Summary
Detta arbete beskriver ett protokoll för kromatinimmunutfällning (ChIP) med en mogen T-cellinje från mus. Detta protokoll är lämpligt för att undersöka fördelningen av specifika histonmarkeringar vid specifika promotorställen eller genom-hela.
Abstract
Signalvägar reglerar genuttrycksprogram via modulering av kromatinstrukturen vid olika nivåer, såsom genom post-translatoriska modifieringar (PTM) av histon-svansar, utbyte av kanoniska histoner med histonvarianter och nukleosomutsättning. Sådan reglering kräver bindning av signalkänsliga transkriptionsfaktorer (TFs) som rekryterar kromatinmodifierande enzymer vid regulatoriska element definierade som förstärkare. Förstå hur signalkaskader reglerar förstärkningsaktivitet kräver en omfattande analys av bindningen av TF, kromatinmodifierande enzymer och beläggningen av specifika histon-märken och histonvarianter. Kromatinimmunutfällning (ChIP) -analyser använder högspecifika antikroppar för immunoprecipitering av specifika protein / DNA-komplex. Den efterföljande analysen av det renade DNA möjliggör identifieringen av regionen som upptas av proteinet som känns igen av antikroppen. Detta arbete beskriver ett protokoll för att effektivt peRform ChIP av histonproteiner i en mogen T-cellinje av mus. Det presenterade protokollet möjliggör utförandet av ChIP-analyser i en rimlig tidsram och med hög reproducerbarhet.
Introduction
Utveckling, differentiering och homeostas beror på specifika genuttrycksprogram som etableras genom att signalera händelser som modulerar kromatinstrukturen och bestämmer därför om en specifik gen aktiveras eller undertrycks på ett cell- och tidsspecifik sätt. Under T-cellutveckling måste specifika genuttrycksprogram fastställas för att korrekt bestämma mognad av T-cellprekursorer från dubbel-negativ (DN) till det enda positiva (SP) tillståndet, som passerar genom flera mellanliggande steg 1 . Hur genuttrycksprogrammet regleras dynamiskt under T-cellutveckling har i stort sett undersökts tidigare år av flera laboratorier 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
Genom post-translationella modifieringar (PTM) av histoner, utbytet avKanoniska histoner med histonvarianter, nukleosomutsättning och DNA-metylering reglerar ON / OFF-omkopplaren av gener. Flera grupper har undersökt genomfördelningen av PTM och histonvarianter för att bestämma märken som är associerade med olika kromatintillstånd i både proximala och distala regulatoriska regioner 7 , 8 , 9 , 10 . Signalkaskader orkestrerar dynamisk kromatinreglering via utbytet av positiva och negativa kromatinmodifierande enzymer (även kända som kromatinmodifierare) vid specifika förstärkningselement. Dessa kromatinmodifierare reglerar kromatinstrukturen och således transkriptionsutmatningen genom exempelvis dynamisk histon-metylering och acetylering. Detta är fallet i Notch-signalvägen 11 , 12 , 13 ,14.
Dynamiska histon PTM; Utbyten med histonvarianter; Och den dynamiska beläggningen av histoner, transkriptionsfaktorer och kofaktorer kan undersökas genom kromatinimmunutfällning (ChIP) analyser. Mycket specifika antikroppar används för att rena specifika DNA-proteinkomplex, och det renade DNAet analyseras med kvantitativ PCR (qPCR); Djup-sekvensering (ChIP-Seq); Eller, mindre ofta, hybridisering till mikroarray (ChIP-ChIP).
ChIP-analyser utmanar ibland på grund av komplikationer med cellens lyser, skjuvning av kromatinet och / eller låg specificitet hos antikropparna. Flera strategier har antagits för att förbättra protokollet, vilket är fallet för NEXSON 15 . Användningen av kylvattenbadkarikatörer undviker provuppvärmning som kan skada epitoperna som är närvarande på proteinet som undersöks, men den energi som krävs för skärning av proverna dispergeras i vattnet.En annan förbättring gjordes med utvecklingen av fokuserade ultraljudsanordningar som förhindrar dispersionen av energin. Därför möjliggör fokuserade ultraljudsanordningar förbättringar i celllys och kromatinskärning, eliminering av operatörinducerade variationer och signifikant ökande reproducerbarhet.
I det här arbetet beskrivs ett protokoll (schematisk översikt i Figur 1 ) för att effektivt utföra ChIP av histonproteiner i en mogen T-cellinje, kallad E2-10HA 16 , 17 . T-celler är vanligtvis svåra att lysera, och skjuvningen av deras kromatin har visat sig vara ineffektiv. I detta protokoll, som utnyttjar en kylfokuserad ultraljudsapparat, optimerades antalet celler, lysisbufferten och skärningsinställningen för E2-10HA-mus-T-cellinjen. Detta protokoll låter en utföra ChIP med hög reproducerbarhet och inom rimlig tid. Faktum är att det kräverÄr ungefär två dagar för att skjuva kromatinet och att utvärdera skjuvans kvalitet och tre dagar för att utföra immunutfällningen, reversera tvärbindningen och rena DNA.
Protocol
OBS! Alla buffertar och mediet som används i detta protokoll finns listade i Tabell 1 .
Dag 1 och 2
1. Tvärbindning av cellerna
- Överför mus T-celler från en 6-brunnsplatta till ett 50 ml rör och centrifugera i 5 minuter vid 4 ° C och ~ 271 x g. Resuspendera cellpelleten i 30 ml IMDM-cellodlingsmedium och räkna cellerna med användning av en Neubauer-kammare.
- Samla alikvoter av 20 x 106 celler i nya 50 ml rör.
- Tillsätt formaldehyd (FMA) till en 1% slutkoncentration direkt till cellodlingsmediet och inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
Varning: FMA är giftigt vid inandning, så arbeta under en avluftningsdosa och använd lämplig skyddsutrustning. Behöver du också hantera FMA-avfall enligt värdinstituts regler. - Tillsätt en 1/8 volym 1 M glycin, pH 7,0, och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Pellera cellerna genom centrifugering för 5Min vid 4 ° C och ~ 271 xg och tvättas med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tvätta cellpelleten med 1 ml PBS och överföra till 1,5 ml rör.
2. Celllysis och kromatinskärning
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml SDS-lysbuffert och inkubera på is under 10 minuter.
- Överför varje prov till ett sonikeringsrör och utför skjuvning med hjälp av en fokuserad ultraljudsapparat enligt de inställningar som anges i tabell 2.
- Efter skjuvning överför proven till 1,5 ml rör och centrifugera i 10 minuter vid 4 ° C och ~ 18 000 x g.
- Överför supernatanten till nya rör.
- Samla 50 μl för att bestämma skjuvningseffektiviteten enligt steg 3 och snäppfrysta det skjuvade lysatet i flytande kväve. Lagra lysatet i enviktiga alikvoter vid -80 ° C.
3. Bestämning av skärningseffektivitet
- Tillsätt 50 μl elueringsbuffert till 50 & #181; L av varje skjuvat lysat och inkubera vid 65 ° C över natt, med skakning.
- Tillsätt 100 μl TE-buffert och 4 μl 10 mg / ml RNas A (0,2 μg / μl slutkoncentration). Blanda och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C med skakning.
- Tillsätt 2 μL 20 mg / ml proteinas K (0,2 μg / μl slutkoncentration) till varje prov och inkubera i 2 timmar vid 55 ° C under skakning.
- Överför varje prov till ett gelrör som är lämpligt för extraktion av fenol / kloroform / isoamylalkohol; Hantera enligt tillverkarens anvisningar.
- Tillsätt 200 μl fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) och skaka rören. Centrifugera i 5 minuter vid 24 ° C och ~ 16.000 xg och överför övre fasen till nya rör.
Varning: Fenol, kloroform och isoamylalkohol är giftiga vid inandning och är frätande. Arbeta under en avluftningsdragning och ha lämplig personlig skyddsutrustning. Hantera också fenol, kloroform och isoamylalkoholavfall acEnligt värdinstitutionens regler.- Upprepa en gång.
- Rening av DNA: n genom användning av reningskolonner enligt tillverkarens instruktioner, med följande modifieringar:
- Tvätta membranet två gånger. Efter sista tvätten, lämna röret öppet i 2 minuter vid rumstemperatur för att avdunsta kvarvarande etanol.
- För elueringen tillsättes 50 | il H20, inkuberas vid rumstemperatur i 1 min, snurra röret under 1 s för att ordentligt blötta membranet och inkubera vid rumstemperatur i 1 min innan eluering av DNA genom centrifugering under 1 min vid 24 ° C och ~ 17 900 x g.
- Kvantifiera det renade DNA-en på en fluorometer med hjälp av en högkänslig sats enligt tillverkarens instruktioner.
- Analysera ungefär 500 ng av det renade DNA på en 1,8% agarosgel och ungefär 1 ng på ett elektroforesystem med användning av en högkänslighetskit.
OBS: Den förväntade sizE av DNA-fragmenten är mellan 200 och 500 bp.
Dagar 3 och 4
4. Immunutfällning
- Späd 1 volym skjuv lysat med 5 volymer utspädningsbuffert.
- Preclear med 30 | il / ml protein En agaros pärlor (framställd enligt tillägg A ) under 30 minuter medan de roterades i kylrummet.
- Centrifugera vid 4 ° C i 5 min vid ~ 750 x g.
- Samla 10% av ingången och lagra den vid 4 ° C.
- Aliquot önskad mängd lysat i nya rör (se tabell 3 för detaljer). Lägg till önskade antikroppar mot varje rör (se tabell 3 för detaljer) och rotera över natten vid 4 ° C.
- Tillsätt 40 μl protein En pärl och inkubera i 1 h vid 4 ° C under rotering.
- Tvätta pärlorna med 1 ml lågsaltbuffert, högsaltbuffert, LiCl-buffert och TE-buffert (för varje tvätt inkuberas i 5 minuter vid 4 ° C under rotering och centrifugeringI 3 min vid 4 ° C och ~ 950 xg). Se tabell 3 för detaljer.
- Tillsätt 110 μl elueringsbuffert och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur, virvelvis varje 2 min.
- Centrifugera i 3 minuter vid 4 ° C och ~ 950 xg och överföra 100 | il supernatant till ett nytt 1,5 ml rör.
- Upprepa steg 4.7-4.8 med 100 μl elueringsbuffert och kombinera eluaten. Tillsätt elueringsbuffert upp till 200 μL för att mata in proven.
- Inkubera alla prov över natten vid 65 ° C med skakning.
Dag 5
5. DNA-rening
- Tillsätt 200 μl TE-buffert till varje eluat och 8 μl 10 mg / ml RNas A (0,2 μg / μl slutkoncentration). Blanda och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C med skakning.
- Tillsätt 4 μl 20 mg / ml proteinas K (0,2 μg / μl slutkoncentration) till varje eluat och inkubera i 2 timmar vid 55 ° C med skakning.
- Överför varje prov till en gelRör lämpligt för fenol / kloroform / isoamylalkoholutvinning; Hantera enligt tillverkarens anvisningar.
- Tillsätt 400 μl fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1) och skaka rören. Centrifugera i 5 min vid 24 ° C och ~ 16 000 x g. Överför övre fasen till nya rör.
Varning: Fenol, kloroform och isoamylalkohol är giftiga vid inandning och är frätande. Arbeta under en avluftningsdragning och ha lämplig personlig skyddsutrustning. Hantera också fenol, kloroform och isoamylalkoholavfall enligt värdinstituts regler.- Upprepa en gång.
- Rening av DNA med användning av reningskolonner enligt tillverkarens anvisningar, med följande ändringar:
- Tvätta membranet två gånger. Efter sista tvätten, lämna rören öppna i 2 minuter vid rumstemperatur för att indunsta kvarvarande etanol.
- För elueringen tillsättes 50 | il H20, inkuberas vid rumstemperaturRe i 1 min, snurra rören i 1 s för att ordentligt blötta membranet och inkubera vid rumstemperatur i 1 min innan eluering av DNA genom centrifugering under 1 min vid 24 ° C och ~ 17 900 x g.
Representative Results
Mogna murina T-celler utsattes för ChIP-analys för att undersöka anrikningen av histon-monometyleringen av lysin 4 på histon 3 (H3K4me1), trimetylering av lysin 4 på histon 3 (H3K4me3) och acetylering av lysin 27 på Histon 3 (H3K27ac), liksom nukleosombeläggningen, såsom avslöjats av panH3 ChIP. Skjuvkvaliteten utvärderades genom analys på en 1,8% agarosgel ( Figur 2A ) och på ett elektroforesystem ( Figur 2B ). H3K4me1 och H3K4me3 används vanligtvis för att identifiera enhancerställen och promotorerna ( Figur 3A ). Faktum är att H3K4me3 är framträdande men inte uteslutande berikat vid promotorer 5 , 8 , 14 . En egenskap hos aktiva förstärkare är att vara mycket berikad för H3K4me1 och H3K27ac och dåligt berikad för H3K4me3 (<Starka klass = "xfig"> Figur 3A, övre panelen), medan inaktiva förstärkare presenterar låga nivåer av H3K4me3 och H3K27ac men höga nivåer av H3K4me1 ( Figur 3A , nedre panel). Såsom visas i figur 3B är Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenasgenen ( Gapdh ) -genen representativ för analysen av aktiva genpromotorer ( Gapdh-promotor ). Faktum är att den visar höga nivåer av H3K4me3 och H3K27ac och låga nivåer av H3K4me1. I figur 3B är Deltex1 ( Dtx1 ) representativ för inaktiva förstärkare ( Dtxl-förstärkare ), eftersom den är högt berikad för H3K4me1 och dåligt berikad för H3K4me3 och H3K27ac. Gene-öken är representativ för en region som saknar kodande gener och stäms vanligtvis som en negativ kontroll för aktiva kromatinmärken. Observationen att H3K4me1, en väl accepterad förstärkare markerar 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , inte berikad vid Gene desert antyder att denna region saknar förstärkare.
Figur 1: Schematisk översikt över det presenterade ChIP-protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Skärande kvalitetskontroll av den mogna mus-T-cellinjen. ( A ) Två olika alikvoter av mogen T-cellinje E2-10HA från musen skjuvades och ungefär 500 ng renat DNA analyserades på en 1,8% agarosgel för att utvärdera deras skjuvningIng kvalitet. ( B ) 1 ng renat DNA från prov 2 analyserades genom elektrofores för att utvärdera dess skjuvningskvalitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kromatinmärken som kännetecknar förstärkare och promotorer. ( A ) Aktiva förstärkare (övre panelen) kännetecknas av hög H3K4me1, låg H3K4me3 och hög H3K27ac, medan inaktiva förstärkare (underpanel) uppvisar hög H3K4me1, låg H3K4me3 och låg H3K27ac. ( B ) Proverna presenterade i figur 2A sammanslogs och användes för ChIP-analys gentemot histon-märken H3K4me1, H3K4me3 och H3K27ac och histonbeläggning, vilket avslöjades av panH3 ChIP. Denna analys visar att thE-promotor av hushållsgenen Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas ( Gapdh-promotor ) är högt berikad för H3K4me3 och H3K27ac och lågberikad för H3K4me1. Å andra sidan förbättras förstärkaren av den inaktiva genen Deltex1 ( Dtxl-förstärkare ) starkt för H3K4me1 men dåligt berikad för H3K4me3 och H3K27ac. ChIP med användning av en panH3-antikropp användes för att undersöka nukleosombeläggning. Gene-öken användes som en negativ kontroll. Ett representativt experiment visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Buffertens namn | Reagens | Slutlig koncentration |
| Utspädningsbuffert | NatriumdodecYlsulfat (SDS) | 0,01% (vikt / vikt) |
| Triton X-100 | 1,1% (volym / volym) | |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 1,2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 16,7 mM | |
| Natriumklorid (NaCl) | 167 mM | |
| DMA-lösning | Dimetyladipimidat (DMA) | 10 mM |
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) | 1x | |
| Elueringsbuffert | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (vikt / volym) |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,0 | 50 mM | |
| Hög saltbuffert | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vikt / volym) |
| Triton X-100 | 1% (volym / volym) | |
| EthylenediamiNetto-ättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumklorid (NaCl) | 500 mM | |
| IMDM-medium | Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) | 1x |
| Fetalt bovint serum (FBS) | 2% (volym / volym) | |
| Penicillin / streptomycin | 1x | |
| Pepton primaton | 0,3 mg / ml | |
| Insulinlösning människa | 4,8 mg / ml | |
| Minimala essentiella icke-essentiella aminosyror (MEM NEAA) | 1x | |
| LiCl-saltbuffert | Litiumklorid (LiCl) | 0,25 M |
| IGEPAL-CA630 | 1% (volym / volym) | |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 1 mM | |
| Tris-HCl pH 8.1 | 10 mM | |
| Låg saltbuffert | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vikt / volym) |
| Triton X-100 | 1% (volym / volym) | |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 20 mM | |
| Natriumklorid (NaCl) | 150 mM | |
| Protein A Sepharose pärlor tvättbuffert | Tris-HCl pH 8,0 | 20 mM |
| Natriumklorid (NaCl) | 500 mM | |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 2 mM | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,1% (vikt / volym) | |
| IGEPAL-CA630 | 1% (volym / volym) | |
| SDS Lysis-buffert | Natriumdodecylsulfat (SDS) | 1% (vikt / volym) |
| etylendiAminetetraättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 10 mM | |
| Tris-HCl pH 8,1 | 50 mM | |
| TE-buffert | Tris-HCl pH 8,0 | 10 mM |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pH 8,0 | 1 mM |
Tabell 1: Lista över buffertarna och mediet som används i detta protokoll.
| PÅ | AV | |
| Toppeffekt | 150,0 | 2,5 |
| Tullfaktor | 15,0 | 15,0 |
| Cykler / skur | 500 | 500 |
| Antal cykler | 28 | |
Tabell 2: Skärningsinställningar som används i detta protokoll. Dessa betingelser har optimerats för en mogen T-cellinje av mus.
| Antikropp | Leverantör | Mängden antikropp / immunutfällning | Mängd celler / immunutfällning | Tvättvillkor |
| H3 | Abcam (ab1791) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gång i låg saltbuffert, två gånger i hög saltbuffert, två gånger i LiCl-saltbuffert och tre gånger i TE-buffert |
| H3K4me1 | Abcam (ab8895) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gång i låg saltbuffert, två gånger i hög saltbuffert, två gånger i LiCl-saltbuffert och tre gånger i TE-buffert |
| H3K4me3 | Diagenode (pAb-003-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | En gång i låg saltbuffert, två gånger i hög saltbuffert, två gånger i LiCl-saltbuffert och tre gånger i TE-buffert |
| H3K27ac | Diagenode (pAb-174-050) | 2,5 mg | 5 x 10 6 | Oc i låg saltbuffert, två gånger i hög saltbuffert, två gånger i LiCl-saltbuffert och tre gånger i TE-buffert |
| IgG | Diagenode (C15410206) | Variabel* | Variabel* | Variabel* |
| * I fallet med IgG-kontrollen måste mängden av både antikropp och celler, liksom tvättstegen, spegla betingelserna för de andra immunutfällningarna. | ||||
Tabell 3: Antikroppar och tvättbetingelser som användes i denna studie.
| Gen | Framåtriktad primer | Omvänd primer | sond |
| Gapdh-promotor (0 kb) | 5'-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 ' | 5'-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 ' | 68 |
| Dtx1 förstärkare (+26 kb) | 5'-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 ' | 5'-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 ' | 27 |
| Gen öken | 5'-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 ' | 5'-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 ' | 94 |
Tabell 4: Primers och prober som används för qPCR i denna studie.
| Problem | orsaker | Lösning |
| Kromatin är skjuvad och fragmenten är för stora. | Alltför många celler har använts. | Minska antalet celler. |
| Skärningen är för låg. | Öka antalet skärningscykler. | |
| Öka skärhastigheten, arbetsfaktorn och / eller cyklerna / sprängningen. | ||
| Kromatin är överskuren och fragmenten är för små. | För få celler har använts. | Öka antalet celler. |
| Skärningen är för hög. | Minska antalet skjuvningscykler. | |
| Minska skjuvpåkänningen, arbetsfaktorn och / eller cyklerna / sprängningen. | ||
| För låg återhämtning över IGG-kontroll och / eller negativ kontroll (hög bakgrund). | Inte tillräckligt med kromatin som används för experimentet. | Öka mängden kromatin. |
| Mängden antikropp är för låg. | Öka mängden antikropp. | |
| Mängden antikropp är för hög. | Minska mängden antikropp. | |
| Antikroppen har låg specificitet. | Byt antikroppen. | |
| Tvättvillkoren är för stränga. | Minska antalet tvättar. | |
| Minska strängheten hos tvättbuffertarna. | ||
| Tvättvillkoren är inte tillräckligt höga. | Öka antalet tvätt. | |
| Öka strängheten hos tvättbuffertarna. | ||
| För mycket DNA pipetterades i qPCR. | Minska mängden DNA som pipetteras i qPCR. | |
| QPCR-förhållandena är inte optimala. | Optimera qPCR-villkoren. | |
| Minska antalet cykler. | ||
| Ingen produkt eller produkt är för låg i qPCR-reaktionen hos ingångsprovet. | Inte tillräckligt med DNA pipetterades i qPCR. | Öka mängden DNA som pipetteras i qPCR. |
| QPCR-förhållandena är inte optimala. | Optimera qPCR-villkoren. | |
| Öka antalet cykler. | ||
| Inte tillräckligt med kromatin som används för experimentet. | Öka mängden kromatin. | |
| Ingen signal i den positiva kontrollen och / eller panH3 ChIP. | Inte tillräckligt med kromatin som används för experimentet. | Öka mängden kromatin. |
| Mängden antikropp är för låg. | Öka mängden antikropp. | |
| AntiKroppen har låg specificitet. | Byt antikroppen. | |
| Eluering är suboptimal. | Var noga med att vortexa proverna för att hålla pärlorna i lösning. |
Tabell 5: Felsökning.
Discussion
ChIP är en giltig teknik för att undersöka huruvida proteiner eller deras PTMs berikas vid specifika genomiska regioner. ChIP-analysresultat är ofta utmanande att tolka på grund av biologiska eller tekniska skäl. De biologiska orsakerna är mångfaldiga och inkluderar svag eller indirekt bindning av proteiner till DNA. Det finns också tekniska begränsningar, såsom begränsad antikroppsspecificitet och ineffektiv celllys eller kromatisk skjuvning. En felsökningsguide ( tabell 5 ) kan hjälpa läsaren att lösa de problem som kan uppstå med ChIP-analyser.
Detta protokoll, som utnyttjar en kylfokuserad ultraljudsapparat, möjliggör en effektiv skjuvning av kromatinet hos en mogen T-cellinje från mus. Protokollets huvudsakliga kritiska steg representeras av skjuvningen av kromatinet, vilket alltid måste optimeras för varje celltyp. Det föreslås att man varierar antalet celler och antalet sonikationscykler. Dessutom, hon Aring effektivitet påverkas negativt av närvaron av SDS-fällningar i proven, som kan bildas under lysis av cellerna på is med SDS lysisbuffert. I detta fall är det bäst att inkubera provet efter lysering vid rumstemperatur i några minuter för att minska förekomsten av SDS-fällningar. Det rekommenderas att optimera protokollet för att erhålla skjuvade fragment mellan 200 och 500 bp och att alltid utvärdera skjuvkvaliteten hos proverna innan de fortsätter med immunutfällningen. Dessutom måste fixeringstiden, mängden antikropp och / eller celler och tvättbetingelserna optimeras för varje antikropp.
Ett mer kritiskt steg för att lyckas med ett ChIP-förfarande är valet av antikroppen, eftersom antikroppar med låg specificitet minskar immunförstörelsens effektivitet avsevärt. Tidigare tillåtes ett enhetligt kvalitetsprov för utvärdering av specificiteten hos flera antikroppar tillgängliga på marknaden Ss = "xref"> 19. Screeningsrörledningen baserades på dot blot, Western blot och ChIP, vilket gav en lista över högkvalitativa reagenser lämpliga för ChIP 19 . Mer nyligen utvärderades specificiteten hos flera kommersiellt tillgängliga antikroppar med användning av histonpeptid-mikroarrayplattformar med hög densitet, vilket möjliggör etablering av en databas om antikroppsspecificitet 20 . Läsaren kan använda detta användbara verktyg för att identifiera de mest specifika antikropparna som kan användas för ChIP-experiment.
Detta protokoll har inte testats för primära T-celler och i detta fall bör läsaren hänvisa till andra publicerade protokoll som framgångsrikt utför ChIP på primära T-celler 3 , 4 , 21 . I synnerhet har detta protokoll framgångsrikt använts för att utföra ChIP på en T-cellinjen för musprogenitor, såväl som på en endotelcellcellinje.
Ove_content "> 5 x 10 6 celler ska användas för varje immunutfällning för analys av histonmarkeringar. Eftersom detta protokoll också kan vara lämpligt, med viss optimering, för att utföra ChIP på TFs eller kofaktorer, är det bäst att öka antalet celler Används för immunutfällningen i dessa fall. För att nå det erforderliga antalet celler för varje experiment kan fler alikvoter av skjuvat lysat sammanfogas innan förtunning av kromatinet i utspädningsbufferten.Detta protokoll kan också modifieras för att utföra ChIP på endogena proteiner som inte binder direkt till DNA. I detta fall kan förfixering med protein-protein-tvärbindningsmedel ( t.ex. dimetyladipimidat, DMA) krävas (se bilaga B för mer information). Den framgångsrika utförandet av ChIP på kofaktorer gjordes tidigare genom att överuttrycka proteiner som är smälta till en biotin-tagg. I detta fall renades proteinet med streptavidin-conjugaMagnetiska pärlor, och en förfixering med DMA utfördes 22 .
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för P. Käse och T. Schmidt-Wöll för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av det samarbetsforskningsbidrag TRR81 och Heisenbergprogrammet (BO 1639 / 5-1) från DFG (German Research Foundation), Max Planck Society och EXC 294 i Freiburg och Excellence Cluster for Cardio Pulmonary System (ECCPS) i Giessen till TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
| Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
| Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
| Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
| dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
| Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Gibco | 15140-122 | |
| Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
| Phase Lock Gel Heavy 2 mL | 5 Prime | 2302830 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |
References
- Rothenberg, E. V. The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming. Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).
- Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity. Cell. 149 (2), 467-482 (2012).
- Cauchy, P., et al. Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation. Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).
- Koch, F., et al. Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).
- Pekowska, A., et al. H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).
- Vanhille, L., et al. High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq. Nat Commun. 6, 6905 (2015).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Ostuni, R., et al. Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).
- Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. Dynamic chromatin regulation at Notch target genes. Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).
- Liefke, R., et al. Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex. Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).
- Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway. Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).
- Oswald, F., et al. A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes. Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).
- Arrigoni, L., et al. Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq. Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).
- Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. Cellular interactions involved in Th cell memory. J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).
- White, J., et al. Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors. J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).
- Ghisletti, S., et al. Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages. Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
- Fenouil, R., et al. CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters. Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).
- Hein, K., et al. Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response. Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).
