Summary
Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız.
Abstract
Kanserin erken evrelerinde, dönüştürülmüş mutant hücreler sitolojik anormallik gösterir, kontrolsüz aşırı büyümeye başlar ve doku organizasyonunu giderek bozmaktadır. Drosophila melanogaster , tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için kanser biyolojisinde popüler bir deneysel model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Drosophila imaginal diskler için genetik araçlar (larvalarda gelişen epitel), insan kanserinin başlangıç evrelerine benzer bir durum olan normal bir epitel dokusunda dönüştürülmüş pro-tümör hücrelerinin oluşturulmasını sağlar. Bununla birlikte, Drosophila kanat imaginal disklerinde yapılan tümörigenez üzerine yakın tarihli bir çalışmada, tümör başlangıcının doku intrensek sitolojik mimarisine ve yerel mikro çevreye bağlı olduğunu göstermiştir; bu, imaginal olarak tümör fenotiplerini değerlendirmede tümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik duyarlılığın göz önüne alınmasının önemli olduğunu düşündürmektedir diskler. Tümör gelişiminin fenotipik analizini kolaylaştırmakİmaj disklerinde, burada, kanat imgesel disklerinde neoplastik tümörleri indüklemek için GAL4-UAS sistemini kullanan genetik deneyler için bir protokolü açıklıyoruz. Daha önce tarif edilmemiş olan, tümör progresyonunun çeşitli aşamalarını (hiperplazi, displazi veya neoplazi gibi) ayırt etmek için net bir sınıflandırma yöntemi olduğu için, imaginal epitelde indüklenen klonal lezyonların fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi daha sunuyoruz. Bu yöntemler, Drosophila'daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.
Introduction
Epitel dokuları, gelişim ve hücre döngüsü yoluyla organizasyonlarını sürdürmek için olağanüstü homeostatik kabiliyet gösteren oldukça organize sistemlerdir. Bununla birlikte, bu sağlam kendi kendini düzenleyen sistem, tümör gelişiminde aşamalı olarak bozulmaktadır. Tümör gelişiminin başlangıcında, bir onkojen aktivasyonundan ya da tümör süpresör geni inaktivasyonundan kaynaklanan mütasyona uğramış hücreler epitel tabakasında ortaya çıkar. Bu "tümör öncesi hücre", baskılanmış bir ortamdan kaçınır, epitelin düzenlenmesini bozar ve kontrolsüz çoğalmaya başlar, tümörojenez oluşur 1 . Son birkaç on yıl içinde, genetik ve moleküler biyolojideki olağanüstü teknolojik gelişmeler kanser araştırmaları konusunda kayda değer ilerlemeler kaydetti. Özellikle, Drosophila melanogasterinde genetik olarak mozaik analiz araçlarını kullanan, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase hedefi) mitoz rekombinası gibi son çalışmalarAtion 2 ve flip-out-GAL4-UAS (upstream aktivasyon dizisi) sistemleri 3 , tümörler 4 , 5 , 6'nın oluşumu ve metastazında rol oynayan genetik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük katkı sağladı.
Korunmuş Drosophila tümör süpresör genleri, ölümcül dev larvalar ( lgl ), büyük diskler ( dlg ) ve karalamalı ( scribble ) bir grup üzerinde yapılan çalışmalar, bu genlerin önemli rol oynadığı için epitel organizasyonu kaybı ile tümör gelişimi arasındaki kritik ilişkiyi vurguladı Epitelyal dokularda apikal-bazal hücre polaritesi ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde 7 . Drosophila imaginal diskleri normal olarak tek tabaka epiteliyken, bu üç genin herhangi birindeki homozigot mutasyonlar, hücrelerin yapısını ve polaritesini kaybetmesine neden olur, farklılık oluşturmazlarKirletir, aşırı yayar ve nihayetinde komşu dokularla kaynaşan çok tabakalı amorf kütleler oluşturur 7 . Benzer bir şekilde, memelilerde, bu genlerin bozulması, kötü huylu tümörlerin 8, 9 gelişiminde ilgilenmektedir. Mutant dokular tarafından sergilenen neoplastik fenotipler, bu üç genin korunmuş, neoplastik tümör baskılayıcı genler (nTSG'ler) 7 , 8 olarak sınıflandırılmasına yol açtı. Homozigot nTSG mutant hücrelerinin düzensiz FLP FRT aracılı mitotik rekombinasyon kullanılarak vahşi tip hayali diskler geliştirilmesinde oluşturulur Bununla birlikte, mutant hücreler, c-Jun N-terminal kinazın (JNK) bağlı apoptoz 10, 11 aracılığıyla dokunun elenir , 12 , 13 , 14 , ekstrüzyon 15 , 16 veya komşular tarafından yutkunma ve fagositoz 17 . Bu genetik olarak mozaik epitelyumda, apoptoz çoğunlukla klon sınırında yer alan nTSG mutant hücrelerinde saptanır ve bitişik normal hücrelerin nTSG mutant hücrelerinin apoptozunu tetiklediğini düşündürür. Bu , 10 , 11 , 12 , 18 . Memeli hücrelerinde yapılan son çalışmalar bu tümör öncesi hücrelerin hücre rekabetine bağlı eliminasyonunun kansere karşı evrimsel olarak korunmuş epitelyal bir kendini savunma mekanizması olduğunu doğruladı 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Bununla birlikte, Drosophila imaginal disklerinde yapılan yeni bir çalışmada, mozaik nTSG knockdown klonlarının spesifik olarak neoplastik tümörleri indüklediği gösterilmiştirKanat imgesel disklerin buz bölgeleri 16 . Başlangıçtaki tümör oluşumu periferik "menteşe" bölgesinde daima bulundu ve kanat disk epitelinin merkezi "kese" bölgesinde asla gözlenmedi, bu, nTSG knockdown hücrelerinin tümörojenik potansiyelinin yerel ortama bağlı olduğunu düşündürdü. Merkezi kese bölgesi, pro-tümör hücrelerinin displastik aşırı büyüme göstermediği bir "tümör soğuk noktası" olarak işlev görürken, çevresel menteşe bölgesi "tümör sıcak noktası" olarak davranır 16 . "Soğuk nokta" kese bölgelerinde, nTSG knockdown hücreleri bazal taraftan laminatlaşır ve apoptozise girer. Aksine, "sıcak nokta" menteşe hücreleri, bazal yanlarında sağlam bir sitokkelet yapıları ağı bulunduğundan, nTSG knockdown hücreleri epitelin apikal yanından kat katlanır ve tümöre özgü aşırı büyümeyi başlatır 16 . Bu nedenle, imgesel disklerdeki tümör fenotiplerinin analizi dikkatli bir şekilde yapılmasını gerektirirTümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik yatkınlığın azalması.
Burada, normal kanat disk epitelinde nTSG knockdown hücrelerinin üretildiği GAL4-UAS- RNAi sistemini kullanan Drosophila kanat imaginal disklerinde neoplastik tümör oluşumunu indükleyen bir protokolü açıkladık. Bu deneysel sistemler kanserin erken safhalarını incelemek için yararlı olsa da, imaginal disk epitelyumundaki tümör progresyon evrelerini değerlendirmek için açık bir sınıflandırma yöntemi daha önce açıklanamamıştır. Bu nedenle, kanat diski epitelyumunda indüklenen tümör öncesi klonal fenotipleri üç kategoriye ayırmak için bir teşhis metodu öneriyoruz: Hiperplazi (artmış proliferasyonu olan aşırı miktarda normal görünen hücrelerin birikimi), displazi (anormal olarak görülen premalign doku Hücreler) ve neoplazi (benign veya malign tümör, anormal görünüm ve anormal proliferasyon paternine sahip hücrelerden oluşur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Haçlar ve Klon İndüksiyonu
- Bakire flies toplamadan önce flakona 12 saat boyunca tüm sinekler çıkarın.
- Şişe içindeki sinekleri CO 2 gazı enjekte ederek anestezi altına alın ve CO 2 sineklik pedi üzerine sinek yerleştirin.
- 10 - 20 bakire dişiyi ve 10 erkek, CO 2 sineklik pedinden yeni bir tüp içine aktarın ve 1 gün süreyle 25 ° C'de inkübe edin.
- Bu sinekleri yeni bir flakona aktarın ve 12 saat 25 ° C'de inkübe edin.
NOT: Bakire dişiler ilk gün yeterli miktarda yumurta bırakmadığı için ilk flakonu atın. - Geliştirici-GAL4 hatları için, yetişkin sinekleri çıkarın ve diseksiyona kadar 25 ° C'de flakonu inkübe edin.
- Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için, yetişkin sinekleri çıkarın ve 25 ° C'de 2-4 gün inkübe edin. Isı şoku öncesi inkübasyon süresi deneysel amaca bağlıdır. Yumurta tortulaştırmasından 2 gün sonra bir ısı şoku (AED) olgunlaşmamış ikinci mozaik klonlar üretirInstar imaginal epitel. 3 veya 4 gün sonra bir ısı şoku AED, erken-orta üçüncül instar imaginal epitelyumda ayırt edilen mozaik klonlar üretir.
NOT: Değiştirilmiş ısı şoku zamanlamasının tümöre özgü fenotipler üzerindeki etkisini incelemek önemlidir. - Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için flakonu, 37 ° C'lik bir su banyosuna 10-45 dakika batırın, ardından 25 ° C'de 2 - 3 gün inkübe edin.
NOT: Her bir deneydeki ısı şoku zamanı, zamanlaması ve kuluçka süresi bilgileri şekil şekillerinde gösterilmiştir.
2. Larvaların Diseksiyonu
- Bir flüoresan stereoskopik mikroskop altında uygun floresan işaretleyiciler ( örn. , EGFP) tarafından genotip onları ahşap bir sopa veya künt forseps ile dolaşıp üçüncü instar larvaları toplayın ve onları PBS (fosfat tamponlu salin) ile bir diseksiyon çanak yerleştirin.
- 2 mL plastik transfer pipet ile pipetleme PBS içinde larvaları yıkayın.
- Bir forsepsle larva merkezini sıkıştırın ve diğer forsepslerle vücudunuzu yarısı kadar yırtın.
- Ön yarımın ağız kancasını bir forsepsle sıkıştırın ve vücudu içeri doğru dışarı çevirmek için ağzı diğer forsepslerle vücuda doğru itin.
- Tükrük bezleri veya yağ cisimleri gibi gereksiz malzemeleri forsepsle çıkarın.
3. Fiksasyon ve Antikor Boyama
- 1.5 mL'lik bir plastik tübün içine larval gövdenin (yarı kanat diskleri dahil) disseke edilmiş ön yarısını aktarın ve yumuşak rotasyon ile karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Fix çözeltisinin 1 mL'sinde (PBS'de% 4 formaldehid) sabitleyin.
DİKKAT: Formaldehit zehirlidir ve kanserojen potansiyeline sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin.
NOT: Bu bölümde, aksi belirtilmediği sürece, tüm basamaklar karanlıkta oda ısısında bir besleyicide gerçekleşir. - Fix çözümünü çıkarın ve atın. Dokuları 1 mL PBT (% 0.3 TritPBS'de X-100 üzerinde) üç kez üç kez 15 dakika boyunca uygulandı.
- PBT'yi çıkarın ve 1 saat süreyle oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C'de 1 saat süre ile bloke edip 1 saat süreyle bekletin. PBTG (PBT'de% 0,2 sığır serumu albumin ve% 5 normal keçi serumu) 1 mL ekleyin.
- PBTG'yi çıkarın ve PBTG ile uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 4 ° C'de hafifçe kavrayın.
- Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile üç kez 15 dakika boyunca yıkayın.
- PBT'yi çıkarın ve PBTG (1: 400) ile uygun şekilde seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca veya 4 ° C'de gece boyunca nutatlayın.
- İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın.
- F-aktin lekesi için, PBT'yi çıkarın ve PBS (1:40) içinde uygun şekilde seyreltilmiş Phalloidin çözeltisi ekleyin. Sonra 20 dakika boyunca kestirin. Phalloidin çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın.
- Nükleer DNA'yı kontrast haline getirmek için PBT'yi çıkarın ve DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini ekleyin (PBS içerisinde 0.5 μg / mL DAPI). Sonra 10 dk.
DİKKAT: DAPI kanserojen potansiyele sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin. - DAPI çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın.
- 1 mL PBS'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir kez yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve ön montaj ortamı olarak 500 μL% 100 gliserol ekleyin.
4. Mikroskop Slaytlarına Monte Edilmesi
- 2 mL plastik transfer pipet kullanarak mikroskop lamı üzerine lekelenmiş dokuları yerleştirin.
- Dokuları, forseps ile başka bir mikroskop slayt üzerinde montaj orta damla için aktarın.
- Diseksiyon dokusunun ucunu bir forsepsle basılı tutun ve diğer forsepslerle beyin ve göz antennal disklerini çekin.
NOT: Parçalanmış beyinleri kanat görüntü disklerine yakın konumda tutun. Beyin, lamellerin kanat imgesel disklerini ezmesini engelleyen bir platform gibi hareket eder. - Kanat imaginal disklerini izole etmek için diseksiyon yapılan dokunun ucunu bir forsepsle tutun ve vücut duvarını hafifçe çizin ve diğer forsepslerle diskleri yırtın.
NOT: Kanat imaginal diskleri bulmak zorsa, trakeayı posteriordan anteriora doğru soyun. Kanat imaginal diskleri trakeaya yapışır. - Düşünceli diskleri bir lamel ve nail polisaj ile hafifçe örtün; 4 ° C'de saklayın.
5. Konfokal Mikroskopi
- Bir konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler elde etmek için emisyon dalga boyu aralığı, lazer yoğunluğu, kazanç, ofset, tarama hızı ve görüntü boyutu dahil olmak üzere görüntü toplama parametreleri ayarlayın 24 .
NOT: Görüntü elde etme ayarlarının ayrıntılı prosedürü için, her mikroskop üreticisinin verdiği kullanım kılavuzuna bakın. - Tek bir ortak yakalamak içinTüm kanat imgesel diskinin nfokal bölümleri, 20X nesnel bir lens kullanın.
- 40X veya 60X mercekleri kullanarak 0,5 - 1,0 μm adım boyutunda z-yığın taraması ile 3 boyutlu görüntüler elde edin.
NOT: Yüksek çözünürlükte hücresel fenotipleri analiz etmek için bir görüntü boyutu 512 x 512 pikselden daha büyük olmalıdır.
6. ImageJ kullanarak Görüntü Analizi
- Konfokal z-yığın görüntülerini elde etmek ve analiz etmek için biyolojik görüntü analizine (https://fiji.sc/) 25 odaklanmış açık kaynaklı ImageJ yazılımı olan Fiji'yi kullanın.
- Dikey bölümler elde etmek için, ImageJ'deki z-yığın görüntülerini açın ve "Image / Stacks / Reslice" menü öğesini seçin.
NOT: Reslice menüsünde XZ ekseni veya YZ ekseni seçilebilir. Düşey kesit, z-yığın resmine düz bir çizgi veya dikdörtgen çizerek keyfi bir yönde de elde edilebilir.
7. Neoplastik Fenotiplerin Teşhisi
- Dikey açmaBir dizi z-yığın görüntüsünden elde edilen kesitler (XZ veya YZ ekseni) ve morfolojik fenotipleri ve antikor boyamasını analiz eder.
- Tümör fenotiplerinin teşhisi için, esas olarak aşağıdaki üç noktaya odaklanmak: (1) knockdown klonları da dahil olmak üzere bir hücre kitlesi ana epitel tabakasından saparsa, (2) junctional proteinlerin subselüler lokalizasyonu bu hücre kütlesi içinde değişirse Ve (3) eğer bu hücre kütlesinin çapı 4 hücreden büyükse.
- Şekil 1'de açıklanan akış şemasına göre tümör fenotiplerini kategorize edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila kanat imaginal disklerinde RNAi aracılı nTSG-knockdown ile deneysel olarak indüklenen neoplastik tümör oluşumunu göstermek için lgl veya scrib için UAS-RNAi ifade etmek için üç farklı GAL4 sürücüsü kullanılmıştır: (1) sd-GAL4, güçlü UAS ekspresyonunu Kanat çantası ve menteşe bölgelerinde hafif ifade ( Şekil 2 ve Şekil 3A ); (2) dorsal medial katmanın iki alanındaki kuvvetli ekspresyon, bir ön-lateral alanın yumuşak ekspresyonu ve ventral-posterior alanın zayıf ekspresyonu da dahil olmak üzere menteşenin alt alanlarında sürüklenen upd-GAL4 ( Şekil 2 ve Şekil 3C ); Ve (3) UAS-genlerini ifade eden rastgele mozaik klonlar üreten, ısı şokuyla indüklenen flip-out GAL4 ( Şekil 4 ve FiGure 5). Tüm deneylerde UAS-EGFP , knockdown klonlarını işaretlemek için UAS-RNAi ile birlikte ifade edildi.
Önce kanat kılıfı ve menteşe bölgelerinde lgl'nin düşürülmesini indüklemek için sd-GAL4 ile çalışan lgl-RNAi kullanıldı. UAS-IgG-RNAi içermeyen kontrol üçüncü instar kanat disklerinde, hiçbir morfolojik değişiklik oluşmadı ( Şekil 3A ). Aksine, lgl-RNAi'yi ifade eden üçüncü instary kanat disklerinde epitelial deformasyonlar ve tümör oluşturan aşırı büyümeler menteşenin bazı bölümlerinde açıkça görülmüştür ( Şekil 3B ). Bununla birlikte, kanat çantası bölgesinde, displastik aşırı büyüme gözlemlenmemiştir. Tümörlü menteşe lezyonlarında güçlü MMP1 (matriks metalloproteaz-1) ekspresyonu gözlenirken kanat çantası bölgesinde görülmedi ( Şekil 3B ). MMP1 ekspresyonu, bazal membranın bozunmasına neden olduğundanEskiden, bu menteşe tümörlerinin metastatik kapasiteye sahip olması mümkündür ( Şekil 3B ). Daha sonra, menteşe bölgesinde lgl knockdown'u başlatmak için upd -GAL4 kullanıldı. UAS-IgG-RNAi içermeyen kontrol üçüncü instar kanat disklerinde, herhangi bir morfolojik değişiklik oluşmadı ( Şekil 3C ). Bununla birlikte, 5 günlük AED'den sonra, upd -GAL4 ve IgGl-RNAi'li üçüncü instar kanat diskleri, epitel tabakasından F-aktin birikimi ve klon yer değiştirmesi ile belirgin epitelyal düzensizlik göstermiştir ( Şekil 3D ). 6 gün AED'de, MMP1'i eksprese eden neoplastik tümörler, örnekler arasında tümör boyutunda değişiklik olmasına rağmen ( Şekil 3E ve F ) menteşe bölgesine aşırı yüklenmiştir ( Şekil 3G ). Menteşe bölgesinin dikey bir kesiti, neoplastik tümörün epitel tabakasının apikal tarafında sapma gösteren dışa vurum geçirdiğini doğruladı ( IgG knockdown ile indüklenen tümör büyümesinin ilerlemesini izlemek için, ısı şokuna bağlı ters çevrilmiş GAL4 mozaik sistemi kullanılarak kanat disklerinde lgl-RNAi eksprese eden sporadik klonlar oluşturuldu. İkinci instar larva (2 gün AED) için ısı şokundan iki gün sonra, menteşe bölgesindeki bazı lgl- knockdown klonları epitel tabakasının apikal yanından sapma gösterdi ( Şekil 4A ). Isı şoku indüksiyonundan dört gün sonra, menteşe bölgesindeki displastik lezyonlar belirginleşti ve lümen apikalinden uzaklaşan lgl- knockdown klonlarının lümende çoğaldığını düşündürdü ( Şekil 4B ). Isı şoku indüksiyonundan yedi gün sonra, menteşe bölgelerinde tümör oluşturan aşırı büyümeler baskın hale geldi ( Şekil 4C ). Göstermek içinTanı yöntemiyle klonal fenotiplerin sınıflandırılması, kanat disklerinde ısı şokuyla indüklenen ters çevrilmiş GAL4 mozaik sistemi kullanılarak scrib-RNAi ifade eden sporadik klonlar oluşturuldu. İkinci instar larva (2 gün AED) için ısı şokundan beş gün sonra, bazı GFP ifade eden keskin -knockdown klonları, tümöre özgü fenotipleri gösterdi ( Şekil 5A ). 2D konfokal görüntülerde ayrıntılı sitolojik ve yapısal fenotipleri elde etmek zordur, ImageJ kullanılarak z-stack konfokal görüntülerin dikey kesitlerinde dört klonunu ( Şekil 5A'daki B, C, D ve E) analiz ettik ( Şekil 4 ve Şekil 5A ). B ve C klonları, septat bağlantılı protein olarak displazi olarak sınıflandırıldı. Büyük (Dlg) diskler yanlış lokalize edildi ( Şekil 5B ve C ). B klonunda, epitelden çıkarılan hücre kütlesi boyutu diametredeki 4 hücreden daha büyük değildiR ( Şekil 5B ), klon C ise epitelden sapmadı ( Şekil 5C ); Dolayısıyla B ve C klonları neoplastik olarak düşünülmemiştir. Bununla birlikte, aynı zamanda Dlg'nin yanlış lokalizasyonu gösterdiği D ve E klonları, epitelyum dışında tümör hücresi kitleleri oluşturdu ( Şekil 5D Ve 5E ). Bu yerinden edilmiş tümörlü klonların büyüklüğü çap olarak 4 hücreden fazla olduğu için, klonlar neoplastik olarak sınıflandırılmıştır. Kanat hayali diskler hiperplastik tümörler veya kist oluşumları teşvik etmek için, temel olarak oncogeneic Ras (Ras V12) ya da Yorkie Hippo yolunun (Yki 3SA) 'in bir kopyalayıcı ortak aktifleştirici aktif formu eksprese sporadik klonlar kullanılarak elde edilmiştir ısı şok kaynaklı Kapak çıkışı GAL4 mozaik sistemi. İkinci instar larvaya ısı şoku uygulandıktan dört gün sonra (2 gün AED), RaGFP tarafından etiketlenen V12 ekspresyon klonları imgesel disklerde yuvarlak hücre kitleleri haline gelmiştir ( Şekil 6A ). Klonu (Şekil 6A'da klon B) 'yi ifade eden Ras V12 olan dikey bir kesit kütle epitelyal tabakasından ayrışmış hücreli hücre kütlesi epitel tabakanın dışında normal epitel yapısı muhafaza düşündürmektedir (Şekil 6B) Dlg doğru lokalizasyonu sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır . Bu Ras V12 ifade eden klonlarda MMP1 ekspresyonu gözlenmedi ( Şekil 6C ). Bu nedenle, klon B, kist oluşumu olarak sınıflandırılmıştır. Dört gün, ikinci instar larvalarına karşı ısı şokundan sonra (2 gün AED), GFP ile işaretlenmiş Yki 3SA 'yi ifade eden klonlar, hayali diskler (Şekil 7A) büyük hücre kütleler meydana getirene. İki klona odaklandık ( Şekil 7A'daki B ve C). Klon B gösterdiepitel hücrelerinin bir alt-apikal zarlarında epitel tabakası ve Dlg uygun lokalizasyon entegrasyonu, Yki 3SA 'yi ifade eden klon B epitel yapısı muhafaza düşündürmektedir. Dolayısıyla, klon B hiperplazi olarak sınıflandırılmıştır ( Şekil 7B ). Menteşe bölgesinde bulunan klon C, Dlg'nin yanlış lokalizasyonu gösterdi ve epitel tabakasının bazal tarafında çok katmanlı yapı oluşturdu. MMP1 sentezleme Yki 3SA 'yi ifade eden klonlar gözlenmedi. Birlikte ele alındığında, C klavuzu benign neoplazi olarak sınıflandırıldı ( Şekil 7C ve D ). 5 "sınıf =" xfigimg "src =" / dosyalar / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg "/> 
Şekil 1: Tümör Fenotiplerinin Sınıflandırılması İçin Akış Şeması. Bu akış çizelgesi, imaginal epitelyumdaki klonal lezyonları sınıflandırmak için bir tanı yöntemini temsil eder. Klasik(1) klonların epitel tabakadan sapması, (2) junctional proteinlerin subcellüler mislokalizasyonu, (3) hücre proliferasyonu, (4) klon büyüklüğü ve (5) MMP1 ekspresyonu olmak üzere beş kritere dayanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. 
Şekil 2: ( A ) Dlg (yeşil) ve çekirdekler (DAPI, macenta) için boyanan vahşi kanat imaginal disk. ( B ) Kanat çantası (mavi), menteşe (turuncu) ve notum (yeşil) bölgelerini gösteren Drosophila kanat imgesel disklerinin şematik gösterimi. ( C ) Normal kanat imaginal disk F-aktin (kırmızı) ve mikrotübüllerle (yeşil) boyandı. Taban zarları, Kollajen IV / Vkg-GFP (mavi) ile etiketlenmiştir. ( D ) Sitenin dikey kesiti( C ) 'de beyaz noktalı çizgi ile işaretlenmiştir. ( E ) Çizgi çizimleri ( D ) epitel tabakasının apikal (kırmızı) ve bazal (mavi) taraflarını izlemektedir. Noktalı çizgiler peripodiyal zarı izler. Dorsal menteşenin distal (Df), medial (Mf) ve proksimal (Pf) katları belirtilmiştir.
Ayrıntılı genotipler: A, w - CD, Vkg-GFP Bu şekli daha geniş bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 3: Enhancer-GAL4s ile indüklenen yere özgü tümör oluşumu. ( A , B ) Konfokal görüntüler, MMP1 (kırmızı) lekelenen belirtilen genotiplerin üçüncü instar larva'larından ayrılan kanat imaginal disklerini göstermektedir. Sd-GAL4- ifadesiSsing bölgeleri GFP ifadesi (yeşil) ile etiketlenmiştir. ( CG ) Konfokal görüntüler, gösterilen genotiplerin üçüncü instar larvalarından kesilen kanat imaginal disklerini belirtilen zaman noktasında AED gösterir. F-aktin, Phalloidin (kırmızı) ile ( CF ) boyandı. MMP1 ekspresyonu ( G ) 'de anti-MMP1 antikorları (kırmızı) ile boyandı. Güncel GAL4 ifade bölgeler GFP ifadesi (yeşil) ile etiketlendi. ( CF ) 'nin alt panelleri üst panellerde belirtilen bölgelerin büyütülmüş görüntüsünü göstermektedir. Beyaz oklar, lgl- knockdown klonları tarafından indüklenen displastik lezyonları belirtir. ( H ) (E) 'nin alt panelinde beyaz noktalı çizgi ile işaretlenmiş olan sitenin dikey kesiti. Beyaz noktalı çizgiler, kanat kılıfı ile (A) ve (B) 'deki menteşe bölgeleri arasındaki sınırları işaretler. Çekirdekler DAPI ile etiketlendi (mavi). Ölçek çubukları (AG) 'de 100 μm ve (H)' de 50 μm. Ayrıntılı genotipler: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS dicer2; UAS LGL-RNAi; C, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS dicer2; Dh, a -, UDP-GAL4 UAS EGFP; UAS dicer2; UAS-lgl-RNAi Bu şekli daha geniş bir sürümünü görmek için buraya tıklayın. 
Şekil 4: Random Mozaik Klonlar Tarafından İndüklenen Tümör Fenotipleri. ( AC ) Konfokal görüntüler, ısı şoku indüksiyonundan sonra belirtilen zaman noktasında lgl-RNAi ve GFP'yi (yeşil) birlikte ifade eden klonlarla üçüncü instar larvaların mozaik kanat görüntü disklerini göstermektedir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlendi. Orta paneller, sol panellerde işaretlenmiş beyaz kare bölgelerin büyütülmüş görünümlerini göstermektedir. Sağ panel S epitel tabakalarının apikal yanının (mavi) ve GFP ifade eden klonların (yeşil) şematik çizgilerini göstermektedir. Epitel içinde bulunan mozaik klonlar açık yeşil renkte gösterilirken epitelden sapmış neoplastik tümörler kırmızı renkte gösterilir. Sol panellerde beyaz noktalı çizgiler, kanat çantası ve menteşe bölgeleri arasındaki sınırları işaretler. Orta panellerdeki beyaz oklar lgl- knockdown klonları tarafından indüklenen displastik lezyonları belirtir. Ölçek çubukları = 100 μm. Ayrıntılı genotipler: AC, hsFLP; UAS dicer2; (2 gün AED'de ısı şokuyla 30 dakika, A'da 25 ° C'de 2 gün inkübe edin, B'de 25 ° C'de 4 gün inkübe edin, 7 gün inkübe edin) CD2> GAL4, UAS-EGFP / UAS-Ig-RNAi Isı şoku sonrası C'de 25 ° C). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Displastik Klon Fenotiplerinin Teşhis Muayenesi. ( A ) Sol panel, Dlg (kırmızı) lekelenen, ısı şoku indüksiyonundan 5 gün sonra, scrib-RNAi ve GFP'yi (yeşil) birlikte ifade eden klonlarla üçüncü instar larvanın bir mozaik kanadı imgesel diskini göstermektedir. Sağ panel, epitel tabakalarının apikal tarafının (mavi) ve GFP ifade eden klonların (yeşil) şematik bir çizgi çizimini göstermektedir. Epitel katmanlarındaki mozaik klonlar açık yeşil renkte gösterilirken epitelden çıkan neoplastik tümörler kırmızı renkte gösterilir. ( BE ) Konfokal görüntüler, (A) 'nın sağ panelinde belirtilen keskin- knockdown klonlarının dikey kesitlerini göstermektedir. Sol taraftaki ikinci paneller, Dlg yerelleştirme modellerini (kırmızı) göstermektedir. Soldan üçüncü paneller, epitel tabakalarının apikal (kırmızı) ve bazal (mavi) kenarlarının şematik çizgilerini ve GFP-ekspresini göstermektedirÖzlü kurnaz knockdown klonları (yeşil). Epitel tabakalardaki displastik klonlar açık yeşil (B ve C) olarak gösterilirken epitelden çıkan neoplastik klonlar macenta (D ve E) olarak gösterilir. Beyaz oklar, tümöre özgü fenotipi gösteren keskin- knockdown klonlarını göstermektedir. Çekirdekler DAPI ile etiketlendi (mavi). Ölçek çubuğu = 50 μm. Her bir klonun tümör fenotipi Şekil 1'de gösterilen akış şemasına göre sınıflandırılmıştır. Ayrıntılı genotipler: AE, hsFLP; UAS Scrib-RNAi; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (ısı şokundan sonra 2 gün AED'de 30 dakika ısı şokuyla 4 gün 25 ˚C'de inkübe edin). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. 
Şekil 6: TanılarRas V12 tik Sınav klonal fenotipleri yi ifade eden. ( A ) Sol panel, Dag (kırmızı) lekelenen, ısı şoku indüksiyonundan 4 gün sonra onkojenik Ras V12 ve GFP'yi (yeşil) birlikte ifade eden klonları olan üçüncü instar larvanın bir mozaik kanadı imgesel diskini göstermektedir. Sağ panel, epitel tabakalarının apikal tarafının (mavi) ve GFP ifade eden klonların (yeşil) şematik bir çizgi çizimini göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder. ( B ) (A) 'nın sağ panelinde belirtilen Ras V12 ifade klonlarının dikey kesitleri. Sol taraftaki ikinci paneller, Dlg yerelleştirme modellerini (kırmızı) göstermektedir. Sol taraftaki üçüncü paneller, epitel tabakalarının apikal (kırmızı) ve bazal (mavi) kenarlarının ve Ras V12 ve GFP ifade klonlarının (yeşil) şematik çizgilerini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 25 μm. ( C ) Eşlik eden klonlarla üçüncü instar larva'nın mozaik kanadı imgesel diski <Em> Ras V12 ve GFP (yeşil), ısı şoku indüksiyonundan 4 gün sonra MMP1 (kırmızı) lekelenmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Ayrıntılı genotipler: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Act> CD2> GAL4, UAS-EGFP (ısı şokundan 45 dakika sonra AED, ısı şokundan sonra 4 gün 25 ° C'de inkübe edin). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. 
Şekil 7: Yki 3SA 'yi ifade eden klonal fenotipleri Tanısal Sınav. (A), sol panel ile üçüncü instar larvasının mozaik kanat hayali diski göstermektedir klonlar birlikte eksprese Dlg (kırmızı) için boyandı 4 gün ısı-şok indüksiyondan sonra yapısal olarak aktif Yki 3SA ve GFP (yeşil). Sağ panel şu şekilde gösteriyor: Epitel tabakalarının apikal yanının (mavi) ve GFP ifade eden klonların (yeşil) kimyasal çizgi çizimi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (A) sağ panelde bulunan klonlan Yki 3SA (BC), dikey bölümler. Sol taraftaki ikinci paneller, Dlg yerelleştirme modellerini (kırmızı) göstermektedir. Soldan üçüncü paneller, epitel tabakalarının apikal (kırmızı) ve bazal (mavi) kenarlarının şematik çizgilerini ve Yki ve GFP ifade eden klonları (yeşil) göstermektedir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Üçüncü instar larvasının (D) Mozaik kanat hayali disk klonlar birlikte eksprese MMP1 (kırmızı) için boyandı 4 gün ısı-şok indüksiyonundan sonra Yki 3SA ve GFP (yeşil). Ölçek çubuğu = 100 μm. Ayrıntılı genotipler: AD, hsFLP ;; UAS Yki 3SA / hareket> CD2> GAL4 UAS EGFP (AED 2 gün ısı ile şoklanmış 30 dakika, 25 ° C 'de 4 gün inkübe).5901fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürden daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAL4-UAS sistemi, Drosophila 26'da hedef gen ekspresyonu için en güçlü genetik araçlardan biridir ve in vivo tümör hücresi indüksiyonu ve analizini büyük ölçüde kolaylaştırır 4 . Bu sistem, transforme edilmiş pro-tümör hücrelerinin normal epitel hücreleri tarafından çevrelendiği insan kanserinin başlangıç aşamalarına oldukça benzer bir durum olan, vahşi tipli epitel dokusunda tümör baskılayıcı genlerin dökülmesini veya kanserojenlerin aşırı ekspresyonunu sağlayan klonların üretilmesini sağlar. GAL4 arttırıcı tuzak hatları veya Janelia GAL4 hatları 27 gibi arttırıcı dizilerle düzenlenen GAL4 sürücü çizgileri benzersiz, zamana bağlı olarak sınırlanmış ifade şekillerine sahiptir. Dolayısıyla, bu arttırıcı-GAL4 çizgileri, imgesel disklerin kısıtlı alanlarında tutarlı bir şekilde tümörleri indüklemek için yararlıdır. Bu çalışmada gösterilen sd-GAL4 ve upd- GAL4'e ilaveten, lgl- knockdown'un indüklediği bEngleiled-GAL4 ( en-GAL4 ), kirpi-GAL4 ( hh-GAL4 ), optomotor-kör-GAL4 ( omb-GAL4 ), yamalı-GAL4 ( ptc-GAL4 ) ve spalt-majör- GAL4 ( salm-GAL4 ), kanat imgesel disklerinin menteşe bölgelerinde neoplastik tümörler oluşturabilir. Geliştirici-GAL4 ifade şablonu geçici olarak kontrol edilmesi gerekiyorsa, GAL4 ve sıcaklık duyarlı GAL80 versiyonu (GAL80 ts ) kombinasyonu bir seçenektir. GAL80 ts , 18 ° C'de GAL4 fonksiyonunu bastırır, ancak 29 ° C'de değil, UAS transgen ekspresyonunun gerekli olduğu gibi açılıp kapatılmasına izin verir 28 .
FLP-FRT sistemi ve GAL4-UAS sistemi 3'ü bir araya getiren flip-out-GAL4 mozaik sistemi, imgesel disklerde rasgele klonlar üretir. Isı şokuyla uyarılabilir flippaz'ı (hsFLP) flip-out GAL4 ile birleştirerek, klon üreticisinin zamanlamasıIyon kontrol edilebilir. Hayali disk hücrelerinin tümörijenik potansiyel gelişimsel aşamada, endojen sinyal olayları, ve / veya hücresel farklılaşma 29, 30 bağlı olabilir, çünkü tümörijenik fenotiplere değiştirilmiş ısı-şok zamanlama etkisini incelemek için çok önemlidir.
NTSG mutant klonlarının, vahşi tip hücreler 10 , 11 , 12 , 18 ile çevrildiğinde, hücre rekabetine bağlı apoptoza maruz kaldıkları gösterilmiş olup, kanser gelişiminde hücre dönüşümü için birden fazla mutasyon gerektiğini düşündürmektedir. Aslında, lgl veya dikenli mutant klonlardaki onkojenik Ras veya Yki'nin aşın ekspresyonu onları agresif tümörler 10 , 18 , 31'e dönüştürürken , yanlışRas V12 veya Yki 3SA ifadesi nTSG mutasyonlar olmadan kendileri tarafından malign neoplazmı yol açmaz. Burada ve daha önce gösterildiği gibi 16 , vahşi kanat disklerinde üretilen pro-tümör nTSG knockdown klonları da apoptozdan geçmekte ve kanat çantasında 16 tümörigenez göstermemektedir. Aynı zamanda, menteşe "sıcak noktalarda" yer alan nTSG knockdown klonları, ek onkojenik mutasyonlar olmaksızın neoplastik tümörlere dönüşür. Menteşe bölgelerinde, nTSG eksikliği olan hücreler, tümojenezisi 16 tahrik etmek için endojen Janus kinaz / sinyal transdüseri ve transkripsiyon aktivatörünü (JAK / STAT) kaçırır. Bu nedenle, upd -GAL4 gibi menteşeye özgü GAL4'ler, tümör süpresör genlerin RNAi aracılı knockdown tarafından sürekli olarak neoplastik tümör oluşumunu indüklemek için yararlı araçlardır. Flip-out-GAL4 ile indüklenen nTSG knockdown mozaik klonlar menteşe rektöründe neoplastik tümörleri indüklemekle birlikteTümör oluşumu, ilk klon boyutuna bağlıdır: 20 dakika boyunca bir ısı şoku tarafından üretilen büyük klonlar genelde tümörigeneze neden olurken, ısı şokunun 10 dakikadan kısa sürede üretilen çoğu küçük klon tamamen yok edilir (KM ve YT, yayınlanmamış veriler).
Tümör gelişimi ve kanser progresyonu üzerine yapılan bir dizi son araştırma Drosophila imaginal diskleri bir model sistem olarak kullanmaktadır 32 , 33 . Bu çalışmalara ortak olarak, neoplastik tümörlerin saptanan belirteçleri vardır: sapma hücre kitleleri, deforme disk şekilleri, F-aktin birikimi, hücre döngüsünün arttırılması (BrdU / EdU birleşimi veya PH3 ekspresyonu), JNK sinyalleşmesinin aktivasyonu ve onun aşağı doğru hedef MMP1, bazal membran (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 veya PAR-6) yer alan proteinlerin kayıp veya subselüler delokalizasyonu da dahil olmak üzere, parçalanma ve / veya epitel disorganizasyonu, septat kavşakları(Lgl, Scrib, Dlg veya Coracle) veya adherens kavşakları (E-Cadherin veya Armadillo). Bu fenotipler, klasik antikor boyaması ile kolaylıkla saptanabilir. Bir klonal fenotipin hiperplazi, displazi, benign neoplazma veya malign neoplazm olup olmadığını belirlemek tümörizmin erken evrelerinde zor olsa da, tek bir epitelyal tek tabaka içeren Drosophila imaginal disk epitelyumunda daha basit olmalıdır. Bu çalışmada, epitelyal tek tabaka içerisinde indüklenen tümörlü klon fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunuldu ( Şekil 1 ). Bu yöntem, z-stack konfokal görüntüler kullanarak beş kritere dikkatle gözlem yapmayı gerektirir; Her teşhis kriterleri konvansiyonel antikor boyama ve konfokal görüntüleme ile incelenebilir. Bu yöntemde getirdiğimiz yeni kriterlerden birisi, imgesel disklerde displazi ve neoplazm arasında ayrım yapan "4 hücre çapı ölçütleri" dir. NTSG mutant klonları gibi pro-tümör hücreleri sıktırEpitelyal tabakalardan hücre rekabeti ya da iğ aksın yönlendirilmesi yoluyla ekstrüzyona tabi tutuldu. 15 , 16 , 34 . Çoğu durumda, bu ekstrüze edilen hücreler apoptoz verir ve bu nedenle çoğalamazlar. Prote-tümör hücrelerin ekstrüzyon sırasında bir kez ve ekstrüzyon sonrasında bir veya iki kez daha hücre bölünmesine uğraması mümkün olmasına rağmen, bu 2-3 hücre çapında bir hücre kitlesi oluşturur. Bu nedenle, epitelyal tabakadan sapmış pro-tümör hücrelerinin bir hücre kütlesi 4 hücreli çaptan büyükse, bunların epitel tabakasının dışındaki bir neoplazma olarak hayatta kaldıklarını ve prolifere olduklarını belirleyebiliriz.
Bu tanı yöntemi basit olmakla birlikte, tümör gelişim ve malignite süresi boyunca ilerledikçe, fenotiplerin zaman içerisinde alınması önemlidir. Örneğin, displazi sitolojik açıdan anormal bir dokudur ve tamamen iyi huylu büyüme ile ön olanlarla olan geçiş halidirMalign. Dolayısıyla, gözlenen bir klon, akış şemasına göre bir displazi olarak tanımlansa bile ( Şekil 1 ), displazi daha sonra bir neoplazmaya dönüşebilir. Larva evresi zamanla sınırlı olmakla birlikte (25 ° C'de 5-6 gün veya 29 ° C AED'de 4-5 gün), imgesel disklerde tümör büyümesi larval aşamayı insülin benzeri bir peptitle indüklenen parianasyon gecikmesi ile uzatır 35 , 36 . Bu nedenle, imgesel disklerde neoplastik tümör oluşumu, birkaç gün daha tümör klon fenotipik ilerlemesini gözlemlemeyi mümkün kılar. Basit sınıflandırma yöntemimiz, Drosophila'daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Makalenin eleştirel okunması için J. Vaughen'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, JSPS KAKENHI Grant Numaraları 26891025, 15H01500 ve YT'ye Takeda Bilim Vakfı Araştırma Yardımı hibeleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
