Summary
ショウジョウバエの上椎間板上皮におけるモザイククローン解析は、腫瘍形成の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するための強力なモデルシステムです。ここでは、GAL4-UASシステムを用いて、 ショウジョウバエの翅の椎間板に腫瘍を誘導するプロトコールについて説明し、腫瘍の表現型を分類するための診断法を紹介する。
Abstract
癌の初期段階では、形質転換された突然変異細胞は細胞学的異常を示し、制御されない過増殖を開始し、組織組織化を漸進的に破壊する。 Drosophila melanogasterは、腫瘍発生の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するために、癌生物学における一般的な実験モデルシステムとして登場しました。特に、 ショウジョウバエ ( Drosophila) imaginal disc(幼生の上皮発生)のための遺伝的ツールは、正常な上皮組織内で形質転換された前腫瘍細胞の生成を可能にする。これはヒト癌の初期段階と同様の状況である。しかし、 ショウジョウバエの翅の椎間板の腫瘍形成に関する最近の研究では、腫瘍の開始は組織固有の細胞構造および局所微小環境に依存することが示され、imaginalの腫瘍表現型を評価する際の腫瘍原性刺激に対する領域特異的感受性を考慮することが重要であるディスク。腫瘍進行の表現型分析を容易にするためにGAL4-UASシステムを用いた遺伝子実験のプロトコールについて説明します。この実験では、翅の椎間板に腫瘍性腫瘍を誘導します。以前には報告されていなかった腫瘍の進行の様々な段階(肥厚、形成異常または腫瘍形成)を識別するための明確な分類方法として、想像上皮に誘発されたクローン病変の表現型を分類するための診断方法をさらに紹介する。これらの方法は、 ショウジョウバエの種々の臓器における腫瘍表現型のクローン分析に広く適用可能であろう。
Introduction
上皮組織は、発達および細胞代謝回転を通じて組織を維持する顕著なホメオスタシス能力を有する高度に組織化されたシステムである。しかしながら、この堅牢な自己組織化システムは、腫瘍発生の間に次第に破壊される。腫瘍発生の開始時に、腫瘍遺伝子活性化または腫瘍抑制遺伝子不活性化から生じる個々の変異細胞が上皮層内に出現する。この形質転換された「プロ腫瘍細胞」が抑制的環境を回避し、上皮組織を破壊し、制御されない増殖を開始すると、腫瘍形成が起こる1 。過去数十年の間に、遺伝学および分子生物学における優れた技術的進歩は、がん研究において顕著な進歩を遂げました。特に、FLP-FRT(フリッパーゼリコンビナーゼ/フリッパーゼリコンビナーゼ標的)有糸分裂組換え体のようなショウジョウバエメラノガスターにおける遺伝的モザイク分析ツールを用いた最近の研究エーション2とフリップアウト-GAL4-UAS(上流活性化配列)システム3、大幅に良好腫瘍4、5、6の形成および転移に関与する遺伝的メカニズムを理解することに貢献しています。
保存されたショウジョウバエ腫瘍サプレッサー遺伝子、 致死性の巨大幼虫 ( lgl )、 大型ディスク ( dlg )、 落書き ( scrib )の研究は、これらの遺伝子が重要な役割を果たすため、上皮組織の消失と腫瘍発生の重要な関係を明らかにした上皮組織7で、頂端-基底細胞極性および細胞増殖の調節インチショウジョウバエの原始椎間板は通常単層上皮であるが、これらの3つの遺伝子のいずれかのホモ接合突然変異は、細胞が構造および極性を失い、過剰増殖し、最終的に隣接する組織と融合する多層アモルファス塊を形成する7 。同様に、哺乳動物におけるこれらの遺伝子の破壊は、悪性腫瘍8,9の開発に関与しています。変異体組織によって示される腫瘍性表現型は、保存、新生物、腫瘍抑制遺伝子(nTSGs)として、これら三つの遺伝子の分類7,8につながっています。ホモ接合nTSG変異細胞は散発的にFLP-FRT媒介有糸分裂組換えを使用して、野生型の成虫を開発する際に生成される場合しかし、変異細胞はc-Jun N末端キナーゼ(JNK)依存性アポトーシス10、11を介して組織から除去されます、12、13、14、15、押出し、 16 、または隣人による貪食および食作用17 。この遺伝的にモザイク上皮では、アポトーシスは主に隣接する正常細胞はnTSG変異細胞10、11、12、18のアポトーシスを引き起こすことを示唆し、クローンの境界に位置nTSG変異体細胞において検出されます。哺乳動物細胞における最近の研究では、プロの腫瘍細胞のこの細胞競争依存除去は癌19、20、21、22、23に対する進化的に保存された上皮の自己防御機構であることを確認しました。
しかし、最近のショウジョウバエの成虫の研究では、モザイクのnTSGノックダウンクローンが腫瘍性腫瘍を特異的に誘導することが示されています翼の想像上のディスクのIC領域16 。初期の腫瘍形成は末梢「ヒンジ」領域に常に見られ、ウイングディスク上皮の中央「ポーチ」領域では決して観察されず、nTSGノックダウン細胞の腫瘍形成能は局所環境に依存することが示唆された。中央ポーチ領域は、プロ腫瘍細胞が形成異常増殖を示さない一方で、周辺ヒンジ領域が「腫瘍ホットスポット」として振る舞う「腫瘍コールドスポット」として機能する16 。 「コールドスポット(cold spot)」ポーチ領域では、nTSG-ノックダウン細胞は基底面から剥離し、アポトーシスを起こす。対照的に、「ホットスポット」ヒンジ細胞は基底面に頑強な細胞骨格構造のネットワークを持っているため、nTSGノックダウン細胞は上皮の頂端側から剥離し、腫瘍原性の過増殖を開始する16 。したがって、原始椎間板における腫瘍表現型の解析には、注意深い検討が必要である腫瘍形成刺激に対する領域特異的感受性の低下。
ここでは、正常なウイングディスク上皮においてnTSGノックダウン細胞が生成されるGAL4-UAS- RNAiシステムを利用して、 ショウジョウバエのウイングのヘルニア椎間板に腫瘍性腫瘍形成を誘導するためのプロトコールについて説明する。これらの実験系は癌の初期段階を研究するのに有用であるが、椎間板上皮における腫瘍進行の段階を評価するための明確な分類方法はこれまで明らかにされていない。したがって、我々はまた、ウイングディスク上皮に誘導された前腫瘍クローン表現型を3つのカテゴリーに分類する診断法を提案する:過形成(増殖が増加した正常数の細胞の過剰な蓄積)、異形成(異常に出現する前悪性組織細胞)、および新生物(異常な外観および異常な増殖パターンを有する細胞からなる良性または悪性の腫瘍)。
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Protocol
1.フライクロスクローン誘導
- バイアルのハエを収集する前に、バイアル内のすべてのハエを12時間後に除去する。
- バイアル内のハエをCO 2ガスを注入して麻酔し、飛行船をCO 2フライパッドに置きます。
- CO 2フライパッドから10〜20匹の未処理の雌と10匹の雄を新鮮なバイアルに移し、25℃で1日間インキュベートする。
- これらのハエを新鮮なバイアルに移し、25℃で12時間インキュベートする。
注:最初の日に十分な卵を置いていないバージンの雌が最初のバイアルを捨てます。 - エンハンサー-GAL4系統については、成虫のハエを除去し、解剖まで25℃でバイアルをインキュベートする。
- フリップアウトGAL4によるモザイククローンの誘導のために、成虫のハエを除去し、バイアルを25℃で2〜4日間インキュベートする。熱ショック前のインキュベーション時間は、実験目的に依存する。卵の沈着の2日後の熱ショック(AED)は、未成熟の第2期にモザイククローンを生成する想像上皮を始める。 3または4日後の熱ショックAEDは、分化した早期から中期の第3齢の上皮上皮においてモザイククローンを生成する。
注:腫瘍原性表現型に対する熱ショックタイミングの変化の影響を調べることが重要である。 - フリップアウト-GAL4によるモザイククローンの誘導のために、バイアルを37℃の水浴中に10〜45分間浸漬し、25℃で2〜3日間インキュベートすることによってバイアルを熱ショックする。
注:各実験における熱ショック時間、タイミング、およびインキュベーション時間の情報は、図の凡例に示されています。
2.幼虫の解剖
- 蛍光立体顕微鏡下で適切な蛍光マーカー( 例えば 、EGFP)で遺伝子型を木製スティックまたは鈍い鉗子で放浪している第3齢の幼虫を収集し、PBS(リン酸緩衝食塩水)を含む解剖皿に入れる。
- 2mLのプラスチックトランスファーピペットでピペッティングすることにより、PBS中の幼虫を洗浄する。
- 1つの鉗子で幼虫の中心をピンチし、他の鉗子で半分に体を裂く。
- 1つの鉗子で前半の口のフックを挟み、他の鉗子で体に向かって口を押して、体を裏返しにします。
- 唾液腺や脂肪体など不要な物質を鉗子で取り除きます。
3.固定および抗体染色
- 幼虫体の解剖学的前半部(imaginal wing discsを含む)を1.5mLプラスチックチューブに移し、穏やかに回転させながら暗所で室温で10分間Fix溶液(PBS中4%ホルムアルデヒド)1mLを固定する。
注意:ホルムアルデヒドは有毒で発癌性があります。皮膚に接触しないよう保護手袋と衣類を着用する。
注意:この部分では、特に明記されていない限り、すべてのステップは暗所で室温でナッターで行われます。 - Fixソリューションを削除して破棄します。組織を1mLのPBT(0.3%TritPBS中のX-100)上で3回、各15分間。
- PBTを除去し、ブロッキングのためにPBTG(0.2%ウシ血清アルブミンおよび5%正常ヤギ血清)1mLを添加し、室温で1時間または4℃で一晩インキュベートする。
- PBTGを除去し、PBTG( 材料表を参照)で適切に希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートする。
- 一次抗体溶液を除去し、1mLのPBTで組織を3回、それぞれ15分間洗浄する。
- PBTを除去し、PBTG(1:400)で適切に希釈した二次抗体溶液を加える。室温で2時間、または4℃で一晩、ナットする。
- 二次抗体溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。
- F-アクチンを染色するために、PBTを除去し、PBS(1:40)で適切に希釈したPhalloidin溶液を加える。次に20分間寝かせる。ファロイジン溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。
- 核DNAを対比染色するために、PBTを除去し、DAPI(4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)溶液(PBS中0.5μg/ mLのDAPI)を加える。その後、10分間ナットする。
注意:DAPIは発癌性があります。皮膚に接触しないよう保護手袋と衣類を着用する。 - DAPI溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。
- 室温で10分間、1mLのPBSで1回すすいでください。
- PBSを除去し、プレマウント培地として500μLの100%グリセロールを添加する。
4.顕微鏡スライドへの取り付け
- 2mLのプラスチックトランスファーピペットを用いて顕微鏡スライド上に染色した組織を置く。
- 鉗子で別の顕微鏡スライド上のマウント媒体の滴に組織を転送します。
- 1つの鉗子で解剖組織の終わりを押さえ、脳と目の触角円板を他の鉗子で引き離します。
注:脳を翼の想像上のディスクの近くに置くように切開したままにしておきます。頭脳は、カバーガラスが羽の想像上のディスクを粉砕するのを防ぐプラットフォームとして機能する。 - 翼の想像上のディスクを隔離するには、解剖された組織の端を1つの鉗子で押さえ、体の壁を静かに引っ掻き、他の鉗子で椎間板を引き裂く。
注:羽の想像上のディスクを見つけることが困難な場合は、後部から前側に気管を剥がします。ウィングの想像上の円板は気管にくっついている。 - 穏やかにカバーガラスでイーガルディスクを覆い、マニキュアでシールします。 4℃で保存する。
5.共焦点顕微鏡法
- 発光波長の範囲、レーザ強度、ゲイン、オフセット、走査速度と画像サイズ24を含む共焦点顕微鏡設定された画像取得パラメータを用いた共焦点画像を取得します。
注:画像取得設定の詳細な手順については、各顕微鏡メーカーが提供する取扱説明書を参照してください。 - 単一の共同をキャプチャするにはウイングイメージディスク全体の非焦点部分には、20倍の対物レンズを使用します。
- 40倍または60倍のレンズを使用して、0.5〜1.0μmのステップサイズでzスタックスキャンによって3次元画像を取得します。
注:細胞の表現型を高解像度で解析するには、画像サイズが512 x 512ピクセルより大きくなければなりません。
6. ImageJを用いた画像解析
- 共焦点zスタック画像を取得し、分析するために、フィジー、生体画像分析(https://fiji.sc/)25に集中オープンソースのImageJソフトウェアを使用します。
- 垂直セクションを取得するには、ImageJでzスタックイメージを開き、メニューアイテム "Image / Stacks / Reslice"を選択します。
注:XZ軸またはYZ軸のいずれかは、[再分割]メニューで選択できます。垂直断面は、zスタック画像上に直線または矩形を描くことによって任意の方向に得ることもできる。
7.新生物表現型の診断
- 垂直を開く1組のz-スタック画像から得られた切片(XZまたはYZ軸)を分析し、形態学的表現型および抗体染色を分析する。
- (1)ノックダウンクローンを含む細胞塊が主上皮層から逸脱する場合、(2)接合細胞タンパク質の細胞内局在がこの細胞塊で変化した場合、腫瘍表現型の診断のために、 、および(3)この細胞塊の直径が4細胞より大きい場合。
- 図1に示すフローチャートに従って、腫瘍表現型を分類する。
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Representative Results
ショウジョウバエのウイング上の椎間板におけるRNAi媒介性のnTSGノックダウンによって実験的に誘導された腫瘍形成を実証するために、3種の異なるGAL4ドライバを用いてlglまたはscribに対するUAS-RNAiを発現さ せた :(1) sd-GAL4ウィングポーチ、およびヒンジ領域における軽度の発現( 図2および図3A )。 (2)背側内側襞の2つのドメインにおける強い発現、1つの前外側ドメインにおける軽度の発現、および腹側 - 後方ドメインにおける弱い発現を含む、ヒンジのサブドメインを駆動するupd-GAL4 ( 図2および図3C )。 (3)UAS遺伝子を発現するランダムモザイククローンを生成する熱ショック誘発フリップアウトGAL4( 図4およびFi図5参照)。全ての実験において、 UAS-EGFPを、 UAS-RNAiと同時発現させて、ノックダウンクローンを標識した。
第1に、 sd-GAL4駆動のlgl-RNAiを用いて、翼のポーチおよびヒンジ領域におけるlglのノックダウンを誘導した。 UAS-lgl-RNAiを含まない対照第3翼のディスクでは、形態学的変化は起こらなかった( 図3A )。対照的に、 lgl-RNAiを発現する第3齢の羽板では、ヒンジの特定の部分で上皮の変形および腫瘍原性の過増殖が明瞭に観察された( 図3B )。しかし、翼のポーチ領域では、異形成の過増殖は観察されなかった。腫瘍性ヒンジ病変では強いMMP1(マトリックスメタロプロテアーゼ-1)の発現が観察されたが、ウィングパウチ領域では発現されなかった( 図3B )。 MMP1の発現は、基底膜の分解に関与しているのでこれらのヒンジ腫瘍は転移能を有する可能性がある( 図3B )。次に、 upd-GAL4を用いて、ヒンジ領域におけるlglノックダウンを誘導した。 UAS-lgl-RNAiを含まない対照第3翼のディスクでは、形態学的変化は起こらなかった( 図3C )。しかし、AEDの5日後、 upd-GAL4およびlgl-RNAiを有する第3齢の羽板は、F-アクチンの蓄積および上皮層からのクローンの置換( 図3D )を伴って顕著な上皮の解体を示した。 6日間のAEDでは、MMP1を発現する腫瘍性腫瘍はヒンジ領域で肥大している( 図3G )が、サンプル間の腫瘍サイズの変化はあるものの( 図3E およびF )。ヒンジ領域の垂直断面は、新生物腫瘍が上皮層の頂端側で逸脱した増殖を受けたことを確認した( lglノックダウンによって誘導された腫瘍増殖の進行をモニターするために、 ll-RNAiを発現する散発性クローンを、熱ショック誘発フリップアウトGAL4モザイク系を用いてウィングディスク中に生成した。第2齢幼虫(2日AED)への熱ショックの2日後、ヒンジ領域に位置するいくつかのlglノックダウンクローンは、上皮層の頂端側から逸脱を示した( 図4A )。熱ショック誘導の4日後、ヒンジ領域の形成異常病変が明瞭になり、 lglノックダウンクローンが根尖側から離れて変位して管腔内に増殖することが示唆された( 図4B )。熱ショック誘導の7日後、腫瘍原性の過増殖がヒンジ領域を支配した( 図4C )。 デモを行うには本発明者らの診断法によるクローン表現型の分類、熱ショック誘発フリップアウトGAL4モザイクシステムを使用して、翼ディスクにscrib-RNAiを発現する散発性クローンを生成した。第2齢幼虫(2日AED)への熱ショックの5日後、特定のGFP発現スクリーニングノックダウンクローンは、腫瘍原性表現型を示した( 図5A )。我々は、2D共焦点画像において詳細な細胞学的および構造的表現型を得ることが困難であるため、ImageJを用いてzスタック共焦点画像の垂直断面において4つのクローン( 図5Aの B、C、DおよびE)を分析した( 図4および図5A )。クローンBおよびCは、septate-junction protein disc(Dlg)がmislocalized( 図5BおよびC )のように異形成として分類されました。クローンBでは、上皮からずらされた細胞塊のサイズは、直径の4細胞以下であったr( 図5B )、クローンCは上皮から逸脱しなかった( 図5C )。したがって、クローンBおよびクローンCは新生物とはみなされなかった。しかし、Dlgの位置が誤って示されたクローンDおよびEは、上皮の外側で腫瘍細胞塊を形成した( 図5D および5E )。これらの置換された腫瘍性クローンのサイズは直径が4細胞を超えるので、クローンは新生物として分類された。 翅の椎間板に過形成腫瘍または嚢胞形成を誘発するために、 ヒツジ経路の転写共活性化因子であるヨウ素原病原体Ras( Ras V12 )または構成的に活性な形態を発現する散発性クローン( Yki 3SA )を、フリップアウトGAL4モザイクシステム。第2齢幼虫(2日間AED)に対する熱ショックの4日後、 RaGFPによって標識されたV12発現クローンは、原始椎間板の丸い細胞塊になった( 図6A )。 Ras V12発現クローン( 図6AのクローンB)の垂直切片は、上皮層から解離した細胞塊がDlgの適切な局在を有し、細胞塊が上皮層の外側の正常な上皮構造を維持することを示唆した( 図6B ) 。 MMP1の発現は、これらのRas V12発現クローンでは観察されなかった( 図6C )。したがって、クローンBは嚢胞形成として分類された。第2齢幼虫(2日AED)への熱ショックの4日後、GFPによって標識されたYki 3SA発現クローンは、 虚血性椎間板に大きな細胞塊を形成した( 図7A )。我々は2つのクローンに焦点を当てた( 図7Aの BおよびC)。クローンBが示したYki 3SA発現クローンBが上皮構造を維持していたことを示唆している。従って、クローンBは過形成と分類された( 図7B )。ヒンジ領域に位置するクローンCは、Dlgの局在化を示し、上皮層の基底側に多層構造を形成した。 MMP1式はYki 3SA発現性のクローンでは観察されませんでした。まとめると、クローンCは良性新生物として分類された( 図7CおよびD )。 5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/>
図1:腫瘍表現型の分類のためのフローチャート。このフローチャートは、想像上皮におけるクローン病変を分類するための診断方法を表す。クラシファイド(1)上皮層からのクローンの逸脱、(2)接合タンパク質の細胞内の誤った局在、(3)細胞増殖、(4)クローンサイズおよび(5)MMP1発現の5つの基準に基づく。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2: ( A )Dlg(緑)と核(DAPI、マゼンタ)で染色された野生型ウィングのimaginal disc。 ( B )ウイングポーチ(青色)、ヒンジ(オレンジ色)、およびノルム(緑色)領域を示すショウジョウバエの翅の想像上の円板の模式的表現。 ( C )F-アクチン(赤色)および微小管(緑色)について染色された正常な翅の想像上のディスク。基底膜は、コラーゲンIV / Vkg-GFP(青色)で標識される。 ( D )サイトの垂直断面( C )に白い点線で示す。 ( E )線画は、( D )の上皮層の頂端(赤)および基底(青)側をトレースする。点線は、周辺膜をトレースする。背側蝶番の遠位(Df)、内側(Mf)および近位(Pf)の折り目が示されている。
詳細な遺伝子型: A、 w - CD、 Vkg-GFP この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3:エンハンサー-GAL4によって誘導される部位特異的腫瘍形成。 ( A 、 B )共焦点画像は、MMP1(赤色)について染色された示された遺伝子型の第3齢幼虫から解剖された羽状の想像上の椎間板を示す。 sd-GAL4- expressing領域をGFP発現(緑色)で標識した。 ( CG )共焦点画像は、指定された時点AEDで示された遺伝子型の第3齢幼虫から解剖された翅の椎間板を示す。 F-アクチンはファロイジン(赤色)で( CF )で染色された。 MMP1発現は、( G )において抗MMP1抗体(赤色)で染色される。 upd-GAL4-発現領域をGFP発現(緑色)で標識した。 ( CF )の下のパネルは、上のパネルに示された領域の拡大図を示す。白い矢印は、 lglノックダウンクローンによって誘発された形成異常病変を示す。 ( H )(E)の下部パネルに白い点線で示した部位の垂直断面。白い点線は、(A)と(B)のウィングパウチとヒンジ領域の境界を示しています。核をDAPI(青色)で標識した。スケールバー=(AG)で100μm、(H)で50μm。詳細な遺伝子型: A、 w - 、sd - GAL4、UAS - EGFP; UAS-dicer2; B、 w - 、sd-GAL4、UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi; C、 w - 、upd-GAL4、UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH、 w - 、upd-GAL4、UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:ランダムモザイククローンによって誘導される腫瘍表現型。 ( AC )共焦点画像は、熱ショック誘発後の指示された時点でlgl-RNAiおよびGFP(緑色)を共発現するクローンを有する第3齢幼虫のモザイクウィングの想像上のディスクを示す。核はDAPI(青色)で標識した。中央のパネルは、左側のパネルにマークされた白い正方形の領域の拡大図を示す。右のパネル上皮層(青色)およびGFP発現クローン(緑色)の頂端側の概略線図を示す。上皮内に位置するモザイククローンは薄緑色で描写され、上皮から逸脱する腫瘍性腫瘍はマゼンタで示される。左のパネルの白い点線は、ウィングポーチとヒンジ領域の境界を示しています。中央のパネルの白い矢印は、 lglノックダウンクローンによって誘発された異形成病変を示す。スケールバー=100μm。詳細な遺伝子型: AC、 hsFLP; UAS-dicer2; UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (熱ショック30分、2日間AED、25℃で2日間インキュベート、25℃で4日間インキュベート、Bで7日間インキュベート)ヒートショック後のCは25℃)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5:異形成クローン表現型の診断検査。 ( A )左側のパネルは、熱ショック誘導の5日後にscrib-RNAiとGFP(緑色)を共発現するクローンがDlg(赤色)で染色された、3齢幼虫のモザイクウィングの想像上の円板を示す。右のパネルは、上皮層(青色)およびGFP発現クローン(緑色)の頂端側の概略線図を示す。上皮層中のモザイククローンは薄緑色で示され、上皮から取り除かれた腫瘍性腫瘍はマゼンタで示されている。 ( BE )共焦点画像は、(A)の右側パネルに示されているスクリーニングノックダウンクローンの垂直切片を示す。左から2番目のパネルは、Dlgの局在パターン(赤色)を示しています。左から3番目のパネルは、上皮層の頂端(赤色)および基底(青色)辺の概略線図を示し、GFP-exprエッセイスクライブ - ノックダウンクローン(緑)。上皮層中の異形成クローンは薄緑色(BおよびC)で示され、上皮から置換された腫瘍性クローンはマゼンタ(DおよびE)で示される。白い矢印は腫瘍形成表現型を示すスクリーブ - ノックダウンクローンを示す。核をDAPI(青色)で標識した。スケールバー=50μm。各クローンの腫瘍表現型を図1に示すフローチャートに従って分類した。詳細な遺伝子型: AE、 hsFLP; UAS-scrib-RNAi; CD2> GAL4、UAS-EGFP (熱ショック30分、2日間AED、熱ショック後25℃で4日間インキュベート)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6:診断Ras V12発現クローン表現型の検討。 ( A )左のパネルは、Dlg(赤色)で染色された熱ショック誘導の4日後に発癌性Ras V12およびGFP(緑色)を共発現するクローンを有する第3齢幼虫のモザイクウィングの想像上の円板を示す。右のパネルは、上皮層(青色)およびGFP発現クローン(緑色)の頂端側の概略線図を示す。スケールバーは50μmを表します。 ( B )(A)の右パネルに示されているRas V12発現クローンの垂直切片。左から2番目のパネルは、Dlgの局在パターン(赤色)を示しています。左から3番目のパネルは、上皮層の頂端(赤色)および基底(青色)側部およびRas V12およびGFP発現クローン(緑色)の概略線図を示す。スケールバー=25μm。 ( C )モザイクウィング第3齢幼虫の想像上のディスクを共発現するクローン<em> Ras V12およびGFP(緑色)を、熱ショック誘導の4日後に、MMP1(赤色)について染色した。スケールバー=100μm。詳細な遺伝子型: AC、 hsFLP; UAS-Ras V12 ; CD2> GAL4、UAS-EGFP (2日間AEDで45分間熱ショックし、熱ショック後25℃で4日間インキュベート)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図7: Yki 3SAを発現するクローン表現型の診断試験。 ( A )左パネルは、熱ショック誘導の4日後に構成的に活性なYki 3SAおよびGFP(緑色)を共発現するクローンがDlg(赤色)で染色された、3齢幼虫のモザイクウィングの想像上の円板を示す。右のパネルは上皮層(青色)およびGFP発現クローン(緑色)の頂端側の化学線図。スケールバー=50μm。 ( BC ) Yki 3SAを発現するクローンの垂直切片は、(A)の右側パネルに示されている。左から2番目のパネルは、Dlgの局在パターン(赤色)を示しています。左から3番目のパネルは、上皮層の頂端(赤色)および基底(青色)側部およびYkiおよびGFP発現クローン(緑色)の概略線図を示す。スケールバー=25μm。 (D)クローンは4日間MMP1(赤)について染色した熱ショック誘導後Yki 3SAおよびGFP(緑色)の共発現との3齢幼虫のモザイク翼成虫ディスク。スケールバー=100μm。詳細な遺伝子型: AD、 hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4、UAS-EGFP (熱ショック30分、2日間AED、25℃で4日間インキュベート)。5901fig7large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
GAL4-UASシステムは、 ショウジョウバエ 26の標的遺伝子発現のための最も強力な遺伝子ツールの1つであり、in vivoで腫瘍細胞の誘導と解析を大いに容易にします4 。このシステムは、野生型上皮組織内の腫瘍抑制遺伝子のノックダウンまたは癌遺伝子の過剰発現を有するクローンの生成を可能にする。これは、形質転換された前腫瘍細胞が正常上皮細胞に取り囲まれているヒト癌の初期段階と非常に類似した状況である。 GAL4エンハンサー - トラップ系統またはJanelia GAL4系統27のようなエンハンサー配列によって調節されるGAL4ドライバー系統は、独自の空間的に制限された発現パターンを有する。従って、これらのエンハンサー-GAL4系統は、限定された想像上の椎間板において一貫して腫瘍を誘導するために有用である。この研究で示されたsd-GAL4およびupd-GAL4に加えて、本発明者らは、 lglノックダウンがbY他のエンハンサートラップGAL4のエングレイルド-GAL4(JA-GAL4)を含む行、 ヘッジホッグ-GAL4(HH-GAL4)、 視運動盲-GAL4(OMB-GAL4)、 パッチさ-GAL4(PTC-GAL4)とSpaltの-major- GAL4 ( Salm-GAL4 )は、翅の椎間板のヒンジ領域に腫瘍性腫瘍を発生させることができる。エンハンサー-GAL4発現パターンを時間的に制御する必要がある場合、GAL4と温度感受性バージョンのGAL80(GAL80 ts )との組み合わせが選択肢となる。 GAL80 tsは、18℃ではGAL4機能を抑制するが、29℃では抑制しないため、必要に応じてUASトランスジーン発現をオンまたはオフに切り替えることができる28 。
FLP-FRTシステムとGAL4-UASシステム3を組み合わせたフリップアウトGAL4モザイクシステムは、想像上のディスクにランダムなクローンを生成します。熱ショック誘導性フリッパーゼ(hsFLP)とフリップアウトGAL4とを組み合わせることにより、クローンの生殖時期イオンは制御可能である。成虫ディスク細胞の腫瘍形成能の発達段階、内因性シグナル伝達事象、および/または細胞分化29、30に依存することができるので、腫瘍形成性表現型に改変された熱ショックタイミングの効果を検討することは非常に重要です。
以前に、野生型細胞10、11、12、18に囲まれたときnTSG変異クローンが癌の発生の間の細胞の形質転換のために必要とされる複数の突然変異を示唆し、細胞競争依存性アポトーシスを受けることが示されています。実際には、発癌性RASまたはYki LGLまたは変異体クローンのScribの過剰発現は、MISに対し31、攻撃的な腫瘍10、18に変換しRas V12またはYki 3SAの発現は、nTSG突然変異なしに悪性新生物をそれ自身で誘導しない。ここでは、以前に16示すように、野生型の翼ディスクに生成されたプロ腫瘍nTSGノックダウンクローンはまた、アポトーシスを起こすと翼ポーチ16で腫瘍形成を示しません。同時に、ヒンジ「ホットスポット」に位置するnTSGノックダウンクローンは、さらなる発癌性突然変異なしに腫瘍性腫瘍に発展する。ヒンジ領域では、nTSG欠損細胞が、内因性ヤヌスキナーゼ/シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子(JAK / STAT)のシグナル伝達をハイジャックして腫瘍形成を促進する16 。したがって、 upd-GAL4のようなヒンジ特異的GAL4は、腫瘍抑制遺伝子のRNAi媒介性ノックダウンによって新生物腫瘍形成を一貫して誘導するための有用なツールである。フリップアウト-GAL4誘導性のnTSG-ノックダウンモザイククローンもまた、ヒンジを用いて腫瘍性腫瘍を誘導するが腫瘍形成は初期クローンサイズに依存する:20分を超える熱ショックによって生成される大きなクローンは通常腫瘍形成を誘導するが、10分未満の熱ショックによって生成されるほとんどの小さなクローンは完全に除去される(KMおよびYT、未発表データ)。
腫瘍の発生および癌の進行に関する最近の研究の数は、モデル系32、33としてショウジョウバエ成虫を使用しています。これらの研究に共通して、逸脱性細胞塊、変形した椎間板の形状、F-アクチンの蓄積、細胞周期の強化(BrdU / EdU取り込みまたはPH3発現)、JNKシグナル伝達およびその下流標的MMP1の基底膜(Crumbs、Stardust、PatJ、aPKC、Bazooka / PAR-3またはPAR-6)、敗血症性接合部に関連するタンパク質の喪失または細胞内非局在化を含む、(Lgl、Scrib、DlgまたはCoracle)、または付着接合部(E-CadherinまたはArmadillo)を含む。これらの表現型は、従来の抗体染色によって容易に検出可能である。腫瘍形成の初期段階でクローン表現型が過形成、異形成、良性新生物または悪性新生物であるかどうかを決定することは困難であるが、単一の上皮単層からなるショウジョウバエの椎間板上皮においてより簡単であるはずである。本研究では、上皮単層に誘導された腫瘍性クローン表現型を分類するための診断法を導入した( 図1 )。この方法では、zスタック共焦点画像を使用して5つの基準を注意深く観察する必要があります。各診断基準は、従来の抗体染色および共焦点撮像によって調べることができる。この方法で導入した新しい基準の1つは、想像上のディスクにおける異形成と新生物とを区別する「4細胞直径基準」である。 nTSG突然変異体クローンのような前腫瘍細胞は頻繁にLY細胞競合または主軸方位差15、16、34を介して上皮層から押し出さ。ほとんどの状況で、これらの押し出された細胞はアポトーシスを起こすため、増殖することはできません。プロ腫瘍細胞は、押し出し中に1回、押し出し後に1〜2回細胞分裂を起こす可能性があるが、これは2〜3細胞直径の細胞塊を作る。したがって、上皮層から逸脱した前腫瘍細胞の細胞塊が4細胞の直径よりも大きい場合、それらが生存し、上皮層の外側の新生物として増殖していると判定することができる。
この診断方法は単純ですが、腫瘍の発達や悪性腫瘍が進行するにつれて、表現型の時間経過を取ることが重要です。例えば、異形成は、細胞学的に異常な組織であり、完全に良性の増殖とそれ以前のものとの間の移行状態である悪性したがって、たとえ観察されたクローンがフローチャート( 図1 )に従って異形成として定義されたとしても、異形成はその後新生物に発展する可能性がある。 ( - 25°C又は4で6日間- 5 29°C AEDで5日間)幼虫段階が時間的に制限されているが、成虫における腫瘍成長は、pupariation 35のインスリン様ペプチド誘起遅延を通して幼虫期を延長します36 。したがって、原発性の椎間板における新腫瘍形成は、腫瘍クローンの表現型の進行をさらに数日間観察することを可能にする。私たちの簡単な分類法は、 ショウジョウバエの様々な器官における腫瘍表現型のクローン分析に広く適用可能であろう。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
私たちは、原稿の批判的読解に対するJ.ヴォーゲンに感謝します。この研究は、日本学術振興会グラント番号26891025,15H01500およびYTへの武田科学財団研究助成金
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
normal goat serum | Sigma | G6767 | |
mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly strains | |||
sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
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