Summary
Mosaisk klonanalys i Drosophila imaginal disc epithelia är ett kraftfullt modellsystem för att studera de genetiska och cellulära mekanismerna av tumöresesen. Här beskriver vi ett protokoll för att inducera tumörer i Drosophila- vinge-imaginala skivor med hjälp av GAL4-UAS-systemet, och introducera en diagnosmetod för att klassificera tumörfenotyperna.
Abstract
I de tidiga stadierna av cancer uppvisar transformerade mutanta celler cytologiska abnormiteter, börjar okontrollerad överväxt och gradvis störar vävnadsorganisationen. Drosophila melanogaster har framkommit som ett populärt experimentellt modellsystem i cancerbiologi för att studera de genetiska och cellulära mekanismerna av tumörgenesen. I synnerhet möjliggör genetiska verktyg för Drosophila- imaginala skivor (utvecklande epitel i larver) skapandet av transformerade pro-tumörceller inom en normal epitelvävnad, en situation som liknar de inledande stadierna av mänsklig cancer. En nyligen genomförd studie av tumörgenesen i Drosophila- vinge-imaginala skivor visade emellertid att tumörinitiering beror på vävnadsinriktad cytoarkitektur och lokal mikromiljö, vilket tyder på att det är viktigt att överväga den regionspecifika mottagligheten för tumörgeneriska stimuli vid utvärdering av tumörfenotyper i imaginal skivor. För att underlätta fenotypisk analys av tumörprogressiPå imaginal-skivor beskriver vi här ett protokoll för genetiska experiment som använder GAL4-UAS-systemet för att inducera neoplastiska tumörer i vinge-imaginala skivor. Vi introducerar vidare en diagnosmetod för att klassificera fenotyperna av klonala lesioner inducerade i imaginal epithelia, eftersom en tydlig klassificeringsmetod för att diskriminera olika stadier av tumörprogression (såsom hyperplasi, dysplasi eller neoplasi) inte tidigare beskrivits. Dessa metoder kan vara brett tillämpliga på klonanalysen av tumörfenotyper i olika organ i Drosophila .
Introduction
Epitelvävnader är högorganiserade system som har den anmärkningsvärda homeostatiska förmågan att behålla sin organisation genom utveckling och cellomsättning. Detta robusta självorganiserande system störs dock progressivt under tumörutveckling. I början av tumörutveckling uppstår individuella mutantceller som uppstår vid onkogenaktivering eller tumör-suppressorgeninaktivering inom ett epitelskikt. När denna transformerade "pro-tumörcell" undviker en undertryckande miljö, stör epithelorganisationen och börjar okontrollerad proliferation, uppträder tumogeneses 1 . Under de senaste decennierna har framstående tekniska framsteg inom genetik och molekylärbiologi gjort märkliga framsteg på cancerforskning. I synnerhet nyligen gjorda studier med hjälp av genetiskt mosaikanalysverktyg i Drosophila melanogaster , såsom FLP-FRT (flippasrekombinas / flippasrekombinasmål) mitotiskt rekombinAtion 2 och flip-out-GAL4-UAS (uppströms aktiverande sekvens) system 3 har kraftigt bidragit till bättre förståelse av de genetiska mekanismerna som är involverade i bildandet och metastasen av tumörer 4 , 5 , 6 .
Studier av en grupp konserverade Drosophila- tumör-suppressorgener, dödliga jätte larver ( lgl ), skivor stora ( dlg ) och scribble ( scrib ) framhävde det kritiska sambandet mellan förlust av epitelorganisation och tumörutveckling, eftersom dessa gener spelar nyckelroller I reglering av apikalbasalcellspolaritet och cellproliferation i epitelvävnader 7 . Medan Drosophila imaginal skivor normalt är monoskiktad epitel, ger homozygote mutationer i någon av dessa tre gener celler att förlora struktur och polaritet, misslyckas med att skilja sigHyra, överproliferera och slutligen bilda flerlagiga amorfa massor som smälter med intilliggande vävnader 7 . På liknande sätt är störningar av dessa gener i däggdjur involverade i utvecklingen av maligna tumörer 8 , 9 . De neoplastiska fenotyperna som uppvisas av mutantvävnaderna har lett till klassificeringen av dessa tre gener som konserverade neoplastiska tumör-suppressorgener (nTSGs) 7 , 8 . När homozygote nTSG-mutanta celler genereras sporadiskt vid utveckling av vildtyps imaginala skivor med användning av FLP-FRT-medierad mitotisk rekombination elimineras mutantceller från vävnaden genom c-Jun N-terminala kinas (JNK) -beroende apoptos 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , strängsprutning 15 , 16 eller engulfment och fagocytos av grannar 17 . I denna genetiska mosaikepitel, upptäcks apoptos mestadels i nTSG-mutanta celler som ligger vid klongränsen, vilket tyder på att intilliggande normala celler utlöser apoptosen hos nTSG-mutanta celler 10 , 11 , 12 , 18 . Tidigare studier i däggdjursceller har bekräftat att denna celltävlingsberoende eliminering av pro-tumorceller är en evolutionärt konserverad epithelial självförsvarsmekanism mot cancer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
En nyligen genomförd studie i Drosophila imaginal-skivor visade emellertid att mosaik-nTSG-knockdown-kloner inducerar neoplastiska tumörer i specifikaIc regioner av vinge imaginal skivor 16 . Den initiala tumörbildningen hittades alltid i det perifera "gångjärnet" -regionen och observerades aldrig i den centrala "påsen" -regionen av vingskivepitelet, vilket tyder på att den tumörgeneriska potentialen hos nTSG-knockdown-celler beror på lokalmiljön. Den centrala pouchregionen fungerar som en "tumörkylspets" där pro-tumörceller inte uppvisar dysplastisk överväxt, medan den perifera gångjärnsregionen uppträder som en "tumör hotspot" 16 . I "coldspot" -påsregioner delamineras nTSG-knockdown-celler från bassidan och genomgår apoptos. I motsats härtill, som "hotspot" gångjärnsceller har ett nätverk av robusta cytoskeletala strukturer på sina basala sidor, delaminerar nTSG-knockdown-celler från apitelens apikala sida och initierar tumörgenerisk överväxt 16 . Därför kräver analys av tumörfenotyper i imaginalskivor noggrann konsistensHärdning av den regionspecifika mottagligheten för tumörgeneriska stimuli.
Här beskriver vi ett protokoll för att inducera neoplastisk tumörbildning i Drosophila- vinge-imaginala skivor som använder GAL4-UAS- RNAi- systemet, med vilka nTSG-knockdown-celler genereras i normal vinge-skivepitel. Även om dessa experimentella system är användbara för att studera de tidiga stadierna av cancer, har en tydlig klassificeringsmetod för att utvärdera stadierna av tumörprogression i imaginal disc epithelia inte beskrivits tydligt tidigare. Därför föreslår vi också en diagnosmetod för att klassificera pro-tumörklonala fenotyper som induceras i vingskivepiteln i tre kategorier: hyperplasi (ackumulering av ett alltför stort antal normala celler med ökad proliferation), dysplasi (premalignerad vävnad som består av abnormt förekommande Celler) och neoplasi (godartad eller malign tumör som består av celler som har ett abnormt utseende och onormalt proliferationsmönster).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Flygkors och kloninduktion
- Ta bort alla flugor i flaskan 12 h innan du samlar in jungfruor.
- Söva flugorna i flaskan genom att injicera CO 2 gas och plats flugor på en CO 2 fluga pad.
- Överför 10-20 kvinnliga kvinnor och 10 män från CO 2- flygelen i en ny flaska och inkubera i 1 dag vid 25 ° C.
- Överför dessa flugor till en ny flaska och inkubera i 12 h vid 25 ° C.
OBS: Kassera den första injektionsflaskan, eftersom oskilda kvinnor inte lägger tillräckligt med ägg under den första dagen. - För enhancer-GAL4-linjer, ta bort de vuxna flugorna och inkubera injektionsflaskan vid 25 ° C tills dissektion.
- För induktion av mosaikkloner genom flip-out-GAL4, avlägsna de vuxna flugorna och inkubera injektionsflaskan i 2-4 dagar vid 25 ° C. Inkubationstiden före värmeschock är beroende av försöksändamålet. En värmechock 2 dagar efter äggavsättning (AED) genererar mosaikkloner i omogna andraInstar imaginal epithelia. En värmechock efter 3 eller 4 dagar AED genererar mosaikkloner i differentierad tidig till mitten av tredje instar imaginal epithelia.
OBS! Det är viktigt att undersöka effekten av förändrad värmechocktidning på tumörgeneriska fenotyper. - För induktion av mosaikkloner med utlopps-GAL4 värmschock injektionsflaskan genom nedsänkning i ett 37 ° C vattenbad i 10-45 min följt av inkubering i 2 - 3 dagar vid 25 ° C.
OBS: Information om värmechocktid, timing och inkubationstid i varje experiment visas i figurerna.
2. Dissektion av larver
- Samla vandrande tredje instarlarver med en träpinne eller trubbiga tångar, genotyper dem med lämpliga fluorescerande markörer ( t.ex. EGFP) under ett fluorescensstereoskopiskt mikroskop och placera dem i en dissektskål med PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
- Tvätta larverna i PBS genom pipettering med 2 ml plastöverföringspipetter.
- Knappa larvernas mitt med en pincett och riva kroppen i hälften med de andra pincettarna.
- Knippa framkroppen med den främre halvan med en tang och tryck munnen mot kroppen med de andra tangarna för att vrida kroppen inuti.
- Ta bort onödiga material som spottkörtlar eller fettkroppar med pincett.
3. Fästning och antikroppsfärgning
- Överför den dissekerade främre halvan av larvkroppen (inklusive imaginal vingskivor) till ett 1,5 ml plaströr och fixa i 1 ml Fix-lösning (4% formaldehyd i PBS) i 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret med försiktig rotation.
VARNING: Formaldehyd är giftigt och har cancerframkallande potential. Använd skyddshandskar och kläder för att förhindra hudkontakt.
OBS! I denna del sker alla steg på en nutatör vid rumstemperatur i mörkret om inget annat anges. - Ta bort Fix-lösningen och kassera. Tvätta vävnaderna med 1 ml PBT (0,3% TritPå X-100 i PBS) tre gånger i 15 min vardera.
- Ta bort PBT och tillsätt 1 ml PBTG (0,2% bovint serumalbumin och 5% normalt get serum i PBT) för blockering och nutat 1 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Ta bort PBTG och tillsätt primär antikroppslösning som är lämpligt utspädd med PBTG (se materialtabell ) och nutat över natten vid 4 ° C.
- Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT tre gånger i 15 min vardera.
- Ta bort PBT och tillsätt sekundär antikroppslösning lämpligt utspädd med PBTG (1: 400). Nöt i 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Ta bort sekundär antikropplösning och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT två gånger i 15 min vardera.
- För att fläcka F-aktin, avlägsna PBT och tillsätta Phalloidin-lösning lämpligt utspädd i PBS (1:40). Därefter nutate i 20 min. Ta bort Phalloidin-lösningen och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT två gånger i 15 min vardera.
- För att motverka nukleär DNA, ta bort PBT och tillsätt DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) lösning (0,5 μg / ml DAPI i PBS). Därefter nutate 10 min.
VARNING: DAPI har cancerframkallande potential. Använd skyddshandskar och kläder för att förhindra hudkontakt. - Ta bort DAPI-lösningen och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT två gånger i 15 min vardera.
- Skölj en gång i 1 ml PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort PBS och tillsätt 500 μL 100% glycerol som förmonteringsmedium.
4. Montering på mikroskopskivor
- Placera de färgade vävnaderna på en mikroskopglas genom att använda en 2 ml plastöverföringspipett.
- Överför vävnaderna till droppar monteringsmedium på ett annat mikroskopglas med tang.
- Håll ner änden av dissekerad vävnad med en tang och dra bort hjärn- och ögonantennalskivor med de andra tangarna.
OBS: Håll de dissekerade hjärnorna för att placera dem nära vinge-imaginala skivor. Hjärnorna fungerar som en plattform som hindrar täckglaset från att krossa vinge-imaginala skivor. - För att isolera vingen sätter imaginala skivor ner änden av dissekerad vävnad med en pincett och repar försiktigt kroppsväggen och sliter av skivorna med de andra pincetterna.
ANMÄRKNING: Om det är svårt att hitta vinge-imaginala skivor, avlägsna luftröret från den bakre delen till den främre sidan. Vinge-imaginala skivor håller sig till luftstrupen. - Skydda försiktigt skivorna med täckglas och tätning med nagellack; Lagra vid 4 ° C.
5. Konfokal mikroskopi
- För att förvärva konfokala bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop fastställda bildförvärvsparametrar inklusive intervall av emissionsvåglängd, laserintensitet, förstärkning, förskjutning, skanningshastighet och bildstorlek 24 .
OBS! För detaljerad procedur för bildupptagningsinställningar, se bruksanvisningen från varje mikroskoptillverkare. - Att fånga enstaka coNfokala sektioner av en helvingar-imaginalskiva, använd en 20X objektivlins.
- Förvärva tredimensionella bilder genom z-stack-skanning i stegstorlek på 0,5 - 1,0 μm med 40X eller 60X-objektiv.
OBS! För att analysera cellulära fenotyper i hög upplösning bör en bildstorlek vara större än 512 x 512 pixlar.
6. Bildanalys med ImageJ
- Använd Fiji, en open source ImageJ-programvara med fokus på biologisk bildanalys (https://fiji.sc/) 25 , för att förvärva och analysera confocal z-stack-bilder.
- För att få vertikala sektioner öppnar du z-stack-bilderna i ImageJ och väljer menyalternativet "Image / Stacks / Reslice".
OBS: XZ-axeln eller YZ-axeln kan väljas i menyn Reslice. Vertikal sektion kan erhållas även i godtycklig riktning genom att rita en rak linje eller rektangel på z-stack bilden.
7. Diagnos av neoplastiska fenotyper
- Öppna vertikaltSektioner (XZ eller YZ-axel) erhållna från en uppsättning z-stackbilder och analysera morfologiska fenotyper och antikroppsfärgning.
- För diagnos av tumörfenotyper, fokuserar man huvudsakligen på följande tre punkter: (1) Om en cellmassa, inklusive knockdown-kloner, avviker från huvudepitelskiktet, (2) om subcellulär lokalisering av knutpunktsproteiner förändras i denna cellmassa , Och (3) om diametern för denna cellmassa är större än 4 celler.
- Kategorisera tumörfenotyper enligt flödesschemat som beskrivs i Figur 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera neoplastisk tumörbildning inducerad experimentellt med RNAi- medierad nTSG-knockdown i Drosophila- vinge-imaginala skivor, användes tre olika GAL4-drivrutiner för att uttrycka UAS-RNAi för lgl eller scrib : (1) sd-GAL4, som driver starkt UAS-uttryck i Vingpåse och mildt uttryck i gångjärnsregionerna ( Figur 2 och Figur 3A ); (2) upd-GAL4, som driver sig i underdomänerna av gångjärnet, inklusive starkt uttryck i två domäner i den dorsala medialvecken, mildt uttryck i en främre-lateral domän och svagt uttryck i den ventrala posterior-domänen ( Figur 2 och Figur 3C ); Och (3) värmechockinducerad flip-out GAL4, vilken genererar slumpmässiga mosaikkloner som uttrycker UAS-gener ( Figur 4 och FiGure 5). I samtliga experiment samordnades UAS-EGFP med UAS-RNAi för att markera knockdown-klonerna.
Först användes sd-GAL4- driven lgl-RNAi för att inducera knockdown av lgl i vingepåsen och gångjärnsregionerna. I kontrollen av tredje instar -vingskivor utan UAS-lgl-RNAi inträffade ingen morfologisk förändring ( Figur 3A ). I motsats härtill observerades epithelial deformationer och tumörgenerala överväxlingar i vissa delar av gångjärnet ( Figur 3B ) i tredje instar- vingskivor som uttryckte lgl-RNAi . I vingpåseområdet observerades dock inte dysplastisk överväxt. Starkt MMPl-uttryck (matrismetalloproteas-1) observerades i de tumörhämmande lesionerna men inte i vingepåseområdet ( Figur 3B ). Eftersom MMPl-uttryck är involverat i nedbrytning av källarmembranDet är möjligt att dessa gångjärntumörer har en metastatisk förmåga ( Figur 3B ). Därefter användes upd-GAL4 för att inducera lgl knockdown i gångjärnsregionen. Vid kontroll av tredje instar -vingskivor utan UAS-lgl-RNAi inträffade inga morfologiska förändringar ( Figur 3C ). Efter 5 dagars AED uppvisade tredje instar-vinge-skivor med uppdater-GAL4 och lgl-RNAi framträdande epitelial disorganisation med F-aktin ackumulering och klonförskjutning från epitelskiktet ( Figur 3D ). Vid 6 dygns AED övergick neoplastiska tumörer som uttryckte MMP1 i gångjärnsregionen ( Figur 3G ), om än med variation i tumörstorlek mellan prover ( Figur 3E och F ). En vertikal sektion av gångjärnsregionen bekräftade att den neoplastiska tumören genomgick avvikande utväxt vid den apikala sidan av epitelskiktet ( För att övervaka progressionen av tumörtillväxt inducerad genom lgl knockdown, genererades sporadiska kloner som uttrycker lgl-RNAi i vinge-skivor med användning av det värmechock-inducerade flip-out-GAL4-mosaiksystemet. Två dagar efter värmechock till andra instarlarver (2 dagar AED) visade några lgl- knockdown-kloner i gångjärnsområdet avvikelse bort från epitelskiktets apikala sida ( Figur 4A ). Fyra dagar efter värmechockinduktion blev dysplastiska lesioner i gångjärnsregionen tydliga, vilket tyder på att lgl- knockdown-kloner som förskjutits bort från apikalsidan prolifererar i lumenet ( Figur 4B ). Sju dagar efter värmechockinduktion dominerade tumörgenerala överväxten gångjärnsregionerna ( Figur 4C ). Att demonstreraKlassificering av klonala fenotyper med vår diagnosmetod genererades sporadiska kloner som uttrycker scrib-RNAi i vingsskivor med hjälp av det värmechock-framkallade utbyte GAL4-mosaiksystemet. Fem dagar efter värmechock till andra stadiets larver (2 dagar AED), vissa GFP-uttryck Scrib -knockdown kloner visade tumörogena fenotyper (figur 5A). Vi analyserade fyra kloner (B, C, D och E i Figur 5A ) i vertikala sektioner av z-stack konfokala bilder med hjälp av ImageJ, eftersom det är svårt att förvärva detaljerade cytologiska och strukturella fenotyper i 2D-konfokala bilderna ( Figur 4 och Figur 5A ). Kloner B och C klassificerades som dysplasi som septat-junction proteinskivor stora (Dgg) mislokaliserades ( Figur 5B och C ). I klon B var storleken på cellmassan som förskjutits från epitelet inte större än 4-celler i diameternR ( Figur 5B ), medan klon C inte avviker från epitelet ( Figur 5C ); Därför betraktades inte kloner B och C neoplastiska. Kloner D och E, som också visade misslokalisering av Dlg, bildade dock tumörcellmassor utanför epitelet ( Figur 5D Och 5E ). Eftersom storleken av dessa förskjutna tumörkloner var mer än 4 celler i diameter klassificerades klonerna som neoplastiska. För att inducera hyperplastiska tumörer eller cysteformationer i vinge-imaginala skivor genererades sporadiska kloner som uttrycker onkogen Ras ( Ras V12 ) eller konstitutivt aktiv form av Yorkie, en transkriptionell koaktivator av Hippo-vägen ( Yki 3SA ) med användning av den värmechockinducerade Flip-out GAL4 mosaik system. Fyra dagar efter värmeschock till andra instarlarver (2 dagar AED), RaS V12- uttryckande kloner märkta med GFP blev runda cellmassor i imaginalskivorna ( Figur 6A ). En vertikal sektion av Ras V12- uttryckande klonen (klon B i figur 6A ) avslöjade att cellmassan dissocierad från epitelskiktet har korrekt lokalisering av Dgg, vilket antyder att cellmassan upprätthåller normala epitelstrukturer utanför epitelskiktet ( Figur 6B ) . MMPl-uttryck observerades ej i dessa Ras V12- uttryckande kloner ( Figur 6C ). Därför klassificerades klonen B som cystbildning. Fyra dagar efter värmechock till andra instarlarver (2 dagar AED) bildade Yki 3SA- uttryckande kloner märkta med GFP stora cellmassor i imaginalskivorna ( Figur 7A ). Vi fokuserade på två kloner (B och C i Figur 7A ). Klon B visadeIntegration i epitelskiktet och korrekt lokalisering av Dgg i epitelcellernas subepikala membran, vilket antyder att den Yki 3SA- uttryckande klonen B upprätthåller epitelstrukturen. Därför klassificerades klon B som hyperplasi ( Figur 7B ). Klon C belägen i gångjärnsregionen visade misslokalisering av Dlg och formad flerskiktsstruktur vid bassidan av epitelskiktet. MMPl-uttryck observerades inte i de Yki 3SA- uttryckande klonerna. Tillsammans klassificerades klon C som godartad neoplasma ( Figur 7C och D ). 5 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Figur 1: Flödesschema för klassificering av tumörfenotyper. Detta flödesschema representerar en diagnosmetod för att klassificera klonala lesioner i imaginal epithelia. Den klassiskaAtion är baserad på fem kriterier: (1) avvikelse från kloner från epitelskiktet, (2) subcellulär misslokalisering av förbindelseproteiner, (3) cellulär proliferation, (4) klonstorlek och (5) MMPl-uttryck. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. 
Figur 2: ( A ) Vild-imaginerskivor vinklad för Dgg (grön) och kärnor (DAPI, magenta). ( B ) Schematisk representation av Drosophila-vinge-imaginala skivor med vingepåse (blå), gångjärn (orange) och notum (grön). ( C ) Normal vinge imaginal skiva färgad för F-aktin (röd) och mikrotubuli (grön). Källmembran är märkta med kollagen IV / Vkg-GFP (blå). ( D ) Vertikal sektion av webbplatsenMarkerad med vit prickad linje i ( C ). ( E ) Linjeleggar spårar apikala (röda) och basala (blå) sidorna av epitelskiktet i ( D ). Stipade linjer spåra peripodialmembranet. Distal (Df), medial (Mf) och proximal (Pf) veck av dorsal gångjärnet indikeras.
Detaljerade genotyper: A, w - CD, Vkg-GFP Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. 
Figur 3: Sätspecifik tumörigenes inducerad av Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Konfokala bilder visar vinge-imaginala skivor dissekerade från tredje instarlarver av angivna genotyper färgade för MMP1 (röd). Sd-GAL4 -expreSingsregioner märktes med GFP-uttryck (grönt). ( CG ) Konfokala bilder visar vinge-imaginala skivor dissekerade från tredje instarlarver av angivna genotyper vid den angivna tidpunkten AED. F-aktin färgades med Phalloidin (röd) i ( CF ). MMPl-uttryck färgas med anti-MMPl-antikroppar (röd) i ( G ). De uppdaterings-GAL4- expressionsområdena märktes med GFP-uttryck (grönt). Bottenpaneler av ( CF ) visar förstorade vyer över regioner som anges i övre paneler. Vita pilar indikerar dysplastiska skador som induceras av lgl- knockdown-kloner. ( H ) Vertikal sektion av platsen markerad med vit prickad linje i bottenpanelen på (E). Vita prickade linjer markerar gränserna mellan vingepåse och gångjärnsområden i (A) och (B). Nukleär märktes med DAPI (blå). Skalstänger = 100 μm i (AG) och 50 μm i (H). Detaljerad genotyper: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w -, sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-LGL-RNAi; C, w - , uppdatering-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , uppdatering-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. 
Figur 4: Tumörfenotyper inducerad av slumpmässiga mosaikkloner. ( AC ) Konfokala bilder visar mosaikvinge-imaginala skivor av tredje instarlarver med kloner som uttrycker lgl-RNAi och GFP (grön) vid den angivna tidpunkten efter värmekok induktion. Kärnor märktes med DAPI (blå). Mellersta paneler visar förstorade vyer över de vita kvadratregionerna som är markerade i vänstra paneler. Den högra panelen S visar schematiska linjeteckningar av apikelsidan av epitelskikten (blå) och de GFP-uttryckande klonerna (grön). Mosaikkloner belägna i epitelet avbildas i ljusgrönt medan neoplastiska tumörer som avviker från epitelet visas i magenta. Vita prickade linjer i de vänstra panelerna markerar gränserna mellan vingepåse och gångjärnsområden. Vita pilar i mittenpaneler indikerar dysplastiska skador som induceras av lgl- knockdown-kloner. Skalstänger = 100 μm. Detaljerad genotyper: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (värmekokad 30 min vid 2 dygn AED, inkubera 2 dagar vid 25 ° C i A, inkubera 4 dagar vid 25 ° C i B, inkubera 7 dagar vid 25 ° C i C efter värmechock). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Diagnostisk undersökning av dysplastiska klonfenotyper. ( A ) Den vänstra panelen visar en mosaikvinge-imaginala skiva av tredje instarlarva med kloner som uttrycker co-uttrycker scrib-RNAi och GFP (grön) 5 dagar efter värmekok induktion, färgad för Dlg (röd). Den högra panelen visar en schematisk linje ritning av den apikala sidan av epitelskikten (blå) och de GFP-uttryckande klonerna (grön). Mosaikkloner i epithelskikten visas i ljusgrön medan neoplastiska tumörer som förskjuts från epitelet visas i magenta. ( BE ) De konfokala bilderna visar vertikala delar av scrib- knockdown-klonerna som anges i den högra panelen av (A). De andra panelerna från vänster visar Dlg-lokaliseringsmönstren (röd). De tredje panelerna från vänster visar schematiska linjeteckningar av apikala (röda) och basala (blå) sidorna av epithelialskikten och GFP-exprEssing scrib- knockdown kloner (grön). Dysplastiska kloner i epithelskikten visas i ljusgrön (B och C) medan neoplastiska kloner som är förskjutna från epitelet visas i magenta (D och E). Vita pilar indikerar scrib- knockdown-kloner som visar tumörgenerisk fenotyp. Nukleär märktes med DAPI (blå). Skala bar = 50 μm. Tumorfenotypen hos varje klon klassificerades i enlighet med flödesschemat visat i figur 1 . Detaljerad genotyper: AE, hsFLP; UAS-Scrib-RNAi; Agera> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( värmekokad 30 min vid 2 dygn AED, inkubera 4 dagar vid 25 ˚C efter värmeschock). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. 
Figur 6: DiagnosTik Undersökning av Ras V12- expression av klonala fenotyper. ( A ) Den vänstra panelen visar en mosaikvinge-imaginala skiva av tredje instarlarva med kloner som uttrycker onkogen Ras V12 och GFP (grön) 4 dagar efter värmekok induktion, färgad för Dlg (röd). Den högra panelen visar en schematisk linje ritning av den apikala sidan av epitelskikten (blå) och de GFP-uttryckande klonerna (grön). Skala bar representerar 50 μm. ( B ) Vertikala sektioner av Ras V12- uttryckande kloner angivna i den högra panelen av (A). De andra panelerna från vänster visar Dlg-lokaliseringsmönstren (röd). De tredje panelerna från vänster visar schematiska linjeteckningar av apikala (röda) och basala (blå) sidor av epithelialskikten och Ras V12 och GFP-uttryckande kloner (grön). Skala bar = 25 μm. ( C ) Mosaicvinge-imaginala skiva av tredje instarlarva med kloner som uttrycker <Em> Ras V12 och GFP (grön) 4 dagar efter värmekok induktion, färgad för MMP1 (röd). Skalstång = 100 μm. Detaljerad genotyper: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Agera> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( värmekokad 45 min vid 2 dygn AED, inkubera 4 dagar vid 25 ° C efter värmechock). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. 
Figur 7: Diagnostisk undersökning av Yki 3SA- uttryckande klonfenotyper. ( A ) Den vänstra panelen visar en mosaikvinge-imaginala skiva av tredje instarlarva med kloner som uttrycker samstämmande konstitutivt aktiv Yki 3SA och GFP (grön) 4 dagar efter värmekok induktion, färgad för Dgg (röd). Den högra panelen visar som Kemisk linje ritning av den apikala sidan av epitelskikten (blå) och de GFP-uttryckande klonerna (grön). Skala bar = 50 μm. ( BC ) Vertikala sektioner av de Yki 3SA- uttryckande klonerna som anges i den högra panelen av (A). De andra panelerna från vänster visar Dlg-lokaliseringsmönstren (röd). De tredje panelerna från vänster visar schematiska linjeteckningar av apikala (röda) och basala (blå) sidorna av epithelialskikten och Yki och GFP uttryckande kloner (grön). Skala bar = 25 μm. ( D ) Mosaic wing imaginal skiva av tredje instar larva med kloner som uttrycker Yki 3SA och GFP (grön) 4 dagar efter värmekok induktion, färgad för MMP1 (röd). Skalstång = 100 μm. Detaljerad genotyper: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act> CD2> GAL4, UAS-EGFP ( värmekokad 30 min vid 2 dygn AED, inkubera 4 dagar vid 25 ° C).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAL4-UAS-systemet är ett av de mest kraftfulla genetiska verktygen för målinriktat genuttryck i Drosophila 26 och underlättar kraftigt inducering och analys av tumörceller in vivo 4 . Detta system möjliggör generering av kloner som bär knockdown av tumör-suppressorgener eller överuttryck av onkogener inom vildtypsepitelvävnad, en situation som mycket liknar de initiala stadierna av humankanker, där transformerade pro-tumorceller är omgivna av normala epitelceller. GAL4-drivlinor som regleras av förstärkningssekvenser såsom GAL4-förstärkare-fällningslinjer eller Janelia GAL4-linjer 27 har unika spatiotemporärt begränsade expressionspatroner. Därför är dessa förstärkare-GAL4-linjer användbara för att inducera tumörer konsekvent i begränsade områden av imaginala skivor. Förutom sd-GAL4 och upd-GAL4 som visas i denna studie, bekräftade vi att lgl- knockdown inducerad by andra förstärkare-fällan GAL4 linjer inklusive engrailed-GAL4 (en-GAL4), hedgehog-GAL4 (hh-GAL4), optomotor blinda-GAL4 (omb-GAL4), patched-GAL4 (ptc-GAL4) och spalt-för stor GAL4 ( salm-GAL4 ) kan generera neoplastiska tumörer i gångjärnsområdena av vinge-imaginala skivor. Om enhancer-GAL4-expressionsmönstret måste kontrolleras temporärt, är en kombination av GAL4 och en temperaturkänslig version av GAL80 (GAL80 ts ) ett alternativ. GAL80 ts undertrycker GAL4-funktionen vid 18 ° C men inte vid 29 ° C, vilket medger att UAS-transgener kan slås på eller stängas av vid behov 28 .
Det utfällbara GAL4-mosaiksystemet, som kombinerar FLP-FRT-systemet och GAL4-UAS-systemet 3 , genererar slumpmässiga kloner i imaginala skivor. Genom att kombinera värmechock-inducerbar flippas (hsFLP) med utflöde GAL4, är klongeneratens tidpunktJon är kontrollerbar. Eftersom den tumörgeneriska potentialen hos imaginala skivceller kan vara beroende av utvecklingsstadiet, endogena signaleringshändelser och / eller celldifferentiering 29 , 30 , är det mycket viktigt att undersöka effekten av förändrad värmechocktidning på tumörgeneriska fenotyper.
Det har tidigare visats att nTSG-mutanta kloner genomgår celltävlingsberoende apoptos när de omges av vildtypsceller 10 , 11 , 12 , 18 , vilket föreslår att flera mutationer erfordras för celltransformation under cancerutveckling. Faktum är att överuttryck av onkogen Ras eller Yki i lgl eller scrib mutantkloner omvandlar dem till aggressiva tumörer 10 , 18 , 31 medan missUttryck av Ras V12 eller Yki 3SA inducerar inte malign neoplasma i sig utan nTSG-mutationer. Såsom visas här och tidigare 16 genomgår pro-tumör-nTSG-knockdown-kloner genererade i vildskivor av vildtyp också apoptos och visar inte tumogenesen i vingepåsen 16 . Samtidigt utvecklas nTSG-knockdown-kloner i gångjärns "hotspots" till neoplastiska tumörer utan några ytterligare onkogena mutationer. I gångjärnsområden kapar nTSG-bristande celler endogen Janus-kinas / signaltransducer och aktivator för transkriptions (JAK / STAT) signaler för att driva tumörgenesen 16 . Därför är gångjärnsspecifika GAL4, såsom uppdatering-GAL4, användbara verktyg för konsekvent inducerande neoplastisk tumörbildning genom RNAi- medierad nedbrytning av tumörundertryckningsgener. Även om flip-out-GAL4-inducerad nTSG-knockdown-mosaikkloner inducerar också neoplastiska tumörer i gångjärnsreaktionGions, tumörigenes förekomst beror på initial klonstorlek: stora kloner genererade av en värmeschock över 20 min ger vanligen tumörgenesen, medan de flesta små kloner som genereras av värmekok kortare än 10 min elimineras fullständigt (KM och YT, obublicerad data).
Ett antal nyligen genomförda studier om tumörutveckling och cancerprogression använder Drosophila imaginal skivor som modellsystem 32 , 33 . Vanliga för dessa studier innefattar flera markörer av neoplastiska tumörer: avvikande cellmassor, deformerade skivformer, ackumulering av F-aktin, förbättrad cellcykel (BrdU / EdU-inkorporering eller PH3-uttryck), aktivering av JNK-signalering och dess nedströms mål MMP1, basalmembran Störning och / eller epithelial disorganisation, inklusive förlust eller subcellulär delokalisering av proteiner involverade i apikalbasalcellspolaritet (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 eller PAR-6), septatförbindelser(Lgl, Scrib, Dlg eller Coracle) eller adherens-korsningar (E-Cadherin eller Armadillo). Dessa fenotyper är lätt detekterbara genom konventionell antikroppsfärgning. Även om det är svårt att bestämma om en klonal fenotyp är hyperplasi, dysplasi, godartad neoplasma eller malign neoplasma i tidigt stadium av tumörgenesen, bör det vara enklare i Drosophila imaginal disc epithelia som består av ett enda epithelial monoskikt. I denna studie introducerade vi en diagnosmetod för att klassificera tumörklonfenotyper inducerad i epitelialskiktet ( Figur 1 ). Denna metod kräver noggranna observationer av fem kriterier med hjälp av z-stack konfokala bilder; Varje diagnostiskt kriterium kan undersökas med konventionell antikroppsväggning och konfokalbildning. En av de nya kriterierna som vi introducerade i denna metod är "4-cell-diameter-kriterier" som diskriminerar mellan dysplasi och neoplasma i imaginalskivor. Pro-tumörceller såsom nTSG-mutantkloner är frekventaLy extruderas från epitelskikt genom celltävling eller spindelförorientering 15 , 16 , 34 . I de flesta situationer apoptoser dessa extruderade celler, och så kan de inte proliferera. Även om det kan vara möjligt att pro-tumorcellerna genomgår celldelning en gång under extrudering och en eller två gånger mer efter strängsprutning, bildar detta en cellmassa med 2- till 3-celldiametern. Om en cellmassa av pro-tumorceller som avviker från epitelskiktet är större än 4-celldiametern, kan vi därför bestämma att de överlever och prolifererar som en neoplasma utanför epitelskiktet.
Även om denna diagnosmetod är enkel är det kritiskt att ta en tidskurs av fenotyper, eftersom tumörutveckling och malignitet utvecklas genom tiden. Dysplasi är till exempel en cytologiskt abnorm vävnad och ett övergångsstatus mellan helt godartade tillväxter och de som är föremalign. Även om en observerad klon definieras som en dysplasi i enlighet med flödesschemat ( figur 1 ) är det därför möjligt att dysplasien därefter utvecklas till en neoplasma. Även om larvstadiet är begränsat i tid (5-6 dagar vid 25 ° C eller 4 - 5 dagar vid 29 ° C AED) förlänger tumörtillväxten i imaginalskivor larvalsteget genom en insulinliknande peptidinducerad fördröjning av pupilation 35 , 36 . Därför gör neoplastisk tumörbildning i imaginala skivor det möjligt att observera tumörklo-fenotypisk progression i flera dagar. Vår enkla klassificeringsmetod kan vara brett tillämplig på klonanalysen av tumörfenotyper i olika organ i Drosophila .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar J. Vaughen för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av bidrag från JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 och Takeda Science Foundation Research Grant till YT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
