Summary
Mosaik klonanalyse i Drosophila imaginal disc epithelia er et kraftfuldt model system til at studere tumoregenesens genetiske og cellulære mekanismer. Her beskriver vi en protokol til at fremkalde tumorer i Drosophila- vinge-imaginale diske ved hjælp af GAL4-UAS-systemet og indføre en diagnosemetode til klassificering af tumorfænotyperne.
Abstract
I de tidlige stadier af kræft viser transformerede mutante celler cytologiske abnormiteter, begynder ukontrolleret overvækst og gradvist forstyrrer vævsorganisation. Drosophila melanogaster er opstået som et populært eksperimentelt modelsystem i kræftbiologi for at studere tumoregenesens genetiske og cellulære mekanismer. Især aktiverer genetiske værktøjer til Drosophila imaginale diske (udviklende epithelier i larver) skabelsen af transformerede pro-tumorceller inden for et normalt epithelvæv, en situation svarende til de indledende stadier af menneskelig cancer. En nylig undersøgelse af tumorigenese i Drosophila- vinge-imaginale diske viste imidlertid, at tumorinitiering afhænger af den vævsintrinsiske cytoarkitektur og det lokale mikromiljø, hvilket tyder på, at det er vigtigt at overveje den regionspecifikke modtagelighed for tumorigeniske stimuli ved evaluering af tumorfænotyper i imaginal diske. At lette fænotypisk analyse af tumorprogressiPå imaginal diske, her beskriver vi en protokol for genetiske eksperimenter ved hjælp af GAL4-UAS-systemet til at fremkalde neoplastiske tumorer i vinge-imaginale diske. Vi introducerer yderligere en diagnosemetode til klassificering af fænotyper af klonale læsioner induceret i imaginal epithelia, da en klar klassificeringsmetode til at diskriminere forskellige stadier af tumorprogression (såsom hyperplasi, dysplasi eller neoplasi) ikke tidligere var beskrevet. Disse metoder kan være bredt anvendelige til klonanalysen af tumorfænotyper i forskellige organer i Drosophila .
Introduction
Epitelvæv er højt organiserede systemer, der har den bemærkelsesværdige homeostatiske evne til at opretholde deres organisation gennem udvikling og celleomsætning. Dette robuste selvorganiserende system forstyrres imidlertid progressivt under tumorudvikling. Ved begyndelsen af tumorudvikling fremkommer individuelle mutantceller, der opstår ved onkogenaktivering eller tumor-suppressor gen inaktivering inden for et epithelialag. Når denne transformerede "pro-tumorcelle" undgår et undertrykkende miljø, forstyrrer epitelorganisationen og begynder ukontrolleret proliferation, forekommer tumorigenese 1 . I løbet af de sidste par årtier har udestående teknologiske fremskridt inden for genetik og molekylærbiologi gjort bemærkelsesværdige fremskridt med kræftforskning. Specielt har nyere undersøgelser, der anvender de genetisk mosaiske analyseværktøjer i Drosophila melanogaster , såsom FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target) mitotisk recombinAtion 2 og flip-out-GAL4-UAS (opstrøms aktiverende sekvens) systemer 3 har i høj grad bidraget til bedre forståelse af de genetiske mekanismer involveret i dannelsen og metastasen af tumorer 4 , 5 , 6 .
Undersøgelser af en gruppe af konserverede Drosophila- tumor-suppressor-gener, dødbringende larver ( lgl ), diske store ( dlg ) og scribble ( scrib ) fremhævede det kritiske forhold mellem tab af epithelial organisation og tumorudvikling, da disse gener spiller nøgleroller I regulering af apisk-basalcellepolaritet og celleproliferation i epitelvæv 7 . Mens Drosophila imaginale diske normalt er monolagede epithelia, forårsager homozygote mutationer i et hvilket som helst af disse tre gener celler at tabe struktur og polaritet, undlader at diffeLeje, overproliferere og til sidst danne flerlags amorfe masser, der smelter sammen med tilstødende væv 7 . Tilsvarende er forstyrrelse af disse gener i pattedyr involveret i udviklingen af ondartede tumorer 8 , 9 . De neoplastiske fænotyper udstillet af de mutante væv har ført til klassificeringen af disse tre gener som konserverede neoplastiske tumor-suppressor gener (nTSG'er) 7 , 8 . Når homozygote nTSG-mutante celler imidlertid sporadisk genereres i udvikling af vildtype-imaginale diske ved anvendelse af FLP-FRT-medieret mitotisk rekombination, fjernes mutantceller fra vævet gennem c-Jun N-terminale kinase (JNK) -afhængig apoptose 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , ekstrudering 15 , 16 eller engulfment og fagocytose af naboer 17 . I denne genetisk mosaiske epithelia registreres apoptose for det meste i nTSG-mutante celler, der er placeret ved klongrænsen, hvilket tyder på, at tilstødende normale celler udløser apoptosen af nTSG-mutante celler 10 , 11 , 12 , 18 . Nylige undersøgelser i mammale celler har bekræftet, at denne cellekonkurrenceafhængige eliminering af pro-tumorceller er et evolutionært bevaret epithelial selvforsvarsmekanisme mod cancer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
En nylig undersøgelse i Drosophila- imaginale diske viste imidlertid, at mosaik-nTSG-knockdown-kloner inducerer neoplastiske tumorer i specifikkeIc regioner af vinge imaginal diske 16 . Indledende tumordannelse blev altid fundet i det perifere "hængsel" -område og observeret aldrig i den centrale "pose" -region i vingeskiveepitelet, hvilket tyder på, at det tumorgenetiske potentiale af nTSG-knockdown-celler afhænger af det lokale miljø. Den centrale pose region fungerer som en "tumor coldspot", hvor pro-tumor celler ikke viser dysplastisk overvækst, mens den perifere hængsel region opfører sig som en "tumor hotspot" 16 . I "coldspot" -poseregioner delaminerer nTSG-knockdown-celler fra basalsiden og gennemgår apoptose. I modsætning hertil, som "hotspot" hængselsceller har et netværk af robuste cytoskeletale strukturer på deres basale sider, delaminerer nTSG-knockdown-celler fra epitelens apikale side og initierer tumorigenisk overgrowth 16 . Derfor kræver analyse af tumorfænotyper i imaginal diske nøje konsistensDeration af den regionspecifikke modtagelighed for tumorigeniske stimuli.
Her beskriver vi en protokol til at inducere dannelse af neoplastisk tumor i Drosophila- fløjens imaginale diske, der anvender GAL4-UAS- RNAi- systemet, hvorved nTSG-knockdown-celler genereres i normal wing disc epithelia. Selv om disse eksperimentelle systemer er nyttige til at studere de tidlige stadier af kræft, er en klar klassificeringsmetode til evaluering af stadierne af tumorprogression i imaginal disc epithelia ikke blevet tydeligt beskrevet tidligere. Derfor foreslår vi også en diagnosemetode til klassificering af pro-tumor-klonale fænotyper induceret i vingeskiveepithelia i tre kategorier: hyperplasi (akkumulering af et for stort antal normale fremtrædende celler med forøget proliferation), dysplasi (præalignant væv sammensat af abnormt forekommende Celler) og neoplasi (godartet eller ondartet tumor sammensat af celler med et unormalt udseende og unormalt proliferationsmønster).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flykryds og kloninduktion
- Fjern alle fluer i hætteglasset 12 timer inden samling af jomfru fluer.
- Bedøve fluerne i hætteglasset ved at injicere CO 2 -gas og placere fluer på en CO 2 flyveplade.
- Overfør 10 - 20 jomfruhvaler og 10 hanner fra CO 2 flyvepuden i et frisk hætteglas og inkuber i 1 dag ved 25 ° C.
- Overfør disse fluer i et frisk hætteglas og inkuber i 12 timer ved 25 ° C.
BEMÆRK: Kassér det første hætteglas, da ufrugtede kvinder ikke lægger nok æg i den første dag. - For enhancer-GAL4-linjer fjerner du de voksne fluer og inkuberer hætteglasset ved 25 ° C indtil dissektion.
- Til induktion af mosaikkloner ved flip-out-GAL4 fjernes de voksne fluer og inkuber hætteglasset i 2 - 4 dage ved 25 ° C. Inkubationstiden før varmestød er afhængig af forsøgsformålet. Et varmechok 2 dage efter ægaflejring (AED) genererer mosaik kloner i umoden sekundInstar imaginal epithelia. Et varmechok efter 3 eller 4 dage AED genererer mosaik kloner i differentieret tidlig til midten af tredje instar imaginal epithelia.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undersøge virkningen af ændret varmechok-timing på tumorigeniske fænotyper. - Til induktion af mosaikkloner ved udflip-GAL4, opvarmes hætteglasset ved nedsænkning i et 37 ° C vandbad i 10 - 45 minutter efterfulgt af inkubering i 2 - 3 dage ved 25 ° C.
BEMÆRK: Oplysninger om varmechok tid, timing og inkubationstid i hvert eksperiment er vist i figurlegenden.
2. Dissektion af Larver
- Saml vandrende tredje instarlarver med en træpind eller blunt tang, genotype dem med passende fluorescerende markører ( f.eks . EGFP) under et fluorescens stereoskopisk mikroskop og læg dem i en dissektionsskål med PBS (fosfatbuffet saltvand).
- Vask larverne i PBS ved pipettering med 2 ml plastoverførselspipetter.
- Pinch midten af larven med en tang og riv kroppen i halvdelen med de andre tang.
- Klip mundkrogen på den forreste halvdel med en tang og skub munden mod kroppen med de andre tang for at dreje kroppen indad ud.
- Fjern unødvendige materialer som spytkirtler eller fedtlegemer med pincet.
3. Fastgørelse og antistoffestikning
- Overfør den dissekerede forreste halvdel af larvallegemet (inklusive imaginale vingeskiver) til et 1,5 ml plastrør og fiks i 1 ml Fix-opløsning (4% Formaldehyd i PBS) i 10 minutter ved stuetemperatur i mørket med forsigtig rotation.
FORSIGTIG: Formaldehyd er giftigt og har kræftfremkaldende potentiale. Brug beskyttelseshandsker og tøj til at forhindre hudkontakt.
BEMÆRK: I denne del finder alle trin sted på en nutator ved stuetemperatur i mørket, medmindre andet er angivet. - Fjern Fix-løsningen og kassér. Vask vævene med 1 ml PBT (0,3% TritPå X-100 i PBS) tre gange i 15 minutter hver.
- Fjern PBT og tilsæt 1 ml PBTG (0,2% bovint serumalbumin og 5% normalt gede serum i PBT) til blokering og nutat 1 h ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Fjern PBTG og tilsæt primær antistofopløsning passende fortyndet med PBTG (se Materialetabel ) og nutat natten over ved 4 ° C.
- Fjern den primære antistofopløsning og vask vævene med 1 ml PBT tre gange i 15 minutter hver.
- Fjern PBT og tilsæt sekundær antistofopløsning hensigtsmæssigt fortyndet med PBTG (1: 400). Nød i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Fjern sekundær antistofopløsning og vask vævene med 1 ml PBT to gange i 15 minutter hver.
- For at plette F-actin fjernes PBT og tilsættes Phalloidin-opløsning hensigtsmæssigt fortyndet i PBS (1:40). Derefter nutate i 20 min. Fjern Phalloidin-opløsningen og vask vævene med 1 ml PBT to gange i 15 minutter hver.
- For at modvirke nukleært DNA fjern PBT og tilsæt DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) opløsning (0,5 μg / ml DAPI i PBS). Derefter nutate 10 min.
FORSIGTIG: DAPI har kræftfremkaldende potentiale. Brug beskyttelseshandsker og tøj til at forhindre hudkontakt. - Fjern DAPI-opløsning og vask vævene med 1 ml PBT to gange i 15 minutter hver.
- Skyl en gang i 1 ml PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern PBS og tilsæt 500 μL 100% glycerol som formonteringsmedium.
4. Montering på microscope dias
- Placer de farvede væv på et mikroskopglas ved hjælp af en 2 ml plast overførselspipette.
- Overfør vævene til dråber monteringsmedium på et andet mikroskopglas med tang.
- Hold slutningen af dissekeret væv fast med en tang og træk hjerne- og øjenantennediskene ud med de andre tang.
BEMÆRK: Hold de dissekerede hjerner til at placere dem i nærheden af vinge-imaginale diske. Hjernen fungerer som en platform, der forhindrer dækslipet i at knuse vingens imaginale diske. - For at isolere vingens imaginale plader holder du enden af dissekeret væv sammen med en pincet og forsigtigt ridder kropsvæggen og rives af pladerne med de andre pincetter.
BEMÆRK: Hvis det er svært at finde vinge-imaginale diske, skal du fjerne luftrøret fra den bageste til den forreste side. Wing-imaginale diske holder sig til luftrøret. - Cover forsigtigt de imaginale skiver med et dæksel og forsegle med neglelak; Opbevares ved 4 ° C.
5. Konfokal mikroskopi
- At erhverve konfokale billeder ved hjælp af et konfokalt mikroskop indstillede billedoptagelsesparametre, herunder rækkevidde af emissionsbølgelængde, laserintensitet, forstærkning, forskydning, scanningshastighed og billedstørrelse 24 .
BEMÆRK: Se den instruktionsvejledning, der leveres af hver mikroskopfabrikant, for detaljerede procedurer for indspilning af billeder. - At fange single coNfokale dele af en hel vinge-imaginaldisk, brug en 20X objektivlins.
- Erhverv 3-dimensionelle billeder ved z-stack scanning i trinstørrelse på 0,5 - 1,0 μm ved hjælp af 40X eller 60X objektiver.
BEMÆRK: For at analysere cellulære fænotyper i høj opløsning skal en billedstørrelse være større end 512 x 512 pixels.
6. Billedanalyse ved hjælp af ImageJ
- Brug Fiji, en open source ImageJ-software fokuseret på biologisk billedanalyse (https://fiji.sc/) 25 , til at erhverve og analysere confocal z-stack-billeder.
- For at erhverve lodrette sektioner skal du åbne z-stack-billederne i ImageJ og vælge menupunktet "Image / Stacks / Reslice."
BEMÆRK: Enten XZ akse eller YZ akse kan vælges i menuen Reslice. Lodret sektion kan også opnås i vilkårlig retning ved at tegne en retlinie eller et rektangel på z-stack-billedet.
7. Diagnose af neoplastiske fenotyper
- Åbn lodretSektioner (XZ eller YZ akse) opnået fra et sæt af z-stack billeder og analysere morfologiske fænotyper og antistoffarvning.
- Til diagnose af tumorfænotyper, fokuserer de primært på følgende tre punkter: (1) Hvis en cellemasse, herunder knockdown-kloner, afviger fra hovedepitellaget, (2) hvis den subcellulære lokalisering af forbindelsesproteiner ændres i denne cellemasse , Og (3) hvis diameteren af denne cellemasse er større end 4 celler.
- Kategoriser tumorfænotyper i overensstemmelse med flowchartet beskrevet i Figur 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere neoplastisk tumordannelse induceret eksperimentelt med RNAi- medieret nTSG-knockdown i Drosophila- vinge-imaginale diske, blev tre forskellige GAL4-drivere brugt til at udtrykke UAS-RNAi for lgl eller scrib : (1) sd-GAL4, som driver stærkt UAS-udtryk i Vingepose og mildt udtryk i hængselregionerne ( figur 2 og figur 3A ); (2) upd-GAL4, som kører i hængselets underdomeiner, herunder stærk ekspression i to dråber i den dorsale mediale fold, mild ekspression i et anterior-lateralt domæne og svag ekspression i det ventrale posterior-domæne ( figur 2 og figur 3C ); Og (3) varmchok-induceret flip-out GAL4, som genererer tilfældige mosaikkloner, der udtrykker UAS-gener ( figur 4 og FiGure 5). I alle forsøgene blev UAS-EGFP co-udtrykt med UAS-RNAi for at markere knockdown-klonerne.
For det første blev sd-GAL4- drevet lgl-RNAi anvendt til at inducere knockdown af lgl i vingeposen og hængselregionerne. I kontrol tredje instar-vingeskiver uden UAS-lgl-RNAi forekom der ingen morfologisk ændring ( figur 3A ). I modsætning hertil blev i tredje instar-vingeskiver, der udtrykker lgl-RNAi , epithel-deformationer og tumorigeniske overgroeder observeret klart i visse dele af hængslet ( figur 3B ). I vingeposeområdet blev der imidlertid ikke observeret dysplastisk overvækst. Stærk MMP1 (matrixmetalloprotease-1) -ekspression blev observeret i de tumorhårige læsioner, men ikke i vingepungregionen ( figur 3B ). Da MMP1-ekspression er involveret i nedbrydning af kælder membranDet er muligt, at disse hængselsvulster har en metastatisk evne ( figur 3B ). Derefter blev upd-GAL4 brugt til at inducere lgl knockdown i hængselområdet. I kontrol tredje instar-vingeskiver uden UAS-lgl-RNAi forekom der ingen morfologiske ændringer ( figur 3C ). Efter 5 dages AED viste tredje instar-vingeskiver med upd-GAL4 og lgl-RNAi fremtrædende epithelial disorganisering med F-actin akkumulering og klonforskydning fra epithelialaget ( Figur 3D ). Ved 6 dages AED overgik neoplastiske tumorer, der udtrykker MMP1, i hængselområdet ( Figur 3G ), omend med variation i tumorstørrelse mellem prøver ( Figur 3E og F ). Et lodret snit af hængselregionen bekræftede, at den neoplastiske tumor gennemgik afvigende udvækst på den apikale side af epitellaget ( For at overvåge progressionen af tumorvækst induceret ved lgl knockdown, blev sporadiske kloner, der udtrykker lgl-RNAi , genereret i vingeskiver under anvendelse af det varmechok-inducerede flip-out GAL4 mosaiksystem. To dage efter varmechok til andre instarlarver (2 dage AED) viste nogle lgl- knockdown kloner placeret i hængselområdet en afvigelse væk fra den apikale side af epitellaget ( figur 4A ). Fire dage efter varmechok-induktion blev dysplastiske læsioner i hængselområdet klar, hvilket tyder på, at lgl- knockdown-kloner forskudt væk fra den apikale side prolifererer i lumenet ( figur 4B ). Syv dage efter induktion af varmechok dominerede tumorigeniske overgroeder hængselsregionerne ( figur 4C ). At demonstrereKlassificering af klonale fænotyper med vores diagnosemetode blev sporadiske kloner, der udtrykker scrib-RNAi , genereret i vingeskiver ved hjælp af det varmechok-inducerede flip-out GAL4 mosaiksystem. Fem dage efter varmechok til andre instarlarver (2 dage AED) viste visse GFP-udtrykkende scrib- knockdown kloner tumorigeniske fænotyper ( Figur 5A ). Vi analyserede fire kloner (B, C, D og E i Figur 5A ) i vertikale sektioner af z-stack-konfokale billeder ved hjælp af ImageJ, fordi det er vanskeligt at erhverve de detaljerede cytologiske og strukturelle fænotyper i 2D-konfokale billeder ( figur 4 og figur 5A ). Kloner B og C blev klassificeret som dysplasi som septat-junction protein-diske store (Dlg) blev mislokaliseret ( Figur 5B og C ). I klon B var størrelsen af cellemassen forskudt fra epitelet ikke større end 4 celler i diameterR ( figur 5B ), mens klon C ikke afviger fra epithelet ( figur 5C ); Derfor blev kloner B og C ikke anset for neoplastiske. Kloner D og E, som også viste mislokalisering af Dlg, dannede imidlertid tumorøse cellemasser uden for epitelet ( Figur 5D Og 5E ). Da størrelsen af disse fordrevne tumorkloner var mere end 4 celler i diameter, blev klonerne klassificeret som neoplastiske. For at fremkalde hyperplastiske tumorer eller cysteformationer i vingens imaginale diske blev sporadiske kloner, der udtrykker onkogen Ras ( Ras V12 ) eller konstitutivt aktiv form for Yorkie, en transskriptionel coaktivator af Hippo-banen ( Yki 3SA ) genereret under anvendelse af den varmechok-inducerede Flip-out GAL4 mosaik system. Fire dage efter varmetræk til anden instar larver (2 dage AED), RaS V12- ekspressionskloner mærket af GFP blev runde cellemasser i imaginalskiverne ( figur 6A ). Et vertikalt afsnit af Ras V12- ekspressionsklonen (klon B i figur 6A ) afslørede, at cellemassen dissocieret fra epithelialaget har korrekt lokalisering af Dlg, hvilket antyder, at cellemassen opretholder normale epitelstrukturer uden for epithelaget ( figur 6B ) . MMP1-ekspression blev ikke observeret i disse Ras V12- ekspressionskloner ( Figur 6C ). Derfor blev klonen B klassificeret som cystdannelse. Fire dage efter varmechok til andre instarlarver (2 dage AED) dannede Yki 3SA- ekspressionskloner mærket af GFP store cellemasser i imaginalskiverne ( figur 7A ). Vi fokuserede på to kloner (B og C i Figur 7A ). Klon B visteIntegration i epithelialaget og korrekt lokalisering af Dlg i epithelcellernes subepikale membraner, hvilket tyder på, at den Yki 3SA- ekspressende klon B opretholdt epitelstrukturen . Derfor blev klon B klassificeret som hyperplasi ( figur 7B ). Klon C placeret i hængselområdet viste mislokalisering af Dlg og dannet flerskiktsstruktur ved den basale side af epitellaget. MMP1-ekspression blev ikke observeret i Yki 3SA- ekspressionsklonerne. Tilsammen blev klon C klassificeret som godartet neoplasma ( Figur 7C og D ). 5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Figur 1: Flowchart for klassificering af tumorfenotyper. Dette rutediagram repræsenterer en diagnosemetode til klassificering af klonale læsioner i imaginal epithelia. Den klassiskeAtion er baseret på fem kriterier: (1) afvigelse af kloner fra epitellaget, (2) subcellulær mislokalisering af forbindelsesproteiner, (3) cellulær proliferation, (4) klonstørrelse og (5) MMP1-ekspression. Klik her for at se en større version af denne figur. 
Figur 2: ( A ) Vildtvinkens imaginale disk farvet for Dgg (grøn) og kerner (DAPI, magenta). ( B ) Skematisk gengivelse af Drosophila-fløjens imaginale skiver, der viser vingepung (blå), hængsel (orange) og notum (grønne) områder. ( C ) Normal wing imaginal disc farvet for F-actin (rød) og mikrotubuli (grøn). Kælder membraner er mærket med Collagen IV / Vkg-GFP (blå). ( D ) Lodret del af stedetMarkeret med hvid prikket linje i ( C ). ( E ) Line tegninger sporer de apikale (røde) og basale (blå) sider af epitellaget i ( D ). Stiplede linjer sporer den peripodiale membran. Distale (Df), mediale (Mf) og proksimale (Pf) folder af dorsal hængsel er angivet.
Detaljerede genotyper: A, w - CD, Vkg-GFP Klik venligst her for at se en større version af denne figur. 
Figur 3: Site-specifik Tumorigenese induceret af Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Konfokale billeder viser vinge-imaginale diske dissekeret fra tredje instarlarver af angivne genotyper farvet til MMP1 (rød). Sd -GAL4 -expreSøsioner blev mærket ved GFP-ekspression (grøn). ( CG ) Konfokale billeder viser vinge-imaginale diske dissekeret fra tredje instarlarver af angivne genotyper ved det angivne tidspunkt AED. F-actin blev farvet med Phalloidin (rødt) i ( CF ). MMP1-ekspression er farvet med anti-MMP1-antistoffer (rød) i ( G ). De opdaterings-GAL4- ekspressionsregioner blev mærket af GFP-ekspression (grøn). Bundpaneler af ( CF ) viser forstørrede visninger af regioner angivet i øverste paneler. Hvide pile indikerer dysplastiske læsioner induceret af lgl- knockdown kloner. ( H ) Lodret sektion af stedet markeret med hvid prikket linje i bundpanelet på (E). Hvide punkterede linjer markerer grænserne mellem vingeposen og hængselregionerne i (A) og (B). Nuclei blev mærket med DAPI (blå). Skalestænger = 100 μm i (AG) og 50 μm i (H). Detaljerede genotyper: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w -, sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-LGL-RNAi; C, w - , opdater-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , opdater-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Venligst klik her for at se en større version af denne figur. 
Figur 4: Tumorfenotyper induceret af tilfældige mosaiske kloner. ( AC ) Konfokale billeder viser mosaikfløjens imaginale diske af tredje instarlarver med kloner, der udtrykker lgl-RNAi og GFP (grøn) på det angivne tidspunkt efter varmechok-induktion. Nuclei blev mærket af DAPI (blå). Mellempanelerne viser forstørrede visninger af de hvide firkantområder, der er markeret i venstre panel. Det rigtige panel S viser skematiske linjetegninger af den apikale side af epithelagene (blå) og de GFP-udtrykkende kloner (grøn). Mosaik kloner placeret i epitelet er afbildet i lysegrøn, mens neoplastiske tumorer, der afviger fra epitelet, er vist i magenta. Hvide punkterede linjer i venstre panel markerer grænserne mellem vingepung og hængselområder. Hvide pile i midterpanelerne indikerer dysplastiske læsioner induceret af lgl- knockdown kloner. Skalestænger = 100 μm. Detaljerede genotyper: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi ( varmeskokt 30 minutter ved 2 dage AED, inkuber 2 dage ved 25 ° C i A, inkuber 4 dage ved 25 ° C i B, inkuber 7 dage ved 25 ° C i C efter varmechok). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Diagnostisk undersøgelse af dysplastiske klonale fenotyper. ( A ) Det venstre panel viser en mosaikfløjs imaginale skive af tredje instarlarva med kloner, der udtrykker co-udtrykker scrib-RNAi og GFP (grøn) 5 dage efter varmechok induktion, farvet for Dlg (rød). Det højre panel viser en skematisk linjetegning af den apikale side af epithelagene (blå) og de GFP-udtrykkende kloner (grøn). Mosaik kloner i epitel lagene er vist i lysegrøn, mens neoplastiske tumorer fordrevet fra epitelet er vist i magenta. ( BE ) De konfokale billeder viser vertikale afsnit af scrib- knockdown klonerne angivet i højre panel af (A). De andre paneler fra venstre viser Dlg lokaliseringsmønstre (rød). De tredje paneler fra venstre viser skematiske linjetegninger af de apikale (røde) og basale (blå) sider af epithelagene og GFP-exprEssing scrib -knockdown kloner (grøn). Dysplastiske kloner i epithelagene er vist i lysegrøn (B og C), mens neoplastiske kloner forskudt fra epitelet er vist i magenta (D og E). Hvide pile angiver scrib- knockdown kloner, der viser tumorigenisk fænotype. Nuclei blev mærket med DAPI (blå). Målestang = 50 μm. Tumorfænotypen af hver klon blev klassificeret i overensstemmelse med flowdiagrammet vist i figur 1 . Detaljerede genotyper: AE, hsFLP; UAS-scrib-RNAi; Handle> CD2> GAL4, UAS-EGFP (varmechokt 30 min ved 2 dages AED, inkuber 4 dage ved 25 ˚C efter varmeskud). Klik her for at se en større version af denne figur. 
Figur 6: DiagnoserTic Undersøgelse af Ras V12- ekspression af klonale fenotyper. ( A ) Det venstre panel viser en mosaikfløjs imaginale skive af tredje instarlarve med kloner, der udtrykker onkogene Ras V12 og GFP (grøn) 4 dage efter varmchok induktion, farvet for Dlg (rød). Det højre panel viser en skematisk linjetegning af den apikale side af epithelagene (blå) og de GFP-udtrykkende kloner (grøn). Skalestang repræsenterer 50 μm. ( B ) Lodrette afsnit af Ras V12- udtrykkende kloner angivet i højre panel af (A). De andre paneler fra venstre viser Dlg lokaliseringsmønstre (rød). De tredje paneler fra venstre viser skematiske linjetegninger af de apikale (røde) og basale (blå) sider af epitheliale lag og Ras V12 og GFP udtrykkende kloner (grøn). Skalbjælke = 25 μm. ( C ) Mosaic wing imaginal disk af tredje instar larve med kloner co-udtrykker <Em> Ras V12 og GFP (grøn) 4 dage efter varmchok induktion, farvet til MMP1 (rød). Målestang = 100 μm. Detaljerede genotyper: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Handle> CD2> GAL4, UAS-EGFP (varmeskokt 45 min ved 2 dages AED, inkuber 4 dage ved 25 ° C efter varmeskud). Klik her for at se en større version af denne figur. 
Figur 7: Diagnostisk undersøgelse af Yki 3SA- ekspression af klonale fenotyper. ( A ) Det venstre panel viser en mosaikfløjs imaginale skive af tredje instarlarve med kloner, der udtrykker konstitutivt aktiv Yki 3SA og GFP (grøn) 4 dage efter varmchok induktion, farvet for Dlg (rød). Det højre panel viser som Kemisk linjetegning af den apikale side af epitellagene (blå) og de GFP-udtrykkende kloner (grøn). Målestang = 50 μm. ( BC ) Lodrette afsnit af Yki 3SA udtrykkende kloner angivet i højre panel af (A). De andre paneler fra venstre viser Dlg lokaliseringsmønstre (rød). De tredje paneler fra venstre viser skematiske linjetegninger af de apikale (røde) og basale (blå) sider af epitellagene og Yki og GFP-udtrykkende kloner (grøn). Skalbjælke = 25 μm. ( D ) Mosaic wing-imaginale skive af tredje instarlarve med kloner, der udtrykker Yki 3SA og GFP (grøn) 4 dage efter varmchok induktion, farvet til MMP1 (rød). Målestang = 100 μm. Detaljerede genotyper: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( varmeskokt 30 minutter ved 2 dage AED, inkuber 4 dage ved 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAL4-UAS-systemet er et af de mest kraftfulde genetiske værktøjer til målrettet genekspression i Drosophila 26 og letter i høj grad tumorcelleinduktion og -analyse in vivo 4 . Dette system muliggør dannelsen af kloner, der bærer knockdown af tumor-suppressorgener eller overekspression af onkogener inden for vildtype epithelvæv, en situation, der ligner meget de indledende stadier af humant cancer, hvor transformerede pro-tumorceller er omgivet af normale epithelceller. GAL4-driverlinier reguleret af enhancersekvenser såsom GAL4 enhancer-trap-linier eller Janelia GAL4-linjer 27 har unikke, spatiotemporalt begrænsede ekspressionspatrere. Derfor er disse enhancer-GAL4-linier nyttige til at inducere tumorer konsekvent i begrænsede områder af imaginale diske. Ud over sd-GAL4 og upd-GAL4 vist i dette studie bekræftede vi, at lgl- knockdown induceret bY andre enhancer-trap GAL4-linjer inklusiv indgraveret-GAL4 ( en-GAL4 ), hedgehog-GAL4 ( hh-GAL4 ), optomotor-blind-GAL4 ( omb-GAL4 ), patched-GAL4 ( ptc-GAL4 ) og spalt-major- GAL4 ( salm-GAL4 ) kan generere neoplastiske tumorer i hængselområderne af vinge-imaginale diske. Hvis forstærker-GAL4-ekspressionsmønsteret skal styres midlertidigt, er en kombination af GAL4 og en temperaturfølsom version af GAL80 (GAL80 ts ) en mulighed. GAL80 ts undertrykker GAL4-funktionen ved 18 ° C, men ikke ved 29 ° C, hvilket gør det muligt for UAS-transgener at tændes eller slukkes som nødvendigt 28 .
Det udfoldede GAL4-mosaiksystem, der kombinerer FLP-FRT-systemet og GAL4-UAS-systemet 3 , genererer tilfældige kloner i imaginale diske. Ved at kombinere varmchok-inducerbar flippase (hsFLP) med flip-out GAL4, er klongeneratets timingIon er kontrollerbar. Da det tumorgenetiske potentiale af imaginale diskceller kan være afhængige af udviklingsstadiet, endogene signalhændelser og / eller celledifferentiering 29 , 30 , er det meget vigtigt at undersøge virkningen af ændret varmetabs-timing på tumorigeniske fænotyper.
Det har tidligere vist sig, at nTSG-mutante kloner undergår cellekonkurrenceafhængig apoptose, når de er omgivet af vildtype-celler 10 , 11 , 12 , 18 , hvilket tyder på, at der kræves multiple mutationer til celletransformation under cancerudvikling. Faktisk transformerer overekspression af onkogen Ras eller Yki i lgl eller scrib mutant kloner dem til aggressive tumorer 10 , 18 , 31, mens misEkspression af Ras V12 eller Yki 3SA inducerer ikke ondartet neoplasma alene uden nTSG-mutationer. Som vist her og tidligere 16 gennemgår pro-tumor-nTSG-knockdown-kloner, der frembringes i vildtype-vingeskiver, også apoptose og viser ikke tumorigenese i vingeposen 16 . Samtidig udvikles nTSG-knockdown kloner i hængsel "hotspots" til neoplastiske tumorer uden yderligere onkogene mutationer. I hængselregioner kapsler nTSG-mangelfulde celler endogen Janus kinase / signal transducer og aktivator for transkription (JAK / STAT) signalering for at drive tumorigenese 16 . Derfor er hængselspecifikke GAL4'er, såsom opdater -GAL4 , nyttige værktøjer til konsekvent inducerende neoplastisk tumordannelse ved RNAi- medieret knockdown af tumorundertrykkelsesgener. Selvom flip-out-GAL4-inducerede nTSG-knockdown-mosaikkloner også inducerer neoplastiske tumorer i hængselsreaktionGioner, tumorigenese forekomsten er afhængig af den oprindelige klonstørrelse: store kloner frembragt ved et varmekok over 20 minutter fremkalder sædvanligvis tumorigenese, hvorimod de fleste små kloner, der genereres af varmetok under 10 minutter, elimineres fuldstændigt (KM og YT, upublicerede data).
En række nylige undersøgelser af tumorudvikling og kræftprogression bruger Drosophila imaginal disks som et modelsystem 32 , 33 . Fælles for disse undersøgelser er adskillige markører af neoplastiske tumorer: afvigende cellemasser, deformerede skiveformer, akkumulering af F-actin, forbedret cellecykling (BrdU / EdU-inkorporering eller PH3-ekspression), aktivering af JNK-signalering og dets nedstrøms mål MMP1, basalmembran Afbrydelse og / eller epithelial disorganisering, herunder tab eller subcellulær delokalisering af proteiner involveret i apical-basalcellepolaritet (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 eller PAR-6), septatforbindelser(Lgl, Scrib, Dlg eller Coracle) eller adherens krydsninger (E-Cadherin eller Armadillo). Disse fænotyper kan let påvises ved konventionel antistoffarvning. Selv om det er vanskeligt at afgøre, om en klonal fænotype er hyperplasi, dysplasi, godartet neoplasma eller ondartet neoplasma i det tidlige stadium af tumorigenese, bør det være enklere i Drosophila imaginal disc epithelia sammensat af et enkelt epitel-monolag. I denne undersøgelse introducerede vi en diagnosemetode til klassificering af tumorklonfænotyper induceret i epithelialmonolaget ( Figur 1 ). Denne metode kræver omhyggelige observationer af fem kriterier ved hjælp af z-stack konfokale billeder; Hvert diagnostisk kriterium kan undersøges ved konventionel antistoffarvning og konfokal billeddannelse. Et af de nye kriterier, vi introducerede i denne metode, er "4-cellediameter-kriterier", der diskriminerer mellem dysplasi og neoplasma i imaginale diske. Pro-tumorceller, såsom nTSG-mutantkloner, er hyppigeEkstruderes fra epitel lag gennem celle konkurrence eller spindel misorientation 15 , 16 , 34 . I de fleste situationer apoptose disse ekstruderede celler, og så kan de ikke sprede sig. Selv om det kan være muligt, at pro-tumorcellerne undergår celledeling en gang under ekstrudering og en eller to gange mere efter ekstrudering, danner dette en cellemasse på 2- til 3-cellediameter. Hvis en cellemasse af pro-tumorceller, der afviges fra epithelialaget, er større end 4-cellediameter, kan vi derfor bestemme, at de overlever og prolifererer som en neoplasma uden for epitellaget.
Selvom denne diagnosemetode er enkel, er det afgørende at tage en tidskurs af fænotyper, da tumorudvikling og malignitet udvikler sig gennem tiden. For eksempel er dysplasi et cytologisk abnormt væv og en overgangstilstand mellem fuldstændigt godartede vækst og de prædiktiveondartet. Selv om en observeret klon er defineret som en dysplasi ifølge flowdiagrammet ( figur 1 ), er det derfor muligt, at dysplasien efterfølgende udvikles til en neoplasma. Selvom larvestadiet er begrænset i tid (5-6 dage ved 25 ° C eller 4 - 5 dage ved 29 ° C AED) forlænger tumorvækst i imaginale skiver larvalfasen via en insulinlignende peptidinduceret forsinkelse af pupariation 35 , 36 . Derfor muliggør neoplastisk tumordannelse i imaginale diske det muligt at observere tumorfonotypeprogression i flere dage. Vores enkle klassificeringsmetode kan være bredt anvendelig til klonanalysen af tumorfænotyper i forskellige organer i Drosophila .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker J. Vaughen for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 og The Takeda Science Foundation Research Grant til YT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
