Summary
Mozaïek kloon analyse in Drosophila imaginal disc epithelia is een krachtig model systeem om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om tumoren te induceren in Drosophila- vleugel-imaginale schijven met behulp van het GAL4-UAS-systeem, en introduceert een diagnose-methode om de tumorfenotypen te classificeren.
Abstract
In de vroege stadia van kanker vertoont getransformeerde mutante cellen cytologische abnormaliteiten, beginnen ongecontroleerde overgroei en weefselorganisatie progressief verstoren. Drosophila melanogaster is ontstaan als een populair experimenteel model systeem in kankerbiologie om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Met name maken genetische hulpmiddelen voor Drosophila imaginale schijven (ontwikkelende epithelia in larven) het mogelijk om getransformeerde pro-tumorcellen in een normaal epitheliaal weefsel te creëren, een situatie die vergelijkbaar is met de initiële stadia van menselijke kanker. Een recente studie van tumorigenese in Drosophila vleugel-imaginale schijven heeft echter aangetoond dat tumorinitiatie afhankelijk is van de weefsel-intrinsieke cytoarchitectuur en de lokale micro-omgeving, wat suggereert dat het belangrijk is om de regio-specifieke vatbaarheid voor tumorigenische stimuli te overwegen bij het evalueren van tumorfenotypes in imaginal discs. Om fenotypische analyse van tumorprogressie te vergemakkelijkenOp imaginale schijven beschrijven we hier een protocol voor genetische experimenten die het GAL4-UAS-systeem gebruiken om neoplastische tumoren in vleugel-imaginale schijven te induceren. We introduceren verder een diagnose methode om de fenotypen van klonale laesies die in imaginale epithelia zijn geïnduceerd te classificeren, aangezien een duidelijke classificatie methode om verschillende stadia van tumorprogressie te discrimineren (zoals hyperplasie, dysplasie of neoplasie) niet eerder is beschreven. Deze methoden kunnen in grote mate van toepassing zijn op de klonale analyse van tumorfenotypes in verschillende organen in Drosophila .
Introduction
Epitheliale weefsels zijn hoog georganiseerde systemen die het opmerkelijke homeostatische vermogen hebben om hun organisatie te behouden door de ontwikkeling en de omzet van cellen. Dit robuuste zelforganiserende systeem wordt echter progressief verstoord tijdens de tumorontwikkeling. Bij het begin van de tumorontwikkeling ontstaan individuele mutante cellen die voortkomen uit oncogene activatie of tumor-suppressor gen inactivatie binnen een epitheliale laag. Wanneer deze getransformeerde "pro-tumorcel" een onderdrukkende omgeving ontwricht, epitheliale organisatie verstoord en ongecontroleerde proliferatie begint, vindt tumorigenese plaats 1 . Uitstekende technologische vooruitgang in de genetica en moleculaire biologie heeft de afgelopen decennia opmerkelijke vooruitgang geboekt op het gebied van kankeronderzoek. In het bijzonder zijn recente studies met behulp van de analysemethoden voor genetisch mozaïekanalyse in Drosophila melanogaster , zoals FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target) mitotisch recombinAtion 2 en flip-out-GAL4-UAS (stroomopwaartse activerende sequentie) systemen 3 hebben veel bijgedragen tot een beter begrip van de genetische mechanismen die betrokken zijn bij de vorming en metastase van tumoren 4 , 5 , 6 .
Studies van een groep geconserveerde Drosophila tumor-suppressor genen, dodelijke reuzenlarven ( lgl ), schijven groot ( dlg ) en scribble ( scrib ), benadrukte de kritische relatie tussen verlies van epitheliale organisatie en tumorontwikkeling, aangezien deze genen sleutelrollen spelen In de regulering van apical-basale celpolariteit en cel proliferatie in epitheliale weefsels 7 . Terwijl Drosophila imaginal discs normaal gesproken een gelaagde epithelia zijn, veroorzaken homozygote mutaties in elk van deze drie genen cellen om structuur en polariteit te verliezen, misluktVerhuren, overpresteren en uiteindelijk vormen multilayerige amorfe massa's die samenvoegen met aangrenzende weefsels 7 . Op soortgelijke wijze is verstoring van deze genen bij zoogdieren betrokken bij de ontwikkeling van kwaadaardige tumoren 8 , 9 . De neoplastische fenotypen die door de mutante weefsels worden tentoongesteld hebben geleid tot de indeling van deze drie genen als geconserveerde neoplastische tumor-suppressor genen (nTSG's) 7 , 8 . Wanneer echter homozygote nTSG-mutante cellen sporadisch worden gegenereerd bij het ontwikkelen van wild-type imaginale schijven met behulp van FLP-FRT-gemedieerde mitotische recombinatie, worden mutante cellen geëlimineerd uit het weefsel door middel van c-Jun N-terminale kinase (JNK) -afhankelijke apoptose 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusie 15 , 16 of engulfment en fagocytose door buren 17 . In deze genetische mozaïekepithelia wordt apoptose meestal gedetecteerd in nTSG-mutante cellen die zich bevinden op de kloongrens, wat suggereert dat naastliggende normale cellen de apoptose van nTSG-mutante cellen 10 , 11 , 12 , 18 triggen. Recente studies in zoogdiercellen hebben bevestigd dat deze celcompetitieafhankelijke eliminatie van pro-tumorcellen een evolutionair bewaard epitheliaal zelfverdediging mechanisme tegen kanker 19 , 20 , 21 , 22 , 23 is .
Een recente studie in Drosophila imaginal discs bleek echter dat mozaïek nTSG-knockdown klonen neoplastische tumoren in specifiekeIc regio's van vleugel imaginale schijven 16 . Aanvankelijke tumorvorming werd altijd gevonden in het perifere "scharnier" gebied en werd nooit waargenomen in het centrale "pouch" gebied van het vleugelplatenepithelium, wat suggereert dat het tumorigene potentieel van nTSG-knockdowncellen afhankelijk is van de lokale omgeving. De centrale zakstreek fungeert als een "tumorkoolspot" waar pro-tumorcellen geen dysplastische overgroei vertonen, terwijl het perifere scharniergebied zich gedraagt als een "tumor hotspot" 16 . In de "koude spleten" -zakkenregio's delamineren de NTSG-knockdown-cellen van de basale zijde en ondergaan apoptose. Daarentegen, als "hotspot" scharniercellen beschikken over een netwerk van robuuste cytoskeletale structuren op hun basale zijkanten, delamineren nTSG-knockdowncellen van de apicale kant van het epithelium en initiëren tumorigenische overgroei 16 . Daarom vereist analyse van tumorfenotypen in imaginale schijven zorgvuldige consiAfwijking van de regio-specifieke gevoeligheid voor tumorigenische stimuli.
Hier beschrijven we een protocol om neoplastische tumorvorming op te wekken in de Drosophila- vleugelbeeldschijven die gebruik maken van het GAL4-UAS- RNAi- systeem waardoor nTSG-knockdown-cellen worden gegenereerd in normale vleugelplaten epithelia. Hoewel deze experimentele systemen nuttig zijn om de vroege stadia van kanker te bestuderen, is een duidelijke classificatiemethode om de stadia van tumorprogressie in imaginale disc epithelia te evalueren nog niet duidelijk beschreven. Daarom stellen we ook een diagnose-methode voor om pro-tumorklonale fenotypes te classificeren die in de vleugelplatenepithelia geïnduceerd zijn in drie categorieën: hyperplasie (accumulatie van een te groot aantal normale verschijnende cellen met verhoogde proliferatie), dysplasie (premalignant weefsel dat bestaat uit abnormaal verschijnen Cellen) en neoplasie (goedaardige of kwaadaardige tumor samengesteld uit cellen die een abnormale verschijning hebben en abnormaal proliferatiepatroon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vliegkruisen en kloneninductie
- Verwijder alle vliegen in de flesje 12 uur voordat u maagvliegen verzamelt.
- Verdoof de vliegen in de flesje door CO 2 -gas te injecteren en vliegen op een CO 2- vliegblok te plaatsen.
- Breng 10 tot 20 maagden en 10 mannetjes van het CO 2 vliegblok in een nieuwe injectieflacon en incubeer gedurende 1 dag bij 25 ° C.
- Breng deze vliegen in een nieuwe fles en incubeer gedurende 12 uur bij 25 ° C.
OPMERKING: Verwijder de eerste injectieflacon aangezien maagden geen voldoende eieren op de eerste dag leggen. - Voor enhancer-GAL4 lijnen, verwijder de volwassen vliegen en incubeer de injectieflacon bij 25 ° C tot dissectie.
- Voor inductie van mozaïekklonen door flip-out-GAL4, verwijder de volwassen vliegen en incubeer de flesje gedurende 2 - 4 dagen bij 25 ° C. De incubatietijd voor warmtechok hangt af van het experimentele doel. Een hitte schok 2 dagen na het ei afzetting (AED) genereert mozaïekklonen in onvolwassen tweedeInstar imaginale epithelia. Een hitte schok na 3 of 4 dagen AED genereert mozaïekklonen in gedifferentieerde vroege tot midden derde instar imaginale epithelia.
OPMERKING: Het is belangrijk om het effect van veranderde warmteschoktijd op tumorige fenotypes te onderzoeken. - Voor inductie van mozaïekklonen door flip-out-GAL4, schud de flesje door onderdompeling in een waterbad van 37 ° C gedurende 10 - 45 minuten, gevolgd door incubatie gedurende 2 - 3 dagen bij 25 ° C.
OPMERKING: Informatie over warmteschoktijd, timing en incubatietijd in elk experiment wordt weergegeven in de figuurlegendes.
2. Dissectie van Larven
- Verzamel wandelende derde-instarlarven met een houten stok of stompe tangen, genotype ze door middel van geschikte fluorescerende markers ( bijv . EGFP) onder een fluorescentie stereoscopische microscoop en plaats ze in een dissectie schotel met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing).
- Was de larven in PBS door pipettering met 2 ml plastic overdrachtpipetten.
- Knijp het middelpunt van de larve met een pincet en scheur het lichaam in de helft met de andere pincet.
- Knijp de mondhaken van de voorste helft met één pincet en duw de mond naar het lichaam met de andere pincet om het lichaam naar buiten te draaien.
- Verwijder onnodige materialen zoals speekselklieren of vetlichamen met tang.
3. Bevestiging en antilichamenverf
- Zet de dissecteerde voorste helft van het larvenlichaam (inclusief imaginale vleugelschijven) over op een 1,5 ml plastic buis en fixeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur in 1 ml Fix oplossing (4% Formaldehyde in PBS) met zachte rotatie.
VOORZICHTIG: Formaldehyde is giftig en heeft kankerverwekkend vermogen. Draag beschermende handschoenen en kleding om contact met de huid te voorkomen.
OPMERKING: In dit deel vinden alle stappen plaats op een nutator bij kamertemperatuur in het donker tenzij anders vermeld. - Verwijder de Fix oplossing en weggooi. Was de weefsels met 1 ml PBT (0,3% TritOp X-100 in PBS) drie keer gedurende 15 minuten elk.
- Verwijder de PBT en voeg 1 ml PBTG (0,2% runder serumalbumine en 5% normaal geiten serum in PBT toe) om 1 uur bij kamertemperatuur of nachts bij 4 ° C te blokkeren en te mengen.
- Verwijder PBTG en voeg primaire antilichaamoplossing toe die geschikt is met PBTG (zie Materialetafel ) en voeg de nacht toe bij 4 ° C.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing en wrijf de weefsels met 1 ml PBT drie keer gedurende 15 minuten elk.
- Verwijder PBT en voeg secundaire antilichaamoplossing toe die geschikt is met PBTG (1: 400). Meng gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Verwijder secundaire antilichaamoplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende 15 minuten elk.
- Om F-actin te vlek, verwijder PBT en voeg Phalloidin-oplossing toe die geschikt is verdund in PBS (1:40). Doe dan 20 min. Verwijder de Phalloidin oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende 15 minuten elk.
- Om nucleair DNA tegen te gaan, verwijder PBT en voeg DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) oplossing (0,5 μg / ml DAPI in PBS) toe. Doe dan 10 min.
VOORZICHTIG: DAPI heeft kankerverwekkend vermogen. Draag beschermende handschoenen en kleding om contact met de huid te voorkomen. - Verwijder DAPI-oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende 15 minuten elk.
- Spoel eenmaal in 1 ml PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder PBS en voeg 500 μL 100% glycerol toe als het voormontagemedium.
4. Montage op Microscope Slides
- Plaats de gekleurde weefsels op een microscoopschuif met een 2 ml plastic transfer pipette.
- Plaats de weefsels op druppels montagemedium op een andere microscoopschuif met tang.
- Houd het uiteinde van het gedissende weefsel vast met een pincet en trek de hersen- en oogantenne schijven met de andere pincet.
OPMERKING: houd de gedissendeerde hersenen in de buurt van de vleugel-imaginale schijven. De hersenen fungeren als een platform waardoor de coverlip de vleugel-imaginale schijven niet vergrijst. - Om de vleugel-imaginale schijven te isoleren, houd het uiteinde van het gedissende weefsel vast met een pincet en schud de lichaamswand voorzichtig en schroef de schijven met de andere pincet af.
OPMERKING: Als het moeilijk is om vleugel-imaginale schijven te vinden, schil de luchtpijp van de achterzijde naar de voorkant. Vleugelbeeldschijven houden zich aan de luchtpijp vast. - Dek de imaginale schijfjes voorzichtig af met een deklip en afdichting met nagellak; Opslaan bij 4 ° C.
5. Confocal Microscopie
- Confocal beelden verkrijgen met behulp van een confocale microscoop ingestelde beeldverwervingsparameters, waaronder bereik van emissiegolflengte, laserintensiteit, gain, offset, scansnelheid en beeldgrootte 24 .
OPMERKING: Raadpleeg de gebruiksaanwijzing van elke microscoopfabrikant voor een gedetailleerde procedure van instellingen voor het maken van beelden. - Om single co te vangenNfocal delen van een hele vleugel imaginale schijf, gebruik een 20X objectieflens.
- Verkrijg 3-dimensionale afbeeldingen door z-stapscanning in stapformaat van 0,5 - 1,0 μm met behulp van 40X of 60X objectieven.
OPMERKING: Om cellulaire fenotypes in hoge resolutie te analyseren, moet een beeldformaat groter zijn dan 512 x 512 pixels.
6. Beeldanalyse met behulp van ImageJ
- Gebruik Fiji, een open source ImageJ software gericht op biologische beeldanalyse (https://fiji.sc/) 25 , om confocal z-stack beelden te verkrijgen en te analyseren.
- Om verticale afdelingen te verwerven, open de z-stack beelden in ImageJ en selecteer het menu item "Image / Stacks / Reslice."
OPMERKING: De XZ-as of de YZ-as kunnen in het menu Reslice worden gekozen. Verticale sectie kan ook in arbitraire richting worden verkregen door een rechte lijn of rechthoek op de z-stapelbeeld te tekenen.
7. Diagnose van neoplastische fenotypes
- Open de verticaleSecties (XZ of YZ-as) verkregen uit één set van z-stapbeelden en analyseren van morfologische fenotypes en antilichamen kleuring.
- Voor de diagnose van tumorfenotypen concentreert zich zich vooral op de volgende drie punten: (1) als een celmassa, inclusief klopklonen, afwijkt van de hoofdepitheliale laag, (2) als de subcellulaire lokalisatie van junctionele eiwitten in deze celmassa wordt veranderd , En (3) als de diameter van deze celmassa groter is dan 4 cellen.
- Categoriseer tumorfenotypen volgens het stroomdiagram beschreven in Figuur 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een neoplastische tumorvorming te demonstreren die door RNAi- gemedieerde nTSG-knockdown in Drosophila- vleugel-imaginale schijven werd geïnduceerd, werden drie verschillende GAL4-stuurprogramma's gebruikt om UAS-RNAi voor lgl of scrib uit te drukken : (1) sd-GAL4, die sterke UAS-expressie in de Vleugelzakje en milde expressie in de scharniergebieden ( figuur 2 en figuur 3A ); (2) upd-GAL4, die rijdt in subdomeinen van het scharnier, met inbegrip van sterke expressie in twee domeinen van de dorsale mediale vouw, milde expressie in één anterior-lateraal domein en zwakke expressie in het ventraal-posterior domein ( Figuur 2 en Figuur 3C ); En (3) warmte-schok geïnduceerde flip-out GAL4, die willekeurige mozaïekklonen produceert die UAS-genen uitdrukken ( Figuur 4 en FiGure 5). In alle experimenten werd UAS-EGFP mede uitgedrukt met UAS-RNAi om de knockdown klonen te markeren.
Ten eerste werd sd-GAL4- gedreven lgl-RNAi gebruikt om de inbraak van lgl in de vleugelzak en scharniergebieden in te schakelen . In de controle van derde instar vleugelschijven zonder UAS-lgl-RNAi , is er geen morfologische verandering plaatsgevonden ( Figuur 3A ). In contrast, in de derde instar vleugelschijven die lgl-RNAi uitdrukken, werden epitheliale vervormingen en tumorigenische overgroei duidelijk waargenomen in bepaalde delen van het scharnier ( Figuur 3B ). In de vleugelhouderegio bleek dysplastische overgroei echter niet waargenomen. Sterke MMP1 (matrix metalloprotease-1) expressie werd waargenomen in de tumorachtige scharnierlaesies, maar niet in de vleugelzakgebied ( Figuur 3B ). Aangezien MMP1 expressie betrokken is bij de afbraak van de keldermembraanHet is mogelijk dat deze scharniertumoren een metastatische mogelijkheid hebben ( Figuur 3B ). Vervolgens werd upd-GAL4 gebruikt om lgl knockdown in het scharniergebied te induceren. In controle derde instar vleugel schijven zonder UAS-lgl-RNAi , werden geen morfologische veranderingen voorgedaan ( Figuur 3C ). Echter, na 5 dagen AED, vertoonden derde instar vleugelschijven met upd-GAL4 en lgl-RNAi prominente epitheliale disorganisatie, waarbij F-actin accumulatie en kloonverplaatsing van de epitheliale laag ( Figuur 3D ) werden weergegeven. Op 6 dagen AED overgingen neoplastische tumoren die MMP1 uitdrukken in het scharniergebied ( Figuur 3G ), zij het met variatie in tumorgrootte tussen monsters ( Figuur 3E en F ). Een verticale doorsnede van het scharniergebied bevestigde dat de neoplastische tumor een afwijkende groei op de apicale kant van de epitheliale laag onderging ( Om de progressie van tumorgroei die geïnduceerd werd door lgl- knockdown te monitoren , werden sporadische klonen die lgl-RNAi tot expressie brengen , gegenereerd in vleugelschijven met behulp van het warmte-schok geïnduceerde GAL4-mozaïek systeem. Twee dagen na hitte-schok op tweede-instar larven (2 dagen AED) vertoonden enkele lgl- knockdown klonen in het scharniergebied afwijking van de apicale kant van de epitheliale laag ( Figuur 4A ). Vier dagen na warmte- schokinductie bleek dysplastische laesies in het scharniergebied duidelijk, wat suggereert dat lgl- knockdownklonen die van de apikale zijde verplaatst worden, in het lumen verplaatsen ( Figuur 4B ). Zeven dagen na hitte-schokinductie domineerden tumorige overgroei de scharniergebieden ( Figuur 4C ). Om deClassificatie van klonale fenotypes met onze diagnose methode werden sporadische klonen die scrib-RNAi tot expressie brengen , gegenereerd in vleugelschijven met behulp van het warmte-schok geïnduceerde uitwip GAL4 mozaïek systeem. Vijf dagen na de heat-shock naar het tweede stadium larven (2 dagen AED), bepaalde GFP tot expressie Scrib -knockdown klonen vertoonden tumorigene fenotype (Figuur 5A). We analyseren vier klonen (B, C, D en E in Figuur 5A ) in verticale delen van z-stack confocalbeelden met behulp van ImageJ, omdat het moeilijk is om de gedetailleerde cytologische en structurele fenotypes in de 2D-confocale beelden te verkrijgen ( Figuur 4 en Figuur 5A ). Klonen B en C werden ingedeeld als dysplasie als septaat-junctie eiwitschijven groot (Dlg) was mislocalized ( Figuur 5B en C ). In kloon B was de grootte van de celmassa die uit het epithel verdween, niet groter dan 4-cellen in diameteR ( Figuur 5B ), terwijl kloon C niet afwisselde van het epithelium ( Figuur 5C ); Daarom werden klonen B en C niet neoplastisch beschouwd. Echter, klonen D en E, die ook mislocalisatie van Dlg toonden, vormden tumorachtige celmassa's buiten het epithelium ( Figuur 5D En 5E ). Aangezien de grootte van deze verplaatste tumorklonen meer dan 4 cellen in diameter was, werden de klonen ingedeeld als neoplastisch. Om hyperplastische tumoren of cysteformaties in de vleugel-imaginale schijven te veroorzaken, werden sporadische klonen die oncogene Ras ( Ras V12 ) of constitutief actieve vorm van Yorkie veroorzaken, een transcriptie coactivator van de Hippo-weg, ( Yki 3SA ) gegenereerd met behulp van de warmte-schok geïnduceerde Flip-out GAL4 mozaïek systeem. Vier dagen na de hitte schokken de tweede larven (2 dagen AED), RaS V12- expresserende klonen gemarkeerd door GFP werden ronde celmassa's in de imaginale schijven ( Figuur 6A ). Een verticale sectie van de Ras V12- expressie kloon (kloon B in figuur 6A ) onthulde dat de celmassa gedisocieerd uit de epitheliale laag een goede lokalisatie van Dlg heeft, hetgeen suggereert dat de celmassa normale epitheliale structuren buiten de epitheliale laag handhaaft ( Figuur 6B ) . MMP1-expressie werd niet waargenomen in deze Ras V12- expressie-klonen ( Figuur 6C ). Daarom werd de kloon B geclassificeerd als cystvorming. Vier dagen na de warmte schokken de tweede- instarlarven (2 dagen AED), Yki 3SA- expressieve klonen die door GFP gemerkt werden, vormen grote celmassa's in de imaginale schijven ( Figuur 7A ). We richten ons op twee klonen (B en C in Figuur 7A ). Clone B liet zienIntegratie in de epitheliale laag en de juiste lokalisatie van Dlg in de subapische membranen van de epitheelcellen, wat suggereert dat de Yki 3SA- expressieklon B epitheelstructuur behoudt. Daarom werd kloon B geclassificeerd als hyperplasie ( figuur 7B ). Clone C, gelegen in het scharniergebied, vertoonde mislocalisatie van Dlg en vormde meerlaagse structuur aan de basiszijde van de epitheliale laag. MMP1 expressie werd niet waargenomen in de Yki 3SA- expressieklonen. Geconcludeerd werd klon C geclassificeerd als goedaardige neoplasma ( Figuur 7C en D ). 5 "class =" xfigimg "src =" / bestanden / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Figuur 1: Flowchart voor classificatie van tumorfenotypes. Deze flowchart staat voor een diagnose methode om clonale laesies te classificeren in imaginale epithelia. De klassiekeAtion is gebaseerd op vijf criteria: (1) afwijking van klonen uit de epitheliale laag, (2) subcellulaire mislocalisatie van junctionele eiwitten, (3) cellulaire proliferatie, (4) kloongrootte en (5) MMP1 expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2: ( A ) Wild-type vleugel-imaginale schijf gekleurd voor Dgg (groen) en kernen (DAPI, magenta). ( B ) Schematische weergave van Drosophila vleugel-imaginale schijven met vleugelzakje (blauw), scharnier (oranje) en notum (groen) gebieden. ( C ) Normale vleugelbeeldschijf gekleurd voor F-actine (rood) en microtubules (groen). Keldermembranen zijn gemerkt met Collageen IV / Vkg-GFP (blauw). ( D ) Verticale sectie van de siteGemarkeerd met witte stippellijn in ( C ). ( E ) Lijntekeningen traceren de apische (rode) en basale (blauwe) zijkanten van de epitheliale laag in ( D ). Stippellijnen bepalen het peripodiale membraan. Distale (Df), mediale (Mf) en proximale (Pf) vouwen van het dorsale scharnier zijn aangegeven.
Gedetailleerde genotypen: A, w - CD, Vkg-GFP Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 3: Site-specifieke Tumorigenese geïnduceerd door Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Confocal beelden tonen vleugel-imaginale schijven gedissecteerd uit derde instar larven van aangeduide genotypen gekleurd voor MMP1 (rood). De sd-GAL4 -expreSsing gebieden werden gemerkt door GFP expressie (groen). ( CG ) Confocal beelden tonen vleugel-imaginale schijven die zijn gescheiden van derde instar larven van aangegeven genotypen op het aangegeven tijdstip AED. F-actine werd gekleurd met Phalloidin (rood) in ( CF ). MMP1 expressie is gekleurd met anti-MMP1 antilichamen (rood) in ( G ). De updates-GAL4- expressiegebieden werden gemerkt door GFP-expressie (groen). Onderpanelen van ( CF ) tonen uitgebreide weergaven van gebieden die in bovenste panelen worden aangegeven. Witte pijlen duiden dysplastische laesies veroorzaakt door lgl- knockdown klonen. ( H ) Verticale sectie van de site gemarkeerd met witte stippellijn in het onderste paneel van (E). Witte stippellijnen markeren de grenzen tussen vleugelzak en scharnierstreken in (A) en (B). Nuclei werden gemerkt met DAPI (blauw). Schaalstaven = 100 μm in (AG) en 50 μm in (H). Gedetailleerde genotypen: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, W -, sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-LGL-RNAi; C, w - , update-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , update-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 4: Tumorfenotypen geïnduceerd door willekeurige mozaïekklonen. ( AC ) Confocal beelden tonen mosaïsche vleugelbeeldschijven van derde instarlarven met klonen die lgl-RNAi en GFP (groen) co-expresseren op het aangegeven tijdstip na warmte-schokinductie. Nuclei werden gemerkt door DAPI (blauw). De middelste panelen tonen vergrote weergaven van de witte vierkante gebieden die in de linkerpanelen worden gemarkeerd. Het juiste paneel S tonen schematische lijntekeningen van de apicale zijde van de epitheliale lagen (blauw) en de GFP-expresserende klonen (groen). Mozaïekklonen die zich in het epitheel bevinden, worden in lichtgroen afgebeeld, terwijl neoplastische tumoren die afwijken van het epitheel, in magenta worden weergegeven. Witte stippellijnen in de linkerpanelen markeren de grenzen tussen vleugelzak en scharniergebieden. Witte pijlen in de middenpanelen wijzen op dysplastische laesies veroorzaakt door lgl- knockdown klonen. Schaalstaven = 100 μm. Gedetailleerde genotypes: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Acteren> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi ( warmgeschokt 30 min bij 2 dagen AED, incubeer 2 dagen bij 25 ° C in A, incubeer 4 dagen bij 25 ° C in B, incubeer 7 dagen bij 25 ° C in C na warmte schok). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Diagnostisch onderzoek van dysplastische klonale fenotypes. ( A ) Het linker paneel toont een imaginale schijf van de mozaïekvleugel van de derde instar larve met klonen die co-expressie geven van scrib-RNAi en GFP (groen) 5 dagen na warmtechokinductie, gekleurd voor Dlg (rood). Het rechter paneel toont een schematische lijntekening van de apische kant van de epitheliale lagen (blauw) en de GFP-expresserende klonen (groen). Mozaïekklonen in de epitheliale lagen worden in lichtgroen weergegeven, terwijl neoplastische tumoren die uit het epitheel zijn verplaatst, in magenta worden getoond. ( BE ) De confocale afbeeldingen tonen verticale delen van de scrib- knockdown-klonen die in het rechterpaneel van (A) worden aangegeven. De tweede panelen van links tonen de Dlg lokalisatiepatronen (rood). De derde panelen van links tonen schematische lijntekeningen van de apische (rode) en basale (blauwe) zijkanten van epitheliale lagen en de GFP-exprEssing scrib- knockdown klonen (groen). Dysplastische klonen in de epitheliale lagen worden weergegeven in lichtgroen (B en C), terwijl neoplastische klonen die uit het epitheel zijn verplaatst, in magenta (D en E) worden getoond. Witte pijlen wijzen op scrib- knockdown klonen die tumorigenisch fenotype tonen. Nuclei werden gemerkt met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. Het tumorfenotype van elke kloon werd ingedeeld volgens het stroomdiagram dat in Figuur 1 is getoond. Gedetailleerde genotypen: AE, hsFLP; UAS-Scrib-RNAi; Acteren> CD2> GAL4, UAS-EGFP (warmgeschokt 30 min bij 2 dagen AED, incubatie 4 dagen bij 25 ˚C na warmte schok). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 6: DiagnoseTic onderzoek van Ras V12- expressie van klonale fenotypes. ( A ) Het linker paneel toont een imaginale schijf van de mozaïekvleugel van de derde instar larve met klonen die oncogene Ras V12 en GFP (groen) co-expresseren 4 dagen na warmte-schokinductie, gekleurd voor Dlg (rood). Het rechter paneel toont een schematische lijntekening van de apische kant van de epitheliale lagen (blauw) en de GFP-expresserende klonen (groen). Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. ( B ) Verticale delen van de Ras V12- expressieklonen die in het rechterpaneel van (A) worden aangegeven. De tweede panelen van links tonen de Dlg lokalisatiepatronen (rood). De derde panelen van links tonen schematische lijntekeningen van de apische (rode) en basale (blauwe) zijkanten van epitheliale lagen en de Ras V12 en GFP die klonen uitdrukken (groen). Schaalbalk = 25 μm. ( C ) Mozaïekvleugel-imaginale schijf van derde instar larve met klonen co-expressie <Em> Ras V12 en GFP (groen) 4 dagen na warmte-schokinductie, gekleurd voor MMP1 (rood). Schaalbalk = 100 μm. Gedetailleerde genotypes: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (warmgeschokt 45 min bij 2 dagen AED, incubeer 4 dagen bij 25 ° C na warmte schok). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 7: Diagnostisch onderzoek van Yki 3SA- expressie van klonale fenotypes . ( A ) Het linker paneel toont een imaginale schijf van de mozaïekvleugel van de derde instar larve met klonen die constitutief actieve Yki 3SA en GFP (groen) co-expresseren 4 dagen na warmtechokinductie, gekleurd voor Dlg (rood). Het rechter paneel toont als Chemische lijntekening van de apicale kant van de epitheliale lagen (blauw) en de GFP-expresserende klonen (groen). Schaalbalk = 50 μm. ( BC ) Verticale delen van de Yki 3SA- expressieklonen die in het rechterpaneel van (A) worden aangegeven. De tweede panelen van links tonen de Dlg lokalisatiepatronen (rood). De derde panelen van links tonen schematische lijntekeningen van de apische (rode) en basale (blauwe) zijkanten van epitheliale lagen en de Yki en GFP-expressieklonen (groen). Schaalbalk = 25 μm. ( D ) Mozaïekvleugel-imaginale schijf van derde instar larve met klonen die Yki 3SA en GFP (groen) co-expresseren 4 dagen na warmte- schokinductie , gekleurd voor MMP1 (rood). Schaalbalk = 100 μm. Gedetailleerde genotypen: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( warmgeschokt 30 minuten bij 2 dagen AED, incubatie 4 dagen bij 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het GAL4-UAS-systeem is een van de meest krachtige genetische hulpmiddelen voor gerichte genuitdrukking in Drosophila 26 en vergemakkelijkt de tumorcelinductie en -analyse in vivo 4 sterk . Dit systeem maakt het mogelijk om klonen te genereren die afbreking van tumoronderdrukkende genen of overexpressie van oncogenen binnen het epitheliale weefsel van wildtype, een situatie die sterk overeenkomt met de initiële stadia van menselijke kanker, waar getransformeerde pro-tumorcellen omringd zijn door normale epitheliale cellen, mogelijk maken. GAL4 driver lijnen gereguleerd door versterker sequenties zoals GAL4 enhancer-trap lijnen of Janelia GAL4 lijnen 27 hebben unieke, spatiotemporally restricted expression patters. Daarom zijn deze versterker-GAL4 lijnen nuttig om tumoren consequent in beperkte gebieden van imaginale schijven te induceren. Naast sd-GAL4 en update-GAL4 in deze studie, bevestigden we dat lgl- knockdown geïnduceerde by andere enhancer trap GAL4 lijnen inclusief engrailed-GAL4 (en-GAL4), hedgehog-GAL4 (hh-GAL4), optomotor-blind-GAL4 (OMB-GAL4), patched-GAL4 (ptc-GAL4) en spalt-meerder- GAL4 ( salm-GAL4 ) kan neoplastische tumoren opwekken in de scharniergebieden van vleugel-imaginale schijven. Als het versterker-GAL4 expressiepatroon tijdelijk moet worden geregeld, is een combinatie van GAL4 en een temperatuurgevoelige versie van GAL80 (GAL80 ts ) een optie. GAL80 ts onderdrukken GAL4-functie bij 18 ° C, maar niet bij 29 ° C, waardoor UAS-transgenen, zoals nodig, kunnen worden uitgeschakeld 28 .
Het flip-out-GAL4 mozaïek systeem, dat het FLP-FRT systeem en het GAL4-UAS systeem 3 combineert, genereert willekeurige klonen in imaginale schijven. Door hitte-shock-induceerbare flippase (hsFLP) te combineren met flip-out GAL4, wordt de timing van kloongeneratieIonen is regelbaar. Omdat het tumorigene potentieel van imaginale schijfcellen afhankelijk kan zijn van het ontwikkelingsstadium, endogene signaleringsgebeurtenissen en / of cellulaire differentiatie 29 , 30 , is het zeer belangrijk om het effect van veranderde warmteschoktijd op tumorige fenotypen te onderzoeken.
Het is eerder aangetoond dat nTSG-mutante klonen celloncurrentieafhankelijke apoptose ondergaan wanneer ze omringd worden door wild-type cellen 10 , 11 , 12 , 18 , wat suggereert dat meerdere mutaties nodig zijn voor celtransformatie tijdens kankerontwikkeling. Overexpressie van oncogene Ras of Yki in lgl of scrib mutant klonen transformeert ze in agressieve tumoren 10 , 18 , 31 terwijl misExpressie van Ras V12 of Yki 3SA induceert geen kwaadaardige neoplasma door zichzelf zonder nTSG mutaties. Zoals hier getoond en eerder 16 , worden pro-tumor nTSG-knockdown klonen gegenereerd in wild-type vleugelschijven ook onderworpen aan apoptose en tonen geen tumorigenese in de vleugelzak 16 . Tegelijkertijd ontwikkelen nTSG-knockdown klonen in scharnier "hotspots" tot neoplastische tumoren zonder extra oncogene mutaties. In scharniergebieden kapot nTSG-deficiënte cellen endogene Janus kinase / signaal transducer en activator van transcriptie (JAK / STAT) signalering om tumorigenese 16 te drijven. Daarom zijn scharnierspecifieke GAL4's, zoals upd-GAL4 , bruikbare gereedschappen voor consistente inducerende neoplastische tumorvorming door middel van RNAi- gemedieerde knockdown van tumoronderdrukkende genen. Hoewel flip-out-GAL4 geïnduceerde nTSG-knockdown mozaïekklonen ook neoplastische tumoren in scharnierreactie veroorzakenGions, tumorigenese voorkomen is afhankelijk van de initiële kloongrootte: grote klonen die door 20 minuten een warmtechok worden gegenereerd, veroorzaken gewoonlijk tumorigenese, terwijl de meeste kleine klonen die worden gegenereerd door hitte schokken korter dan 10 minuten volledig worden geëlimineerd (KM en YT, ongepubliceerde data).
Een aantal recente studies over tumorontwikkeling en kankerprogressie gebruiken Drosophila imaginal discs als model systeem 32 , 33 . Gemeen bij deze studies behoren meerdere markers van neoplastische tumoren: afwijkende celmassa's, vervormde schijfvormen, accumulatie van F-actine, verbeterde celcycling (BrdU / EdU-integratie of PH3-expressie), activering van JNK-signalering en zijn stroomafwaartse doel MMP1, basismembraan Ontwrichting en / of epitheliale disorganisatie, inclusief verlies of subcellulaire delocalisatie van eiwitten die betrokken zijn bij apical-basale celpolariteit (Kruimels, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 of PAR-6)(Lgl, Scrib, Dlg of Coracle), of hechtingsverbindingen (E-Cadherin of Armadillo). Deze fenotypes zijn gemakkelijk te detecteren door middel van conventionele antilichamenkleuring. Hoewel het moeilijk is te bepalen of een clonale fenotype hyperplasie, dysplasie, goedaardige neoplasma of kwaadaardige neoplasma is in het vroege stadium van tumorigenese, zou het eenvoudiger moeten zijn in de Drosophila imaginal disc epithelia, samengesteld uit een enkele epitheliale monolaag. In deze studie hebben we een diagnose methode geïntroduceerd om tumor-klonfenotypes in de epitheliale monolaag te classificeren ( Figuur 1 ). Deze methode vereist nauwkeurige observaties van vijf criteria met behulp van z-stack confocal beelden; Elk diagnostisch criterium kan worden onderzocht door conventionele antilichamen kleuring en confocale beeldvorming. Een van de nieuwe criteria die we in deze methode hebben geïntroduceerd, zijn "criteria met 4 cellen", die onderscheid maakt tussen dysplasie en neoplasma in imaginale schijven. Pro-tumorcellen zoals nTSG mutante klonen zijn frequentWordt geëxtrudeerd uit epitheliale lagen door celcompetitie of spindelveroriëntatie 15 , 16 , 34 . In de meeste situaties apoptose deze geëxtrudeerde cellen, zodat ze niet kunnen prolifereren. Hoewel het mogelijk zou zijn dat de pro-tumorcellen eenmaal tijdens de extrusie een celverdeling ondergaan en een of twee keer na extrusie een celmassa met een diameter van 2 tot 3 cellen hebben. Daarom, als een celmassa van pro-tumorcellen afwijken van de epitheliale laag groter is dan 4-cel diameter, kunnen we bepalen dat ze overleven en prolifereren als een neoplasma buiten de epitheellaag.
Hoewel deze diagnose methode simpel is, is het cruciaal om een tijdsoort van fenotypes te nemen, aangezien de ontwikkeling van tumoren en maligniteit door de tijd voortgangt. Bijvoorbeeld, dysplasie is een cytologisch abnormaal weefsel en een overgangsstatus tussen volledig gunstige groei en die voorop staankwaadaardig. Daarom, zelfs als een waargenomen kloon wordt gedefinieerd als een dysplasie volgens het stroomdiagram ( Figuur 1 ), is het mogelijk dat de dysplasie vervolgens in een neoplasma ontwikkelt. Hoewel het larvenstadium tijdig is beperkt (5-6 dagen bij 25 ° C of 4 - 5 dagen bij 29 ° C AED), verdubbelt de tumorgroei in imaginale schijven het larvalfase door een insulineachtige peptide-geïnduceerde vertraging van pupilatie 35 , 36 . Daarom maakt neoplastische tumorvorming in imaginale schijven het mogelijk om de fenotypische progressie van de tumorkloon gedurende enkele dagen te waarnemen. Onze eenvoudige classificatie methode kan in grote mate van toepassing zijn op de klonale analyse van tumorfenotypen in verschillende organen in Drosophila .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken J. Vaughen voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 en The Takeda Science Foundation Research Grant aan YT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
