Summary
Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.
Abstract
Signaleringsbanen regelen genuitdrukkingsprogramma's via de modulatie van de chromatinstructuur op verschillende niveaus, zoals door post-translationele modificaties (PTM's) van histonestaarten, de uitwisseling van canonische histonen met histonvarianten en nucleosome-uitzetting. Dergelijke regulatie vereist de binding van signaalgevoelige transcriptiefactoren (TF's) die chromatine-modificerende enzymen aanwenden bij regulatorische elementen gedefinieerd als versterkers. Om te begrijpen hoe signaalcascades versterkeractiviteit regelen, vereist een uitgebreide analyse van de binding van TF's, chromatine-modificerende enzymen en de bezetting van specifieke histoonmerken en histon-varianten. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays gebruiken zeer specifieke antilichamen om specifieke eiwit / DNA complexen te immunoprecipiteren. De daaropvolgende analyse van het gezuiverde DNA laat de identificatie toe van het gebied dat door het antilichaam wordt herkend door het eiwit. Dit werk beschrijft een protocol om efficiënt te peRform ChIP van histonproteïnen in een volwassen muis T-cellijn. Het gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om ChIP-analyses te verrichten in een redelijk tijdschema en met een hoge reproduceerbaarheid.
Introduction
Ontwikkeling, differentiatie en homeostase zijn afhankelijk van specifieke genuitdrukkingsprogramma's die worden vastgesteld door signalering van gebeurtenissen die de chromatinstructuur moduleren en daarom bepalen of een specifiek gen op een cel- en tijdspecifieke manier geactiveerd of onderdruk wordt. Tijdens de ontwikkeling van T-cellen moeten specifieke genuitdrukkingsprogramma's worden vastgesteld om de rijping van T-celprecursoren van de dubbel-negatieve (DN) naar de enkele positieve (SP) toestand te bepalen, die door middel van meerdere tussenstadia 1 doorlopen. Hoe het genexpressieprogramma dynamisch gereguleerd is tijdens de T-celontwikkeling is in de voorgaande jaren door diverse laboratoria 2 , 3 , 4 , 5 , 6 in grote mate onderzocht.
Door post-translationele modificaties (PTM's) van histonen, de uitwisseling vanKanonische histonen met histonvarianten, nucleosoomuitzetting en DNA-methylering regelen de ON / OFF-switch van genen. Verschillende groepen hebben de genoom-brede verdeling van PTM's en histon-varianten onderzocht om markeringen te bepalen die met verschillende chromatinestanden in zowel proximale als distale regulerende gebieden 7 , 8 , 9 , 10 geassocieerd zijn. Signalerende cascades orchestreer dynamische chromatinregulatie via de uitwisseling van positieve en negatieve chromatine-modificerende enzymen (ook bekend als chromatine-modificatoren) bij specifieke versterkerelementen. Deze chromatine modificatoren regelen de chromatinstructuur en dus de transcriptie-uitvoer door bijvoorbeeld dynamische histonmetylering en acetylering. Dit is het geval in de Notch signaleringsroute 11 , 12 , 13 ,14.
Dynamische histon PTM's; Uitwisselingen met histon varianten; En de dynamische bezetting van histonen, transcriptiefactoren en cofactoren kunnen worden onderzocht door chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays. Hoogspecifieke antilichamen worden gebruikt om specifieke DNA-eiwitcomplexen te zuiveren en het gezuiverde DNA wordt geanalyseerd door kwantitatieve PCR (qPCR); Diep-sequencing (ChIP-Seq); Of minder vaak tegenwoordig hybridisatie naar microarray (ChIP-ChIP).
ChIP assays zijn soms uitdagend door complicaties met de lysis van de cellen, afscheiding van de chromatine en / of lage specificiteit van de antilichamen. Verschillende strategieën zijn aangenomen om het protocol te verbeteren, zoals het geval is voor NEXSON 15 . Het gebruik van koelwaterbad-sonicators vermijdt de verhitting van het monster dat de aanwezige epitopen kan beschadigen op het onderzochte eiwit, maar de energie die nodig is voor het scheren van de monsters wordt in het water verspreid.Er is nog een verbetering geboekt bij de ontwikkeling van gefocusseerde ultrasonische apparaten die de verspreiding van de energie voorkomen. Daarom zorgen de gefocusseerde ultrasonische apparaten voor verbeteringen in cellysis en chromatinafscheiding, waardoor operator-geïnduceerde variaties elimineren en de reproduceerbaarheid aanzienlijk verhogen.
Dit werk beschrijft een protocol (schematisch overzicht in Figuur 1 ) om het ChIP van histonproteïnen efficiënt uit te voeren in een volwassen T-cellijn van de muis, genaamd E2-10HA 16 , 17 . T-cellen zijn meestal moeilijk om te lichten en de afscheiding van hun chromatine is gebleken dat ze ondoeltreffend zijn. In dit protocol, dat gebruik maakt van een koelgerichte ultrasonicator, werden het aantal cellen, de lysisbuffer en de schaarinstelling geoptimaliseerd voor de E2-10HA muis T-cellijn. Met dit protocol kunt u ChIP met hoge reproduceerbaarheid en in een redelijke tijd uitvoeren. In feite is het nodigIs ongeveer twee dagen om de chromatine te scheren en de kwaliteit van het scheren te evalueren en drie dagen om de immunoprecipitatie te verrichten, de verknoping om te zetten en het DNA te zuiveren.
Protocol
OPMERKING: Alle buffers en het medium dat in dit protocol wordt gebruikt, staan in tabel 1 .
Dagen 1 en 2
1. Crosslinking van de cellen
- Plaats de muis T-cellen van een 6-putjesplaat naar een 50 ml buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C en ~ 271 x g. Resuspendeer de celpellet in 30 ml IMDM-celkweekmedium en tel de cellen met behulp van een Neubauer kamer.
- Verzamel aliquots van 20 x 106 cellen in nieuwe 50 ml buizen.
- Voeg formaldehyde (FMA) toe aan een 1% uiteindelijke concentratie direct aan het celkweekmedium en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
Let op: FMA is giftig bij inademing, dus werk onder een afzuigkap en draag voldoende beschermende uitrusting. Behandel ook FMA-afval volgens de regels van de gastinstelling. - Voeg een 1/8-volume 1 M glycine, pH 7,0, toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Pellet de cellen door centrifugeren voor 5Min bij 4 ° C en ~ 271 xg en wassen met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Was de celpelletje met 1 ml PBS en overbrengen naar 1,5 ml buizen.
2. Cell Lysis en Chromatin Shearing
- Resuspendeer de celpellet in 1 ml SDS lysisbuffer en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Breng elk monster over naar een sonicatiebuis en voer scheren uit door gebruik te maken van een gefocuste ultrasonicator volgens de in tabel 2 aangegeven instellingen .
- Na afscheiding, de monsters overbrengen naar 1,5 ml buizen en centrifuge gedurende 10 minuten bij 4 ° C en ~ 18.000 x g.
- Breng de supernatant over naar nieuwe buizen.
- Verzamel 50 μL om de scheerfficiëntie volgens stap 3 te bepalen en snijd het gesneden lysaat in vloeibare stikstof af. Bewaar het lysaat in eenmalig gebruik bij -80 ° C.
3. Bepaling van scherpe efficiëntie
- Voeg 50 μl elutiebuffer toe aan de 50 & #181; L van elk gesneden lysaat en incuberen bij 65 ° C overnacht, met schudden.
- Voeg 100 μl TE buffer en 4 μL 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl uiteindelijke concentratie) toe. Meng en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C, met schudden.
- Voeg 2 μL 20 mg / ml protease K (0,2 μg / μl eindconcentratie) toe aan elk monster en incubeer gedurende 2 uur bij 55 ° C, met schudden.
- Breng elk monster over naar een gelbuis die geschikt is voor fenol / chloroform / isoamylalcohol extractie; Handelen volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg 200 μl fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1) toe en schud de buizen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 24 ° C en ~ 16.000 xg en verplaats de bovenste fase naar nieuwe buizen.
Voorzichtigheid: Fenol, chloroform en isoamylalcohol zijn giftig bij inademing en corrosief; Werk onder een afzuigkap en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. Behandel ook fenol-, chloroform- en isoamylalcoholafval acVolgens de regels van de gastinstelling.- Herhaal een keer.
- Reinig het DNA met behulp van zuiveringskolommen volgens de instructies van de fabrikant, met de volgende wijzigingen:
- Was de membraan tweemaal tweemaal. Na de laatste was laat de buis 2 minuten op kamertemperatuur open staan om de resterende ethanol te verdampen.
- Voor de elutie voeg 50 μL H20 toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut, draai de buis gedurende 1 s om het membraan goed nat te maken en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut voordat het DNA door 1 minuut centrifugeren wordt geëlueerd 24 ° C en ~ 17.900 x g.
- Kwantificeer het gezuiverde DNA op een fluorometer met behulp van een hoge gevoeligheidskit volgens de instructies van de fabrikant.
- Analyseer ongeveer 500 ng van het gezuiverde DNA op een 1,8% agarosegel en ongeveer 1 ng op een elektroforese systeem met behulp van een hoge gevoeligheidskit.
OPMERKING: De verwachte sizE van de DNA-fragmenten is tussen 200 en 500 bp.
Dagen 3 en 4
4. Immunoprecipitatie
- Verdun 1 volume gesneden lysaat met 5 volumes verdunningsbuffer.
- Preclear met 30 μL / ml eiwit Een agarose kralen (bereid volgens bijlage A ) gedurende 30 minuten tijdens het roteren in de koude kamer.
- Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij ~ 750 x g.
- Verzamel 10% van de invoer en sla het op bij 4 ° C.
- Aliquot de gewenste hoeveelheid lysaat in nieuwe buizen (zie tabel 3 voor details). Voeg de gewenste antilichamen toe aan elke buis (zie tabel 3 voor details) en draai overnacht bij 4 ° C.
- Voeg 40 μl eiwit een kralen toe en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C tijdens het roteren.
- Was de kralen met 1 ml laagzoutbuffer, hoge zoutbuffer, LiCl-buffer en TE-buffer (voor elke was, incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C tijdens rotatie en centrifugeGedurende 3 minuten bij 4 ° C en ~ 950 xg). Zie tabel 3 voor details.
- Voeg 110 μl elutiebuffer toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, vortex elke 2 minuten.
- Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 4 ° C en ~ 950 xg en overbreng 100 μL supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis.
- Herhaal stappen 4.7-4.8 met 100 μl elutiebuffer en combineer de eluaten. Voeg elutiebuffer tot 200 μL toe om de monsters in te voeren.
- Incubeer alle monsters overnacht bij 65 ° C, met schudden.
Dag 5
5. DNA-zuivering
- Voeg 200 μl TE buffer aan elk eluaat toe en 8 μl 10 mg / ml RNase A (0,2 μg / μl eindconcentratie). Meng en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C, met schudden.
- Voeg 4 μL 20 mg / ml protease K (0,2 μg / μl uiteindelijke concentratie) toe aan elk eluaat en incubeer gedurende 2 uur bij 55 ° C, met schudden.
- Breng elk monster over naar een gelBuis geschikt voor fenol / chloroform / isoamylalcohol extractie; Handelen volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg 400 μl fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1) toe en schud de buizen. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 24 ° C en ~ 16.000 x g. Breng de bovenste fase over naar nieuwe buizen.
Voorzichtigheid: Fenol, chloroform en isoamylalcohol zijn giftig bij inademing en corrosief; Werk onder een afzuigkap en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. Behandel ook fenol-, chloroform- en isoamylalcoholafval volgens de regels van de gastinstelling.- Herhaal een keer.
- Reinig het DNA met behulp van zuiveringskolommen volgens de instructies van de fabrikant, met de volgende wijzigingen:
- Was de membraan tweemaal tweemaal. Na de laatste was laten de buizen gedurende 2 minuten op kamertemperatuur open staan om de resterende ethanol te verdampen.
- Voeg bij de elutie 50 μl H20 toe, incubeer bij kamertemperatuur1 minuut draaien, de buizen voor 1 s draaien om het membraan goed nat te maken en gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur te incuberen alvorens het DNA gedurende 1 min bij 24 ° C en ~ 17,900 x g te elueren.
Representative Results
Oudere muizen T-cellen werden onderworpen aan ChIP analyse om de verrijking van de histonmark monomethylering van lysine 4 op histone 3 (H3K4me1), trimethylering van lysine 4 op histone 3 (H3K4me3) te onderzoeken en acetylering van lysine 27 op Histone 3 (H3K27ac), evenals de nucleosome bezetting, zoals blijkt uit panH3 ChIP. De afscheidingskwaliteit werd geëvalueerd door analyse op een 1,8% agarosegel ( Figuur 2A ) en op een elektroforese systeem ( Figuur 2B ). H3K4me1 en H3K4me3 worden in het algemeen gebruikt om respectievelijk versterkersites en promotors te identificeren ( Figuur 3A ). In feite is H3K4me3 prominent maar niet uitsluitend verrijkt bij promotors 5 , 8 , 14 . Een kenmerk van actieve versterkers moet zeer verrijkt zijn voor H3K4me1 en H3K27ac en slecht verrijkt voor H3K4me3 (<Sterke klasse = "xfig"> Figuur 3A, bovenste paneel), terwijl inactieve versterkers lage hoeveelheden H3K4me3 en H3K27ac bevatten maar hoge niveaus van H3K4me1 ( Figuur 3A , onderpaneel). Zoals getoond in Figuur 3B is het Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase ( Gapdh ) gen representatief voor de analyse van actieve genpromotoren ( Gapdh promotor ). In feite toont het hoge niveaus van H3K4me3 en H3K27ac en lage H3K4me1 niveaus. In figuur 3B is Deltex1 ( Dtx1 ) representatief voor inactieve versterkers ( Dtx1 versterker ), aangezien het zeer verrijkt is voor H3K4me1 en slecht verrijkt voor H3K4me3 en H3K27ac. Gene woestijn is representatief voor een regio die geen coderende genen heeft en wordt meestal gedagvaard als een negatieve controle voor actieve chromatine merken. De opmerking dat H3K4me1, een goed aanvaarde versterker 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , is niet verrijkt bij Gene desert, suggereert dat dit gebied geen versterkers heeft.
Figuur 1: Schematisch overzicht van het gepresenteerde ChIP-protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Scherpe kwaliteitscontrole van de volwassen T-cellijn van de muis. ( A ) Twee verschillende porties volwassen T-cellijn E2-10HA werden gesneden en ongeveer 500 ng gezuiverd DNA werd geanalyseerd op een 1,8% agarosegel om hun schaar te evalueren.Kwaliteit. ( B ) 1 ng gezuiverd DNA uit monster 2 werd geanalyseerd door elektroforese om de schaarkwaliteit te evalueren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Chromatine markeringen die enhancers en promotors karakteriseren. ( A ) Actieve versterkers (bovenpaneel) worden gekenmerkt door hoge H3K4me1, lage H3K4me3 en hoge H3K27ac, terwijl inactieve versterkers (onderste paneel) hoge H3K4me1, lage H3K4me3 en lage H3K27ac bevatten. ( B ) De monsters gepresenteerd in figuur 2A werden samengevoegd en gebruikt voor ChIP analyse versus histonenmerken H3K4me1, H3K4me3 en H3K27ac en histone bezetting, zoals blijkt uit panH3 ChIP. Uit deze analyse blijkt dat thE promotor van het huishoudingsgen Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase ( Gapdh promotor ) is zeer verrijkt voor H3K4me3 en H3K27ac en laag verrijkt voor H3K4me1. Anderzijds is de versterker van het inactieve gen Deltex1 ( Dtx1 enhancer ) zeer verrijkt voor H3K4me1 maar slecht verrijkt voor H3K4me3 en H3K27ac. ChIP met behulp van een panH3 antilichaam werd gebruikt om nucleosome bezetting te onderzoeken. Gene woestijn werd gebruikt als negatieve controle. Er wordt een representatief experiment getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van de buffer | Reagens | Definitieve concentratie |
| Verdunningsbuffer | Natrium dodecYl sulfate (SDS) | 0,01% (w / v) |
| Triton X-100 | 1,1% (v / v) | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 | 1,2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 16,7 mM | |
| Natriumchloride (NaCl) | 167 mM | |
| DMA oplossing | Dimethyladipimidaat (DMA) | 10 mM |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | 1x | |
| Elutiebuffer | Natriumdodecylsulfaat (SDS) | 1% (w / v) |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,0 | 50 mM | |
| Hoge zoutbuffer | Natriumdodecylsulfaat (SDS) | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| EthylenediamiNetto-azijnzuurzuur (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumchloride (NaCl) | 500 mM | |
| IMDM medium | Iscove's gemodificeerde medium van Dulbecco (IMDM) | 1x |
| Foetaal runder serum (FBS) | 2% (v / v) | |
| Penicilline / streptomycine | 1x | |
| Peptone primatone | 0,3 mg / ml | |
| Insuline oplossing menselijk | 4,8 mg / ml | |
| Minimale essentiële niet-essentiële aminozuren (MEM NEAA) | 1x | |
| LiCl zoutbuffer | Lithiumchloride (LiCl) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 | 1 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 10 mM | |
| Lage zoutbuffer | Natriumdodecylsulfaat (SDS) | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumchloride (NaCl) | 150 mM | |
| Proteïne Een Sepharose kralenwasbuffer | Tris-HCl pH 8,0 | 20 mM |
| Natriumchloride (NaCl) | 500 mM | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | 0,1% (w / v) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| SDS Lysis buffer | Natriumdodecylsulfaat (SDS) | 1% (w / v) |
| ethyleendiAminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 50 mM | |
| TE buffer | Tris-HCl pH 8,0 | 10 mM |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) pH 8,0 | 1 mM |
Tabel 1: Lijst van buffers en het medium dat in dit protocol wordt gebruikt.
| OP | UIT | |
| Piekvermogen | 150,0 | 2.5 |
| Duty factor | 15.0 | 15.0 |
| Cycli / burst | 500 | 500 |
| Aantal cycli | 28 | |
Tabel 2: Scherpinstellingen die in dit protocol worden gebruikt. Deze voorwaarden zijn geoptimaliseerd voor een volwassen T-cellijn van de muis.
| Antilichaam | Leverancier | Hoeveelheid antilichaam / immunoprecipitatie | Aantal cellen / immunoprecipitatie | Wasomstandigheden |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Eenmaal in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en driemaal in TE-buffer |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Eenmaal in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en driemaal in TE-buffer |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Eenmaal in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en driemaal in TE-buffer |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Oc in laagzoutbuffer, tweemaal in hoge zoutbuffer, tweemaal in LiCl-zoutbuffer en drie keer in TE-buffer |
| IgG | Diagenode (C15410206) | variabel * | variabel * | variabel * |
| * In het geval van de IgG-controle moet de hoeveelheid van zowel antilichaam als cellen, evenals de wasstapjes, de condities van de andere immunoprecipitaties weerspiegelen. | ||||
Tabel 3: Antilichamen en wasomstandigheden gebruikt in deze studie.
| Gen | Voorwaartse primer | Omgekeerde primer | sonde |
| Gapdh promotor (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Dtx1 versterker (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Gene woestijn | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tabel 4: Primers en probes gebruikt voor qPCR in deze studie.
| Probleem | Oorzaken | Oplossing |
| Chromatine is ondergesneden en fragmenten zijn te groot. | Te veel cellen zijn gebruikt. | Verminder het aantal cellen. |
| Het scheren is te laag. | Verhoog het aantal schuifcycli. | |
| Verhoog de scherppiekvermogen, de arbeidsfactor en / of de cycli / uitbarsting. | ||
| Chromatine is overgesneden en fragmenten zijn te klein. | Er zijn te weinig cellen gebruikt. | Verhoog het aantal cellen. |
| Het scheren is te hoog. | Verminder het aantal schuifcycli. | |
| Verminder de afsnijdpiekvermogen, de arbeidsfactor en / of de cycli / uitbarsting. | ||
| Te laag herstel over IGG controle en / of negatieve controle (hoge achtergrond). | Niet genoeg chromatine is gebruikt voor het experiment. | Verhoog de hoeveelheid chromatine. |
| Hoeveelheid antilichaam is te laag. | Verhoog de hoeveelheid antilichaam. | |
| Hoeveelheid antilichaam is te hoog. | Verminder de hoeveelheid antilichaam. | |
| Het antilichaam heeft een lage specificiteit. | Verander het antilichaam. | |
| De wasomstandigheden zijn te streng. | Verminder het aantal was. | |
| Verminder de strengheid van de wasbuffers. | ||
| De wasomstandigheden zijn niet streng genoeg. | Verhoog het aantal was. | |
| Verhoog de strengheid van de wasbuffers. | ||
| Te veel DNA werd gepipetteerd in de qPCR. | Verminder de hoeveelheid DNA die in de qPCR gepipetteerd wordt. | |
| QPCR condities zijn niet optimaal. | Optimaliseer de qPCR condities. | |
| Verminder het aantal cycli. | ||
| Geen product of product is te laag in de qPCR-reactie van het invoermonster. | Niet genoeg DNA werd gepipetteerd in de qPCR. | Verhoog de hoeveelheid DNA die in de qPCR wordt gepipetteerd. |
| QPCR condities zijn niet optimaal. | Optimaliseer de qPCR condities. | |
| Verhoog het aantal cycli. | ||
| Niet genoeg chromatine is gebruikt voor het experiment. | Verhoog de hoeveelheid chromatine. | |
| Geen signaal in de positieve controle en / of panH3 ChIP. | Niet genoeg chromatine is gebruikt voor het experiment. | Verhoog de hoeveelheid chromatine. |
| Hoeveelheid antilichaam is te laag. | Verhoog de hoeveelheid antilichaam. | |
| De antiLichaam heeft een lage specificiteit. | Verander het antilichaam. | |
| Elutie is suboptimale. | Zorg ervoor dat u de monsters vaak wervelt om de kralen in oplossing te houden. |
Tabel 5: Problemen oplossen.
Discussion
ChIP is een geldige techniek om te onderzoeken of eiwitten of hun PTM's verrijkt zijn in specifieke genomische gebieden. ChIP analyse resultaten zijn vaak moeilijk te interpreteren vanwege biologische of technische redenen. De biologische redenen zijn veelvuldig en omvatten zwakke of indirecte binding van eiwitten aan DNA. Er zijn ook technische beperkingen, zoals beperkte antilichaamspecificiteit en inefficiënte cellysis of chromatinafscheiding. Een probleemoplossingsgids ( tabel 5 ) kan de lezer helpen om de problemen op te lossen die kunnen worden geconfronteerd met ChIP-analyses.
Dit protocol, die gebruik maakt van een koelgerichte ultrasonische inrichting, maakt het mogelijk om de chromatine van een volwassen T-cellijn van de muis doeltreffend te scheren. De belangrijkste kritische stap van het protocol wordt weergegeven door het scheren van de chromatine, die altijd voor elk celtype geoptimaliseerd moet worden. Er wordt voorgesteld om het aantal cellen en het aantal sonicatie cycli te variëren. Bovendien, de zij Aring efficiëntie wordt negatief beïnvloed door de aanwezigheid van SDS precipitaten in de monsters, die tijdens de lysis van de cellen op ijs kunnen vormen met SDS lysis buffer. In dit geval is het het beste om het monster gedurende een paar minuten bij kamertemperatuur na kamertemperatuur te incuberen om de aanwezigheid van SDS-precipitaten te verminderen. Het wordt aangeraden het protocol te optimaliseren om scherpe fragmenten tussen 200 en 500 bp te verkrijgen en om altijd de afscheidingskwaliteit van de monsters te beoordelen alvorens te gaan met de immunoprecipitatie. Bovendien moet de fixatietijd, hoeveelheid antilichaam en / of cellen en de wasomstandigheden worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam.
Nog een kritische stap in het succesvol maken van een ChIP-procedure is de keuze van het antilichaam, aangezien de lage specificiteit antilichamen de efficiëntie van de immunoprecipitatie aanzienlijk verminderen. Voorheen is een uniforme kwaliteits test procedure toegestaan voor de evaluatie van de specificiteit van verschillende antilichamen die op de markt beschikbaar zijn Ss = "xref"> 19. De screening pijpleiding was gebaseerd op dot blot, Western blot en ChIP, die een lijst van hoogwaardige reagentia geschikt voor ChIP 19 leverde. Meer recent werd de specificiteit van verscheidene in de handel verkrijgbare antilichamen geëvalueerd onder toepassing van hoge-dichtheid histone peptide microarray platforms, waardoor het mogelijk is een database op te stellen voor antilichaam specificiteit 20 . De lezer kan dit handige hulpmiddel gebruiken om de meest specifieke antilichamen die kunnen worden gebruikt voor ChIP-experimenten, te identificeren.
Dit protocol is niet getest op primaire T-cellen en in dit geval moet de lezer verwijzen naar andere gepubliceerde protocollen die ChIP succesvol uitvoeren op primaire T-cellen 3 , 4 , 21 . Met name is dit protocol succesvol gebruikt voor het uitvoeren van ChIP op een T-cellijn van een muisprogenitor, evenals op een endotheliale cellijn van de muis.
Ove_content "> 5 x 10 6 cellen dienen te worden gebruikt voor elke immunoprecipitatie voor de analyse van histonenmerken. Omdat dit protocol ook geschikt kan zijn, met enige optimalisatie, om ChIP op TFs of cofactoren uit te voeren, is het het beste om het aantal cellen te verhogen In deze gevallen wordt gebruikt voor de immunoprecipitatie. Om het vereiste aantal cellen voor elk experiment te bereiken, kunnen meer aliquots van gesneden lysaat samengevoegd worden voordat het chromatine in de verdunningsbuffer verdund wordt.Dit protocol kan ook worden aangepast om ChIP uit te voeren op endogene eiwitten die niet direct aan het DNA binden. In dit geval kan pre-fixatie met eiwit-eiwit verknopers ( bijv. Dimethyl adipimidaat, DMA) worden vereist (zie bijlage B voor meer informatie). De succesvolle prestatie van ChIP op cofactoren werd eerder gedaan door overexpressie van eiwitten die gefuseerd zijn aan een biotin-tag. In dit geval werd het eiwit gezuiverd met streptavidine-conjugaTed magnetische kralen, en een pre-fixatie met DMA werd uitgevoerd 22 .
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar voor P. Käse en T. Schmidt-Wöll voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de samenwerkingsonderzoek TRR81 en het Heisenberg-programma (BO 1639 / 5-1) van de DFG, de Max Planck Society en de EXC 294 in Freiburg en de Excellence Cluster voor Cardio Pulmonary System (ECCPS) in Giessen naar TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
