Summary
Mosaisk klonanalyse i Drosophila imaginal disc epithelia er et kraftig modellsystem for å studere de genetiske og cellulære mekanismene til tumorigenese. Her beskriver vi en protokoll for å indusere svulster i Drosophila- vinge-imaginale plater som bruker GAL4-UAS-systemet, og introdusere en diagnosemetode for å klassifisere tumorfenotyper.
Abstract
I de tidlige stadier av kreft viser transformerte mutantceller cytologiske abnormiteter, begynner ukontrollert overvekst og gradvis forstyrrer vevsorganisasjon. Drosophila melanogaster har dukket opp som et populært eksperimentelt modellsystem i kreftbiologi for å studere de genetiske og cellulære mekanismene til tumorigenese. Spesielt gjør genetiske verktøy for Drosophila imaginale plater (utvikler epithelia i larver) opprettelsen av transformerte pro-tumorceller i et normalt epitelvev, en situasjon som ligner på de første stadier av menneskelig kreft. En nylig studie av tumorigenese i Drosophila- vinge-imaginale plater viste imidlertid at svulstinitiasjon avhenger av vevsintrinsisk cytoarkitektur og lokal mikromiljø, noe som tyder på at det er viktig å vurdere regionsspesifikk følsomhet for tumorigeniske stimuli ved evaluering av tumorfenotyper i imaginal plater. For å lette fenotypisk analyse av tumorprogresiPå imaginal plater, her beskriver vi en protokoll for genetiske eksperimenter som bruker GAL4-UAS-systemet for å indusere neoplastiske svulster i vinge-imaginale plater. Vi presenterer videre en diagnosemetode for å klassifisere fenotyper av klonale lesjoner indusert i imaginal epithelia, da en klar klassifiseringsmetode for å diskriminere ulike stadier av svulstprogresjon (for eksempel hyperplasi, dysplasi eller neoplasi) ikke hadde blitt beskrevet tidligere. Disse metodene kan være bredt anvendbare for klonanalysen av tumorfenotyper i forskjellige organer i Drosophila .
Introduction
Epiteliale vev er høyt organiserte systemer som har den bemerkelsesverdige homeostatiske evnen til å opprettholde sin organisasjon gjennom utvikling og celleomsetning. Dette robuste selvorganiserende systemet blir imidlertid gradvis forstyrret under tumorutvikling. Ved begynnelsen av tumorutvikling, oppstår individuelle mutantceller som oppstår ved onkogenaktivering eller tumor-suppressor-geninaktivering i et epitelskjema. Når denne transformerte "pro-tumorcellen" unngår et undertrykkende miljø, forstyrrer epithelial organisasjon, og begynner ukontrollert proliferasjon, forekommer tumorigenese 1 . De siste teknologiske fremskritt innen genetikk og molekylærbiologi har de siste tiårene gjort bemerkelsesverdige fremskritt på kreftforskning. Spesielt har nyere studier ved hjelp av genetisk mosaikkanalyseværktøy i Drosophila melanogaster , som FLP-FRT (flippase rekombinase / flippase rekombinase target) mitotisk recombinAtion 2 og flip-out-GAL4-UAS (oppstrøms aktiverende sekvens) systemer 3 har i stor grad bidratt til bedre forståelse av de genetiske mekanismene som er involvert i dannelsen og metastasen av tumorer 4 , 5 , 6 .
Studier av en gruppe konserverte Drosophila- svulster-suppressor-gener, dødelige gigantiske larver ( lgl ), plater store ( dlg ) og scribble ( scrib ), fremhevet det kritiske forholdet mellom tap av epitelorganisering og tumorutvikling, da disse gener spiller sentrale roller I regulering av apikal-basalcellepolaritet og celleproliferasjon i epitelvev 7 . Mens Drosophila- imaginale plater vanligvis er monolagert epitel, vil homozygote mutasjoner i noen av disse tre genene føre til at celler mister struktur og polaritet, mislykkes i å diffeLeie, overproliferere og til slutt danne flerlags amorfe masser som smelter sammen med tilstøtende vev 7 . På samme måte er forstyrrelse av disse gener i pattedyr involvert i utviklingen av ondartede svulster 8 , 9 . De neoplastiske fenotyper utstilt av mutantvevet har ført til klassifisering av disse tre gener som konserverte neoplastiske svulster-suppressorgener (nTSG'er) 7 , 8 . Når homozygote nTSG-mutantceller sporadisk genereres ved utvikling av vildtype-imaginale plater med bruk av FLP-FRT-mediert mitotisk rekombinasjon, blir mutantceller eliminert fra vevet gjennom c-Jun N-terminale kinase (JNK) -avhengig apoptose 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , ekstrudering 15 , 16 eller engulfment og fagocytose av naboer 17 . I denne genetisk mosaikkepitel er apoptose for det meste detektert i nTSG-mutante celler lokalisert ved klongrensen, noe som antyder at tilstøtende normale celler utløser apoptosen av nTSG-mutantceller 10 , 11 , 12 , 18 . Nylige studier i pattedyrceller har bekreftet at denne cellekonkurranseavhengige eliminering av pro-tumorceller er et evolusjonært konservert epitelisk selvforsvarsmekanisme mot kreft 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
En nylig studie i Drosophila imaginale plater viste imidlertid at mosaikk nTSG-knockdown kloner induserer neoplastiske svulster i spesifikkIc regioner av vinge imaginal plater 16 . Initial tumorformasjon ble alltid funnet i det perifere "hengsel" -området og aldri observert i den sentrale "pose" -regionen på vingeskiveepitelet, noe som tyder på at det tumoregeneriske potensialet for nTSG-knockdown-celler avhenger av lokalt miljø. Den sentrale pose regionen fungerer som en "tumor coldspot" hvor pro-tumor celler ikke viser dysplastisk overvekst, mens den perifere hengsel regionen oppfører seg som en "tumor hotspot" 16 . I "coldspot" -poseregioner delaminerer nTSG-knockdown-celler fra basalsiden og gjennomgår apoptose. I motsetning til at "hotspot" hengselceller har et nettverk av robuste cytoskeletale strukturer på deres basale sider, delaminerer nTSG-knockdown-celler fra apitelens epikale side og initierer tumorigenisk overvekst 16 . Derfor krever analyse av tumorfenotyper i imaginale plater nøye konsistensAvledning av den regionspesifikke følsomheten for tumorigeniske stimuli.
Her beskriver vi en protokoll for å indusere neoplastisk svulstdannelse i Drosophila- vinge-imaginale plater som benytter GAL4-UAS- RNAi- systemet ved hjelp av hvilke nTSG-knockdown-celler genereres i normal vingeskive epithelia. Selv om disse eksperimentelle systemene er nyttige for å studere de tidlige stadier av kreft, er det ikke klart beskrevet en klar klassifiseringsmetode for å evaluere stadiene av svulstprogresjon i imaginal disc epithelia. Derfor foreslår vi også en diagnosemetode for å klassifisere pro-tumor-klonale fenotyper indusert i vingeskiveepitelene i tre kategorier: hyperplasi (akkumulering av et overdreven antall normalt fremkomne celler med økt proliferasjon), dysplasi (premalignert vev sammensatt av unormalt forekommende Celler) og neoplasi (godartet eller ondartet svulst sammensatt av celler som har et unormalt utseende og unormalt proliferasjonsmønster).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flykors og kloninduksjon
- Fjern alle fluene i hetteglasset 12 timer før du samler jomfru fluer.
- Anestesér fluene i hetteglasset ved å injisere CO 2 -gass og legg fluer på en CO 2- flytepute.
- Overfør 10 - 20 jomfruhunner og 10 hanner fra CO 2 flypute til et nytt hetteglass og inkuber i 1 dag ved 25 ° C.
- Overfør disse fluene til et nytt hetteglass og inkuber i 12 timer ved 25 ° C.
MERK: Kast det første hetteglasset da ufødte kvinner ikke legger nok egg i den første dagen. - For enhancer-GAL4-linjer fjerner du de voksne fluene og inkuberer hetteglasset ved 25 ° C til disseksjon.
- For induksjon av mosaikk kloner ved utløp-GAL4, fjern de voksne fluene og inkuber hetteglasset i 2 - 4 dager ved 25 ° C. Inkubasjonstiden før varmesjokk er avhengig av eksperimentelt formål. Et varmeskudd 2 dager etter eggavsetning (AED) genererer mosaikk kloner i umoden sekundInstar imaginal epithelia. Et varslingsstøt etter 3 eller 4 dager AED genererer mosaikk kloner i differensiert tidlig til midten av tredje instar imaginal epithelia.
MERK: Det er viktig å undersøke effekten av endret varmestokk-timing på tumoregeneriske fenotyper. - For induksjon av mosaikk kloner ved utløp-GAL4, varme støt hetteglasset ved nedsenkning i et 37 ° C vannbad i 10 - 45 minutter etterfulgt av inkubering i 2 - 3 dager ved 25 ° C.
MERK: Informasjon om varmekjokk tid, timing og inkubasjonstid i hvert eksperiment er vist i figurlegenden.
2. Disseksjon av larver
- Samle vandrende tredjedel-larver med en trepinne eller stumpe tang, genotype dem ved hjelp av passende fluorescerende markører ( f.eks . EGFP) under et fluorescens stereoskopisk mikroskop og plasser dem i en disseksjonsfat med PBS (fosfatbuffet saltvann).
- Vask larver i PBS ved pipettering med 2 ml plastoverføringspipetter.
- Klem midten av larven med en tang og rive kroppen i halvparten med de andre tangene.
- Klem morkroken på den fremre halvdelen med en tang og trykk munnen mot kroppen med de andre tangene for å snu kroppen innvendig ut.
- Fjern unødvendige materialer som spyttkjertler eller fettlegemer med tau.
3. Fiksering og antistofffarging
- Overfør den dissekerte fremre halvdelen av larvallegemet (inkludert imaginale vingeskiver) til en 1,5 ml plastrør og fest i 1 ml Fix-løsning (4% Formaldehyd i PBS) i 10 minutter ved romtemperatur i mørket med forsiktig rotasjon.
FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig og har kreftfremkallende potensial. Bruk vernehansker og klær for å unngå hudkontakt.
MERK: I denne delen finner alle trinnene sted på en nøtterom ved romtemperatur i mørket, med mindre annet er nevnt. - Fjern Fix-løsningen og kast bort. Vask vevet med 1 ml PBT (0,3% TritPå X-100 i PBS) tre ganger i 15 minutter hver.
- Fjern PBT og tilsett 1 ml PBTG (0,2% bovint serumalbumin og 5% normalt geatserum i PBT) for blokkering og nutat 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Fjern PBTG og tilsett primær antistoffoppløsning passende fortynnet med PBTG (se Materialetabell ) og nutat over natten ved 4 ° C.
- Fjern den primære antistoffoppløsningen og vask vevet med 1 ml PBT tre ganger i 15 minutter hver.
- Fjern PBT og tilsett sekundær antistoffoppløsning hensiktsmessig fortynnet med PBTG (1: 400). Brukes i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Fjern sekundær antistoffløsning og vask vevet med 1 ml PBT to ganger i 15 minutter hver.
- For å flekke F-aktin, fjern PBT og tilsett Phalloidin-oppløsning hensiktsmessig fortynnet i PBS (1:40). Deretter nyter i 20 min. Fjern Phalloidin-oppløsningen og vask vevet med 1 ml PBT to ganger i 15 minutter hver.
- For å motvirke nukleær DNA, fjern PBT og tilsett DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) oppløsning (0,5 μg / ml DAPI i PBS). Deretter nyter 10 min.
FORSIKTIG: DAPI har kreftfremkallende potensial. Bruk vernehansker og klær for å unngå hudkontakt. - Fjern DAPI-oppløsning og vask vevet med 1 ml PBT to ganger i 15 minutter hver.
- Skyll en gang i 1 ml PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Fjern PBS og tilsett 500 μL 100% glyserol som formonteringsmedium.
4. Montering på Microscope Slides
- Plasser de fargede vevene på et mikroskopflippe ved hjelp av en 2 ml plastoverføringspipette.
- Overfør vevet til dråper med monteringsmedium på et annet mikroskopdia med tau.
- Hold enden av dissekert vev ned med en tang og trekk hjernen og øyetantennediskene med de andre tangene.
MERK: Hold de dissekerte hjernene for å plassere dem i nærheten av vinge-imaginale plater. Hjernen fungerer som en plattform som hindrer dekselet fra å knuse vingens imaginale plater. - For å isolere vingen, legger imaginale plater enden av dissekert vev med en tang og forsiktig skraper kroppsveggen og slipper av platen med de andre tangene.
MERK: Hvis det er vanskelig å finne vinge-imaginale plater, skyll luftrøret fra den bakre til den fremre siden. Wing-imaginale plater holder seg til luftrøret. - Dekke forsiktig skinnene med et deksel og forsegle med neglelakk; Lagre ved 4 ° C.
5. Konfokal mikroskopi
- Å skaffe konfokale bilder ved hjelp av et konfokalmikroskopsett bildeoppkjøpsparametere, inkludert rekkevidde av utslippsbølgelengde, laserintensitet, forsterkning, forskyvning, skannehastighet og bildestørrelse 24 .
MERK: For detaljerte prosedyrer for innkjøpsinnstillinger, se bruksanvisningen som leveres av hver mikroskopprodusent. - Å fange single coNfokale deler av en helvings imaginal plate, bruk en 20X objektivlinse.
- Oppnå tredimensjonale bilder ved z-stack-skanning i trinnstørrelse på 0,5 - 1,0 μm ved hjelp av 40X eller 60X-objektiver.
MERK: For å analysere cellulære fenotyper i høy oppløsning, bør en bildestørrelse være større enn 512 x 512 piksler.
6. Bildeanalyse ved hjelp av ImageJ
- Bruk Fiji, en åpen kildekode ImageJ-programvare fokusert på biologisk bildeanalyse (https://fiji.sc/) 25 , for å skaffe og analysere confocal z-stack-bilder.
- For å hente vertikale seksjoner, åpne z-stack-bildene i ImageJ og velg menypunktet "Image / Stacks / Reslice."
MERK: Enten XZ-aksen eller YZ-aksen kan velges i Reslice-menyen. Vertikal seksjon kan også oppnås i en vilkårlig retning ved å tegne en rett linje eller rektangel på z-stack-bildet.
7. Diagnose av neoplastiske fenotyper
- Åpne vertikalSeksjoner (XZ eller YZ-akse) oppnådd fra ett sett med z-stack-bilder og analysere morfologiske fenotyper og antistofffarging.
- For diagnostisering av tumorfenotyper, fokuserer de hovedsakelig på følgende tre punkter: (1) dersom en cellemasse, inkludert knockdown-kloner, avviker fra hovedepitellaget, (2) dersom subcellulær lokalisering av kryssproteiner blir endret i denne cellemasse , Og (3) hvis diameteren av denne cellemassen er større enn 4 celler.
- Kategoriser tumorfenotyper i henhold til flytskjemaet som er beskrevet i Figur 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere neoplastisk tumordannelse som ble eksperimentelt fremkalt av RNAi- mediert nTSG-knockdown i Drosophila- vinge-imaginale plater, ble tre forskjellige GAL4-drivere brukt til å uttrykke UAS-RNAi for lgl eller scrib : (1) sd-GAL4, som driver sterkt UAS-uttrykk i Vingepose og mildt uttrykk i hengselområdene ( figur 2 og figur 3A ); (2) upd-GAL4, som kjører i hengselens underdomener, inkludert sterkt uttrykk i to domener i dorsal medialfold, mildt uttrykk i ett anterior-lateralt domene og svakt uttrykk i det ventrale bakre domene ( figur 2 og figur 3C ); Og (3) varme-sjokk-indusert flip-out GAL4, som genererer tilfeldige mosaikk kloner som uttrykker UAS-gener ( Figur 4 og FiGure 5). I alle forsøkene ble UAS-EGFP co-uttrykt med UAS-RNAi for å markere knockdown-klonene.
Først ble sd-GAL4- driven lgl-RNAi brukt til å inducere knockdown av lgl i vingeposen og hengselområdene. I kontroll tredje instar vingeskiver uten UAS-lgl-RNAi oppstod ingen morfologisk endring ( Figur 3A ). I motsetning, i tredje instar vingeskiver som uttrykker lgl-RNAi , ble epiteldeformasjoner og tumoregeneriske overvekster klart observert i visse deler av hengselet ( Figur 3B ). I vingeposenområdet ble imidlertid ikke dysplastisk overvekst observert. Sterk MMP1 (matriksmetalloprotease-1) -uttrykk ble observert i svulsthengige lesjoner, men ikke i vingeposen-regionen ( figur 3B ). Siden MMP1-uttrykket er involvert i nedbrytning av kjellermembranenDet er mulig at disse hengselsvulstene har en metastatisk evne ( figur 3B ). Deretter ble oppdatering -GAL4 brukt til å indusere lgl knockdown i hengselområdet. I kontroll tredje instar vingeskiver uten UAS-lgl-RNAi oppstod ingen morfologiske endringer ( figur 3C ). Etter 5 dagers AED viste tredje instar - vingeskive med upd-GAL4 og lgl-RNAi fremtredende epithelial disorganisering, med F-actin akkumulering og klonforskyvning fra epitellaget ( Figur 3D ). På 6 dager AED overgikk neoplastiske svulster som uttrykte MMP1 i hengselområdet ( Figur 3G ), om enn med variasjon i tumorstørrelse mellom prøver ( Figur 3E og F ). En vertikal del av hengselområdet bekreftet at den neoplastiske svulsten gjennomgikk avvikende utvekst på apikalsiden av epitellaget ( For å overvåke progresjonen av tumorvekst indusert ved lgl- knockdown, ble sporadiske kloner som uttrykker lgl-RNAi , generert i vingeskiver ved hjelp av det varme-sjokk-induserte flipp-ut GAL4-mosaikksystemet. To dager etter varmeskjokk til andre instar larver (2 dager AED) viste noen lgl- knockdown kloner i hengselområdet avviket fra apikalsiden av epitellaget ( Figur 4A ). Fire dager etter varme-sjokk induksjon ble dysplastiske lesjoner i hengselområdet klar, noe som tyder på at lgl- knockdown kloner forskjøvet vekk fra apikalsiden proliferere i lumenet ( Figur 4B ). Sju dager etter varmekjokkinduksjon dominerte tumorigene overgrowths hengselregionene ( figur 4C ). Å demonstrereKlassifisering av klonale fenotyper med vår diagnosemetode, ble sporadiske kloner som uttrykker scrib-RNAi , generert i vingeskiver ved hjelp av det varme-sjokk-induserte utløp GAL4 mosaikksystemet. Fem dager etter varme-sjokk til andre instar larver (2 dager AED) viste visse GFP-uttrykkende scrib- knockdown kloner tumorigeniske fenotyper ( Figur 5A ). Vi analyserte fire kloner (B, C, D og E på figur 5A ) i vertikale seksjoner av z-stabile konfokale bilder ved hjelp av ImageJ, fordi det er vanskelig å anskaffe de detaljerte cytologiske og strukturelle fenotyper i 2D-konfokale bildene ( figur 4 og figur 5A ). Kloner B og C ble klassifisert som dysplasi som septat-junction protein-disker store (Dlg) ble mislokalisert ( figur 5B og C ). I klone B var størrelsen på cellemassen forskjøvet fra epitelet ikke større enn 4-celler i diameterR ( figur 5B ), mens klon C ikke avvike fra epitelet ( figur 5C ); Derfor ble kloner B og C ikke ansett som neoplastiske. Klonene D og E, som også viste mislokalisering av Dlg, dannet imidlertid tumorøse cellemasser utenfor epitelet ( Figur 5D Og 5E ). Da størrelsen på disse fordrevne svulstige klonene var mer enn 4 celler i diameter, ble klonene klassifisert som neoplastisk. For å indusere hyperplastiske tumorer eller cysteformasjoner i vinge-imaginale plater, ble sporadiske kloner som uttrykker onkogen Ras ( Ras V12 ) eller konstitutivt aktiv form av Yorkie, en transkripsjonskosaktivator av Hippo-banen, ( Yki 3SA ) generert ved hjelp av den varme-sjokk-induserte Flip-out GAL4 mosaikk system. Fire dager etter varmenesjokk til andre instar larver (2 dager AED), RaS V12- ekspressende kloner merket av GFP ble runde cellemasser i imaginal-platene ( figur 6A ). En vertikal del av Ras V12- ekspressjonsklonen (klon B i figur 6A ) viste at cellemassen dissosiert fra epitellaget har riktig lokalisering av Dlg, hvilket antyder at cellemassen opprettholder normale epitelstrukturer utenfor epitellaget ( figur 6B ) . MMP1-uttrykk ble ikke observert i disse Ras V12- ekspresserende klonene ( figur 6C ). Derfor ble klonen B klassifisert som cystdannelse. Fire dager etter varmenesjokk til andre instarlarver (2 dager AED) dannet Yki 3SA- ekspressende kloner som var merket av GFP store cellemasser i imaginalskivene ( figur 7A ). Vi fokuserte på to kloner (B og C i Figur 7A ). Klon B visteIntegrasjon i epithelialaget og riktig lokalisering av Dlg i de epitelceller subepikale membranene, hvilket tyder på at Yki 3SA- ekspressjonsklonen B opprettholdt epitelstrukturen. Derfor ble klon B klassifisert som hyperplasi ( figur 7B ). Klon C lokalisert i hengselområdet viste mislokalisering av Dlg og dannet flerskiktsstruktur ved den basale siden av epitellaget. MMP1-uttrykk ble ikke observert i Yki 3SA- ekspresserende kloner. Til sammen ble klon C klassifisert som godartet neoplasma ( Figur 7C og D ). 5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Figur 1: Flowchart for klassifisering av tumorfenotyper. Dette flytskjemaet representerer en diagnosemetode for å klassifisere klonale lesjoner i imaginal epithelia. Den klassiskeAtion er basert på fem kriterier: (1) avvik fra kloner fra epitellaget, (2) subcellulær mislokalisering av sammenhengerproteiner, (3) cellulær proliferasjon, (4) klonstørrelse og (5) MMP1-ekspression. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 2: ( A ) Wild-type vinge-imaginal plate farget for Dgg (grønn) og kjerner (DAPI, magenta). ( B ) Skjematisk representasjon av Drosophila-vinge-imaginale plater som viser veskepute (blå), hengsel (oransje) og notum (grønne) regioner. ( C ) Normal vinge-imaginal plate farget for F-aktin (rød) og mikrotubuli (grønn). Kaldemembraner er merket med Kollagen IV / Vkg-GFP (blå). ( D ) Vertikal del av nettstedetMerket med hvit prikket linje i ( C ). ( E ) Linjetegninger sporer apikale (røde) og basale (blå) sider av epitellaget i ( D ). Stiplede linjer sporer peripodialmembranen. Distal (Df), medial (Mf) og proksimal (Pf) brett av dorsal hengsel er indikert.
Detaljert genotyper: A, w - CD, Vkg-GFP Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 3: Nettstedsspesifikk Tumorigenese Induced av Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Konfokale bilder viser vinge-imaginale disker dissekert fra tredje instar larver av angitte genotyper farget for MMP1 (rød). Sd -GAL4 -expreSsing-regioner ble merket med GFP-uttrykk (grønn). ( CG ) Konfokale bilder viser vinge-imaginale disker dissekert fra tredje instarlarver av angitte genotyper ved det angitte tidspunktet AED. F-aktin ble farget med Phalloidin (rødt) i ( CF ). MMP1-ekspresjon er farget med anti-MMP1-antistoffer (rødt) i ( G ). De oppdaterings -GAL4- ekspressende områdene ble merket med GFP-ekspresjon (grønn). Bunnpaneler av ( CF ) viser forstørrede visninger av regioner angitt i øvre paneler. Hvite piler indikerer dysplastiske lesjoner indusert av lgl- knockdown kloner. ( H ) Vertikal del av området merket med hvit prikket linje i bunnpanelet på (E). Hvite prikkede linjer markerer grensene mellom vingeposen og hengselområdene i (A) og (B). Nuclei ble merket med DAPI (blå). Skalestenger = 100 μm i (AG) og 50 μm i (H). Detaljert genotyper: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-LGL-RNAi; C, w - , oppdater-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , oppdater-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 4: Tumorfenotyper Induced by Random Mosaic Clones. ( AC ) Konfokale bilder viser mosaikkfløyens imaginale plater av tredje instarlarver med kloner som uttrykker lgl-RNAi og GFP (grønn) på det angitte tidspunktet etter varmestokk-induksjon. Nuclei ble merket med DAPI (blå). Mellompanelene viser forstørrede visninger av de hvite firkantområder som er merket i venstre panel. Det høyre panelet S viser skjematiske linjetegninger av den apikale siden av epitel lagene (blå) og de GFP-uttrykkende klonene (grønn). Mosaikk kloner lokalisert innenfor epitelet er avbildet i lysegrønn mens neoplastiske svulster som avviker fra epitelet er vist i magenta. Hvite prikkede linjer i venstre panel markerer grensene mellom vingeposen og hengselområdene. Hvite piler i midtpanelene indikerer dysplastiske lesjoner indusert av lgl- knockdown kloner. Skalestenger = 100 μm. Detaljert genotyper: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi ( varmeskokt 30 min ved 2 dager AED, inkuber 2 dager ved 25 ° C i A, inkuber 4 dager ved 25 ° C i B, inkuber 7 dager ved 25 ° C i C etter varmesjokk). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Diagnostisk undersøkelse av dysplastiske klonale fenotyper. ( A ) Det venstre panelet viser en mosaikkfløyes imaginale plate av tredje instar larva med kloner som uttrykker co-uttrykker scrib-RNAi og GFP (grønn) 5 dager etter varmestokk-induksjon, farget for Dlg (rød). Det høyre panelet viser en skjematisk linjetegning av den apikale siden av epitel lagene (blå) og de GFP-uttrykkende klonene (grønn). Mosaikk kloner i epitel lagene er vist i lysegrønn mens neoplastiske svulster fordrevet fra epitelet er vist i magenta. ( BE ) De konfokale bildene viser vertikale deler av scrib- knockdown klonene angitt i høyre panel på (A). De andre panelene fra venstre viser Dlg lokaliseringsmønstre (rød). De tredje panelene fra venstre viser skjematiske linjetegninger av apikale (røde) og basale (blå) sider av epitel lag og GFP-exprEssing scrib- knockdown kloner (grønn). Dysplastiske kloner i epitel lagene er vist i lysegrønne (B og C) mens neoplastiske kloner som er forskjøvet fra epitelet, er vist i magenta (D og E). Hvite piler indikerer scrib- knockdown kloner som viser tumorigenisk fenotype. Nuclei ble merket med DAPI (blå). Skalbjelke = 50 μm. Tumorfenotypen av hver klon ble klassifisert i henhold til flytskjemaet vist i figur 1 . Detaljert genotyper: AE, hsFLP; UAS-SCRIB-RNAi; Handle> CD2> GAL4, UAS-EGFP (varme-sjokkert 30 min ved 2 dager AED, inkuber 4 dager ved 25 ˚C etter varmestokk). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 6: DiagnoserTic Undersøkelse av Ras V12- ekspressing klonale fenotyper. ( A ) Venstre panel viser en mosaikkfløyes imaginale plate av tredje instar larva med kloner som uttrykker onkogen Ras V12 og GFP (grønn) 4 dager etter varmestokk-induksjon, farget for Dlg (rød). Det høyre panelet viser en skjematisk linjetegning av den apikale siden av epitel lagene (blå) og de GFP-uttrykkende klonene (grønn). Skalbjelke representerer 50 μm. ( B ) Vertikale seksjoner av Ras V12 uttrykkende kloner angitt i høyre panel av (A). De andre panelene fra venstre viser Dlg lokaliseringsmønstre (rød). De tredje panelene fra venstre viser skjematiske linjetegninger av de apikale (røde) og basale (blå) sidene av epitel lagene og Ras V12 og GFP uttrykker kloner (grønn). Skalbjelke = 25 μm. ( C ) Mosaic vinge imaginal plate av tredje instar larva med kloner co-uttrykker <Em> Ras V12 og GFP (grønn) 4 dager etter induksjon av varme-sjokk, farget for MMP1 (rød). Skalbjelke = 100 μm. Detaljert genotyper: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Handle> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( varmeskokt 45 min ved 2 dager AED, inkuber 4 dager ved 25 ° C etter varmestokk). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 
Figur 7: Diagnostisk undersøkelse av Yki 3SA- ekspressende klonale fenotyper. ( A ) Venstre panel viser en mosaikkfløyes imaginale plate av tredje instar larva med kloner som uttrykker sammensetning av konstitutivt aktiv Yki 3SA og GFP (grønn) 4 dager etter varmestokk-induksjon, farget for Dlg (rød). Det høyre panelet viser som Kjemisk linje tegning av den apikale siden av epitel lagene (blå) og de GFP-uttrykkende klonene (grønn). Skalbjelke = 50 μm. ( BC ) Vertikale deler av Yki 3SA uttrykkende kloner angitt i høyre panel av (A). De andre panelene fra venstre viser Dlg lokaliseringsmønstre (rød). De tredje panelene fra venstre viser skjematiske linjetegninger av apikale (røde) og basale (blå) sider av epitel lagene og Yki og GFP uttrykkende kloner (grønn). Skalbjelke = 25 μm. ( D ) Mosaisk vinge-imaginale plate av tredje instarlarva med kloner som uttrykker Yki 3SA og GFP (grønn) 4 dager etter varmekjokk-induksjon, farget for MMP1 (rød). Skalbjelke = 100 μm. Detaljert genotyper: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( varmeskokt 30 min ved 2 dager AED, inkuber 4 dager ved 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAL4-UAS-systemet er et av de kraftigste genetiske verktøyene for målrettet genuttrykk i Drosophila 26, og i stor grad letter tumorinduksjon og analyse in vivo 4 . Dette systemet muliggjør generering av kloner som bærer knockdown av tumor-suppressor-gener eller overekspresjon av onkogener innen vildtype epitelvev, en situasjon som er svært lik de innledende stadier av menneskelig kreft hvor transformerte pro-tumorceller er omgitt av normale epitelceller. GAL4-driverlinjene regulert av forsterker-sekvenser som GAL4-forsterker-felle linjer eller Janelia GAL4-linjer 27 har unike, spatiotemporalt begrensede uttrykksmønstre. Derfor er disse forsterker-GAL4-linjene nyttige for å indusere tumorer konsekvent i begrensede områder av imaginale plater. I tillegg til sd-GAL4 og upd-GAL4 vist i denne studien, bekreftet vi at lgl- knockdown induced bY andre enhancer- fals GAL4-linjer inkludert engrailed-GAL4 ( en-GAL4 ), hedgehog-GAL4 ( hh-GAL4 ), optomotor-blind-GAL4 ( omb-GAL4 ), patched-GAL4 ( ptc-GAL4 ) og spalt-major- GAL4 ( salm-GAL4 ) kan generere neoplastiske svulster i hengselregioner av vinge-imaginale plater. Hvis forsterker-GAL4-uttrykksmønsteret må reguleres midlertidig, er en kombinasjon av GAL4 og en temperaturfølsom versjon av GAL80 (GAL80 ts ) et alternativ. GAL80 ts undertrykker GAL4-funksjonen ved 18 ° C, men ikke ved 29 ° C, noe som tillater at UAS-transgener uttrykkes for å bli slått på eller av som nødvendig 28 .
Det utløste GAL4-mosaikksystemet, som kombinerer FLP-FRT-systemet og GAL4-UAS-systemet 3 , genererer tilfeldige kloner i imaginale plater. Ved å kombinere varme-sjokk-inducerbar flippase (hsFLP) med flip-out GAL4, er kloninggeneratets tidspunktIon er kontrollerbar. Fordi det tumoregeneriske potensialet av imaginale diskceller kan være avhengig av utviklingsstadiet, endogene signaleringshendelser og / eller celledifferensiering 29 , 30 , er det svært viktig å undersøke effekten av endret varmetakts-timing på tumorigeniske fenotyper.
Det har tidligere blitt vist at nTSG-mutantkloner undergår cellekonkurranseavhengig apoptose når de er omgitt av villtype-celler 10 , 11 , 12 , 18 , hvilket tyder på at flere mutasjoner er nødvendige for celletransformasjon under kreftutvikling. Faktisk forvandler overekspresjon av onkogen Ras eller Yki i lgl eller scrib mutant kloner dem til aggressive svulster 10 , 18 , 31 mens feilEkspresjon av Ras V12 eller Yki 3SA fremkaller ikke malign neoplasma av seg selv uten nTSG-mutasjoner. Som vist her og tidligere 16 gjennomgår pro-tumor nTSG-knockdown-kloner generert i vildtskiver av villtype også apoptose og viser ikke tumoregenese i vingeposen 16 . Samtidig utvikles nTSG-knockdown kloner i hengsel "hotspots" til neoplastiske svulster uten ytterligere onkogene mutasjoner. I hengselregioner kapsler nTSG-mangelfulle celler endogen Janus kinase / signaltransducer og aktivator for transkripsjon (JAK / STAT) signalering for å drive tumorigenese 16 . Derfor er hengselspecifikke GAL4er som oppdater -GAL4 nyttige verktøy for konsekvent fremkallende neoplastisk tumordannelse ved RNAi- mediert knockdown av tumor-suppressorgener. Selv om flip-out-GAL4-indusert nTSG-knockdown-mosaikkkloner også induserer neoplastiske svulster i hengselreireGions, tumorigenese forekomst er avhengig av opprinnelig klonstørrelse: store kloner fremstilt av et varmeskudd over 20 minutter fremkaller vanligvis tumorigenese, mens de fleste små kloner generert av varmestokk kortere enn 10 minutter, elimineres fullstendig (KM og YT, upubliserte data).
En rekke nyere studier på utvikling av kreft og kreftprogresjon bruker Drosophila imaginal plater som modellsystem 32 , 33 . Felles for disse studiene er flere markører av neoplastiske svulster: avvikende cellemasser, deformerte skiveformer, akkumulering av F-aktin, forbedret cellecykling (BrdU / EdU-inkorporering eller PH3-ekspresjon), aktivering av JNK-signalering og dens nedstrøms mål MMP1, kjellermembran Forstyrrelse og / eller epithelial disorganisering, inkludert tap eller subcellulær delokalisering av proteiner involvert i apikal-basalcellepolaritet (krummer, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 eller PAR-6), septatforbindelser(Lgl, Scrib, Dlg eller Coracle) eller adherens krysser (E-Cadherin eller Armadillo). Disse fenotyper er lett å detektere ved konvensjonell antistofffarging. Selv om det er vanskelig å avgjøre om en klonal fenotype er hyperplasi, dysplasi, godartet neoplasma eller ondartet neoplasma i tidlig stadium av tumorigenese, bør det være enklere i Drosophila imaginal plate epithelia sammensatt av et enkelt epithelial monolayer. I denne studien introduserte vi en diagnosemetode for å klassifisere tumorklonfenotyper indusert i epithelialmonolaget ( Figur 1 ). Denne metoden krever nøye observasjoner av fem kriterier ved hjelp av z-stablet konfokale bilder; Hvert diagnostisk kriterium kan undersøkes ved konvensjonell antistofffarging og konfokal bildebehandling. En av de nye kriteriene vi introduserte i denne metoden er "4-celle-diameterskriterier" som diskriminerer mellom dysplasi og neoplasma i imaginale plater. Pro-tumorceller som nTSG-mutantkloner er hyppigeEkstruderes fra epitel lag gjennom celle konkurranse eller spindel misorientation 15 , 16 , 34 . I de fleste situasjoner apoptose disse ekstruderte cellene, og slik kan de ikke sprede seg. Selv om det kan være mulig at pro-tumorcellene gjennomgår celledeling en gang under ekstrudering og en eller to ganger etter ekstrudering, danner dette en cellemasse på 2- til 3-cellediameter. Derfor, hvis en cellemasse av pro-tumorceller som avvikes fra epithelialaget er større enn 4-celle-diameter, kan vi derfor bestemme at de overlever og prolifererer som en neoplasma utenfor epitellaget.
Selv om denne diagnosemetoden er enkel, er det viktig å ta en tidskurs av fenotyper, da utviklingen av svulster og malignitet utvikler seg over tid. For eksempel er dysplasi et cytologisk abnormt vev og en overgangsstatus mellom helt godartede vekst og de som er preondartet. Derfor, selv om en observert klon er definert som en dysplasi i henhold til flytskjemaet ( figur 1 ), er det derfor mulig at dysplasi senere utvikler seg til en neoplasma. Selv om larvstadiet er begrenset i tid (5-6 dager ved 25 ° C eller 4 - 5 dager ved 29 ° C AED), forlener tumorvekst i imaginale plater larvalstadiet gjennom en insulinlignende peptidinducert forsinkelse av pupariasjon 35 , 36 . Derfor gjør neoplastisk svulstdannelse i imaginale plater det mulig å observere fonotypisk progresjon i tumorklon i flere dager. Vår enkle klassifikasjonsmetode kan være bredt anvendelig for klonanalysen av tumorfenotyper i forskjellige organer i Drosophila .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker J. Vaughen for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 og The Takeda Science Foundation Research Grant til YT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
