd metod såsom målning av svansar. Placera högst 5 möss per bur.
  2. Förbereda utspädning av IAV (fluorescerande bildar enheter (FFU) / mus) under aseptiska förhållanden i en total volym av 30 µL/mus i sterila 1 x fosfat buffert saltlösning (PBS). Upprätthålla det virus inokulatet på is. Beräkna mängden IAV att lägga till i den virala utspädningen med formel: ((X FFU per mus/30 µL) x slutliga volym) / aktiemarknaden viral titer.
  3. Väger möss med en skala och vikten för varje mus (dag 0). Håll musen i dorsala ställning plocka upp av kragen i nacken mellan pekfinger och tumme. Håll svansen mot handen med lillfingret.
  4. Söva musen intraperitonealt (i.p.) med 240-250 mg/kg av TBE genom att sätta nålen i den kaudala 2/3 av höger sida av buken. Pausa kort innan du drar nålen. Återgå musen till buren och vänta 5 min.
  5. Gäller sterila oftalmologiska salva i ögonen att förhindra torrhet medan musen är sövd. Kontrollera om musen är sövd av brist på pedal tillbakadragande reflexen (dvs, tå nypa). Om möss inte är fullt anesthetized de kommer att hosta upp viruset.
  6. När musen är fullt anesthetized, Placera musen i dorsala koordinationsrubbning. Sätt Pipettera spetsen som innehåller 30 µL av de virus inokulatet i näsborren och långsamt men ständigt mata ut lösningen. Glöm inte musen är inandning preparatet genom att observera inokulatet släppa försvinner.
  7. Kontrollera att musen andas som TBE kan sänka andelen temperatur och andning. Tillbaka djuret till buren att placera den i dorsala koordinationsrubbning. Övervaka möss för tecken på andnöd och om observerade, hjälpa musen för att andas genom att hålla djur vertikalt och inducera påverkan driven respiration 24. Övervaka musen tills det återfår medvetandet (30-45 min efter det var sövd).

4. Karakterisering av Viral patogenes ( figur 1)

  1. utvärdering av sjuklighet och dödlighet ( figur 1 och figur 2)
    1. Infektera i.n. 3-4 grupper av kvinnliga 6-till-8-vecka-gammal C57BL/6 möss (minst 5 möss per grupp, n = 5) med 10-faldig doser (10, 10 2 10 3 och 10 4 FFU/mus) av PR8 WT som beskrivs i avsnitt 3.
    2. Monitor och väga möss med en skala över de närmaste 14 dagarna vid ungefär samma tid att minimera vikt variationer i mat intag. Euthanize möss som förlora 20% av sin initiala kroppsvikt som beskrivs i avsnitt 1.
    3. Efter 14 dagar, avliva de möss som överleva virusinfektion som beskrivs i avsnitt 1.
    4. Beräkning av viral 50% mus dödlig dos (MLD 50) baserat på den överlevnadsdata som erhållits med metod av Reed och Muench 25. Först beräkna andel avståndet (PD):
      Equation 1
      1. därefter beräkna den MLD 50 genom följande formel:
        Equation 2
  2. utvärdering av viral titrar i lungorna och nässlemhinnan ( figur 1 och figur 2. )
    1. återvinning av lungor och nässlemhinnan
      1. infektera i.n. kvinnliga 6-till-8-vecka-gammal C57BL/6 möss (n = 6) med viral dosen till 10-10 4 FFU av PR8 WT-prov som beskrivs i avsnitt 3.
      2. Samla mus lungor och nässlemhinnan dagar 2 (n = 3) och 4 (n = 3).
        1. Euthanize möss med en dödlig dos (i.p.) TBE (500 mg/kg). Placera djuret i dorsala koordinationsrubbning och desinficera päls över bröstkorgen med 70% etanol. Skära i huden med en skalpell från bröstbenet till basen på buken. Kapningar av 1 cm från basen av snittet till laterala delar av möss med saxen.
        2. Skär den nedsatt ven med sax att blöda musen som metoden sekundära dödshjälp. Placera djuret i ventrala ställning och vänta 2 min så att blodet att rinna ut. Detta steg är viktigt att minska blod i lungorna.
        3. Ta bort huden från hela den övre delen av musen (inklusive huvudet) till basen på buken där första snittet gjordes med hjälp av dissekera pincett och sax. Skära huvudet med saxen och placera den i en steril torr petriskål.
        4. Skär knytpunkter mellan överkäken och underkäken med saxen och kassera underkäken. Med saxen, göra två nedskärningar i ändarna av zygomatic bågarna och ta bort dem. Ta bort ögonen med hjälp av dissekera tången.
        5. Håller kraniet med dissekera tången och skär av kraniet längs sagittal suturen med en skalpell. Lyft de två halvorna av kraniet med hjärnan att se nässlemhinnan. De nasala mucosas omges av de främre benen i kraniet, inklusive nasal, överkäken, Palatinen, zygomatic, och ethmoid ben.
        6. Med en skalpell, skär del av kraniet med hjärnan och kassera. Placera den andra delen av kraniet med nässlemhinnan i ett sterilt rör. Förvara tuben på is (4 ° C) om proverna behandlas samma dag, eller på torris att frysa dem snabbt om proverna kommer att behandlas senare.
        7. För att undvika kontaminering av proverna, rengöra och desinficera dissekera verktygen mellan varje vävnad som återhämtat sig och mellan varje djur dissektion med klor koldioxid desinfektionsmedel.
        8. Att samla lungorna, placera djuret i dorsala koordinationsrubbning och skär lungsäcken med saxen. Öppna bröstkorgen genom att skära revbenen på 1 cm på båda sidor om bröstbenet. Göra nedskärningarna från basen av revbenen till den överlägsna delen med saxen.
        9. Gör ett tvärsnitt med saxen mellan de två snitt i den överlägsna del av bröstkorgen och ta bort bröstet plattan. Håll lungorna med tången, skär i slutet av luftstrupen (strax före lungorna) med saxen och sätta lungorna i ett sterilt rör. Förvara tuben på is (4 ° C) om proverna behandlas samma dag, eller på torris att frysa dem snabbt om proverna kommer att behandlas senare.
          Obs: Homogenisera vävnadsproverna samma dag som de samlas och förvaras vid-80 ° C att analysera viral titrar senare. Det är viktigt att prover inte genomgå upprepad frysning-tining cykler innan viruset titrar bestäms. Alternativt kan lagra vävnadsproverna vid-80 ° C tills de skall bearbetas.
    2. Homogenisering av lungor och nässlemhinnan
      1. Placera lungor eller nässlemhinnan i en steril Dounce Homogenisatorer och tillsätt 1 mL kall infektion media. Homogenisera provet genom att flytta mortelstöten upp och ner för ca 1 min i rumstemperatur (RT) tills lungorna är helt stört. Sätta det homogeniserade provet i ett sterilt rör och store vid 4 ° C. användning en nya Dounce Homogenisatorer för varje prov.
      2. Centrifugera proverna vid 300 x g i 5-10 min vid RT. samla supernatanten i en ny sterilt rör. Lagra supernatanten vid 4 ° C om viral titrering utförs på samma dag och kassera pelleten. Alternativt frysa (-80 ° C) supernatanten av det homogeniserade prover för att utvärdera viral titrar senare.
    3. Virustitrering av indirekt immunofluorescens
      1. dagen före titrering, utsäde 96 brunnar med Madin-Darby Canine njure (MDCK) epitelceller (4 x 10 4 celler per brunn) att nå ~ 80-90% sammanflödet i vävnadsodling media. Placera cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Dagen för viral titrering, kontrollera cellerna under mikroskopet för att bekräfta en enskiktslager innan virusinfektion.
      2. Förbereda 1:10 utspädningar av supernatanten av homogeniserad proverna (lung- eller nässlemhinnan) i infektion media i en plattan med 96 brunnar. Utföra viral titreringen av exemplar att noggrant bestämma viral titrar.
        1. Lägg 90 µL av infektion media till var och en av brunnarna i plattan med 96 brunnar. Tillsätt 10 µL av en av supernatanten homogeniserade prover till brunnar A1, A2 och A3 för att utvärdera viral antikroppnivåns på varje prov i tre exemplar. Tillsätt 10 µL av en annan supernatanten homogeniserade prover till brunnar A4, A5 och A6. Utföra samma utspädning i följd med resten av proverna.
        2. Efter det att provet supernatanten till rad A, använda en flerkanalig Pipettera för att blanda genom pipettering upp och ner. Överför 10 µL från rad A till rad B. ändring tips mellan utspädningar och blanda väl. Upprepa detta tills de når den sista raden (H).
      3. Ta bort vävnad odlingssubstratet (steg 4.2.3.1) med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter från MDCK celler i 96 brunnar och tvätta två gånger med 100 µL per brunn 1 x PBS.
      4. Överföra 50 µL per brunn av seriellt utspädda supernatanten de homogeniserade prover som plattan med 96 brunnar med MDCK celler. Börja överföra de högre spädningarna (rad H) till de lägre utspädningarna (rad A). I det här fallet är det inte nödvändigt att ändra tips mellan olika rader.
      5. Sätta 96 brunnar plattorna på en gungande plattform för 1 h på RT att tillåta viral adsorption. Efter viral adsorption, ta bort den inokulum med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter och tillsätt 100 µL per brunn efter infektion media. Inkubera infekterade celler för 8 h i en 33 ° C eller 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Fortsätta till fastställande, färgning, imaging och viral titer beräkning som beskrivs i steg 4.2.3.6 – 4.2.3.12.
      6. Ta bort vävnad odlingssubstratet från 96 brunnar plattorna med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter. Fixa och permeabilize cellerna med 100 µL per brunn av fixering/permeabilisering lösning för 20 min på RT.
        Varning: Använd fixering/permeabilisering lösningen i ett dragskåp för att förhindra formaldehyd exponering.
      7. Bort fixering/permeabilisering lösningen med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter, tvätta med 1 x PBS, och inkubera fast cellerna med blockering lösning för 1 h på RT. Store cellerna i blockering lösning vid 4 ° C eller gå vidare till nästa steg.
      8. Ta bort blockering lösningen. Tillsätt 50 µL per brunn 1 µg/mL monoklonala antikroppar (mAb) anti-NP HB-65 späds med lösningen för spädning av antikropp. Inkubera i 1 h vid 37 ° C. olika mAb eller polyclonAl antikroppar (pAb) anti-PR8 kan användas.
      9. Under tiden, späd 1: 200 av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugerade sekundära antimus-antikropp i antikropp utspädning lösning. Centrifugera lösningen vid 1.700 x g i 5-10 min på RT. Andra sekundära antikroppar konjugerat med andra fluorophores kan användas.
      10. Ta bort den primära antikroppen och tvätta 3 gånger med 100 µL per brunn 1 x PBS. Tillsätt 50 µL per brunn av sekundär antikropp utspädning och Inkubera under 30-45 minuter vid 37 ° C. ta bort sekundära antikroppen och tvätta 3 gånger med 100 µL per brunn 1 x PBS. Lämna den sista tvättningen i plattan.
      11. Observera cellerna i fluorescens Mikroskop för att fastställa antalet positiva betsad (grön) celler. Beräkna viral titern genom att räkna FFU/mL. Beräkna viral titern uttryckt i FFU/mL från utspädning med 30-50 positiva färgade celler med hjälp av formeln: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/spädning.

5. Utvärdering av humorala immunsvar ( figur 3)

  1. infektera i.n. 3 grupper av kvinnliga 6-till-8-vecka-gammal C57BL/6 möss (n = 5) med olika doser (10 2 10 3 och 10 4 FFU / mus) av PR8 LAIV, och mock-infektera en grupp (n = 5) med 1 x steril fosfatbuffrad Koksaltlösning som en negativ kontroll. Utför i.n mus infektioner som beskrivs i avsnitt 3.
    1. Mus blödning av submandibular punktering
      1. fjorton dagar efter immunisering, samla in möss blodet submandibular blödning med en 4 mm lansetten 26, eller använda en annan IACUC godkänd metod.
        1. Håll musen genom att plocka upp av kragen i nacken mellan pekfinger och tumme. Håll svansen mot handen med pinky finger att immobilisera musen.
        2. Sätta musen i en lateral position att se kinden. Gör punkteringen på mellan retro-orbital och submandibular venerna med halsvenen. Sink lancet (4 mm) och återställa blodet i ett sterilt rör (cirka 0,2 - 0,4 mL/mus återvinns). Applicera tryck på att punktera med en steril servett för några sekunder. Placera musen tillbaka i buren.
      2. Lade rören för 1-2 h vid 37 ° C och sedan Centrifugera dem 700 x g i 30 min på RT att separera serum från blodet. Överför det övre skiktet som består av serum med en Pipettera till en ny sterilt rör. Kassera pelleten av röda blodkroppar (RBC). Lagra i serum vid -20 ° C.
  2. Analys av totala antikroppar mot virala proteiner
    1. beredning av infekterade MDCK cell extrakt
      1. dagen innan infektion, frö en 100 mm maträtt med 4-5 x 10 6 MDCK celler (att nå ~ 80-90 % sammanflödet nästa dag) i vävnadsodling media. Placera cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Dagen för virusinfektion, kontrollera cellerna under mikroskopet för att bekräfta en enskiktslager innan virusinfektion.
      2. Förbereda en viral utspädning med en låg (0,001) multiplicity av infektion (MOI) för PR8 WT i infektion media i 4 mL totala slutvolymen. Beräkna mängden PR8 WT med formeln ((X MOI x n ° celler) x slutliga volym) / aktiemarknaden viral titer.
      3. Sug ut vävnad odlingssubstratet från MDCK cell plattan och tvätta två gånger med 4 mL 1 x PBS. Lägg till den virala inokulatet (4 mL) och sätter plattan på en gungande plattform för 1 h på RT att tillåta viral adsorption. Ta bort det virala inokulatet med vakuum och tillsätt 8-10 mL efter infektion media innehållande 1 µg/mL TPCK-behandlade trypsin. Inkubera infekterade celler för 48-72 h i en 33 ° C eller 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
      4. Lossa cellerna med hjälp av en cell-skrapa och samla celler och vävnad odlingsmedium med en Pipettera i en 15 mL tub. Centrifugera röret vid 400 x g i 5-10 min på RT. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL av RIPA bufferten och sätta mixen i en 1,5 mL sterilt rör. Inkubera på is för 20-30 min.
      5. Centrifugera röret vid 1300 x g under 20-30 minuter vid 4 ° C. noga, återställa supernatanten. Store cellen extrahera i 100 µL alikvoter vid -20 ° C.
      6. Titrera cell extrakt som beskrivs av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) innan utvärdera dem för förekomst av antikroppar 9 , 10 , 11 , 27. inkludera cell extrakt från mock-infekterade MDCK celler (beredd enligt ovan) som en negativ kontroll.
    2. ELISA ( figur 4)
      1. belägga polystyren 96 brunnar med den tillämpliga utspädningen av infekterade-MDCK cell extrahera i 1 x PBS (vanligtvis mellan 1: 200 - 1:1, 000). Coat en annan tallrik med samma utspädning av mock-infekterade MDCK cell extrakt som en negativ kontroll. Inkubera över natten (O/N) vid 4 ° C.
      2. Ta bort supernatanten med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter och tvätta en gång med 100 µL per brunn 1 x PBS med en flerkanals Pipettera. Blockera icke-specifik bindning genom att tillsätta 100 μl/brunn för att blockera lösning för 1 h på RT.
      3. Under tiden göra 2-faldig seriespädningar (start utspädning 1:50) av sera från varje mus smittade i steg 5.1 i lösningen för spädning av antikropp i en plattan med 96 brunnar.
      4. Ta bort blockering lösningen från de 96 brunnar polystyrenplattor med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter. Tillsätt 50 μl av varje mus serumspädningen i lämpliga väl och inkubera 1 h vid 37 ° C.
      5. Ta bort möss sera med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter. Tvätta brunnarna 3 gånger med destillerat vatten och en flerkanalig Pipettera. Tillsätt 50 µL per brunn av en sekundär antimus-antikropp konjugerat med pepparrot peroxidas (HRP) utspädd 1:2,000 i lösningen för spädning av antikropp. Inkubera vid 37 ° C. 1 h
      6. Ta bort den sekundära antikroppen med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter. Tvätta brunnarna 3 gånger med destillerat vatten och en flerkanalig Pipettera. Bered substratlösningen tetrametylbensidin (TMB) genom att blanda 1:1 lösning A och B. Tillsätt 100 µL per brunn av substrat och inkubera i 5-10 min på RT i mörkret.
      7. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 μl/brunn av 0,2 N H 24. Läs plattorna vid 450 nm på en ELISA-spektrofotometer.
      8. Subtrahera det värde som erhålls i varje utspädning av MDCK mock-infekterade 96 brunnar plattan från det värde som erhålls i den MDCK-infekterade plattan med 96 brunnar. Beräkna de genomsnittliga värdena för varje spädning med olika serum och företräda dem i en graf som visar standardavvikelser (SD).
  3. Analys av neutraliserande antikroppar
    1. Hemagglutination hämning (HAI) analysen ( figur 5)
      1. innan du utför HAI analysen, behandla mus sera med receptorn förstör enzymet (RDE) för att eliminera alla icke-specifik hämmare finns i serumet. Lägga till 1 volymdel mus serum i 4 volymer av RDE arbetsutspädningen (en spädning av serumet är nu 1:5). Inkubera O/N (12- 18 h) i 37 ° C vattenbad.
      2. Värma serumprover vid 56 ° C i 30 min att inaktivera RDE.
      3. Förhand fastställa aktiviteten hemagglutination (HAU) av PR8 WT av standard HA assay 28. När den virala HAU bestäms, späd viral beståndet till 8 HAU per 50 µL i 1 x PBS.
      4. Förbereda 2-faldig seriespädningar (12 utspädningar) RDE-behandlade serum i en plattan med 96 brunnar i V-botten. Använd en rad för varje serumprov (t.ex., A1 till A12).
        1. Lägg 25 µL av 1 x PBS från A1 till A12 brunnar. Testa varje serumprov i en rad. Tillsätt 25 µL av RDE-behandlade serum (1:5) till 25 µL 1 x PBS i den första brunnen i kolumnen (A1). Den första serumspädningen är 1:10.
        2. När alla RDE-behandlade serum läggs till den första kolumnen, (t.ex., A1, B1, C1), använda en flerkanalig Pipettera för att blanda sera och 1 x PBS genom pipettering upp och ner. Över 25 µL utspädda sera från den första kolumnen till den andra kolumnen (t.ex., från A1 a2). Ändra tips mellan utspädningar och blanda.
        3. Upprepa steg 5.3.1.4.2. tills de når den sista kolumnen (t.ex., A12, B12, C12). Kassera den 25 µL från den sista kolumnen, att hålla volymen konsekvent i alla brunnarna (25 µL). Inkluderar en rad av brunnar som innehåller endast 25 µL 1 x PBS utan någon sera som en negativ kontroll.
      5. Lägga till 25 µL av IAV utspätt till 8 HAU/50 µL till var och en av brunnarna med sera i plattan med 96 brunnar i V-botten; den avslutande volymen i varje är väl 50 µL, innehållande 4 HAU av virus. Blanda innehållet genom upprepad pipettering. Inkubera i 1 h på RT.
      6. Lägga till 50 µL av den 0,5% Turkiet röda blodkropparna till var och en av brunnarna. Blanda innehållet genom upprepad pipettering. Inkubera plattan för 30-45 min på is. Läs HAI analysen visuellt när de röda blodkropparna i kontrollbrunnarna (1 x PBS) bildar en röd fällning (dvs, pellets) på botten av brunnarna.
        Obs: Röda blodkroppar från andra arter såsom kyckling, marsvin eller häst kan också användas.
      7. Beräkna var HAI-titrarna genom att identifiera den sista väl där de röda blodkropparna bildar en röd pellet och hemagglutination uppstår inte.
        Obs: Det reciprocal värderar denna utspädning är HAI titern. De reciprocal värderar multipliceras med en faktor 20 att korrigera för 1:20 utspädning av serumet i första raden.
    2. Virus mikroneutraliserings-analys (VNA) ( figur 6)
      1. dagen innan VNA, förbereda MDCK celler i en plattan med 96 brunnar att nå 80-90% sammanflödet nästa dag som beskrivs i steg 5.2.1.1. Förbereda en utspädning av PR8 WT i infektion media ha 200 FFU/25 µL.
      2. Inaktivera mus sera på 56 ° C i 1 h. göra 2-faldig seriespädningar (12 spädning) per mus sera i tre exemplar med en plattan med 96 brunnar.
        1. Lägga till 40 µL serum till 160 µL av infektion media i den första brunnen som den första raden, (t.ex., A1) (serum spädning 1:5). Blanda genom pipettering. Tillsätt 100 µL av infektion media till andra brunnarna (A2 till H12).
        2. Överföra 100 µL från första raden till den andra raden att göra 1:2 utspädningar (t.ex., från A1 a2). Ändra tips mellan utspädningar och blanda genom pipettering. Upprepa detta tills den sista raden (t.ex., A12). Kassera 100 µL från den sista raden, att hålla volymen konsekvent i alla brunnarna (100 µL).
      3. Tillsätt 100 µL av IAV utspädning i alla brunnar. Inkubera i 1 h på RT. Under tiden, ta bort vävnad odlingssubstratet från MDCK celler i den plattan med 96 brunnar med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter och tvätta två gånger med 100 µL per brunn 1 x PBS.
      4. i varje plattan med 96 brunnar MDCK celler, lämna två rader av kontrollerna. En rad är den negativa kontrollen (celler utan viruset och sera), och den andra raden är den positiva kontrollen av infektion (celler med virus i avsaknad av sera eller sera från mock-infekterade möss).
      5. Överföra 50 µL per brunn från virus-antikropp plattan till 96 brunnar pläterar av MDCK celler. Lägg plattorna på en gungande plattform för 1 h på RT att tillåta viral adsorption.
      6. Ta bort den virus-antikropp inokulum med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter och tillsätt 100 µL per brunn efter infektion Media innehållande 1 µg/mL TPCK-behandlade trypsin.
      7. Inkubera cellerna för ~ 3-4 dagar i en 33 ° C eller 37 ° C inkubator med 5% CO 2 tills cytopatisk effekt (CPE) observeras i den positiva kontrollen (infekterade celler i avsaknad av sera eller med kontrollserumet).
      8. Ta bort vävnad odlingssubstratet med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter och tillsätt 100 µL per brunn av 0,1% kristallviolett. Inkubera i 1 h på RT. ta bort kristallviolett lösningen med en vakuum insugningsventil-flerkanals-adapter. Tvätta brunnarna 3 gånger med destillerat vatten. Torka plattorna vid RT.
      9. Beräkna var VNA-titrarna genom att identifiera den högsta utspädning som behåller en konfluenta cell enskiktslager av MDCK celler.
        Obs: Det reciprocal värderar denna motsvarande utspädning är neutraliserande antikropp titern. De reciprocal värderar multipliceras med en faktor på 10 att korrigera 1:10 utspädning av sera i den första brunnen av raden.

6. Utvärdering av skydd effekt vacciner ( figur 3)

  1. vaccinera i.n. en grupp kvinnliga 6-till-8-vecka-gammal C57BL/6 möss (n = 11) med PR8 LAIV dos att testa (FFU/mus) och mock-vaccinera en annan grupp av möss (n = 11) med 1 x steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Utföra mus i.n. vaccinationer som tidigare beskrivs i avsnitt 3.
  2. Fjorton dagar efter vaccination, blöda möss och samla sera som beskrivs i avsnitt 3. Analysera förekomsten av totalt och neutraliserande antikroppar mot PR8 WT som beskrivs i avsnitt 5.1.1.
  3. Femton dagar efter vaccination, mät och anteckna musen kroppsvikt (dag 0). Utmana möss i.n. med en dödlig dos av den PR8 WT (homolog challenge) som tidigare beskrivs i avsnitt 3.
  4. Mäta kroppsvikt och överlevnad (n = 5 / grupp) under 14 dagar efter utmaning att utvärdera sjuklighet och dödlighet som produceras av PR8 WT challenge i vaccinerade möss (avsnitt 4.1).
  5. Återställa mus lungor och nässlemhinnan (n = 3/dag) på dag 2 och dag 4 efter utmana med PR8 WT homogenisera och analysera lungorna och nässlemhinnan som beskrivs i avsnitt 4.2 till bedömer virusreplikation av PR8 WT i vaccinerade möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Karakterisering av viral patogenesen hos möss

Patogenesen av IAV är relaterade till sjuklighet och dödlighet orsakad av sin infektion. Dessa två parametrar kan utvärderas i möss enkelt: IAV sjuklighet är associerad med viktminskning hos infekterade möss och andelen överlevnad visar dödligheten (figur 1). Den kroppsvikt och överlevnaden hos IAV-infekterade möss övervakas vanligtvis dagligen i minst två veckor efter infektion8,9,10,29. Överlevnad uppgifterna kan avgöra MLD50 som beräknades med hjälp av metoden för Reed och Muench25. En annan indikator på IAV patogenes är relaterad till virusreplikation i lägre (lungor) och i övre (nässlemhinnan) luftvägarna (figur 1). Den information som erhålls med viral titern i dessa organ motsvarar till sjuklighet och dödlighet värden, och tillsammans ger en bra indikation på viral patogenes. Det är känt att IAV replikering i mus lungor topp mellan dag 2 och 4 efter infektion (PI), och så rekommenderar vi att återställa dessa organ på dag 2 och 4 p.i.

Figure 1
Figur 1: karakterisering av IAV patogenesen hos möss: IAV patogenesen hos möss är relaterad till dess sjuklighet (viktminskning) och dödlighet (% överlevnad), och även IAV möjlighet att replikera i övre (nässlemhinnan) och nedre (lungor) luftvägarna. Kort, på dag 0 möss vägs och bedövas intraperitonealt med 2,2,2-tribromoethanol (TBE) innan de är smittade intranasalt med IAV. Från dag 1 till dag 14 vägs möss dagligen för att utvärdera viktminskning (morbiditet) och % överlevnad (dödlighet) att beräkna den mus dödliga dosen 50 (MLD50). På dag 2 och dag 4 efter infektion, är möss lungorna och nässlemhinnan återhämtade och homogeniseras för att utvärdera virusreplikation. Möss experiment att karakterisera IAV patogenes med PR8 WT utförs BSL-2 villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I figur 2representeras uppgifter som erhållits i utvärderingen av PR8 WT patogenes. Fyra grupper om 6-8-vecka-gamla C57BL/6 möss (n = 11) var infekterade i.n. med angivna doser (10, 102103 och 104 FFU/mus) av PR8 WT. Den kroppsvikt och överlevnaden för 5 möss per grupp mättes av 14 dagar p.i. (figur 2AB). Alla möss immuniserats med 104 FFU av PR8 WT förlorade vikt snabbt (figur 2A) och alla av dem dog vid dag 5 och 6 p.i. (figur 2B). Möss som immuniserats med 103 FFU av PR8 WT förlorade kroppsvikt på senare tider p.i. (figur 2A) och de alla dog av dag 7 och 8 p.i. (figur 2B). Alla möss immuniserats med 102 FFU av PR8 WT förlorade kroppsvikt (figur 2A) men endast 2 av dem dog på dag 9 p.i. (figur 2B). Slutligen, möss som immuniserats med 10 FFU av PR8 WT förlora inte vikt (figur 2A) och alla av dem överlevde infektion (figur 2B). MLD50 av PR8 WT i detta experiment som beräknats med Reed och Muench metoden25 var 1,5 x 102 FFU (figur 2 c).

Att utvärdera PR8 replikeringen i övre och nedre luftvägarna tarmkanalen hos möss infekterade i.n. med angivna doser (10, 102, 103och 104 FFU/mus), lungorna och nässlemhinnan återfanns på dag 2 och 4 PI (n = 3). Efter lung homogenisering analyserades mängden virus i detta organ med immunofluorescens assay (figur 2D). Viral titern upptäckts i lungorna i grupperna olika möss var släkt med den dos som används för att vaccinera dem: högre viral titrar upptäcktes i lungorna av möss som immuniserats med 104 FFU av PR8 WT på dag 2 och 4 Pi, medan lägre viral titrar upptäcktes i i lungorna av möss som immuniserats med 10 FFU av PR8 WT.

Figure 2
Figur 2: Representation av Data erhållits i utvärderingen av Viral patogenes: Att analysera sjuklighet och dödlighet av PR8 WT, 6-8-vecka-gamla kvinnliga C57BL/6 möss (n = 5) var infekterade i.n. med angivet antal lysrör-bilda enheter (FFU) av PR8 WT och sedan övervakas dagligen i 2 veckor för (A) kroppsvikt förlust (morbiditet) och (B) överlevnad (dödlighet). Uppgifterna utgör medel och standardavvikelser av resultat fastställas för enskilda möss (n = 5). (C) värdena för % överlevnad utvärderas över 2 veckor används för att beräkna de MLD50 använder Reed och Muench metoden25. (D) för att utvärdera virusreplikation, 6-8-vecka-gamla kvinnliga C57BL/6 möss (n = 6) var infekterade i.n. med angivet antal FFU. Virusreplikation i lungorna eller nässlemhinnan infekterade möss utvärderas vanligen på dag 2 och 4 PI med en immunofocus-analys. Viral titrar bokförs som FFU/mL. Uppgifterna utgör medel och SDs av resultat erhållna i varje mus. Streckade linjer ingår att ange detektionsgränsen (200 FFU/mL) i analysen. Möss och vävnadsodling experiment att bedöma IAV sjuklighet, dödlighet och viral titrar med PR8 utfördes BSL-2 villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Utvärdering av humorala svar inducerad efter vaccination

Humorala svar induceras mot IAV infektion har en viktig roll i kontrollen av virusinfektion. Därför är det mycket viktigt att analysera de humorala svar framkallas av IAV WT infektioner eller nya IAV vacciner (figur 3). I musmodell, är 14 dagar efter immunisering, möss blödde för att analysera förekomsten av antikroppar mot de totala virala proteinerna av ELISA (figur 4) och närvaro av neutraliserande antikroppar riktade viral HA proteinet, som vanligtvis är analyseras av gemensamma serologiska metoder, såsom en HAI assay (ng klass = ”xfig” > figur 5) eller en VNA (figur 6).

Figure 3
Figur 3: system för de olika stegen i karakterisering av säkerhet, immunogenicitet och skydd effekt av en LAIV: När en ny LAIV är utvecklad, används musmodell av IAV infektion vanligen för att testa säkerhet, immunogenicitet och skydd effekt. I detta system, experimenten att bedöma säkerhet (A), indikeras immunogenicitet (B) och skydd effekt (C) en kandidat LAIV. (A) för att utvärdera säkerheten av en LAIV är det nödvändigt till assay samma parametrar (sjuklighet, dödlighet och virusreplikation i övre och nedre luftvägarna) beskrivs i figur 1. För att utvärdera immunogeniciteten, möss är immuniserats och 14 dagar efter vaccination är de blödde av submandibular punktering. Humorala svar analyseras genom att bedöma förekomsten av totala antikroppar mot IAV proteiner av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) och genom att utvärdera förekomst av neutraliserande antikroppar av hemagglutination hämning analys (HAI) och/eller virus mikroneutraliserings-analys (VNA). (C) för att utvärdera skyddseffekt, 15 dagar efter vaccination, möss utmanas med IAV WT. Protection utvärderas effekten av mätning av möss sjuklighet, dödlighet och viral titrar i lungorna av utmanade möss som beskrivs i figur 1 . Möss-experiment för att karaktärisera säkerhet, immunogenicitet och skydd effekten av en LAIV kandidat utförs BSL-2 villkor. Andra BSL kostymer eller inneslutningsförhållandena kan krävas beroende på IAV stammen används för utmaningen av vaccinerade möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Att utvärdera immunogeniciteten hos PR8 LAIV, tre grupper av 6-8-vecka-gamla C57BL/6 möss (n = 5) vaccinerades med olika doser (102103och 104 FFU/mus) PR8 LAIV eller mock vaccinerats med 1 x PBS som en negativ kontroll. Fjorton dagar efter vaccinationen, samlades möss sera in av submandibular blödande26 (figur 3). Antikroppssvar mot totala virusproteiner utvärderades av ELISA med en 1: 200 utspädning av cell extrakt av PR8-infekterade MDCK celler (figur 4). Varje serum var analyseras individuellt. Resultaten indikerar att sera från möss immuniserats med den högre dosen (104 FFU) av PR8 LAIV hade högre antikroppsnivåerna var mot totala PR8 proteiner än sera hos möss som immuniserats med den lägre dosen (102 FFU). Sera kontroll (mock-infekterade möss) visade inte reaktivitet mot PR8 antigener.

Figure 4
Figur 4: Schematisk bild av den Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) för att utvärdera humorala antikroppssvar: Nivåer av PR8-specifika antikroppar förekommer i infekterade möss bestäms av ELISA i 96 brunnar polystyren plattor belagda med cell extrakt från mock (kontroll) eller PR8-infekterade MDCK celler. Kort, på 14 dagar p.i. (figur 3), möss som immuniserats med angivna doser av PR8 LAIV var blödde av submandibular punktering och sera samlades. Varje serum utvärderades individuellt av ELISA för IgG antikroppar mot totala PR8 proteiner. Diagramdata representerar medel och standardavvikelser av resultaten som erhållits från enskilda möss sera (n = 6). O.D, optisk densitet. ELISA-analyser utfördes i ett BSL-2 skåp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att analysera förekomsten av neutraliserande antikroppar i musen serum använder HAI analys, 2-faldig seriespädningar av serum (tidigare inaktiverat vid 56 ° C) för varje grupp av möss som immuniserats med olika doser (102103och 104 FFU) av PR8 LAIV inkuberades med 4 HAU av PR8 WT för 1 h på RT (figur 5). Sedan, 0,5% av Turkiet RBC: er har lagts till PR8-sera blandningar. Den övre delen av figur 5 är en schematisk representation av möjliga HAI resultat: när serumet innehåller neutraliserande antikroppar, röda blodkropparna nederbörd observeras i botten av brunnen eftersom antikropparna bundna till viral HA proteinet förhindra hemagglutination av de röda blodkropparna. Däremot, i avsaknad av neutraliserande antikroppar, observeras hemagglutination av de röda blodkropparna. Sedan, HAI titern beräknas som det reciproka värdet av utspädning av serumet i de senaste väl sakna hemagglutination. HAI resultaten visade i den nedre delen av figur 5 visar att serum från mus vaccinerats med den största mängden PR8 LAIV (104 FFU) har den högre titern av neutraliserande antikroppar medan serumet från en mus immuniserats med den lägre dos (102 FFU) har den lägsta titern av neutraliserande antikroppar mot PR8. Ingen neutraliserande antikroppar var närvarande i serumkontroll (mock-infekterade möss).

Figure 5
Figur 5: Hemagglutination hämning (HAI) analys: Nivåer av neutraliserande antikroppar mot PR8 WT i infekterade möss kan enkelt utvärderas av HAI assay. Kort, 2-faldig seriespädningar (start spädning 1:10) av sera från möss som immuniserats med angivna doser av PR8 LAIV blandades (1:1) med 4 HAU av PR8 WT för 1 h på RT i en plattan med 96 brunnar i V-botten. Efter 1 h inkubation, har 0,5% RBC: er lagts till virus-serumblandningarna för 30-60 min på is. HAI-titrar bestäms genom att identifiera den sista väl där de röda blodkropparna bildar en röd knapp och hemagglutination uppstår inte (överst). HAI analyser med PR8 WT utfördes i ett BSL-2 skåp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I figur 6representeras uppgifter som erhållits i utvärderingen av neutraliserande antikroppar i mus sera av VNA. 200 FFU av PR8 WT blandades med 2-faldig seriespädningar av serum (tidigare inactivatEd vid 56 ° C) från möss som immuniserats med olika doser (102103och 104 FFU) av PR8 LAIV för 1 h på RT. Varje serumprov utvärderades i tre exemplar. Virus-sera blandningarna användes att infektera enskiktslager av MDCK celler i en plattan med 96 brunnar. Den övre delen av figur 6 är en schematisk representation av möjliga VNA resultat: avsaknad av neutraliserande antikroppar i serum resultat i CPE på cirka 3-4 dagar p.i. Däremot när neutraliserande antikroppar är närvarande (intakt cell enskiktslager), de binder till viral HA och förhindra virusinfektion, och det finns ingen CPE. Förekomst av CPE är oftast visualiseras genom färgning infekterade celler med kristallviolett och viral neutralisering titrar beräknas som det reciproka värdet av den sista utspädningen där infektion är helt blockerad. Resultaten av VNA är representerade i den nedre delen av figur 6. Serumet från möss som immuniserats med den höga mängden PR8 LAIV (104 FFU) har den största titern av neutraliserande antikroppar medan sera från möss som immuniserats med den lägre dosen eller PR8 LAIV (102 FFU) har den lägsta titern av neutraliserande antikroppar, liknande resultat som erhållits med HAI-analys. Ingen neutraliserande antikroppar var närvarande i serum från mock-infekterade möss.

Figure 6
Figur 6: Virus mikroneutraliserings-analys (VNA): Ett alternativ till HAI analysen, VNA analysen kan utvärdera förekomst av PR8 WT neutraliserande antikroppar. Kort, sera från möss som vaccinerats med de angivna doserna av PR8 LAIV var seriellt 2-faldig utspädd (start spädning 1:5) i 96 brunnar och blandad 1:1 med 200 FFU av PR8 WT för 1 h på RT. Efter 1 h användes virus-serumblandningarna att infektera 96 brunnar MDCK celler. Infekterade celler inkuberades i 3-4 dagar tills fullständig cytopatisk effekt. 96-väl plåtarna var sedan färgas med 0,1% kristallviolett. VNA titrar bestäms genom att identifiera den högsta utspädningen att behålla en konfluenta cell enskiktslager. VNA med PR8 WT utfördes BSL-2 villkor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Utvärdering av skydd effekten av IAV vacciner hos möss

När en ny LAIV är utvecklad, dess säkerhet, immunogenicitet och skydd effekt måste vara testade i vivooch musmodell är oftast den första djurmodell som valt att analysera dessa parametrar. Figur 3 är ett av de olika steg som krävs för att karakterisera en ny LAIV i möss. För att utvärdera säkerheten av en LAIV (figur 3A), möss är infekterade i.n. använder ett liknande protokoll till de experimentella procedurer som beskrivs i avsnittet patogenes (avsnitt 4), och de kroppsvikt och överlevnad övervakning kommer att ge information om sjuklighet och dödlighet av LAIV (siffror 2A2B), inklusive de MLD50. Dessutom vid inokulering med olika vaccindoser, replikering av LAIV i lägre (lungor) och i övre (nässlemhinnan) luftvägarna bör vara bedömda8,9,10, 11,29 (figur 2D). För att testa immunogenicitet, samlas sera från möss som vaccinerats med LAIV innan utmaningen med PR8 WT (homolog challenge), med liknande protokoll till de som beskrivs i avsnittet immunogenicitet (avsnitt 5) (figur 3B). Förekomsten av totalt och neutraliserande antikroppar i sera kan upptäckas av ELISA och HAI eller VNA, respektive.

Slutligen för att testa skydd effekt, LAIV-vaccinerade möss utmanas med PR8 WT och skydd effekt kännetecknas av övervakning sjuklighet, dödlighet och förekomsten av utmaning PR8 WT i lungorna, som tidigare beskrivits i avsnitt 4 ( Figur 3 c)8,9,10,11. Om LAIV inducerar skydd mot PR8 WT utmaning, möss kommer inte att förlora kroppsvikt och de kommer att överleva dödliga utmaningen med IAV WT. Dessutom IAV WT viral titrar i lungorna upptäcks inte eller kommer att minska avsevärt jämfört mock (PBS) vaccinerade möss8,9,10,11.

Vävnadsodling media och lösningar Sammansättning Förvaring Användning Kommentarer
Tissue culture media: Dulbecco ändrade örnens medium (DMEM), 10% fetalt bovint Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG) 445 ml DMEM, 50 ml FBS och 5 ml 100 x 1% Penicillin (100 enheter/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) - L - glutamin (2 mM) (PSG) Förvaras vid 4° C Detta medium används för underhåll av Madin-Darby Canine njure (MDCK) epitelceller
Efter infektion media: DMEM 0,3% bovint Albumin (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% BA 1% PSG) 491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA och 5 ml 100 x PSG Förvaras vid 4° C Detta medium används för underhåll av MDCK celler efter infektion med influensa A-virus (IAV)
10 x fosfatbuffrad saltlösning (10 x PBS) 80 g NaCl, 2 g kaliumklorid, 11,5 g av Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4. Lägg till ddH2O upp till 1 L. Justera pH till 7,3 Förvara i rumstemperatur (RT) Sterilisera i autoklav
1 x PBS Späd 10 x PBS 1:10 med ddH2O Butiken på RT Sterilisera i autoklav
Infektion media: 1 x PBS, 0,3% BA, 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS) 487 ml 1 x PBS sterila, 4,2 ml 35% BA och 5 ml 100 x 1% Penicillin (100 enheter/ml)-Streptomycin (100 µg/ml) (PS) Förvaras vid 4 ° C Detta medium används för IAV infektioner
Fixering/permeabilisering lösning: 4% formaldehyd, 0,5% triton x-100 utspätt i 1 x PBS 400 mL Neutral buffrad Formalin 10%, 5 ml Triton x-100 och 595 ml 1 x PBS
d > Store på RT Denna lösning används för att fixera och permeabilize MDCK celler i viral titrering experiment Förbereda lösningen i ett dragskåp att förhindra exponering för formaldehyd Blockering lösning: 2,5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS 2,5 g BSA i 97,5 mL 1 x PBS Förvaras vid 4 ° C Denna lösning används som en blockerande lösning för immunofluorescens analyser och ELISA-test. Sterilisera genom filtrering med 0,2 µm filter. Antikropp lösningen för spädning (1% BSA i 1 x PBS) 1 g av BSA i 99 mL 1 x PBS Förvaras vid 4 ° C Denna lösning används för utspädning av primära och sekundära antikroppar i immunofluorescence assays och ELISA-test Sterilisera genom filtrering med 0,2 µm filter 0,1% kristallviolett lösning 1 g kristallviolett i 400 ml metanol. Lägga till 600 ml ddH2O Butiken på RT Denna lösning används för att åtgärda och fläcken MDCK celler i viral neutralisering analyser Tosylsulfonyl phenylalanyl klormetyl keton (TPCK)-behandlade trypsin Förbereda en 1000 x stamlösning 1 mg/ml i ddH2O Förvaras vid-20 ° C Den TPCK-trypsin läggs i IAV infektioner Gör 100 µl portioner RIPA bufferten 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1% Triton x-100, 0,1% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS, 140 mM NaCl Förvaras vid 4 ° C Denna lösning används för att göra cell extrakt

Tabell 1: vävnadsodling Media och lösningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musmodell av IAV är allmänt används för in-vivo studier av IAV patogenes, immunogenicitet och skydd effekt. Små möss gör dem lätta att manipulera och lagra jämfört med andra djurmodeller som illrar eller marsvin. Dessutom av användarvänligheten när det gäller djur som kostnad, bostäder och reproduktion tillåta deras användning i prekliniska vaccination tester där stort antal djur behövs. Särskilt, eftersom möss har använts i flera forsknings discipliner, flera molekylära och immunologi murina reagenser finns tillgängliga för att underlätta deras användning för IAV studier. Dessutom minimal värd variabiliteten och förekomsten av ett immunförsvar som är evolutionärt liknar den som finns i människor göra dem en robust liten djurmodell för IAV studier. Slutligen, studien av värd-virala proteininteraktioner och deras bidrag till viral patogenes är för närvarande genomförbara av tillgång till KO möss. Bredvid flera fördelarna med att använda möss för IAV studier, är de dock inte användbar för IAV överföring studier. Illrar eller marsvin är därför lämpligare djurmodeller studera IAV överföring. Kliniska symtom hos möss som infekterats med IAV vanligtvis visas 2-3 dagar efter infektion, men detta kan variera beroende på mus ålder, immunstatus, kön, genetiska bakgrunden och stam; samt viral stam och dos används. Symtomen är anorexi, letargi, trängas, ruggig päls, förlust av kropp vikt och död16,17.

I detta manuskript beskriver vi hur man utvärderar viral patogenes i möss som infekterats i.n. med IAV genom att övervaka viktminskning (morbiditet), procentandel av överlevnad (dödlighet) och genom att bedöma virusreplikation i övre (nässlemhinnan) och lägre (lungor) luftvägarna (figur 1 och figur 2). Patogenesen av IAV är en mycket viktig parameter inte bara i samband med nya IAV stammar utan också i säkra genomförandet av LAIV vaccinkandidater (figur 3). Säsongsbetonade IAVs och IAVs som infekterar andra däggdjur (som hästar, hundar eller svin) producerar vanligtvis inte tecken på sjukdom i möss11,27. I detta fall är analysen av viral titrar i lungorna eller nässlemhinnan infekterade möss den viktigaste parametern att utvärdera viral patogenes av IAV stammar. När lungorna och nässlemhinnan samlas, de är homogeniserad och mängden virus i dessa organ kan analyseras med plack assay, immunofluorescens assay, vävnadsodling infektiös dos 50 (TCID50) eller en annan validerad metod8 ,29. Vi rekommenderar att utvärdera viral titrar med indirekt immunofluorescens eftersom plack analysen kräver en högre mängd MDCK celler (6-well platta format) och, liksom TCID50, krävs mer tid (3-4 dagar) för att beräkna viral titrar. För att utföra indirekt immunofluorescens analysen, är det dock nödvändigt att ha: 1) primära specifika antikroppar mot en IAV protein (det är rekommenderat att använda en antikropp mot de IAV nucleoprotein, NP, eftersom det är den vanligast förekommande virala protein som produceras under virusinfektion); (2) sekundära antikroppar konjugerat till en fluorophore; och 3) fluorescens Mikroskop räkna fluorescerande positiva infekterade celler.

Eftersom immunsystemet hos möss är evolutionärt liknar immunsystemet hos människor16 och eftersom möss kan framkalla en stark och skyddande humorala svar mot IAV infektion, kan immunogeniciteten hos IAVs (eller vaccinkandidater) lätt utvärderas genom att bestämma totalt (ELISA; Figur 4) och neutralisering (HAI, figur 5) eller VNA (figur 6) antikroppssvar. För att analysera de humorala svar efter immunisering, kan möss avblödas genom olika godkända metoder såsom retro-orbital punktering, svans klipp, ytlig ven punktering eller submandibular punktering. Vi valde den submandibular punktering teknik26 eftersom förfarandet kräver inte användning av anestesi och ger oss möjlighet att erhålla en acceptabel volym blod för immunologiska studier; i motsats till retro-orbital punkteringen är där möss bör vara sövd, och med svans klippet eller ytlig ven punktering, där blodvolymen återhämtade sig vanligtvis låg.

I detta manuskript beskrev vi hur man kan utvärdera förekomst av antikroppar mot totala virala proteiner av ELISA använder virusinfekterade cellen extrakt. Eftersom IAV infektion inducerar en skyddande immunitet som medieras, huvudsakligen av antikroppar mot viral HA (antigena viral huvudmålet), rekommenderas det starkt att bedöma mängden specifika antikroppar induceras mot HA av ELISA med rekombinant renat HA proteiner10. För att analysera förekomsten av neutraliserande antikroppar, både HAI och VNA metoder accepteras men båda har fördelar och nackdelar. HAI är snabb (2-3 h) och godkänts av centrera för sjukdom och Control (CDC) att utvärdera förekomsten av IAV neutraliserande antikroppar30. VNA är mer tidskrävande (3-4 dagar) men är mer specifikt eftersom det utvärderar endast antikroppar som kan neutralisera virusinfektion. Noterbart har i VNA visat att upptäcka stjälk-reaktivt HA neutraliserande antikroppar31, samt NA neutraliserande antikroppar32. En annan fördel med VNA är analysens känslighet, sedan mindre IAV (200 FFU) behövs jämfört med HAU analysen som kräver cirka ~ 104-105 FFU. Dessutom kan HAI analysen vara problematiskt för att detektera neutraliserande antikroppar mot aviär IAVs på grund av svårigheter med att tolka resultaten33,34,35. VNA kräver dessutom inte användningen av röda blodkroppar för identifiering av influensa neutraliserande antikroppar.

Slutligen beskriver vi de experimentella rutiner för att utvärdera de tre viktigaste aspekter som måste beaktas i utvecklingen av nya IAV vacciner (figur 3): 1) säkerhet: vaccinet måste vara säker och inte producera sjukdom; (2) immunogenicitet: vaccinet måste vara immunogent och framkalla både humorala och cellulära skyddande svar; (3) skydd effekt: vaccinet måste inducera skydd mot utmaningen med WT homologa och heterologa virus. Musmodell är ett bra val för den första screening av en ny IAV vaccin i vivo eftersom det kan utvärdera olika vaccinationssystem som och villkor, inklusive användning av olika tillsatsmedel, antigen-och vaccinbanker dos, administration och omfattande skydd mot utmaningen med homologa eller heterologt IAVs stammar16,17. Men innan du fortsätter till kliniska prövningar, bör vaccinkandidater minst testas i en modell för andra in-vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Forskning om influensavirus i LM-S laboratorium finansieras delvis av The New York influensa Center of Excellence (NYICE), medlem av NIAID Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning (CEIRS). Vi tackar Wendy Bates för hennes stöd i rättelserna av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4 °C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 °C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4 °C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4 °C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4 °C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20 °C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100 mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Girard, M. P., Cherian, T., Pervikov, Y., Kieny, M. P. A review of vaccine research and development: human acute respiratory infections. Vaccine. 23, (50), 5708-5724 (2005).
  2. Arnold, S., Monto, M. D. Epidemiology and Virology of Influenza Illness. Am J Manag Care. 6, Suppl 5. 255-264 (2000).
  3. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. 5th ed, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  4. Li, K. S., et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 430, (6996), 209-213 (2004).
  5. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. Int J Mol Sci. 18, (20), (2017).
  6. Kunisaki, K. M., Janoff, E. N. Influenza in immunosuppressed populations: a review of infection frequency, morbidity, mortality, and vaccine responses. Lancet Infect Dis. 9, (8), 493-504 (2009).
  7. Belshe, R. B. Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med. 356, (7), 685-696 (2007).
  8. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. J Virol. 89, (6), 3421-3426 (2015).
  9. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. J Virol. 88, (18), 10525-10540 (2014).
  10. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. J Virol. 90, (14), 6291-6302 (2016).
  11. Nogales, A., Huang, K., Chauché, C., DeDiego, M. L., Murcia, P. R., Parrish, C. R., Martínez-Sobrido, L. Canine influenza viruses with modified NS1 proteins for the development of live-attenuated vaccines. Virology. 500, (2017), 1-10 (2016).
  12. Garcia-Sastre, A., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 252, (2), 324-330 (1998).
  13. Lowen, A. C. Blocking interhost transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model. J Virol. 83, (7), 2803-2818 (2009).
  14. Mubareka, S. Transmission of influenza virus via aerosols and fomites in the guinea pig model. J Infect Dis. 199, (6), 858-865 (2009).
  15. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476C, 206-216 (2014).
  16. Margine, I., Krammer, F. Animal Models for Influenza Viruses: Implications for Universal Vaccine Development. Pathogens. 3, (4), 845-874 (2014).
  17. Bouvier, N., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2, (8), 1530-1563 (2010).
  18. Pica, N., Iyer, A., Ramos, I., Bouvier, N. M., Fernandez-Sesma, A., García-Sastre, A., Lowen, A. C., Palese, P., Steel, J. The DBA.2 mouse is susceptible to disease following infection with a broad, but limited, range of influenza A and B viruses. J Virol. 85, (23), 12825-12829 (2011).
  19. Watanabe, H., Numata, K., Ito, T., Takagi, K., Matsukawa, A. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains. Shock. 22, (5), 460-466 (2004).
  20. Srivastava, B., Blazejewska, P., Hessmann, M., Bruder, D., Geffers, R., Mauel, S., Gruber, A. D., Schughart, K. Host genetic background strongly influences the response to influenza a virus infections. PLoS One. 4, (3), e4857 (2009).
  21. Lowen, A. C., Bouvier, N. M., Steel, J. Transmission in the Guinea Pig Model. Curr Top Microbiol Immunol. 385, 157-183 (2014).
  22. Schickli, J. H. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, (1416), 1965-1973 (2001).
  23. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. (42), (2010).
  24. National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed, National Academies Press (U.S.). (2011).
  25. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (3), 493-497 (1938).
  26. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, (9), 39-43 (2005).
  27. Nogales, A. A temperature sensitive live-attenuated canine influenza virus H3N8 vaccine. J Virol. (2016).
  28. Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9, (11), 2663-2681 (2014).
  29. Guo, H., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L., Topham, D. J. Induction of CD8 T cell heterologous protection by a single dose of single-cycle infectious influenza virus. J Virol. 88, 12006-12016 (2014).
  30. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. Antigenic Characterization. Available from: http://www.cdc.gov/flu/professionals/laboratory/antigenic.htm (2017).
  31. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. (2015).
  32. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98). J Virol. 76, (23), 12274-12280 (2002).
  33. Beare, A. S., Webster, R. G. Replication of avian influenza viruses in humans. Arch Virol. 119, 37-42 (1991).
  34. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol. 37, (4), 937-943 (1999).
  35. Stephenson, I., Wood, J. M., Nicholson, K. G., Zambon, M. C. Sialic acid receptor specificity on erythrocytes affects detection of antibody to avian influenza haemagglutinin. J Med Virol. 70, (3), 391-398 (2003).
Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).More

Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter