Summary
Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.
Abstract
Het CRISPR / Cas9 genoom engineering systeem heeft de biologie revolutionair gemaakt door het mogelijk te maken voor nauwkeurige genoom-editing met weinig moeite. Geleid door een enkele gids RNA (sgRNA) die specificiteit verleent, klooft het Cas9-eiwit beide DNA-strengen op de target locus. De DNA-pauze kan zowel niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) of homologiregerichte reparatie (HDR) veroorzaken. NHEJ kan kleine deleties of invoegingen introduceren die tot frame-shift mutaties leiden, terwijl HDR mogelijk maakt voor grotere en nauwkeuriger storingen. Hier presenteren wij protocollen voor het genereren van knock-out-cellijnen door koppeling van gevestigde CRISPR / Cas9 methoden met twee opties voor downstream selectie / screening. De NHEJ-aanpak maakt gebruik van een enkele sgRNA-cut-site en selectie-onafhankelijke screening, waarbij eiwitproductie wordt beoordeeld op dot-immunoblot op een hoge doorvoerwijze. De HDR-aanpak gebruikt twee sgRNA-cut-sites die het gen van belang richten. Samen met een voorziene HDR-sjabloon kan deze methode worden verwijderdVan tientallen kb, ondersteund door de ingevoegde selecteerbare weerstandsmelder. De passende toepassingen en voordelen van elke methode worden besproken.
Introduction
Stabiele genetische veranderingen bieden een voordeel ten opzichte van transiënte methoden van cellulaire perturbatie, die in hun efficiëntie en duur variabel kunnen zijn. Genomische bewerking is de laatste jaren steeds vaker geworden door de ontwikkeling van doelspecifieke nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 En RNA-geleidende nucleasen afgeleid van het geclusterde, regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) systeem 10 .
De CRISPR / Cas9-bewerkingsmachines zijn aangepast aan een immuunsysteem dat bacteriën en archea gebruiken om te beschermen tegen virale infectiesAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . In dit proces worden korte 20-30 nt-fragmenten van invallende virale sequentie opgenomen in een genomische locus als "spacers", geflankeerd door herhaling van eenheden 14 , 15 . Opvolgende transcriptie- en RNA-verwerking genereert kleine CRISPR-geassocieerde RNA's 16 (crRNAs) die samen met een trans-activerende crRNA 17 (tracrRNA) samenstellen met het effector Cas9 endonuclease. De crRNA's verschaffen derhalve specificiteit voor Cas9-targeting, het begeleiden van het complex om complementaire virale DNA-sequenties te kloppen en verdere infecties 18 , 19 te voorkomen. Elke "protospacer" -sequentie in het geteikende DNA kan dienen als de bron van het crRNA, zolang het direct 5 'is naar een kort protospacer naburig motief (PAM), NGG in het geval van S. pyogenes Cas9 21 geladen is.
Bij expressie van Cas9 en een sgRNA in eukaryote cellen, splitst het Cas9-eiwit beide DNA-strengen op de gerichte locus. Bij afwezigheid van een geschikt gebied van homologe sequentie fixeert de cel deze pauze via niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) 22 , 23 , 24 , die typisch kleine deleties of zelden invoegingen introduceren. Wanneer u een open doel richtLeestraject leidt de reparatie waarschijnlijk tot een translationele frameshift die een niet-functioneel eiwitproduct produceert. In tegenstelling, wanneer deze wordt voorzien van een exogeen sjabloon met grote gebieden van homologie, kan de cel de dubbelstrengpauze repareren door homologie gerichte reparatie 25 , 26 . Deze route zorgt voor grotere nauwkeurige deleties, vervangingen of invoegingen in het genoom, gekoppeld aan de introductie van excisabele selectiemarkeringen 27 .
Hier presenteren we protocollen voor het genereren van knock-out cellijnen door middel van een van deze twee CRISPR / Cas9 methoden ( Figuur 1A ). De NHEJ-aanpak maakt gebruik van een enkele sgRNA-cut-site en selectie-onafhankelijke screening, en vereist dus een beetje voorafgaande voorbereiding. Als u deze methode gebruikt, leid u RNA's die complementair zijn met exons in de buurt van het 5'-uiteinde van het transcript, dat waarschijnlijk een knock-out zal produceren, ontworpen moeten worden. Sinds de modificatIonen in het genoom in dit geval zijn klein, screening voor knock-out klonen is gebaseerd op dot blots, waar het eiwit product wordt beoordeeld op een high-throughput manier. We gebruiken de generatie van ELAV-achtige 1-eiwit (ELAVL1) knock-out lijnen als voorbeeld. De tweede aanpak is gebaseerd op homologie gerichte reparatie (HDR) en maakt gebruik van twee sgRNA-cut-sites die het gen of gebied van belang richten, waardoor er tientallen kb's kunnen worden verwijderd. Een plasmide met twee gebieden van homologie die de splitsingsplaatsen flankert, verschaft een vervangende sjabloon ( Figuur 1B ), waarbij een selecteerbare weerstandsmerker wordt geïntroduceerd die de efficiëntie van knock-out generatie verhoogt. Deze methode kan ook worden aangepast om genmodificaties te introduceren met goed ontworpen homologie armen. In dit geval zorgt de integratie van een nieuw DNA fragment voor PCR-gebaseerde screening ( Figuur 1C ). Hier gebruiken we de generatie van Pumilio RNA bindende familielid 2 (PUM2) knock-out lijnen als voorbeeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Identificatie van Homologie Regio's rond de gewenste verwijdering
OPMERKING: Uitsluitend nodig als u op basis van de selectie op basis van een selectie gaat.
- Selecteer twee gebieden, aanvankelijk 1,5-2 kb, aan weerszijden van de gewenste verwijderingslokus, die als homologiewapens in het HDR-sjabloon zal dienen ( Figuur 1A ). Identificeer regio's die BsaI-herkenningssites ontbreken op beide strengen (GGTCTC) om klonen te vergemakkelijken. Als BsaI-sites onontkoombaar zijn, gebruik dan een alternatief type IIs restrictie-enzym (BsmBI, SapI, BbsI) en modificeer de overeenkomstige plaatsen in het ontvanger plasmide (pUC19-BsaI), donor plasmide van resistentie marker (pGolden-Neo of pGolden-Hygro) en Homologie arm PCR product overhangen.
2. Generatie van Cas9-sgRNA Expression Plasmiden
- Definieer de targeting site (s) voor mutagenese. Voor de single-cut, selectievrije methode, target 5 'proximale coderingsexonen om de kans op een niet-fu te verhogenNctionele mutatie. Voor de twee-snijmethode selecteer twee sites die zo veel mogelijk van het gen overschrijden.
OPMERKING: in onze ervaring worden deleties tot 53 kb efficiënt gemaakt. - Voer 200 tot 300 bp van de gerichte regio sequentie in in het design tool crispr.mit.edu. Voor selectiegebaseerd klonen gebruik 200-300 bp van de geïdentificeerde homologegebieden die proximaal zijn voor de verwijderingslokus ( Figuur 1A ). Selecteer 2-3 van de meest gerangschikte sgRNA's per doelgebied om rekening te houden met verschillen in hun activiteit en om onafhankelijke klonen te isoleren die niet dezelfde potentiële off-target-effecten delen.
- Om duplexvormige oligonucleotiden te ontwerpen met geschikte overhangen voor invoeging in het expressieplasmide, laat de eindige PAM-sequentie (NGG) weg en voeg een 5'-CACC overhang toe, gevolgd door een G naar de topstreng oligo. Voor de bottom-strand-oligo voegt u een 5'-AAAC overhang toe aan de omgekeerde complementaire doelsequentie, gevolgd door een 3'-C, als eenHieronder gelust:
- Voeg synthetische oligonucleotiden in die overeenkomen met de sgRNA's in het pSpCas9 (BB) plasmide onder gebruikmaking van Golden Gate kloning 28 zoals beschreven in het Zhang lab protocol 29 .
3. Generatie van Homologie Gerichte Reparatie Sjabloon Plasmiden
OPMERKING: Uitsluitend nodig als u op basis van de selectie op basis van een selectie gaat. Het homologie-gerichte reparatie template plasmide bestaat uit een geneesmiddel resistentie cassette gevlankerd door twee gebieden die complementair zijn aan het genoom net buiten de twee sgRNA target sites ( Figuur 1B ).
- Uit de ruimere homologiegebieden die in stap 1.1 geïdentificeerd zijn, selecteert 800-1000 bp 26 niet meer dan 5-10 bp weg van de ontworpen Cas9-snijplaatsen, om te dienen als de homologiewapens ( Figuur 1A ). Zorg ervoor dat u de sgRNA niet opneemtTarget site en zijn PAM in de homologie armen, omdat dit CRISPR / Cas9 splitsing van het sjabloon plasmide zelf zal veroorzaken. Als de homologiewapens interne BsaI-sites bevatten, gebruik dan alternatieve sgRNA-sites.
- PCR versterkt homologie armen uit genomisch DNA met behulp van een high-fidelity DNA polymerase, volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van voorwaartse en omgekeerde primers met extra 5'-sequentie die BsaI sites (GGTCTC) introduceert en unieke overhangen aan beide uiteinden van het homologiegebied. De overhangen moeten behoorlijke sequenties bevatten om de juiste montage volgorde en oriëntatie te genereren, zoals hieronder beschreven ( Figuur 1B ):
Linker homologie arm FP overhang: 5 'GGGTCTCA GGCC
Linker homologie arm RP overhang: 5 'GGGTCTCT CACG
Right homology arm FP overhang: 5 'GGGTCTCA GTCC
Rechter homologie arm RP overhang: 5 'GGGTCTCT CCAC - Controleer homologie armen voor de juiste amplifIcatie via gelelektroforese alvorens verder te gaan.
- Monteer de rechter- en linker homologie arm regio's met de weerstandscassette in een HDR template plasmide door Golden Gate kloning 28 . Gebruik pGolden-Neo of pGolden-Hygro plasmiden 30 als de bron van loxP-flankerde weerstandscassettes (loxP-PGK-Neo-pA-loxP of loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Gebruik pUC19-BsaI, een gemodificeerd pUC19 met BsaI plaatsen in het meervoudige kloningsgebied en geëlimineerde BsaI plaatsen elders, als de ontvanger vector (beschikbaar op aanvraag). Gebruik een verhouding van 1: 1: 1: 1 voor de drie inserts en vector.
- Bereid het volgende reactiemengsel 30 op :
Right homology arm PCR product 0,06 pmol (30-40ng) Linker homologie arm PCR product 0,06 pmol (30-40ng) PGolden-Neo plasmide (100 ng / μl) 1 &# 181; L PUC19-BsaI plasmide (100 ng / μl) 1 μl 2x T7 DNA ligase buffer 5 μl BsaI (10 U / μl) 0,75 μl T7 DNA-ligase (3000 U / μl) 0,25 μl Water Tot 10 μl - Gebruik de volgende thermocycler parameters: 37 ° C gedurende 5 min, 20 ° C gedurende 5 min. Herhaal gedurende 30 cycli.
- Behandel het kloningsproduct met een exonuclease volgens de instructies van de fabrikant om het overgebleven, gelineariseerd DNA te verteren.
- Transformeer het reactiemengsel in een bevoegde E. coli stam volgens het protocol dat aan de cellen is toegevoerd, en plaat op ampicilline bevattende schotels.
- Bereid het volgende reactiemengsel 30 op :
- Om klonen te identificeren met het juiste sjabloonsamenstel, voer bacteriën uitAl colony PCR om de homologie arm subregio's van het gemonteerde inzetstuk te versterken (aangezien het hele inzet te groot kan zijn om betrouwbaar te vermenigvuldigen). Gebruik een primerglans aan de flankerende plasmide-sequentie en een tweede primer die complementair is aan de rand van de weerstandscassette ( Figuur 1B , de sequentie is gebruikelijk voor zowel Neo als Hygro-inserts), waardoor een montageafhankelijk product wordt verkregen dat ongeveer 200 bp langer is dan De bevatte homologie arm:
PUC19-Bsal-Links: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Resistance-Left: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19-BsaI-Rechts: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Resistance-Right: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Kies bacteriële kolonies met steriele tandstokjes en schud de bacteriën in 20 μL water. Verhit bij 95 ° C gedurende 15 minuten, en draai in een tafelsentrifuge bij maximale snelheid gedurende 5 minuten. Plaats onmiddellijk op ijs.
- Bereid het volgende PCR-mengsel voor 31 </ Sup>:
Verdun koloniesjabloon 1,25 μl 10x Taq reactiebuffer 1,25 μl 20mM dNTPs 0,25 μl 10 μM Voorwaartse primer 0,25 μl 10 μM Reverse Primer 0,25 μl Taq Polymerase 0,25 μl Water 9 μl - Gebruik de volgende thermocycler parameters: 95 ° C gedurende 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min / kb), herhaal gedurende 25 minuten, 72 ° C gedurende 2 min.
- Controleer het PCR-product voor de juiste amplicongrootte door agarosegel-elektroforese.
- Optioneel, miniprep plasmide DNA uit individuele kolonies met correcte invoeggrootte en sequentie thE homologie arm regio's door Sanger sequencing met de hierboven genoemde amplificatie primers.
4. Transfectie van CRISPR-componenten in gekweekte cellen
- Voor transfectie: cultuur T-REx293 cellen in DMEM media aangevuld met 10% FBS bij 37 ° C en 5% CO2.
- Plaat cellen op 6-putjes platen en groeien tot ongeveer 70% confluency. Breng een put in voor een niet-getroffen controle.
- Transfect cellen met 2,5 μg totaal plasmide met behulp van een commercieel transfectie protocol. Tegelijkertijd handhaaft u de niet-getransfecteerde controle.
OPMERKING: De transfectiemethode en de efficiëntie variëren afhankelijk van het celtype. Bepaal de juiste transfectiemethode voor het systeem voorafgaand aan het experiment.- Voor transfectie van cellen met selectie, gebruik 0.75 μg Cas9-sgRNA 1 (linker cut), 0,75 μg Cas9-sgRNA 2 (rechter snij) en 1,0 μg homologe recombinatie template.
- Voor transfectieOp cellen zonder selectie, gebruik 2.5 μg Cas9-sgRNA plasmide.
5. Drug Selection
- 48 uur na transfectie, behandel de cellen met het juiste geneesmiddel (Neomycin / Hygromycin). Voer de selectie uit totdat alle cellen in de niet-getransfecteerde controle sterven (meestal 3-5 dagen voor Neo, 7-14 dagen voor Hygro).
OPMERKING: Gebruik concentraties van 500 μg / ml en 10 μg / ml voor respectievelijk Neomycin en Hygromycin voor T-REx293 cellen. Voor andere celtypes kan het nuttig zijn om een voorafgaande titratie van geneesmiddel op niet getransfecteerde cellen uit te voeren om de effectieve concentratie te bepalen.
6. Isolatie van klonale populaties
- Groei cellen tot 100% samenvloeiing in het oorspronkelijke goed na selectie. Zaadcellen in 96 putjes platen bij een dichtheid van 0,33 cellen per putje.
OPMERKING: Het zaaien van drie platen met 96 putjes is een goed uitgangspunt om isolatie van meer dan één juiste kloon te verzekeren, maar meer of minder kan nodig zijn depEindigt op sgRNA en HDR efficiënties. - Volg kolonies over een periode van 2-4 weken, tot de kolonies zichtbaar zijn voor het oog. Kies zichtbare kolonies met een steriele pipettaart en keer opnieuw in nieuwe putjes om monolaaggroei te stimuleren. Bij gebruik van suspensiecellen kunnen zelfs lagere zaaddichtheden worden gebruikt om een groter deel van enkelkolonieputjes te waarborgen.
7. Screening Kandidaten
- Screening kandidaten zonder gebruik van selectie: dot blot
- Groei individuele klonen tot 50-100% samenvloeiing. Verwijder de monolaag van cellen door pipettering in de put.
- Aliquot 90 μL van het totale volume van 100 μl aan een schone microcentrifugebuis. Spin af bij 6000 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten, verwijder de media en lyse celpelletjes in 10 μl 1x Lysis Buffer of 1x SDS-laadbuffer (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 0,1% broomfenolblauw, 40% Glycerol, 100 mM DTT). Voeg 90 μL nieuwe media toe aan de rest van de cellen in de welIk ga verder voortplanten.
- Pipetteer 1 μL cellysaat op een droog nitrocellulosemembraan om een punt te vormen. Blot elk monster tweemaal op twee afzonderlijke membranen, waardoor twee identieke patronen van monsters ontstaan.
- Blok de membranen in 5% melk in TBST (Tris Buffered Saline + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g Tris base, tot 1 L gedestilleerd water, pH 7,4) 31 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur Met rocking, hier en gedurende de procedure).
- Blot gebruik maken van het primaire antilichaam tegen het doel eiwit op een membraan en het primaire antilichaam voor een controle eiwit (tubuline, GAPDH, of enig ander eiwit dat niet verwacht wordt te veranderen) anderzijds. Gebruik de aanbevolen verdunning van primaire antilichamen (0.2 μg / ml voor ELAVL1 en 0,1 μg / ml voor Pum2 in dit geval) in TBST + 5% melk. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was 3 keer met TBST gedurende 5 minuten.
- Incubeer elk membraan met een geschikt HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in TBST + 5% melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was 3 keer met TBST gedurende 5 minuten.
- Breng chemiluminescentie-substraatoplossing aan (zie Materiaaltafel) volgens de instructies van de fabrikant en beeld het gescheurde membraan op een digitale chemiluminescentie beeldmaker.
- Bepaal puntintensiteiten voor de doel- en controle-eiwitten met behulp van de juiste software.
- Elimineer kandidaten met een laag controle eiwit signaal, en bereken de achtergestelde subtracted ratio's van het doel om eiwitintensiteiten voor de resterende kandidaten te regelen. Selecteer de kandidaten met de laagste verhoudingen voor doorgang en verdere validatie door western blot.
- Screening kandidaten met het gebruik van selectie: kolonie PCR
- Verzamel cellysaat met behulp van een DNA prep kit (zie Material Table ).
- Dupliceer individuele kolonies in een nieuwe 96 put en groei tot 100% confluency.
- Verwijder media uit een set van de klonen, aEn resuspenderen cellen in 30 μl extractiebuffer uit de kit. Vervoer naar een schone 1,5 ml microcentrifuge buis.
- Verhit de oplossing tot 96 ° C gedurende 15 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
- Voeg 30 μl stabiliseringsbuffer uit de kit. Goed mengen.
- Identificeer wildtype en monoallele / biallele mutantlijnen door kolonie PCR.
- Ontwerp twee afzonderlijke sets van PCR-primers (voor de linker- en rechterkant van de target locus) om regio's rond de homologiewapen te versterken, gebaseerd op succesvolle of mislukte integratie van de weerstandscassette ( Figuur 2C ). Aan elke kant, gebruik een gemeenschappelijke primer (rood) die buiten de homologie arm ontkieft. Gebruik het met een bijbehorende gepaarde primer die complementair is aan de endogene sequentie, die het homologiegebied (blauw) uitstrekt, om te testen voor het wildtype allel. Gebruik een andere gepaarde primer, complementair aan de ingebouwde weerstandscassette (zie primers in sectie2.3), om te testen voor de gewenste mutatie.
- (Aanbevolen) Validateer de primer sets met behulp van cellysaat uit de oorspronkelijke geselecteerde bulkcellenpopulatie, aangezien het een mengsel van zowel WT als mutante allelen bevat ( Figuur 2D ).
- Bereid het volgende reactiemengsel voor:
Cellysaat 0,5 μl 10x KOD buffer 1,25 μl 25 mM MgSO4 0,75 μl 2 mM dNTPs 1,25 μl 10 μM Voorwaartse primer 0,375 μl 10 μM Reverse Primer 0,375 μl KOD polymerase 0,25 μl Water 7,75 μl - Gebruik de volgende thermocycler condities: 95 ° C gedurende 2 minuten, (95 ° C gedurende 20 s, Primer Tm gedurende 10 s, 70 ° C gedurende 20 s / kb) herhalen gedurende 25 cycli.
- Visualiseer het PCR-product door agarosegel-elektroforese.
- Herhaal het kolonie-PCR-test voor elke kant van de voorspelde integratie. Selecteer en uitbreid kandidaten die de aanwezigheid van integratie en geen endogeen sequentieproduct voor de verwijderde regio tonen.
- Valideer positieve kandidaten door western blot en / of RT-qPCR.
- Verzamel cellysaat met behulp van een DNA prep kit (zie Material Table ).
8. Controleer de genomische mutatie door sequencing
- Isolatie van genomisch DNA van mutante cellijnen door fenol chloroform extractie 31 .
- PCR versterken het sgRNA doelgebied met behulp van primers met 5'-overhangen die BsaI-restrictieplaatsen toevoegen aan elk einde.
OPMERKING: Voor klonen die zijn bewerkt met HDR, waar beide allelen identiek kunnen zijn, kan het PCR-product direct worden gesorteerd. - Kloneer het versterkte gebied in pUC19-BsaI door Golden Gate-kloning.
- Transformeer het reactiemengsel in een bevoegde E. coli stam.
- Miniprep plasmide DNA van 6-10 individuele kolonies en sequentie het gekloneerde gebied door Sanger sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor de opwekking van ELAVL1 knock-out lijnen was een robuust antilichaam beschikbaar, zodat het bewerken met behulp van enkele sgRNA's ( Figuur 1A , links) werd uitgevoerd, gevolgd door prik-immunoblot. Drie sgRNA's werden onafhankelijk getransfecteerd om efficiënties te vergelijken en doelwitseffecten in de resulterende klonen uit te sluiten. Na het verzamelen en blottende cellysaten van klonale bevolkingen op twee nitrocellulosemembranen werden de blots onderzocht voor zowel ELAVL1 als PUM2 (als een normalisatiebeheersing) ( Figuur 2A ). De gekwantificeerde verhouding van ELAVL1 tot PUM2 signaal demonstreerde een zeer breed,> 10 4- voudig bereik onder de geïsoleerde lijnen ( Figuur 2B ). Met deze verhouding als selectiecriterium, valideerden we een aantal lijnen met behulp van ELAVL1 western blots ( Figuur 3A ). In de meeste gevallen waren clonale populaties met het laagste relatieve ELAVL1-signaalCorrect geïdentificeerd als knockouts ( Figuur 2B ), die de voorspellende kracht van deze kwantificering bevestigen (ondanks grote variabelen in het stuursignaal, die waarschijnlijk voortvloeien uit verschillende getallen verzamelde cellen). Omgekeerd vertoonden de meeste klonen met tussenverhoudingen ELAVL1-signaal bij validatie, die mogelijk monoallele deletie-gebeurtenissen vertegenwoordigen. Er werd echter geen algemene tiering van de verhoudingen in WT waargenomen, monoallele en volledige (biallele) mutantpoolen waargenomen, en zelfs de ELAVL1-positieve klonen vertoonden een breed en continu bereik van niveaus, waarschijnlijk door de klonale variabiliteit van expressie. De algemene effectiviteit van ELAVL1 knockout generatie met deze methode varieerde van 6 tot 36% onder de sgRNAs.
Voor andere gendoelstellingen (zoals PUM2) voorkomt de kwaliteit van de beschikbare antilichamen nauwkeurige screening van kandidaatklonen door dot blot door een hoge achtergrond van cross-reactiviteit. Bovendien kan de efficiëntie van het targeten van sommige genomische loci aanzienlijk lager zijn door de toegankelijkheid van chromatin. In dergelijke gevallen is een selectieafhankelijke methode geschikt om de efficiëntie te verhogen. Twee sgRNA's die vroeger en laat coderende gebieden van PUM2 richten werden gecotransfecteerd met een homologie gerichte reparatie template om 45 kb genomisch DNA te excuderen en te vervangen door een neomycine resistentie cassette ( Figuur 1A , rechts). Assemblage van de homologie template is geïllustreerd in figuur 1B . PCR-primers werden ontworpen om gebieden rond de homologiewapens te versterken op basis van succesvolle of niet-succesvolle integratie van de weerstandscassette ( Figuur 2C ), en werden getest op niet-getransfecteerde en de bulk geselecteerde cellen (linker paneel). Zoals verwacht, werd in een niet-getransfecteerde cel alleen een amplicon dat overeenkomt met de endogene toestand (bovenste) waargenomen, terwijl de grootmaat geselecteerde cellen ampliconen van beide tonenWild-type en mutante allelen. Celllysaten uit gegenereerde klonale kandidaten werden verzameld en gescreend voor de aanwezigheid van zowel de endogene sequentie als de weerstandscassette. Kandidaat knockouts werden geïdentificeerd door de aanwezigheid van alleen de weerstandscassette amplicon, die biallele deletie / integratie aangeeft ( Figuur 2D , sterren). Klonen met monoallele inserties werden ook waargenomen en waren vrij gebruikelijk, aangezien dergelijke populaties ook het selectieproces kunnen overleven. Deze klonen werden aangeduid door de aanwezigheid van zowel de endogene sequentie als de weerstandscassette. In enkele gevallen werden ook klonale wildtypes op de geteste locus waargenomen, wat suggereerde dat willekeurige, niet-sgRNA-geassisteerde genomische integratie van de homologiregerde reparatie template op een lage frequentie optreedt. Biallele mutantlijnen werden verder geëvalueerd door western blot ( Figuur 3B ). De totale efficiëntie van knock-out generatie met behulp van de HDR procedure was 33%.
Figuur 1: Een workflow voor het genereren van CRISPR-gemedieerde knockouts in zoogdiercellijnen. ( A ) Genoom bewerking gebeurtenissen geproduceerd door CRISPR / Cas9 splitsing en NHEJ (links) of HDR (rechts). De site van Cas9 splitsing wordt aangeduid door een witte verticale lijn. ( B ) Componenten en montage van het HDR sjabloon plasmide. De type IIs-restrictie-enzymen die worden gebruikt bij het klonen van Golden Gate, zoals BsaI, herkennen een asymmetrische DNA-sequentie en laten een verstoorde snede buiten de herkenningssequentie achter, waardoor het ontwerp van willekeurige overlappende segmenten voor montage mogelijk wordt gemaakt (foto). Pijlen geven de primerposities aan om te controleren of het correcte plasmide montage is. ( C ) Workflow: na transfectie (en drugselectie, indien van toepassing), worden cellen geplateerd bij beperkende verdunningen in platen met 96 putjes. Clonale populatiesWorden door middel van dot immunoblot (selectieafhankelijk, NHEJ) of kolonie PCR (selectieafhankelijk, HDR) gescreend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Knock-outlijnen voor screening-kandidaten door puntblots of kolonie-PCR. ( A ) Punt immunoblot van geïsoleerde ELAVL1-gerichte klonen met ELAVL1 antilichaam (links), en afzonderlijk met een antilichaam voor een controle eiwit, Pum2 (rechts). Klonen die weinig controle-signaal tonen, waarschijnlijk door lage eiwithoeveelheden, worden gemarkeerd met een X en uitgesloten van verdere analyse. Klonen met een laag ELAVL1-signaal (cirkels) werden verder getest door westerse blots die de kandidaten bevestigen (groen) of ongeldig (grijs). ( B ) Kwantificering van KO cAndidates van dot blot. Verhoudingen van ELAVL1 om eiwitsignaal te regelen in de dot blot getoond in A, in toenemende volgorde. ( C ) Primer ontwerp voor knock-out / insertie testen via kolonie PCR. Een primer die complementair is aan de genomische locus buiten het homologiearmgebied (rood) is gekoppeld aan een primer die complementair is met de endogene sequentie (blauw) of naar de weerstandscassette (groen), probeert voor de ongeredde toestand, of een deletie / insertie gebeurtenis , Respectievelijk. Afzonderlijke primerparen zijn ontworpen om beide zijden van de integratie te testen. ( D ) Voorbeeld agarosegel van kolonie-PCR-resultaten met behulp van primers die de stroomopwaartse integratiekruis overspannen met behulp van endogene binnenprimers (bovenste) en uitklopbare binnenprimers (bodem). Primers worden eerst gevalideerd in zowel ouders T-REx293 cellen als bulk geselecteerde cellen (links). Individuele kandidaatklonen (midden) en de verwachte bandpatronen voor WT, KO en monoallele deletie (WT / KO) klonen (rechts). Biallele knockout klonen zijn aan te gevenD door een ster. De juiste versterkingsproducten worden aangeduid met zwarte pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Validatie van knockout kandidaten door Western blot. ( A ) Western blot voor ELAVL1 (top) van een subset van klonen geïdentificeerd door dot blot. PUM2 werd op hetzelfde membraan gedrukt als een laadcontrole (bodem). ( B ) Western blot voor PUM2 (top) van een subset van klonen geïdentificeerd door kolonie PCR. GAPDH bleek op hetzelfde membraan als een laadbeheersing (bodem). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het CRISPR / Cas9-systeem heeft de mogelijkheid tot efficiënte generatie van stabiele genomische modificaties mogelijk, die een meer consistent alternatief bieden voor andere transiënte manipulatiemethoden. Hier hebben wij twee methoden voor de snelle identificatie van CRISPR / Cas9 gen-knockouts in zoogdiercellijnen voorgesteld. Beide methoden vereisen weinig cellulair materiaal, zodat het testen in vroege stadia van klonale cultuur kan worden gedaan, waardoor tijd en reagentia bespaard kunnen worden. Om de efficiëntie van beide methoden te verhogen, raden we aan het testen van meerdere sgRNA's, omdat de efficiëntie afhankelijk is van de volgorde en de genomische locatie. Daarnaast is het gebruik van meerdere sgRNAs nuttig bij het identificeren van off-target-effecten door het detecteren van outlier fenotypes als gevolg van mutaties in niet-geteste genen. Effectieve transfectie en Cas9 splitsing vergroten de kans op knockouts enorm. Als alternatief transfecteren de cellen direct met commercieel verkregen sgRNA / Cas9 ribonucleoproteïne complexen 32 ,33 kan het protocol versnellen en effecten verminderen.
Dot blots zijn geschikt om te beoordelen eiwit knockouts veroorzaakt door de kleine genomische veranderingen als gevolg van NHEJ. Aangezien slechts een enkel sgRNA / Cas9 construct nodig is, kan deze aanpak het snelst zijn bij het verkrijgen van nullijnen, en de blot procedure omzeilt extra stappen, waardoor de screening wordt bespoedigd. Het genormaliseerde immunoblot eiwitsignaal dient als een betrouwbare voorspeller van succesvolle validatie ( Figuur 2B ). Dit protocol is ideaal voor het genereren van knockouts met minimale genomische verstoring. Als alternatief kan deze screeningsmethode worden aangepast aan sonde voor eiwitadditie of -verandering, zoals transgene eiwitten of eiwitmarkeringen. Deze screeningsmethode vereist echter een antilichaam met hoge specificiteit voor het eiwit van belang, aangezien de kruisreactiviteit leidt tot een hoge achtergrond in dotbots. Deze methode is uiteraard beperkt tot mutaties gerichtEiwit coderende gebieden, aangezien de uiteindelijke uitvoer afhankelijk is van de aanwezigheid / afwezigheid van een eiwitproduct. Het is ook belangrijk om op te merken dat mutaties veroorzaakt door NHEJ kunnen leiden tot een verscheidenheid aan eiwituitkomsten, waaronder een eiwit met constitutief actieve, gedeeltelijke of dominante negatieve functie, of een functioneel eiwit dat de detectie antilichaam epitoop mist. Om deze problemen te minimaliseren, is het handig om de Cas9-snij zo vroeg mogelijk in de coderende regio te richten, teneinde de kans te vergroten om een volledig niet-functioneel eiwit te genereren. Daarnaast kunnen targeten van genomische gebieden die minder toegankelijk zijn voor de Cas9-machines, lage afbraakopbrengsten produceren bij afwezigheid van selectie. Tenslotte kunnen knockouts die een selectief nadeel geven, moeilijk zijn om door deze werkwijze te verkrijgen voor soortgelijke redenen.
Door gebruik te maken van homologiegerichte reparatiemechanismen, samen met CRISPR / Cas9-splitsing, kunnen veel grotere en meer specifieke genomische manipulaties worden toegepast, die zowel laRge schaal deleties (afgebeeld door twee sgRNA splitsingen) en invoegingen. Aangezien er twee splitsingsgebeurtenissen en een nauwkeurig herstelproces moeten plaatsvinden, neemt integratie van een geneesmiddel tegen resistentie de uitslag opbrengsten aanzienlijk toe door deze methode te gebruiken. Hoewel dot blot detectie ook kan worden gebruikt, is screening door kolonie-PCR meer algemeen toepasbaar om nauwkeurige detectie-integratie / knock-out kandidaten met dergelijke grote genomische verstoringen te detecteren. Verder kan het testen met PCR identificeren van klonen met onvolmaakte en onvolledige integraties, die inzicht kunnen geven in de omvang en aard van het HDR-proces zelf. Daarnaast kan de geïntroduceerde marker vervolgens worden verwijderd (door transiënte Cre expressie of toevoeging in membraan-doorlaatbare vorm), waardoor een minimale 34 bp deletie litteken (loxP site) wordt gelaten en het toekomstige hergebruik van de selectiemarkering mogelijk maakt. De flexibiliteit van deze aanpak neemt toe door gebruik te maken van meerdere weerstandsmerkers, waardoor het mogelijk is meerdere cumu te genererenLeidende eiwit knockouts. Het is belangrijk bij het toepassen van deze methode dat de afwezigheid van het product verder gevalideerd wordt, bijvoorbeeld door RT-qPCR van het verwachte transcript. Aangezien dit scherm antilichaam onafhankelijk kan zijn, wordt deze methode gemakkelijk toegepast op eiwitknockouts zonder een robuust antilichaam, evenals om veranderingen op te sporen die niet vallen in proteïne coderende genen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Gissell Sanchez, Megan Lee en Jason Estep voor experimenteel hulp, en Weifeng Gu en Xuemei Chen erkennen voor het delen van reagentia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
