Summary
Nya framsteg inom förmågan att genetiskt manipulera somatiska cellinjer har stor potential för grundläggande och tillämpad forskning. Här presenterar vi två tillvägagångssätt för CRISPR / Cas9 genererad knockoutproduktion och screening i däggdjurscellslinjer, med och utan användning av selekterbara markörer.
Abstract
CRISPR / Cas9 genomteknik systemet har revolutionerat biologi genom att tillåta exakt genom redigering med liten ansträngning. Styrs av en enda RNA-guide (sgRNA) som ger specificitet spjälkar Cas9-proteinet båda DNA-strängarna i det riktade locuset. DNA-pausen kan trigga antingen icke-homolog slutförslutning (NHEJ) eller homologeradriktad reparation (HDR). NHEJ kan introducera små raderingar eller infogningar som leder till ramförskjutningsmutationer, medan HDR möjliggör större och mer exakta störningar. Här presenterar vi protokoll för att generera knockoutcellinjer genom att koppla upp etablerade CRISPR / Cas9-metoder med två alternativ för nedströmsval / screening. NHEJ-tillvägagångssättet använder en enda sgRNA-cut-plats och selektionsoberoende screening, där proteinproduktion utvärderas med primär immunoblot på ett högt genomströmningsmöte. HDR-tillvägagångssättet använder två sgRNA-cut-platser som spänner över genen av intresse. Tillsammans med en tillhandahållen HDR-mall kan den här metoden uteslutasAv tiotals kb, med hjälp av den infogade selekterbara resistansmarkören. De lämpliga applikationerna och fördelarna med varje metod diskuteras.
Introduction
Stabila genetiska förändringar ger en fördel jämfört med övergående metoder för cellulär störning, som kan variera i effektivitet och varaktighet. Genomisk redigering har blivit allt vanligare de senaste åren på grund av utvecklingen av målspecifika nukleaser, såsom zinkfibre-nukleaser 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALEN) 6 , 7 , 8 , 9 Och RNA-styrda nukleaser härledda från de grupperade, regelbundna interspaced korta palindroma upprepningarna (CRISPR) -systemet 10 .
CRISPR / Cas9-redigeringsmaskinen är anpassad från ett immunsystem som bakterier och arkeor använder för att försvara sig mot virusinfektionerRöv = "xref"> 11 , 12 , 13 . I denna process inkorporeras korta 20-30 nt-fragment av invaderande virussekvens i ett genomiskt lokus som "distansorgan" flankerade av upprepande enheter 14 , 15 . Efterföljande transkription och RNA-behandling alstrar små CRISPR-associerade RNA 16 (crRNAs) som tillsammans med ett transaktiverande crRNA 17 (tracrRNA) samlas med effektorn Cas9-endonukleas. CrRNA: erna ger således specificitet mot Cas9-målsättning, styrning av komplexet för att klyva komplementära virala DNA-sekvenser och förhindra ytterligare infektioner 18 , 19 . Vilken som helst "protospacer" -sekvens i det riktade DNA kan tjäna som källa till crRNA, så länge som det är direkt 5 'till ett kort protospacer intilliggande motiv (PAM), NGG i fallet med S. pyogenes Cas9 21 .
Vid uttryck av Cas9 och ett sgRNA i eukaryota celler klyver Cas9-proteinet båda DNA-strängarna vid det riktade locuset. I frånvaro av en lämplig region av homolog sekvens fixar cellen denna paus via icke-homolog slutförslutning (NHEJ) 22 , 23 , 24 , som typiskt introducerar små deletioner eller sällan insättningar. När du riktar in en öppenLäsramen leder reparationen sannolikt till en translationell ramskift som producerar en icke-funktionell proteinprodukt. I motsats därtill kan cellen, när den förses med en exogen mall med stora homologiska områden, fixera dubbelsträngsprickningen genom homologinriktad reparation 25 , 26 . Denna väg möjliggör större exakta deletioner, ersättningar eller insertioner i genomet, i kombination med införandet av excisabla markeringsmarkörer 27 .
Här presenterar vi protokoll för att generera knockoutcellinjer genom någon av dessa två CRISPR / Cas9-metoder ( Figur 1A ). NHEJ-tillvägagångssättet använder en enda sgRNA-cut-plats och urval oberoende screening, och kräver sålunda liten förberedelse framåt. När du använder den här metoden, vägleda RNA som är komplementära till exoner nära 5'-änden av transkriptet, vilket sannolikt kommer att producera en knockout, måste utformas. Sedan modificatJoner till genomet i detta fall är små, screening för knockout-kloner baseras på punktfläckar, där proteinprodukten utvärderas på ett högt genomströmningsmöte. Vi använder generationen av ELAV-liknande 1 protein (ELAVL1) knockout-linjer som ett exempel. Det andra tillvägagångssättet är beroende av homologeradriktad reparation (HDR) och använder två sgRNA-cut-platser som spänner över genen eller regionen av intresse, vilket möjliggör borttagning av tiotals kb. En plasmid med två regioner av homologi som flankerar klyvningsställena tillhandahåller en ersättningsmall ( Figur 1B ), introducerande en selekterbar resistansmarkör som ökar effektiviteten av knockout-generationen. Denna metod kan också anpassas för att introducera genmodifieringar med korrekt utformade homologiska armar. I detta fall möjliggör integrationen av ett nytt DNA-fragment för PCR-baserad screening ( Figur 1C ). Här använder vi generationen av Pumilio RNA-bindande familjemedlem 2 (PUM2) knockout-linjer som ett exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Identifiering av homologiska regioner runt den önskade raderingen
OBS! Endast nödvändig om du använder valbaserad redigering.
- Välj två regioner, ursprungligen 1,5-2 kb, på vardera sidan av det önskade deletionslokalet, som kommer att fungera som homologarmar i HDR-mallen ( Figur 1A ). Identifiera regioner som saknar BsaI-erkännandepunkter på båda strängarna (GGTCTC) för att underlätta kloning. Om BsaI-ställen är oundvikliga, använd ett alternativt typ IIs-restriktionsenzym (BsmBI, SapI, BbsI) och modifiera de motsvarande ställena i mottagarplasmiden (pUC19-BsaI), resistansmarkörsdonatorplasmiden (pGolden-Neo eller pGolden-Hygro) och Homolog arm PCR produktöverhäng.
2. Generering av Cas9-sgRNA Expressionsplasmider
- Definiera målsidan för mutagenes. För den enkna, urvalsfria metoden, rikta 5'-proximala kodningsexoner för att öka sannolikheten för en icke-fuNktionell mutation. För tvåskärningsmetoden, välj två platser som spänner så mycket av genen som behövs.
OBS! Enligt vår erfarenhet är raderingar på upp till 53 kb effektivt skapade. - Ange 200 till 300 bp av den riktade regionssekvensen i designverktyget crispr.mit.edu. För selektionsbaserad kloning, använd 200-300 bp av de identifierade homologiregionerna som är proximala till deletionsplatsen ( Figur 1A ). Välj 2-3 av de högst rankade sgRNAs per riktade region för att ta hänsyn till skillnader i deras aktivitet och att isolera oberoende kloner som inte delar samma potentiella off-target-effekter.
- Att utforma duplexade oligonukleotider med lämpligt överhäng för införande i expressionsplasmiden utelämnar slutänden PAM-sekvens (NGG) och adderar ett 5'-CACC-överhäng följt av en G till toppsträngoligoten. För den nedre strängoligoen lägger du till ett 5'-AAAC-överhäng till den omvända komplementerade målsekvensen följt av en 3'-C, som ilLustrerade nedan:
- Sätt in syntetiska oligonukleotider som motsvarar sgRNA: erna i pSpCas9 (BB) -plasmiden med användning av Golden Gate-kloning 28 såsom beskrivits i Zhang-lab-protokollet 29 .
3. Generering av homologiregerade reparationsmallplasmider
OBS! Endast nödvändig om du använder valbaserad redigering. Den homologiregerade reparationsmallplasmiden består av en läkemedelsresistanskassett flankerad av två regioner som är komplementära till genomet precis utanför de två sgRNA-målsätena ( Figur 1B ).
- Från de bredare homologiska regionerna identifierade i steg 1.1, välj 800-1000 bp 26 inte mer än 5-10 bp bort från de utformade Cas9-cut-platserna, för att fungera som homologarmarmen ( Figur 1A ). Var noga med att inte inkludera sgRNAMålplats och dess PAM i homologarmarna, eftersom detta kommer att orsaka CRISPR / Cas9-klyvning av mallplasmiden själv. Om homologarmarna innehåller interna BsaI-ställen, använd alternativa sgRNA-sidor.
- PCR förstärker homologiska armar från genomiskt DNA med hjälp av ett högfidelitets-DNA-polymeras, enligt tillverkarens instruktioner, med hjälp av framåt- och bakre primers med ytterligare 5'-sekvens som introducerar BsaI-ställen (GGTCTC) och unika överhäng i vardera änden av homologregionen. Överhängen måste innehålla lämpliga sekvenser för att generera korrekt monteringsordning och orientering, såsom beskrivs nedan ( Figur 1B ):
Vänster homologiarm FP-överhäng: 5 'GGGTCTCA GGCC
Vänster homologiarm RP-överhäng: 5 'GGGTCTCT CACG
Höger homologarmar FP-överhäng: 5 'GGGTCTCA GTCC
Höger homologiarm RP-överhäng: 5 'GGGTCTCT CCAC - Kontrollera homologiska armar för lämplig amplifIcation via gelelektrofores innan du fortsätter framåt.
- Montera de högra och vänstra homolog armområdena med motståndskassetten i en HDR-mallplasmid genom Golden Gate-kloning 28 . Använd pGolden-Neo eller pGolden-Hygro plasmider 30 som källa till loxP-flankerade motståndskassetter (loxP-PGK-Neo-pA-loxP eller loxP-PGK-Hyg-pA-loxP). Använd pUC19-BsaI, en modifierad pUC19 med BsaI-ställen i den multipla kloningsregionen och eliminerade BsaI-ställen på andra ställen, som mottagarvektorn (tillgänglig på begäran). Använd ett förhållande av 1: 1: 1: 1 för de tre insatserna och vektorn.
- Förbered följande reaktionsblandning 30 :
Right homology arm PCR produkt 0,06 pmol (30-40ng) Vänster homologi arm PCR-produkt 0,06 pmol (30-40ng) PGolden-Neo-plasmid (100 ng / | il) 1 &# 181; L PUC19-BsaI-plasmid (100 ng / | il) 1 jil 2x T7 DNA ligasbuffert 5 | il BsaI (10 U / μl) 0,75 pl T7-DNA-ligas (3000 U / jil) 0,25 | il Vatten Upp till 10 μl - Använd följande termocyklerparametrar: 37 ° C i 5 min, 20 ° C i 5 min. Upprepa i 30 cykler.
- Behandla klonprodukten med ett exonukleas per tillverkarens anvisningar för att smälta bort allt återstående linjärt DNA.
- Transformera reaktionsblandningen till en kompetent E. coli- stam enligt det protokoll som matas med cellerna och plattan på ampicillinhaltiga rätter.
- Förbered följande reaktionsblandning 30 :
- För att identifiera kloner med rätt mallmontering, utför bakterierAl koloni-PCR för att amplifiera homologarmar-delregionerna i det sammansatta insatsen (eftersom hela insatsen kan vara för stor för att förstärkas på ett tillförlitligt sätt). Använd en primerglödgning till den flankerande plasmidsekvensen och en andra primer som är komplementär mot kanten av motståndskassetten ( Figur 1B , sekvensen är vanlig för både Neo- och Hygro-insatser), vilket alstrar en monteringsberoende produkt som är ungefär 200 bp längre än Den innehöll homologarmen:
PUC19-Bsal-vänster: 5 'GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG
Motstånd-vänster: 5 'AAAAGCGCCTCCCCTACCC
PUC19-BsaI-Right: 5'GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
Motstånd-höger: 5 'AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG- Välj bakteriekolonier med sterila tandpinnar och suspendera bakterierna i 20 μl vatten. Värm vid 95 ° C i 15 minuter och spinn ner i en bordplattformscentrifug med maximal hastighet i 5 min. Placera omedelbart på is.
- Förbered följande PCR-blandning 31 </ Sup>:
Späd kolonnmall 1,25 μl 10x Taq reaktionsbuffert 1,25 μl 20 mM dNTPs 0,25 | il 10 μM framåtriktad primer 0,25 | il 10 ^ M omvänd primer 0,25 | il Taq-polymeras 0,25 | il Vatten 9 | il - Använd följande termocyklerparametrar: 95 ° C under 30 s, (95 ° C 30 s, 61 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min / kb), upprepa i 25 cykler, 72 ° C i 2 min.
- Kontrollera PCR-produkten för korrekt amplikonstorlek genom agarosgelelektrofores.
- Eventuellt kan miniprep-plasmid-DNA från enskilda kolonier med korrekt insättningsstorlek och sekvens thE-homologiarmregioner genom Sanger-sekvensering med amplifieringsprimrarna som nämnts ovan.
4. Transfektion av CRISPR-komponenter i odlade celler
- Före transfektion: kultur T-REx293-celler i DMEM-medium kompletterad med 10% FBS vid 37 ° C och 5% CO2.
- Placera celler på plattor med 6 brunnar och växa till ca 70% konfluens. Inkludera en brunn för en oövervakad kontroll.
- Transfektera celler med 2,5 μg total plasmid med användning av ett kommersiellt transfektionsprotokoll. Parallellt behåll den otransfekterade kontrollen.
OBS: Transfektionsmetod och effektivitet varierar beroende på celltyp. Bestäm lämplig transfektionsmetod för systemet före experimentet.- För transfektion av celler med selektion använd 0.75 μg Cas9-sgRNA 1 (vänster klippning), 0,75 μg Cas9-sgRNA 2 (höger klippning) och 1,0 μg homolog rekombinationsmall.
- För transfektionPå celler utan val, använd 2,5 μg Cas9-sgRNA-plasmid.
5. Läkemedelsval
- 48 h efter transfektion, behandla cellerna med lämpligt läkemedel (Neomycin / Hygromycin). Utför val tills alla celler i den otransfekterade kontrollen dör (normalt 3-5 dagar för Neo, 7-14 dagar för Hygro).
OBS! Använd koncentrationer av 500 μg / mL och 10 μg / ml för Neomycin respektive Hygromycin för T-REx293-celler. För andra celltyper kan det vara användbart att utföra en tidigare titrering av läkemedel på otransfekterade celler för bestämning av den effektiva koncentrationen.
6. Isolering av klonala populationer
- Växa celler till 100% sammanflöde i originalbrunnen efter valet. Fröceller i 96-brunnsplattor vid en densitet av 0,33 celler per brunn.
ANMÄRKNING: Seeding av tre 96 brunnsplattor är en bra utgångspunkt för att säkerställa isolering av mer än en korrekt klon, men mer eller mindre kan behövas depSlutar på sgRNA och HDR effektivitet. - Observera kolonier över en 2-4 veckorsperiod tills kolonier är synliga för ögat. Välj synliga kolonier med en steril pipettspets och åter i nya brunnar för att uppmuntra monolagstillväxt. Vid användning av suspensionsceller kan även lägre sötdensiteter användas för att säkerställa en större andel enskilda kolonihål.
7. Screening Kandidater
- Screening kandidater utan användning av urval: dot blot
- Växa individuella kloner till 50-100% konfluens. Lossa monolagret av celler genom pipettering i brunnen.
- Aliquot 90 μL av den totala volymen på 100 | jl till ett rent mikrocentrifugrör. Spin ner vid 6000 rpm i 5 minuter, avlägsna media och lyscellspellett i 10 | il av 1x Lysis Buffer eller 1x SDS-laddningsbuffert (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 0,1% bromfenolblått, 40% Glycerol, 100 mM DTT). Tillsätt 90 μL nytt medium till resten av cellerna i welJag fortsätter att fortplantas.
- Pipettera 1 μl celllysat på ett torrt nitrocellulosemembran för att bilda en punkt. Blot varje prov två gånger på två separata membran, vilket skapar två identiska mönster av prover.
- Blockera membranen i 5% mjölk i TBST (Tris buffrad saltlösning + 0,01% Tween 20: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3 g Tris-bas, upp till 1 1 destillerat vatten, pH 7,4) 31 i 1 h vid rumstemperatur ( Med gunga, här och under hela förfarandet).
- Blot använder den primära antikroppen mot målproteinet på ett membran och den primära antikroppen för ett kontrollprotein (tubulin, GAPDH eller något annat protein som inte förväntas förändras) å andra sidan. Använd den rekommenderade primär antikroppspädningen (0,2 μg / ml för ELAVL1 och 0,1 μg / ml för Pum2 i detta fall) i TBST + 5% mjölk. Inkubera 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta 3 gånger med TBST i 5 min.
- Inkubera varje membran med lämplig HRP-konjugerad sekundär antikropp i TBST + 5% mjölk i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta 3 gånger med TBST i 5 min.
- Applicera kemiluminescenssubstratlösning (se materialtabell) enligt tillverkarens anvisningar och bild det blottade membranet på en digital kemiluminescensbildare.
- Kvantifiera punktintensiteter för mål- och kontrollproteinerna med hjälp av lämplig programvara.
- Eliminera kandidater med låg kontrollproteinsignal och beräkna bakgrundsavdragna förhållanden av mål för att kontrollera proteinintensiteter för de återstående kandidaterna. Välj kandidater med de lägsta förhållandena för passage och ytterligare validering av Western blot.
- Screening kandidater med användning av urval: koloni PCR
- Samla celllysat med hjälp av ett DNA-prep-kit (se materialtabell ).
- Duplicera enskilda kolonier i en ny 96-brunn och växa till 100% konfluens.
- Ta bort media från en uppsättning kloner, aNd resuspendera celler i 30 | j, l extraktionsbuffert från satsen. Överför till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Värm lösningen till 96 ° C under 15 minuter och låt svalna till rumstemperatur.
- Tillsätt 30 μl stabiliseringsbuffert från satsen. Blanda väl.
- Identifiera vildtyp och monoallel / biallelmutantlinjer genom koloni-PCR.
- Utforma två separata uppsättningar av PCR-primers (för vänster och höger sida av den riktade locusen) för att amplifiera regioner runt homologarmarna baserat på antingen framgångsrik eller misslyckad integrering av resistanskassetten ( Figur 2C ). På varje sida använder du en gemensam primer (röd) som annealerar utanför homologarmen. Använd den med en motsvarande parad primer som är komplementär till den endogena sekvensen, som spänner över homologregionen (blå), för att testa för allelens vildtyp. Använd en annan parad primer, komplementär till den infogade motståndskassetten (se primer i sektion2,3) för att testa för den önskade mutationen.
- (Rekommenderas) Validera primeruppsättningarna med hjälp av cellysat från den ursprungliga valda masscellpopulationen, eftersom den innehåller en blandning av både WT och mutant alleler ( Figur 2D ).
- Förbered följande reaktionsblandning:
Celllysat 0,5 | il 10x KOD-buffert 1,25 μl 25 mM MgS04 0,75 pl 2 mM dNTPs 1,25 μl 10 μM framåtriktad primer 0,375 pl 10 ^ M omvänd primer 0,375 pl KOD-polymeras 0,25 | il Vatten 7,75 pl - Använd följande termocyklervillkor: 95 ° C i 2 min, (95 ° C i 20 s, Primer Tm i 10 s, 70 ° C i 20 s / kb) upprepas under 25 cykler.
- Visualisera PCR-produkten med agarosgelelektrofores.
- Upprepa koloni-PCR-testningen för varje sida av den förutsagda integrationen. Välj och expandera kandidater som visar närvaro av integration och ingen endogen sekvensprodukt för den raderade regionen.
- Validera positiva kandidater med western blot och / eller RT-qPCR.
- Samla celllysat med hjälp av ett DNA-prep-kit (se materialtabell ).
8. Bekräfta genomisk mutation genom sekvensering
- Isolera genomiskt DNA från mutanta cellinjer genom fenolkloroformutvinning 31 .
- PCR amplifierar sgRNA-målregionen med användning av primers med 5'-överhäng som adderar BsaI-restriktionsställen i varje ände.
OBS! För kloner som redigerats med HDR, där båda allelerna kan vara identiska kan PCR-produkten sekvenseras direkt. - Klon den amplifierade regionen i pUC19-BsaI genom Golden Gate-kloning.
- Transformera reaktionsblandningen till en kompetent E. coli- stam.
- Miniprep-plasmid-DNA från 6-10 individuella kolonier och sekvensera den klonade regionen genom Sanger-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För generering av ELAVL1 knockout-linjer var en robust antikropp tillgänglig, så att redigering med användning av enskilda sgRNA ( Figur 1A , vänster) utfördes, följt av primärimmunoblot. Tre sgRNA transfekterades oberoende för att jämföra effektivitet och att utesluta mål-effekter i de resulterande klonerna. Efter samling och blottning av celllysat från klonpopulationer på två nitrocellulosemembran undersöktes blottarna för både ELAVL1 och PUM2 (som en normaliseringskontroll) ( Figur 2A ). Det kvantifierade förhållandet mellan ELAVL1 och PUM2-signalen demonstrerade ett mycket brett,> 10 4- falt intervall bland de isolerade linjerna ( Figur 2B ). Genom att använda detta förhållande som ett urvalskriterium validerades ett antal linjer med hjälp av ELAVL1 western blots ( Figur 3A ). I de flesta fall var klonpopulationer med den lägsta relativa ELAVL1-signalenKorrekt identifierad som knockouts ( Figur 2B ), vilket bekräftar den prediktiva effekten av denna kvantifiering (trots stor variation i styrsignalen, som sannolikt härrörde från olika antal samlade celler). Omvänt uppvisade de flesta klonerna med mellanliggande förhållanden ELAVL1-signal vid validering, vilket potentiellt representerade monoalleliska deletionshändelser. Emellertid observerades ingen generell tiering av förhållandena i WT, monoallela och fullständiga (bialleliska) mutanta pooler, och även de ELAVL1-positiva klonerna visade ett brett och kontinuerligt intervall av nivåer, troligen beroende på klonal variabilitet av uttryck. Den övergripande effekten av ELAVL1-knockoutgenerering med denna metod varierade mellan 6 och 36% bland sgRNA.
För andra genmål (såsom PUM2) förhindrar kvaliteten på de tillgängliga antikropparna noggrann screening av kandidatkloner med dot blot på grund av hög bakgrund från korsreaktionvitet. Dessutom kan effektiviteten att rikta sig mot några genomiska loci vara väsentligt lägre på grund av tillgänglighet av kromatin. I sådana fall är en urvalsberoende metod lämplig för att öka effektiviteten. Två sgRNA som riktar sig mot tidiga och sena kodande regioner av PUM2 samtransfekterades med en homologiregerad reparationsmall för att excisera 45 kb genomiskt DNA och ersätta det med en neomycinresistenskassett ( Figur 1A , höger). Montering av homologmallen visas i figur IB . PCR-primers konstruerades för att amplifiera regioner runt homologarmarna baserat på antingen framgångsrik eller misslyckad integration av resistenskassetten ( Figur 2C ) och testades på otransfekterade och de valda cellerna (vänstra panelen). Som förväntat observerades i untransfekterade celler endast en amplikon motsvarande det endogena tillståndet (topp), medan de valda cellerna visade amplikoner från bådaVildtyp och mutant alleler. Celllysat från genererade klonala kandidater uppsamlades och screenades för närvaro av både den endogena sekvensen och resistanskassetten. Kandidatuttryck identifierades genom närvaron av resistanskassett amplicon ensam, vilket indikerar biallelisk deletion / integration ( Figur 2D , stjärnor). Kloner med monoalleliska insertioner observerades också, och var ganska vanliga, eftersom sådana populationer också kan överleva urvalsprocessen. Dessa kloner indikerades genom närvaron av både den endogena sekvensen och resistenskassetten. I några få fall observerades klonala vildtyper vid det testade locuset, vilket antyder att slumpmässig, icke-sgRNA-assisterad genomisk integration av den homologiregerade reparationsmallen förekommer vid en låg frekvens. Bialleliska mutantlinjer validerades vidare med western blot ( Figur 3B ). Den totala effektiviteten hos knockout-generationen med användning av HDR-förfarandet var 33%.
Figur 1: Ett arbetsflöde för att generera CRISPR-medierade knockouts i däggdjurscellinjer. ( A ) Genome redigering händelser som produceras av CRISPR / Cas9 klyvning och NHEJ (vänster) eller HDR (höger). Platsen för Cas9-klyvning betecknas med en vit vertikal linje. ( B ) Komponenter och montering av HDR-mallplasmiden. Typ IIs-restriktionsenzymerna som användes vid kloning av Golden Gate, såsom BsaI, känner igen en asymmetrisk DNA-sekvens och lämnar en förskjuten skära utanför igenkänningssekvensen, vilket medger utformning av godtyckliga överlappande segment för montering (bild). Pilar indikerar primerpositionerna för att kontrollera efter korrekt plasmidmontering. ( C ) Arbetsflöde: efter transfektion (och läkemedelsval om tillämpligt), celler pläteras vid begränsande utspädningar i plattor med 96 brunnar. Klonala populationerScreenas antingen med primär immunoblot (selektionsoberoende, NHEJ) eller koloni-PCR (selektionsberoende, HDR). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Screening-kandidat-knockout-linjer med prickfläckar eller koloni-PCR. ( A ) primär immunoblot av isolerade ELAVL1-riktade kloner med ELAVLl-antikropp (vänster) och separat med en antikropp för ett kontrollprotein, Pum2 (höger). Kloner som uppvisade liten kontrollsignal, sannolikt på grund av låga proteinproteiner, markeras med en X och utesluts från ytterligare analys. Kloner med låg ELAVL1-signal (cirklar) testades ytterligare av västblottar som bekräftade (grön) eller ogiltiggjordes (grå) kandidaterna. ( B ) Kvantificering av KO cAndidates från dot blot. Förhållanden av ELAVL1 för att styra proteinsignalen i punktfläcken som visas i A, i ökande ordning. ( C ) Primer design för knockout / insertion testning via koloni PCR. En primer som är komplementär till det genomiska locuset utanför homologarmarområdet (rött) är parat med en primer som är komplementär till den endogena sekvensen (blå) eller mot resistenskassetten (grön), probing för det oförändrade tillståndet eller en deletions- / införingshändelse , Respektive. Separata primerpar är konstruerade för att testa båda sidor av integrationen. ( D ) Exempel agarosgel av koloni-PCR-resultat med användning av primrar som sträcker sig uppströmsintegreringskonfigurationen med användning av endogena inre primers (topp) och knockout inuti primers (botten). Primers valideras först i både föräldra T-REx293-celler och bulkvalda celler (vänster). Individuella kandidatkloner (mitten) och de förväntade bandmönstren för WT, KO och monoallel deletion (WT / KO) kloner (höger). Bialleliska knockoutkloner indikerasD av en stjärna. De korrekta amplifieringsprodukterna anges med svarta pilar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Validering av knockoutkandidater med Western blot. ( A ) Western blot för ELAVL1 (överst) av en delmängd av kloner identifierade med dot blot. PUM2 blottades på samma membran som en lastkontroll (botten). ( B ) Western blot för PUM2 (topp) av en delmängd av kloner identifierade av koloni-PCR. GAPDH blottades på samma membran som en lastkontroll (botten). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR / Cas9-systemet har möjliggjort effektiv generation av stabila genomiska modifieringar, vilket ger ett mer konsekvent alternativ till andra övergående manipuleringsmetoder. Här har vi presenterat två metoder för snabb identifiering av CRISPR / Cas9 gen-knockouts i däggdjurscellinjer. Båda metoderna kräver litet cellulärt material, så testning kan ske i tidiga stadier av klonalkultur, vilket sparar tid och reagenser. För att öka effektiviteten hos båda metoderna rekommenderar vi att testa flera sgRNA, eftersom effektiviteten varierar beroende på sekvens och genomisk lokalisering. Dessutom är användning av flera sgRNAs användbara vid identifiering av off-mål-effekter genom detektering av outlier-fenotyper som ett resultat av mutationer i icke-riktade gener. Effektiv transfektion och Cas9-klyvning ökar kraftigt chansen att generera knockouts. Alternativt transfekterar cellerna direkt med kommersiellt erhållna sgRNA / Cas9 ribonukleoproteinkomplex 32 ,33 kan påskynda protokollet och sänka off-target-effekterna.
Dot blots är väl lämpade för att bedöma protein knockouts orsakade av de små genomiska förändringar på grund av NHEJ. Eftersom endast en enda sgRNA / Cas9-konstruktion är nödvändig, kan detta tillvägagångssätt vara det snabbaste för att erhålla nulllinjer, och blötproceduren omger ytterligare steg, vilket ökar skärningen. Den normaliserade immunoblotproteinsignalen tjänar som en pålitlig förutsägelse för framgångsrik validering ( Figur 2B ). Detta protokoll är idealiskt för generering av knockouts med minimal genomisk störning. Alternativt kan denna screeningsmetod anpassas till sond för proteintillsats eller modifiering, såsom transgena proteiner eller proteinkoder. Denna screeningsmetod kräver emellertid en antikropp med hög specificitet mot proteinet av intresse, eftersom korsreaktivitet leder till hög bakgrund i punktfläckar. Denna metod är naturligtvis begränsad till mutationsmålningProteinkodningsregioner, eftersom den slutliga utgången beror på närvaron / frånvaron av en proteinprodukt. Det är också viktigt att notera att mutationer orsakade av NHEJ kan leda till en mängd proteinresultat, inklusive ett protein med konstitutivt aktiv, partiell eller dominerande negativ funktion eller ett funktionellt protein som saknar detektionsantikroppsepitopen. För att minimera dessa problem är det användbart att rikta in Cas9-snittet så tidigt som möjligt i kodningsregionen, för att öka chanserna för att generera ett helt icke-funktionellt protein. Dessutom kan riktade genomiska regioner som är mindre tillgängliga för Cas9-maskinen, producera låga borttagningsutbyten i frånvaro av selektion. Slutligen kan knockouts som ger en selektiv nackdel vara svår att erhålla genom denna metod av liknande skäl.
Användning av homologiregerade reparationsmekanismer tillsammans med CRISPR / Cas9-klyvning möjliggör mycket större och mer specifika genomiska manipuleringar, vilket kan innefatta både laRge-skala deletioner (avgränsad av två sgRNA-klyvningar) och insertioner. Eftersom två klyvningshändelser och en exakt reparationsprocess måste äga rum, ökar integrationen av en läkemedelsresistansmarkör väsentligt utslagningsutbyten med användning av denna metod. Även om dot blot-detektering också kan användas, är screening med koloni-PCR mer allmänt tillämplig för att exakt detektera korrekta integrations / knockoutkandidater med sådana stora genomiska störningar. Vidare möjliggör testning genom PCR identifiering av kloner med ofullkomliga och ofullständiga integreringar, vilket kan ge insikt i omfattningen och naturen hos HDR-processen i sig. Dessutom kan den introducerade markören därefter avlägsnas (genom transient Cre-uttryck eller tillsats i membranpermeabel form), vilket lämnar en minimal 34 bp deletionsärr (loxP-plats) och möjliggör framtida återanvändning av markeringsmarkören. Flexibiliteten i detta tillvägagångssätt ökar med användning av flera resistansmarkörer, vilket möjliggör generering av multipel kumuLativa proteinet knockouts. Det är viktigt vid tillämpning av denna metod att frånvaron av produkt ytterligare valideras, exempelvis genom RT-qPCR för det förväntade transkriptet. Eftersom denna skärm kan vara antikropp oberoende, kan denna metod enkelt appliceras på proteinutslag utan en robust antikropp, såväl som att detektera förändringar som inte faller i proteinkodande gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna Gissell Sanchez, Megan Lee och Jason Estep för experimentell hjälp, och Weifeng Gu och Xuemei Chen för att dela reagenser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al. 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1x SDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
References
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, . Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
