Summary
Este trabajo describe un protocolo para la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) utilizando una línea de células T de ratón madura. Este protocolo es adecuado para investigar la distribución de marcas de histonas específicas en sitios específicos del promotor o en todo el genoma.
Abstract
Las vías de señalización regulan los programas de expresión génica a través de la modulación de la estructura de la cromatina a diferentes niveles, como las modificaciones postraduccionales (PTMs) de las colas histonas, el intercambio de histonas canónicas con variantes de histonas y el desalojo de nucleosomas. Tal regulación requiere la unión de factores de transcripción sensibles a señales (TFs) que reclutan enzimas modificadoras de la cromatina en elementos reguladores definidos como potenciadores. Entender cómo las cascadas de señalización regulan la actividad potenciadora requiere un análisis exhaustivo de la unión de TFs, enzimas modificadoras de la cromatina y la ocupación de marcas histonas específicas y variantes de histonas. Los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) utilizan anticuerpos altamente específicos para inmunoprecipitar complejos específicos de proteína / ADN. El análisis subsiguiente del ADN purificado permite identificar la región ocupada por la proteína reconocida por el anticuerpo. Este trabajo describe un protocolo paraRform ChIP de las proteínas histonas en una línea de células T de ratón madura. El protocolo presentado permite la realización de ensayos ChIP en un plazo razonable y con alta reproducibilidad.
Introduction
El desarrollo, la diferenciación y la homeostasis dependen de programas de expresión génica específicos que se establecen mediante eventos de señalización que modulan la estructura de la cromatina y, por tanto, determinan si un gen específico se activa o se reprime de una manera específica de la célula y del tiempo. Durante el desarrollo de células T, se deben establecer programas específicos de expresión génica para determinar adecuadamente la maduración de los precursores de células T desde el estado doblemente negativo (DN) hasta el estado positivo único (SP), pasando por varias etapas intermedias 1 . La forma en que el programa de expresión génica se regula dinámicamente durante el desarrollo de células T ha sido ampliamente investigado en años anteriores por varios laboratorios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Por modificaciones postraduccionales (PTMs) de las histonas, el intercambio deLas histonas canónicas con variantes de histonas, el desalojo de nucleosomas y la metilación del ADN regulan el interruptor ON / OFF de los genes. Varios grupos han investigado la distribución de todo el genoma de PTMs y variantes de histonas para determinar las marcas que se asocian con diferentes estados de cromatina en ambas regiones reguladoras proximal y distal 7 , 8 , 9 , 10 . Las cascadas de señalización orquestan la regulación dinámica de la cromatina mediante el intercambio de enzimas modificadoras de la cromatina positivas y negativas (también conocidas como modificadores de la cromatina) en elementos potenciadores específicos. Estos modificadores de la cromatina regulan la estructura de la cromatina y, por tanto, la producción transcripcional, por ejemplo, por metilación dinámica de las histonas y acetilación. Este es el caso en la vía de señalización Notch 11 , 12 , 13 ,14.
PTM histonas dinámicas; Intercambios con variantes de histonas; Y la ocupación dinámica de histonas, factores de transcripción y cofactores pueden ser investigados mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Los anticuerpos altamente específicos se usan para purificar complejos específicos de ADN-proteína, y el ADN purificado se analiza por PCR cuantitativa (qPCR); Secuenciación profunda (ChIP-Seq); O, menos frecuentemente hoy en día, hibridación a microarrays (ChIP-ChIP).
Los ensayos de CHIP a veces son desafiantes debido a complicaciones con la lisis de las células, cizallamiento de la cromatina y / o baja especificidad de los anticuerpos. Se han adoptado varias estrategias para mejorar el protocolo, como es el caso de NEXSON 15 . El uso de sonicadores de baño de agua de refrigeración evita el calentamiento de la muestra que podría dañar los epítopos presentes en la proteína bajo investigación, pero la energía requerida para el cizallamiento de las muestras se dispersa en el agua.Otra mejora se hizo con el desarrollo de dispositivos de ultrasonidos enfocados que evitan la dispersión de la energía. Por lo tanto, los dispositivos de ultrasonidos enfocados permiten mejoras en la lisis celular y en el cizallamiento de la cromatina, eliminando las variaciones inducidas por el operador y aumentando significativamente la reproducibilidad.
Este trabajo describe un protocolo (descripción esquemática en la Figura 1 ) para realizar eficientemente el ChIP de las proteínas histonas en una línea de células T de ratón madura llamada E2-10HA 16 , 17 . Las células T suelen ser difíciles de lisar, y el cizallamiento de su cromatina se ha revelado que es ineficiente. En este protocolo, que hace uso de un enfriador enfocado ultrasonidos, el número de células, el tampón de lisis y el ajuste de cizallamiento se optimizaron para la línea de células T de ratón E2-10HA. Este protocolo permite realizar un ChIP con alta reproducibilidad y en un tiempo razonable. De hecho, requiereEs aproximadamente dos días para cortar la cromatina y evaluar la calidad del cizallamiento, y tres días para realizar la inmunoprecipitación, revertir la reticulación y purificar el ADN.
Protocol
NOTA: Todos los búferes y el medio utilizado en este protocolo se enumeran en la Tabla 1 .
Días 1 y 2
1. Reticulación de las células
- Transferir las células T de ratón de una placa de 6 pocillos a un tubo de 50 ml y centrifugar durante 5 min a 4 ° C y ~ 271 x g. Resuspender el sedimento celular en 30 ml de medio de cultivo celular IMDM y contar las células utilizando una cámara Neubauer.
- Recoja alícuotas de 20 x 10 6 células en nuevos tubos de 50 ml.
- Añadir formaldehído (FMA) a una concentración final del 1% directamente al medio de cultivo celular e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
Precaución: FMA es tóxico si se inhala, así que trabaje bajo una campana extractora y use equipo de protección adecuado. También, maneje los residuos FMA de acuerdo con las reglas de la institución anfitriona. - Añadir un 1/8-volumen de 1 M de glicina, pH 7,0, e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Pellet las células por centrifugación de 5Min a 4 ° C y ~ 271 xg y se lava con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Lavar el sedimento celular con 1 mL de PBS y transferir a tubos de 1,5 mL.
2. Lisis Celular y Cizallamiento de Cromatina
- Resuspender el sedimento celular en 1 mL de tampón de lisis SDS e incubar en hielo durante 10 min.
- Transferir cada muestra a un tubo de sonicación y realizar el cizallamiento usando un ultrasonizador enfocado de acuerdo con los ajustes indicados en la Tabla 2.
- Tras el cizallamiento, se transfieren las muestras a tubos de 1,5 ml y se centrifugan durante 10 min a 4 ° C y ~ 18.000 x g.
- Transferir el sobrenadante a nuevos tubos.
- Recoger 50 μL para determinar el rendimiento de cizallamiento de acuerdo con el paso 3 y congelar rápidamente el lisado cortado en nitrógeno líquido. Almacene el lisado en alícuotas de un solo uso a -80 ° C.
3. Determinación de la eficiencia de corte
- Añadir 50 μl de tampón de elución al 50 & #181 mu L de cada lisado sometido a cizallamiento e incubar a 65ºC durante la noche, con agitación.
- Añadir 100 μl de tampón TE y 4 μL de RNasa A 10 mg / ml (concentración final de 0,2 μg / μL). Mezclar e incubar durante 2 ha 37 ° C, con agitación.
- Añadir 2 μL de 20 mg / ml de proteinasa K (concentración final de 0,2 μg / μl) a cada muestra e incubar durante 2 ha 55 ° C, con agitación.
- Transferir cada muestra a un tubo de gel adecuado para la extracción de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico; Manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir 200 μl de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25: 24: 1) y agitar los tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C y ~ 16.000 xg y transferir la fase superior a nuevos tubos.
Precaución: El fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico son tóxicos si son inhalados y son corrosivos; Trabajar debajo de una campana de humos y usar equipo de protección personal adecuado. También, manejar fenol, cloroformo y residuos de alcohol isoamílico acDe acuerdo con las normas de la institución de acogida.- Repita una vez.
- Purificar el ADN utilizando columnas de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones:
- Lave la membrana dos veces. Después del último lavado, dejar el tubo abierto durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual.
- Para la elución, añadir 50 μl de H2O, incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, centrifugar el tubo durante 1 s para humedecer adecuadamente la membrana e incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto antes de eluir el ADN por centrifugación durante 1 minuto a 24 ° C y ~ 17.900 x g.
- Cuantificar el ADN purificado en un fluorómetro utilizando un kit de alta sensibilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Analizar aproximadamente 500 ng del ADN purificado en un gel de agarosa al 1,8% y aproximadamente 1 ng en un sistema de electroforesis usando un kit de alta sensibilidad.
NOTA: El esperado sizE de los fragmentos de ADN está entre 200 y 500 pb.
Días 3 y 4
4. Inmunoprecipitación
- Diluir 1 volumen de lisado cortado con 5 volúmenes de tampón de dilución.
- Preclear con 30 μL / ml de perlas de agarosa de proteína A (preparadas de acuerdo con el Apéndice A ) durante 30 min mientras gira en la habitación fría.
- Centrifugar a 4 ° C durante 5 min a ~ 750 x g.
- Recoger el 10% de la entrada y almacenarla a 4 ° C.
- Alícuota de la cantidad deseada de lisado en nuevos tubos (ver Tabla 3 para más detalles). Añadir los anticuerpos deseados a cada tubo (véase la Tabla 3 para más detalles) y girar durante una noche a 4 ° C.
- Añadir 40 μL de perlas de proteína A e incubar durante 1 h a 4 ° C mientras giraba.
- Lavar las perlas con 1 mL de tampón de baja sal, tampón de alto contenido en sal, tampón LiCl y tampón TE (para cada lavado, incubar durante 5 minutos a 4 ° C mientras gira y centrifugaDurante 3 min a 4 ° C y ~ 950 xg). Consulte la Tabla 3 para obtener más detalles.
- Añadir 110 μl de tampón de elución e incubar durante 15 min a temperatura ambiente, agitando vorticialmente cada 2 min.
- Centrifugar durante 3 min a 4 ° C y ~ 950 xg y transferir 100 μ l de sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Repita los pasos 4.7-4.8 con 100 μl de tampón de elución y combine los eluatos. Añadir tampón de elución hasta 200 μL para introducir las muestras.
- Incubar todas las muestras durante la noche a 65 ° C, con agitación.
Día 5
5. Purificación de ADN
- Añadir 200 μl de tampón TE a cada eluato y 8 μl de RNasa A 10 mg / mL (concentración final de 0,2 μg / μl). Mezclar e incubar durante 2 ha 37 ° C, con agitación.
- Añadir 4 μL de 20 μg / ml de proteinasa K (concentración final de 0,2 μg / μl) a cada eluato e incubar durante 2 ha 55 ° C, con agitación.
- Transferir cada muestra a un gelTubo adecuado para la extracción de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico; Manejar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir 400 μl de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (25: 24: 1) y agitar los tubos. Centrifugar durante 5 min a 24 ° C y ~ 16.000 x g. Transferir la fase superior a nuevos tubos.
Precaución: El fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico son tóxicos si son inhalados y son corrosivos; Trabajar debajo de una campana de humos y usar equipo de protección personal adecuado. También, manejar residuos de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico de acuerdo con las reglas de la institución de acogida.- Repita una vez.
- Purificar el ADN utilizando columnas de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones:
- Lave la membrana dos veces. Después del último lavado, dejar los tubos abiertos durante 2 min a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual.
- Para la elución, añadir 50 μl de H2O, incubar a temperatura ambienteDurante 1 min, centrifugar los tubos durante 1 s para humedecer adecuadamente la membrana, e incubar a temperatura ambiente durante 1 min antes de eluir el ADN por centrifugación durante 1 min a 24 ° C y ~ 17.900 x g.
Representative Results
Las células T murinas maduras se sometieron a análisis de ChIP para investigar el enriquecimiento de la mono-metilación de la histona de la lisina 4 en la histona 3 (H3K4me1), la trimetilación de la lisina 4 en la histona 3 (H3K4me3) y la acetilación de la lisina 27 sobre Histona 3 (H3K27ac), así como la ocupación de los nucleosomas, como se revela por panH3 ChIP. La calidad de cizallamiento se evaluó mediante análisis en un gel de agarosa al 1,8% ( Figura 2A ) y en un sistema de electroforesis ( Figura 2B ). H3K4me1 y H3K4me3 se usan generalmente para identificar sitios potenciadores y promotores, respectivamente ( Figura 3A ). De hecho, H3K4me3 es prominente pero no exclusivamente enriquecido en los promotores 5 , 8 , 14 . Una característica de los potenciadores activos debe ser altamente enriquecida para H3K4me1 y H3K27ac y mal enriquecida para H3K4me3 (<Mientras que los intensificadores inactivos presentan niveles bajos de H3K4me3 y H3K27ac pero altos niveles de H3K4me1 ( Figura 3A , panel inferior). Como se muestra en la Figura 3B , el gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa ( Gapdh ) es representativo del análisis de promotores de genes activos ( promotor Gapdh ). De hecho, muestra altos niveles de H3K4me3 y H3K27ac y bajos niveles de H3K4me1. En la Figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) es representativo de potenciadores inactivos ( Dtx1 potenciador ), ya que está altamente enriquecido para H3K4me1 y mal enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac. El desierto génico es representativo de una región que carece de genes codificadores y suele ser demandado como un control negativo de las marcas activas de la cromatina. La observación de que H3K4me1, una marca de potenciador bien aceptada 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , no está enriquecido en Gene desierto sugiere que esta región carece de potenciadores.
Figura 1: Visión general esquemática del protocolo ChIP presentado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Control de calidad de corte de la línea de células T de ratón madura. ( A ) Dos partes alícuotas diferentes de la línea de células T de ratón madura E2-10HA se cortaron y aproximadamente 500 ng de ADN purificado se analizaron en un gel de agarosa al 1,8% para evaluar su cizallaCalidad. ( B ) 1 ng de ADN purificado de la muestra 2 se analizó por electroforesis para evaluar su calidad de cizallamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Marcas de cromatina que caracterizan potenciadores y promotores. ( A ) Los potenciadores activos (panel superior) se caracterizan por H3K4me1 alto, H3K4me3 bajo y H3K27ac alto, mientras que los intensificadores inactivos (panel inferior) presentan H3K4me1 alto, H3K4me3 bajo y H3K27ac bajo. ( B ) Las muestras presentadas en la Figura 2A se agruparon y se usaron para el análisis de ChIP frente a las marcas de histonas H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac y la ocupación de las histonas, como se reveló por panH3 ChIP. Este análisis muestra queE promotor del gen doméstico El gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa ( promotor Gapdh ) está altamente enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac y poco enriquecido para H3K4me1. Por otra parte, el potenciador del gen inactivo Deltex1 ( potenciador Dtx1 ) está altamente enriquecido para H3K4me1 pero pobremente enriquecido para H3K4me3 y H3K27ac. ChIP utilizando un anticuerpo panH3 se utilizó para investigar la ocupación de nucleosomas. Gene desierto se utilizó como un control negativo. Un experimento representativo es mostrado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del buffer | Reactivo | Concentración final |
| Tampón de dilución | Sodio dodecIlo (SDS) | 0,01% (p / v) |
| Triton X-100 | 1,1% (v / v) | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 | 1,2 mM | |
| Tris - HCl pH 8,1 | 16,7 mM | |
| Cloruro sódico (NaCl) | 167 mm | |
| Solución DMA | El adipimidato de dimetilo (DMA) | 10 mM |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | 1x | |
| Tampón de elución | El dodecilsulfato sódico (SDS) | 1% (p / v) |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris - HCl pH 8,0 | 50 mM | |
| Alto tampón de sal | El dodecilsulfato sódico (SDS) | 0,1% (p / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| EtilendiamiÁcido netetraacético (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris - HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Cloruro sódico (NaCl) | 500 mM | |
| Medio IMDM | El medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) | 1x |
| El suero bovino fetal (FBS) | 2% (v / v) | |
| Penicilina / Estreptomicina | 1x | |
| Peptona primatona | 0,3 mg / ml | |
| Solución de insulina humana | 4,8 mg / ml | |
| Medio esencial mínimo aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) | 1x | |
| Tampón de sal de LiCl | Cloruro de litio (LiCl) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 | 1 mM | |
| Tris - HCl pH 8.1 | 10 mM | |
| Bajo tampón de sal | El dodecilsulfato sódico (SDS) | 0,1% (p / v) |
| Triton X-100 | 1% (v / v) | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris - HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Cloruro sódico (NaCl) | 150 mM | |
| Proteína A Sepharose perlas buffer de lavado | Tris - HCl pH 8,0 | 20 mM |
| Cloruro sódico (NaCl) | 500 mM | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| El dodecilsulfato sódico (SDS) | 0,1% (p / v) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (v / v) | |
| SDS tampón de lisis | El dodecilsulfato sódico (SDS) | 1% (p / v) |
| EtilenodiÁcido aminotetraacético (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris - HCl pH 8,1 | 50 mM | |
| Tampón TE | Tris - HCl pH 8,0 | 10 mM |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) pH 8,0 | 1 mM |
Tabla 1: Lista de los tampones y el medio utilizado en este protocolo.
| EN | APAGADO | |
| La punta del Poder | 150,0 | 2,5 |
| Factor de servicio | 15,0 | 15,0 |
| Ciclos / explosión | 500 | 500 |
| Número de ciclos | 28 | |
Tabla 2: Configuraciones de corte usadas en este protocolo. Estas condiciones se han optimizado para una línea de células T de ratón madura.
| Anticuerpo | Proveedor | Cantidad de anticuerpo / inmunoprecipitación | Cantidad de células / inmunoprecipitación | Condiciones de lavado |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Una vez en tampón de sal bajo, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Oce en tampón de baja sal, dos veces en tampón de salina alta, dos veces en tampón de sal de LiCl y tres veces en tampón de TE |
| IgG | Diagenode (C15410206) | Variable* | Variable* | Variable* |
| * En el caso del control IgG, la cantidad de anticuerpo y células, así como las etapas de lavado, tienen que reflejar las condiciones de las otras inmunoprecipitaciones. | ||||
Tabla 3: Anticuerpos y condiciones de lavado utilizados en este estudio.
| Gene | Primer directo | Primer inverso | sonda |
| Promotor de Gapdh (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Dtx1 potenciador (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Desierto de genes | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tabla 4: Primers y sondas utilizadas para qPCR en este estudio.
| Problema | Causas | Solución |
| La cromatina está bajo cizallamiento y los fragmentos son demasiado grandes. | Se han utilizado demasiadas celdas. | Reduzca el número de celdas. |
| El cizallamiento es demasiado bajo. | Aumentar el número de ciclos de corte. | |
| Aumentar la potencia de pico de cizallamiento, el factor de servicio y / o los ciclos / ráfaga. | ||
| La cromatina es excesivamente cortada y los fragmentos son demasiado pequeños. | Se han utilizado muy pocas células. | Aumentar el número de celdas. |
| El cizallamiento es demasiado alto. | Reducir el número de ciclos de corte. | |
| Reducir la potencia máxima de cizallamiento, el factor de servicio y / o los ciclos / ráfagas. | ||
| Demasiado baja recuperación sobre IControl gG y / o control negativo (fondo alto). | No se usó suficiente cromatina para el experimento. | Aumentar la cantidad de cromatina. |
| La cantidad de anticuerpo es demasiado baja. | Aumentar la cantidad de anticuerpos. | |
| La cantidad de anticuerpo es demasiado alta. | Reducir la cantidad de anticuerpos. | |
| El anticuerpo tiene una especificidad baja. | Cambiar el anticuerpo. | |
| Las condiciones de lavado son demasiado estrictas. | Reducir el número de lavado. | |
| Reducir la rigurosidad de los tampones de lavado. | ||
| Las condiciones de lavado no son lo suficientemente estrictas. | Aumentar el número de lavado. | |
| Aumentar la rigurosidad de los tampones de lavado. | ||
| Demasiado ADN se pipeteó en el qPCR. | Reducir la cantidad de ADN pipeteado en el qPCR. | |
| QPCR condiciones no son óptimas. | Optimice las condiciones qPCR. | |
| Reducir el número de ciclos. | ||
| Ningún producto o producto es demasiado bajo en la reacción qPCR de la muestra de entrada. | No se pipeteó suficiente DNA en el qPCR. | Aumentar la cantidad de ADN pipeteado en el qPCR. |
| QPCR condiciones no son óptimas. | Optimice las condiciones qPCR. | |
| Aumentar el número de ciclos. | ||
| No se usó suficiente cromatina para el experimento. | Aumentar la cantidad de cromatina. | |
| No hay señal en el control positivo y / o panH3 ChIP. | No se usó suficiente cromatina para el experimento. | Aumentar la cantidad de cromatina. |
| La cantidad de anticuerpo es demasiado baja. | Aumentar la cantidad de anticuerpos. | |
| El antiCuerpo tiene baja especificidad. | Cambiar el anticuerpo. | |
| La elución es subóptima. | Asegúrese de agitar frecuentemente las muestras para mantener las perlas en solución. |
Tabla 5: Solución de problemas.
Discussion
ChIP es una técnica válida para investigar si las proteínas o sus PTM se enriquecen en regiones genómicas específicas. Los resultados del ensayo CHIP a menudo son difíciles de interpretar debido a razones biológicas o técnicas. Las razones biológicas son múltiples e incluyen la unión débil o indirecta de proteínas al ADN. También existen limitaciones técnicas, tales como la limitada especificidad de anticuerpos y la lisis celular ineficiente o el cizallamiento de la cromatina. Una guía de solución de problemas ( Tabla 5 ) puede ayudar al lector a resolver los problemas que pueden encontrarse con los ensayos ChIP.
Este protocolo, haciendo uso de un dispositivo de ultrasonido enfocado enfriamiento, permite cortar eficientemente la cromatina de una línea de células T de ratón madura. El principal paso crítico del protocolo está representado por el cizallamiento de la cromatina, que siempre debe optimizarse para cada tipo de célula. Se sugiere variar el número de células y el número de ciclos de sonicación. Además, la Aring está influenciada negativamente por la presencia de precipitados de SDS en las muestras, que pueden formarse durante la lisis de las células sobre hielo con tampón de lisis SDS. En este caso, es mejor incubar la muestra después de la lisis a temperatura ambiente durante unos minutos para reducir la presencia de precipitados de SDS. Se recomienda optimizar el protocolo para obtener fragmentos cortados entre 200 y 500 pb y evaluar siempre la calidad de corte de las muestras antes de proceder con la inmunoprecipitación. Adicionalmente, el tiempo de fijación, la cantidad de anticuerpo y / o células, y las condiciones de lavado deben optimizarse para cada anticuerpo.
Un paso más crítico para hacer que un procedimiento de CHIP tenga éxito es la elección del anticuerpo, ya que los anticuerpos de baja especificidad reducen significativamente la eficacia de la inmunoprecipitación. Anteriormente, un procedimiento de prueba de calidad unificado permitió la evaluación de la especificidad de varios anticuerpos disponibles en el mercado Ss = "xref"> 19. La tubería de detección se basó en dot blot, Western blot y ChIP, proporcionando una lista de reactivos de alta calidad adecuados para ChIP 19 . Más recientemente, se evaluó la especificidad de varios anticuerpos comercialmente disponibles utilizando plataformas de microarrays de péptidos de histonas de alta densidad, lo que permitió establecer una base de datos sobre la especificidad de anticuerpos 20 . El lector puede utilizar esta herramienta útil para identificar los anticuerpos más específicos que se pueden utilizar para los experimentos de ChIP.
Este protocolo no ha sido probado para las células T primarias y, en este caso, el lector debe referirse a otros protocolos publicados que llevan a cabo con éxito ChIP en células T primarias 3 , 4 , 21 . En particular, este protocolo se ha utilizado con éxito para realizar ChIP en una línea de células T progenitoras de ratón, así como en una línea de células endoteliales de ratón.
Ove_content "> Para cada inmunoprecipitación se deben utilizar 5 x 10 6 células para el análisis de las marcas histonas, ya que este protocolo también puede ser adecuado, con alguna optimización, para realizar ChIP en TFs o cofactores, lo mejor es aumentar el número de células Utilizado para la inmunoprecipitación en estos casos Para alcanzar el número requerido de células para cada experimento, se pueden agrupar más partes alícuotas de lisado cortado antes de diluir la cromatina en el tampón de dilución.Este protocolo también podría ser modificado para realizar ChIP en proteínas endógenas que no se unen directamente al ADN. En este caso, se puede requerir una fijación previa con reticulantes proteína-proteína ( por ejemplo, adipimidato de dimetilo, DMA) (ver Apéndice B para más información). El rendimiento exitoso de ChIP en cofactores se realizó previamente mediante la sobreexpresión de proteínas que se fusionan a una etiqueta de biotina. En este caso, la proteína se purificó con estreptavidina-conjugaTed granos magnéticos, y una pre-fijación con DMA se realizó [ 22] .
Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a P. Käse y T. Schmidt-Wöll su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación colaborativa TRR81 y el programa Heisenberg (BO 1639 / 5-1) de la DFG (Fundación Alemana de Investigación), la Sociedad Max Planck y la EXC 294 en Friburgo y el Cluster de Excelencia para el Sistema Cardio Pulmonar (ECCPS) en Giessen a TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
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