Summary
Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.
Abstract
El sistema de ingeniería del genoma CRISPR / Cas9 ha revolucionado la biología permitiendo la edición precisa del genoma con poco esfuerzo. Guiado por una sola guía de ARN (sgRNA) que confiere especificidad, la proteína Cas9 escinde ambas cadenas de ADN en el lugar de destino. La ruptura del ADN puede desencadenar la unión final no homóloga (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ puede introducir pequeñas supresiones o inserciones que conducen a mutaciones de cambio de marco, mientras que el HDR permite perturbaciones más grandes y más precisas. Aquí, presentamos protocolos para la generación de líneas celulares knockout mediante el acoplamiento CRISPR / Cas9 métodos establecidos con dos opciones para la selección / cribado aguas abajo. El enfoque de NHEJ utiliza un único sitio de corte sgRNA y selección independiente de la selección, donde la producción de proteínas se evalúa por punto inmunoblot en un alto rendimiento. El enfoque HDR utiliza dos sitios de corte sgRNA que abarcan el gen de interés. Junto con una plantilla de HDR proporcionada, este método puede lograr supresiónDe decenas de kb, ayudado por el marcador de resistencia seleccionable insertado. Se discuten las aplicaciones y ventajas apropiadas de cada método.
Introduction
Las alteraciones genéticas estables proporcionan una ventaja sobre los métodos transitorios de perturbación celular, que pueden ser variables en su eficacia y duración. La edición genómica se ha vuelto cada vez más común en los últimos años debido al desarrollo de nucleasas específicas para el objetivo, como las nucleasas de zinc-dedo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , nucleasas efectoras semejantes a activadores de transcripción (TALENs) 6 , 7 , 8 , 9 Y ARN-guiado nucleasas derivadas de las agrupadas, regularmente intercaladas palindromic corto repite (CRISPR) sistema [ 10] .
La maquinaria de edición CRISPR / Cas9 está adaptada de un sistema inmunológico que las bacterias y arqueas utilizan para defenderse contra infecciones viralesAsno = "xref"> 11 , 12 , 13 . En este proceso, fragmentos cortos de 20-30 nt de secuencia viral invasora se incorporan en un locus genómico como "espaciadores" flanqueados por unidades repetidas 14 , 15 . La transcripción subsiguiente y el procesamiento de ARN genera ARNs 16 (CRRNAs) asociados a CRISPR pequeños que, junto con un ARNc trans-activador 17 (tracrRNA), se reúnen con la endonucleasa Cas9 efectora. Los CRRNAs, por lo tanto, proporcionar la especificidad de Cas9 orientación, la guía del complejo para escindir secuencias complementarias de ADN viral y la prevención de nuevas infecciones [ 18 , 19] . Cualquier secuencia "protospacer" en el ADN diana puede servir como fuente del CRRNA, siempre y cuando esté directamente 5 'con un motivo adyacente protospacer corto (PAM), NGG en el caso de S. pyogenes Cas9 21] .
Tras la expresión de Cas9 y un sgRNA en células eucariotas, la proteína Cas9 escinde ambas cadenas de ADN en el locus diana. En ausencia de una región apropiada de secuencia homóloga, la célula fija esta ruptura mediante la unión final no homóloga (NHEJ) 22 , 23 , 24 , que típicamente introduce pequeñas deleciones o, en raras ocasiones, inserciones. Al orientar unaLectura, la reparación conduce probablemente a un desplazamiento de traslación que produce un producto proteico no funcional. Por el contrario, cuando se proporciona una plantilla exógena con grandes regiones de homología, la célula puede fijar la ruptura de doble hebra mediante reparación dirigida por homología 25 , 26 . Esta ruta permite mayores deleciones precisas, sustituciones o inserciones en el genoma, junto con la introducción de marcadores de selección excisable [ 27] .
Aquí, presentamos protocolos para generar knockout líneas celulares por cualquiera de estos dos CRISPR / Cas9 métodos ( Figura 1A ]. El enfoque de NHEJ utiliza un solo sitio de corte sgRNA y selección independiente de la selección, y por lo tanto requiere poca preparación inicial. Cuando se utiliza este método, deben diseñarse RNAs guía complementarios a los exones cerca del extremo 5 'de la transcripción, que son más probables para producir un knockout. Desde la modificaciónIones al genoma en este caso son pequeños, el cribado para los clones knockout se basa en transferencias de punto, donde el producto proteico se evalúa de una manera de alto rendimiento. Utilizamos la generación de líneas de knockout de ELAV-like 1 protein (ELAVL1) como ejemplo. El segundo enfoque se basa en la reparación dirigida por homología (HDR) y utiliza dos sitios de corte de sgRNA que abarcan el gen o región de interés, permitiendo deleciones de decenas de kb. Un plásmido con dos regiones de homología que flanquean los sitios de escisión proporciona una plantilla de reemplazo ( Figura 1B ), introduciendo un marcador de resistencia seleccionable que aumenta la eficiencia de la generación de knockout. Este método también puede adaptarse para introducir modificaciones genéticas con brazos de homología diseñados apropiadamente. En este caso, la integración de un nuevo fragmento de ADN permite el cribado basado en PCR ( Figura 1C ). Aquí, utilizamos la generación de Pumilio RNA vinculante familia miembro 2 (PUM2) knockout líneas como un ejemplo.
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Protocol
1. Identificación de regiones de homología alrededor de la deleción deseada
NOTA: Sólo es necesario si se utiliza la edición basada en la selección.
- Seleccione dos regiones, inicialmente de 1,5-2 kb, a cada lado del locus de deleción deseado, que servirá como brazos de homología en la plantilla HDR ( Figura 1A ). Identificar las regiones que carecen de sitios de reconocimiento BsaI en cada capítulo (GGTCTC) para facilitar la clonación. Si los sitios BsaI son inevitables, utilice una enzima de restricción alternativa de tipo IIs (BsmBI, SapI, BbsI) y modifique los sitios correspondientes en el plásmido receptor (pUC19-BsaI), el plásmido donante marcador de resistencia (pGolden-Neo o pGolden-Hygro) y Homología brazo productos PCR sobresale.
2. Generación de plásmidos de expresión de Cas9-sgRNA
- Definir el (los) sitio (s) de orientación para la mutagénesis. Para el método de corte único, sin selección, los exones proximales de codificación 5 'para aumentar la probabilidad de un no fuMutación funcional. Para el método de dos cortes, seleccione dos sitios que abarquen tanto del gen como sea necesario.
NOTA: En nuestra experiencia, las supresiones de hasta 53 kb se crean eficientemente. - Introduzca 200 a 300 pb de la secuencia de la región objetivo en la herramienta de diseño crispr.mit.edu. Para la clonación basada en selección, utilice 200-300 pb de las regiones de homología identificadas que son proximales al locus de deleción ( Figura 1A ). Seleccione 2-3 de los sgRNAs de mayor rango por región objetivo para tener en cuenta las diferencias en su actividad y para aislar clones independientes que no compartan los mismos potenciales efectos fuera de la meta.
- Para diseñar oligonucleótidos dúplex con salientes adecuados para su inserción en el plásmido de expresión, omitir la secuencia de PAM final (NGG) y añadir un saliente de 5'-CACC seguido por un G al oligo de la hebra superior. Para el oligo de la hebra inferior, añada un saliente 5'-AAAC a la secuencia diana complementada con el reverso, seguido por un 3'-C, como ilIlustrado a continuación:
- Insertar oligonucleótidos sintéticos correspondientes a los sgRNAs en el plásmido pSpCas9 (BB) utilizando la clonación Golden Gate 28 como se describe en el protocolo de laboratorio Zhang [ 29] .
3. Generación de Plásmidos Plantilla de Reparación dirigida por Homología
NOTA: Sólo es necesario si se utiliza la edición basada en la selección. El plásmido plantilla de reparación dirigida por homología consiste en un casete de resistencia a fármacos flanqueado por dos regiones que son complementarias al genoma justo fuera de los dos sitios diana sgRNA ( Figura 1B ).
- A partir de las regiones de homología más amplias identificadas en el paso 1.1, seleccionar 800-1.000 pb 26 no más de 5-10 pb de los sitios de corte Cas9 diseñados, para servir como brazos de homología ( Figura 1A ). Asegúrese de no incluir el sgRNAEl sitio diana y su PAM en los brazos de homología, ya que esto causará la escisión CRISPR / Cas9 del propio plásmido molde. Si los brazos de homología contienen sitios BsaI internos, utilice sitios alternativos de sgRNA.
- PCR amplifica los brazos de homología a partir del ADN genómico usando una ADN polimerasa de alta fidelidad, según las instrucciones del fabricante, usando cebadores directos e inversos con secuencia 5 'adicional que introduce sitios BsaI (GGTCTC) y salientes únicos en cada extremo de la región de homología. Los salientes deben contener secuencias apropiadas para generar el orden de montaje y orientación correctos, como se describe a continuación ( Figura 1B ):
Homología izquierda brazo FP overhang: 5 'GGGTCTCA GGCC
Brazo de homología izquierda RP prominente: 5 'GGGTCTCT CACG
Homología derecha brazo FP overhang: 5 'GGGTCTCA GTCC
Brazo de homología derecha brazo de RP: 5 'GGGTCTCT CCAC - Comprobar los brazos de homología para el amplificador apropiadoPor electroforesis en gel antes de continuar adelante.
- Reúna las regiones del brazo de homología derecha e izquierda con el casete de resistencia en un plásmido molde HDR por clonación Golden Gate [ 28] . Utilizar plásmidos pGolden-Neo o pGolden-Hygro 30 como fuente de los casetes de resistencia flanqueados con loxP (loxP-PGK-Neo-pA-loxP o loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Utilizar pUC19-BsaI, un pUC19 modificado con sitios BsaI en la región de clonación múltiple y eliminar sitios BsaI en otra parte, como el vector receptor (disponible a petición). Utilice una proporción de 1: 1: 1: 1 para los tres insertos y el vector.
- Preparar la siguiente mezcla de reacción 30 :
Producto de PCR del brazo de homología derecha 0,06 pmoles (30-40 ng) Producto de PCR del brazo de homología izquierdo 0,06 pmoles (30-40 ng) El plásmido pGolden - Neo (100 ng / μl) 1 &# 181; L PUC19 - BsaI (100 ng / μl) 1 μl 2x tampón de ADN ligasa T7 5 μL BsaI (10 U / μl) 0,75 μL T7 ADN ligasa (3000 U / μl) 0,25 μL Agua Hasta 10 μL - Utilice los siguientes parámetros del termociclador: 37 ° C durante 5 min, 20 ° C durante 5 min. Repita durante 30 ciclos.
- Tratar el producto de clonación con una exonucleasa según las instrucciones del fabricante para digerir cualquier ADN lineal restante.
- Transformar la mezcla de reacción en una cepa E. coli competente de acuerdo con el protocolo suministrado con las células, y la placa sobre platos que contienen ampicilina.
- Preparar la siguiente mezcla de reacción 30 :
- Para identificar clones con el conjunto de plantilla correcto, realizar bacteriasAl colonia PCR para amplificar las subregiones del brazo de homología del inserto montado (ya que el inserto completo puede ser demasiado grande para amplificarse de forma fiable). Utilizar un recocido de cebador a la secuencia de plásmido flanqueante y un segundo cebador complementario al borde del cassette de resistencia ( Figura 1B , la secuencia es común a los insertos Neo e Hygro), generando un producto dependiente del ensamblaje que es aproximadamente 200 pb más largo que El brazo de homología contenida:
PUC19 - Bsal - Izquierda: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Resistencia-Izquierda: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19 - BsaI - Derecha: 5 'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Resistencia-Derecha: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Elija colonias bacterianas con mondadientes estériles y suspenda las bacterias en 20 μl de agua. Calentar a 95 ° C durante 15 min, y girar en una centrífuga de mesa a la velocidad máxima durante 5 min. Coloque inmediatamente sobre hielo.
- Preparar la siguiente mezcla de PCR 31 </ Sup>:
Plantilla de colonia diluida 1,25 mu l Tampón de reacción Taq 10x 1,25 mu l 20mM dNTPs 0,25 μL 10 μM Imprimación directa 0,25 μL 10 μM Imprimación inversa 0,25 μL Taq Polimerasa 0,25 μL Agua 9 μL - Utilizar los siguientes parámetros del termociclador: 95 ° C durante 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min / kb), repetir durante 25 ciclos, 72 ° C durante 2 min.
- Compruebe el producto de PCR para el tamaño correcto del amplicón mediante electroforesis en gel de agarosa.
- Opcionalmente, el ADN de plásmido de miniprep de colonias individuales con tamaño de inserto correcto y secuenciaE por secuenciación de Sanger con los cebadores de amplificación mencionados anteriormente.
4. Transfección de componentes CRISPR en células cultivadas
- Antes de la transfección: cultivar células T-REx293 en medio DMEM suplementado con FBS al 10% a 37ºC y CO 2 al 5%.
- Placa de células en placas de 6 pozos y crecer hasta aproximadamente el 70% de confluencia. Incluya un pozo para un control no transfectado.
- Transfect células con 2,5 μ g plásmido total utilizando un protocolo de transfección comercial. En paralelo, mantener el control no transfectado.
NOTA: El método de transfección y la eficiencia varían dependiendo del tipo de célula. Determine el método de transfección apropiado para el sistema antes del experimento.- Para la transfección de células con selección, se utilizan 0,75 μg de Cas9-sgRNA 1 (corte a la izquierda), 0,75 μg de Cas9-sgRNA 2 (corte derecho) y 1,0 μg de plantilla de recombinación homóloga.
- Para transfectiDe las células sin selección, se utiliza 2,5 μ g de Cas9-sgRNA plásmido.
5. Selección de fármacos
- 48 h después de la transfección, tratar las células con el fármaco apropiado (Neomicina / Higromicina). Llevar a cabo la selección hasta que todas las células en el control no transfectado mueren (normalmente 3-5 días para Neo, 7-14 días para Hygro).
NOTA: Use concentraciones de 500 μg / mL y 10 μg / mL para Neomicina e Higromicina, respectivamente para las células T-REx293. Para otros tipos de células, puede ser útil llevar a cabo una titulación previa de fármaco en células no transfectadas para determinar la concentración efectiva.
6. Aislamiento de las poblaciones clonales
- Cultivar las células hasta el 100% de confluencia en el pocillo original después de la selección. Seed células en placas de 96 pozos a una densidad de 0,33 células por pocillo.
NOTA: La siembra de tres placas de 96 pocillos es un buen punto de partida para asegurar el aislamiento de más de un clon correcto, pero se puede necesitar más o menos depTerminando en sgRNA y HDR eficiencias. - Observe las colonias durante un período de 2-4 semanas, hasta que las colonias sean visibles al ojo. Elija colonias visibles con una punta de pipeta estéril y vuelva a sembrar en nuevos pozos para estimular el crecimiento de monocapa. Cuando se usan células en suspensión, incluso se pueden utilizar densidades de siembra más bajas para asegurar una mayor proporción de pozos de una sola colonia.
7. Selección de Candidatos
- Selección de candidatos sin el uso de la selección: dot blot
- Crecer clones individuales a 50-100% de confluencia. Desalojar la monocapa de las células pipeteando dentro del pozo.
- Alícuota de 90 μL del volumen total de 100 μL a un tubo de microcentrífuga limpio. Se centrifuga a 6000 rpm durante 5 min, se elimina el medio y se liza el sedimento celular en 10 μl de tampón de lisis 1x o tampón de carga SDS 1x (5x: Tris-Cl 250 mM pH 6,8, SDS al 8%, azul de bromofenol al 0,1% Glicerol, DTT 100 mM). Añadir 90 μl de nuevos medios al resto de las células en elL para continuar propagando.
- Pipetear 1 μl de lisado celular sobre una membrana de nitrocelulosa seca para formar un punto. Blot cada muestra dos veces en dos membranas separadas, creando dos patrones idénticos de muestras.
- Bloquear las membranas en 5% de leche en TBST (solución salina tamponada con Tris + 0,01% de Tween 20: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3 g de base de Tris, hasta 1 l de agua destilada, pH 7,4) 31 durante 1 h a temperatura ambiente Con balanceo, aquí y durante todo el procedimiento).
- Blot usando el anticuerpo primario contra la proteína diana en una membrana, y el anticuerpo primario para una proteína de control (tubulina, GAPDH, o cualquier otra proteína que no se espera que cambie) en el otro. Utilice la dilución recomendada de anticuerpos primarios (0,2 μg / mL para ELAVL1 y 0,1 μg / mL para Pum2 en este caso) en TBST + 5% de leche. Incubar 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con TBST durante 5 min.
- Incubar cada membrana con anticuerpo secundario conjugado con HRP apropiado en TBST + 5% de leche durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con TBST durante 5 min.
- Aplique una solución de sustrato de quimioluminiscencia (véase Tabla de Materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante e imprima la membrana manchada en un dispositivo de imagen de quimioluminiscencia digital.
- Cuantificar las intensidades de los puntos para las proteínas objetivo y de control utilizando el software apropiado.
- Eliminar a los candidatos con baja señal de proteína de control, y calcular el fondo substraído ratios de objetivo para controlar la intensidad de proteínas para los candidatos restantes. Seleccione los candidatos con las proporciones más bajas para el paso y la posterior validación por transferencia western.
- Selección de candidatos con el uso de la selección: PCR de colonias
- Recoger el lisado celular usando un kit de preparación de ADN (Ver Tabla de Materiales ).
- Duplicar las colonias individuales en un pozo de 96 nuevos y crecer hasta 100% de confluencia.
- Eliminar los medios de un conjunto de los clones, unY resuspender las células en 30 μl de tampón de extracción del kit. Transferir a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml.
- Calentar la solución a 96 ° C durante 15 min y dejar enfriar a temperatura ambiente.
- Añadir 30 μL de tampón de estabilización del kit. Mezclar bien.
- Identificar líneas mutantes de tipo salvaje y monoalélicas / bialélicas mediante PCR de colonias.
- Diseñar dos conjuntos separados de cebadores de PCR (para el lado izquierdo y derecho del locus objetivo) para amplificar las regiones alrededor de los brazos de homología basado en la integración exitosa o fallida del casete de resistencia ( Figura 2C ). En cada lado, utilice un cebador común (rojo) que se recoje fuera del brazo de homología. Se utiliza con un cebador pareado correspondiente que es complementario a la secuencia endógena, que abarca la región de homología (azul), para ensayar el alelo de tipo salvaje. Utilice otro cebador pareado, complementario al casete de resistencia insertado (ver cebadores en la sección2.3), para probar la mutación deseada.
- (Recomendado) Validar los conjuntos de cebadores usando lisado celular de la población de células a granel original seleccionada, ya que contendrá una mezcla de ambos WT y alelos mutantes ( Figura 2D ).
- Preparar la siguiente mezcla de reacción:
Lisado celular 0,5 μl 10 x tampón KOD 1,25 mu l MgSO _ {4} 25 mM 0,75 μL DNTPs 2 mM 1,25 mu l 10 μM Imprimación directa 0,375 μL 10 μM Imprimación inversa 0,375 μL KOD polimerasa 0,25 μL Agua 7,75 μL - Utilizar las siguientes condiciones del termociclador: 95 ° C durante 2 min, (95 ° C durante 20 s, Primer Tm durante 10 s, 70 ° C durante 20 s / kb) repetir durante 25 ciclos.
- Visualizar el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa.
- Repita la prueba de PCR de colonias para cada lado de la integración prevista. Seleccione y expanda candidatos que muestren presencia de integración y ningún producto de secuencia endógena para la región suprimida.
- Validar los candidatos positivos por Western blot y / o RT-qPCR.
- Recoger el lisado celular usando un kit de preparación de ADN (Ver Tabla de Materiales ).
8. Verificar la mutación genómica mediante secuenciación
- Aislar el ADN genómico de líneas celulares mutantes por extracción de fenol cloroformo 31 .
- La PCR amplifica la región diana de sgRNA, utilizando cebadores con salientes 5 'que añaden sitios de restricción BsaI a cada extremo.
NOTA: Para clones editados con HDR, donde ambos alelos pueden ser idénticos, el producto de PCR puede secuenciarse directamente. - Clonar la región amplificada en pUC19-BsaI por clonación Golden Gate.
- Transformar la mezcla de reacción en una cepa E. coli competente.
- Miniprep ADN plasmídico de 6-10 colonias individuales y secuencia de la región clonada por secuenciación de Sanger.
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Representative Results
Para la generación de ELAVL1 knockout líneas, un anticuerpo robusto estaba disponible, por lo que la edición utilizando sgRNAs único ( Figura 1A , izquierda) se realizó, seguido de inmunotransferencia punto. Se transfectaron tres sgRNAs de forma independiente para comparar las eficiencias y para descartar los efectos deseados en los clones resultantes. Después de recoger y borrar los lisados celulares de las poblaciones clonales en dos membranas de nitrocelulosa, las manchas se probaron tanto para ELAVL1 y PUM2 (como un control de normalización) ( Figura 2A ]. La relación cuantificada de ELAVL1 a PUM2 señal demostró un amplio rango,> 10 4- fold entre las líneas aisladas ( Figura 2B ]. Usando esta relación como un criterio de selección, hemos validado un número de líneas utilizando ELAVL1 western blots ( Figura 3A ]. En la mayoría de los casos, las poblaciones clonales con la señal ELAVL1 relativa más baja fueron( Figura 2B ), lo que confirma el poder predictivo de esta cuantificación (a pesar de la considerable variabilidad en la señal de control, que probablemente surgió de diferentes números de células recogidas). Por el contrario, la mayoría de los clones con relaciones intermedias exhibieron señal ELAVL1 al validar, representando potencialmente eventos de deleción monoalélicos. Sin embargo, no se observó ninguna gradación general de las proporciones en grupos de mutantes WT, monoalélicos y completos (bialélicos), e incluso los clones positivos para ELAVL1 mostraron un amplio y continuo rango de niveles, probablemente debido a la variabilidad clonal de la expresión. La eficacia global de la generación de ELAVL1 knockout utilizando este método varió de 6 a 36% entre los sgRNAs.
Para otras dianas genéticas (tales como PUM2), la calidad de los anticuerpos disponibles impide la selección precisa de los clones candidatos por transferencia de puntos debido a un alto nivel de reactividad cruzadaVidad Además, la eficiencia de la orientación de algunos loci genómicos puede ser sustancialmente menor debido a la accesibilidad de la cromatina. En tales casos, un método dependiente de la selección es apropiado para aumentar la eficiencia. Dos sgRNAs dirigidos a las regiones de codificación precoz y tardía de PUM2 fueron cotransfectados con un modelo de reparación dirigida por homología con el fin de extraer 45 kb de ADN genómico y reemplazarlo con un cassette de resistencia a la neomicina ( Figura 1A , derecha). El montaje de la plantilla de homología se ilustra en la Figura 1B . Los cebadores de PCR se diseñaron para amplificar las regiones alrededor de los brazos de homología basándose en la integración satisfactoria o no satisfactoria del casete de resistencia ( Figura 2C ), y se ensayaron en células no transfectadas y seleccionadas en gran escala (panel izquierdo). Como era de esperar, en las células no transfectadas, sólo se observó un amplicón correspondiente al estado endógeno (parte superior), mientras que las células seleccionadas en gran escala mostraron amplicones de ambosAlelos de tipo salvaje y mutantes. Los lisados celulares de los candidatos clonales generados se recogieron y tamizaron para determinar la presencia tanto de la secuencia endógena como de la casete de resistencia. Los knockouts candidatos se identificaron por la presencia del amplicón de casete de resistencia solo, indicando deleción / integración bialélica ( Figura 2D , estrellas). También se observaron clones con inserciones monoalélicas, y fueron bastante comunes, ya que tales poblaciones también pueden sobrevivir al proceso de selección. Estos clones se indicaron por la presencia tanto de la secuencia endógena como de la casete de resistencia. En algunos casos, clonal wildtypes en el lugar testado también se observaron, lo que sugiere que no aleatorias, sgRNA asistida por la integración genómica de la homología dirigida reparación plantilla se produce a una baja frecuencia. Las líneas mutantes bialélicas se validaron adicionalmente mediante transferencia Western ( Figura 3B ). La eficiencia global de la generación de knockout mediante el procedimiento HDR fue de 33%.
Figura 1: Un flujo de trabajo para generar knockouts mediados por CRISPR en líneas de células de mamífero. ( A ) Genoma que edita eventos producidos por escisión CRISPR / Cas9 y NHEJ (izquierda) o HDR (derecha). El sitio de la escisión de Cas9 se indica mediante una línea vertical blanca. ( B ) Componentes y ensamblaje del plásmido molde HDR. Las enzimas de restricción de tipo II usadas en la clonación de Golden Gate, tales como BsaI, reconocen una secuencia de ADN asimétrica y dejan un corte escalonado fuera de la secuencia de reconocimiento, permitiendo el diseño de segmentos de superposición arbitrarios para el ensamblaje. Las flechas indican las posiciones del cebador para comprobar el correcto montaje del plásmido. ( C ) Flujo de trabajo: después de la transfección (y selección de fármaco si es aplicable), las células se cubren en las diluciones limitadoras en placas de 96 pocillos. Poblaciones clonalesSe seleccionan mediante inmunoblot punto (independiente de la selección, NHEJ) o PCR de colonias (dependiente de la selección, HDR). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Selección de líneas eliminatorias candidatas por transferencia de puntos o PCR de colonias. ( A ) Inmunotransferencia de puntos de clones aislados de ELAVL1 con anticuerpo ELAVL1 (a la izquierda), y por separado con un anticuerpo para una proteína de control, Pum2 (derecha). Los clones que mostraron poca señal de control, probablemente debido a cantidades de proteína de entrada bajas, están marcados con una X y excluidos de un análisis posterior. Los clones con señal ELAVL1 baja (círculos) se ensayaron adicionalmente mediante transferencias de Western que confirmaron (verde) o invalidaron (gris) a los candidatos. ( B ) Cuantificación de KO cAndidatos de punto blot. Ratios de ELAVL1 para controlar la señal de la proteína en el punto blot mostrado en A, en orden creciente. ( C ) Diseño de cebador para pruebas de eliminación / inserción mediante PCR de colonias. Un cebador complementario al locus genómico fuera de la región del brazo de homología (rojo) se empareja con un cebador complementario a la secuencia endógena (azul) o al cassette de resistencia (verde), sondeo para el estado no editado o un evento de deleción / inserción , Respectivamente. Los pares de cebadores separados están diseñados para probar ambos lados de la integración. ( D ) Ejemplo de gel de agarosa de PCR de colonias utilizando cebadores que abarcan la unión de integración corriente arriba usando cebadores internos endógenos (arriba) y knockout dentro de cebadores (parte inferior). Los cebadores se validan por primera vez en ambas células T-REx293 parentales y en células seleccionadas a granel (izquierda). Clones candidatos individuales (medio) y los patrones de banda esperados para clones WT, KO y deleción monoaléica (WT / KO) (derecha). Los clones knockout bialélicos se indicanD por una estrella. Los productos de amplificación correctos se indican mediante flechas negras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Validación de candidatos knockout por Western blot. ( A ) Western blot para ELAVL1 (parte superior) de un subconjunto de clones identificados por transferencia de puntos. PUM2 se transfirió en la misma membrana que un control de carga (parte inferior). ( B ) Western blot para PUM2 (parte superior) de un subconjunto de clones identificados por PCR de colonias. GAPDH se transfirió en la misma membrana que un control de carga (parte inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El sistema CRISPR / Cas9 ha permitido la generación eficiente de modificaciones genómicas estables, que proporcionan una alternativa más consistente a otros métodos de manipulación transitorios. Aquí, hemos presentado dos métodos para la rápida identificación de CRISPR / Cas9 genes knockouts en líneas de células de mamíferos. Ambos métodos requieren poco material celular, por lo que las pruebas se pueden hacer en las primeras etapas del cultivo clonal, ahorrando tiempo y reactivos. Para aumentar la eficiencia de ambos métodos, se recomienda probar múltiples sgRNAs, ya que las eficiencias varían dependiendo de la secuencia y la ubicación genómica. Además, el uso de sgRNAs múltiples es útil en la identificación de los efectos fuera de destino mediante la detección de fenotipos atípicos como resultado de las mutaciones en los genes no dirigidos. La transfección eficaz y la escisión de Cas9 aumentarán considerablemente las posibilidades de generar knockouts. Alternativamente, la transfección de las células directamente con el comercio de origen sgRNA / Cas9 ribonucleoprotein complejos [ 32]33 pueden acelerar el protocolo y reducir los efectos fuera de destino.
Las manchas de puntos son adecuadas para evaluar los knockouts de proteínas causados por las pequeñas alteraciones genómicas debidas a NHEJ. Dado que sólo es necesaria una única construcción de sgRNA / Cas9, este enfoque puede ser el más rápido en la obtención de líneas nulas, y el procedimiento de borrado evita pasos adicionales, acelerando el cribado. La señal de la proteína inmunoblot normalizado sirve como un predictor fiable de la validación con éxito ( Figura 2B ]. Este protocolo es ideal para la generación de knockouts con una perturbación genómica mínima. Alternativamente, este método de cribado puede adaptarse para investigar la adición o modificación de proteínas, tales como proteínas transgénicas o etiquetas de proteínas. Sin embargo, este método de cribado requiere un anticuerpo con alta especificidad para la proteína de interés, ya que la reactividad cruzada conduce a un alto nivel de fondo en puntos blot. Este método se limita naturalmente a mutaciones dirigidas aProteínas, ya que la producción final depende de la presencia / ausencia de un producto proteico. Es importante observar también que las mutaciones causadas por NHEJ pueden conducir a una variedad de resultados de proteínas, incluyendo una proteína con función constitutivamente activa, función negativa parcial o dominante, o una proteína funcional que carece del epítopo de anticuerpo de detección. Para minimizar estos problemas, es útil dirigir el corte Cas9 tan pronto en la región de codificación como sea posible, con el fin de aumentar las posibilidades de generar una proteína totalmente no funcional. Además, dirigirse a regiones genómicas que son menos accesibles a la maquinaria Cas9 puede producir bajos rendimientos de deleción en ausencia de selección. Finalmente, los knockouts que confieren una desventaja selectiva pueden ser difíciles de obtener por este método por razones similares.
El uso de mecanismos de reparación dirigidos por homología junto con la escisión CRISPR / Cas9 permite manipulaciones genómicas mucho más grandes y más específicas, que pueden incluir tanto la(Delineadas por dos escisiones de sgRNA) e inserciones. Debido a que deben llevarse a cabo dos eventos de disociación y un proceso de reparación preciso, la integración de un marcador de resistencia a fármacos aumenta sustancialmente los rendimientos de eliminación mediante este método. Aunque también se puede utilizar la detección de transferencia de puntos, la selección por PCR de colonias es aplicable de manera más general para detectar con exactitud candidatos correctos de integración / nocaut con tales perturbaciones genómicas grandes. Además, la prueba por PCR permite la identificación de clones con integraciones imperfectas e incompletas, lo que puede proporcionar una comprensión de la extensión y naturaleza del propio proceso HDR. Además, el marcador introducido se puede eliminar posteriormente (por expresión de Cre transitoria o adición en forma permeable a la membrana), dejando una cicatriz de deleción de 34 pb mínima (sitio loxP) y permitiendo la reutilización futura del marcador de selección. La flexibilidad de este enfoque aumenta con el uso de múltiples marcadores de resistencia, lo que permite la generación de múltiples cumuLacto proteína knockouts. Es importante al aplicar este método que la ausencia de producto se valide adicionalmente, por ejemplo mediante RT-qPCR del transcrito esperado. Dado que esta pantalla puede ser independiente de los anticuerpos, este método se aplica fácilmente a los knockouts de proteínas sin un anticuerpo robusto, así como para detectar cambios que no caen en genes codificantes de proteínas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Gissell Sanchez, Megan Lee y Jason Estep por la asistencia experimental, y Weifeng Gu y Xuemei Chen por compartir reactivos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
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