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Biology

मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं में स्वस्थता के सिटू इम्युनोफ्लोरोइसेंट स्टाइनिंग में

Published: June 12, 2017 doi: 10.3791/55908
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2
1Department of Medicine, Institute of Translational Pharmacology, Italian National Research Council, 2Epigenetics and Regenerative Medicine, IRCCS Fondazione Santa Lucia, 3Biological and Environmental Sciences and Engineering Division, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 4Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

Summary

सक्रिय भोजी उत्पादक मांसपेशी पुनर्जनन के साथ जुड़ा हुआ है, जो स्नायु स्टेम सेल (एमईएससी) सक्रियण के लिए आवश्यक है। यहां, हम नियंत्रण और घायल चूहों से मांसपेशियों के ऊतक वर्गों के माओड-पॉजिटिव मुस्कलों में एक भोजी मार्कर LC3 के स्वस्थानी पहचान में एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

बढ़ती साक्ष्य टिशू होमोस्टेसिस को संरक्षित करने के लिए एक महत्वपूर्ण नियामक प्रक्रिया के रूप में भोजी को इंगित करता है यह ज्ञात है कि भोजी कंकाल की मांसपेशियों के विकास और पुनर्जनन में शामिल है, और कई मांसपेशियों के विकृतियों और उम्र से संबंधित मांसपेशी विकारों में स्वस्थ प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। मांसपेशियों की मरम्मत के दौरान उपग्रह कोशिकाओं के कार्यात्मक थकावट के साथ सहभागिता वाली स्वस्थ प्रक्रिया की एक हालिया वर्णित अवधारणा यह दर्शाती है कि सक्रिय भोजी उत्पादक मांसपेशी पुनर्जनन के साथ युग्मित है। इन आंकडों में सामान्य और रोग दोनों की स्थिति में मांसपेशियों के उत्थान के दौरान उपग्रह सेल सक्रियण में भोजी की महत्वपूर्ण भूमिका को उजागर किया जाता है, जैसे कि पेशी डाइस्ट्रोफी यहां, हम मांसपेशी पुनर्योजी परिस्थितियों के दौरान प्रौढ़ स्नायु स्टेम सेल (एमयूसीसी) कम्पार्टमेंट में आक्सीफैजिक प्रक्रिया की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल एलसी 3 के सीटू इम्युनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए सेटअप पद्धति का वर्णन करता है, ए एकयूटोफैजी मार्कर, और मायऑड, एक मैयोजेनिक वंश मार्कर, नियंत्रण से मांसपेशियों के ऊतक वर्गों और घायल चूहों में। रिपोर्ट की गई पद्धति में एक विशिष्ट सेल डिब्बे, म्यूसिक कम्पार्टमेंट में आंकात्मक प्रक्रिया की निगरानी के लिए अनुमति दी जाती है, जो मांसपेशियों के उत्थान के आयोजन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन वयस्क स्टेम कोशिकाओं (स्नायु उपग्रह कोशिकाओं, मुकाबले) और अन्य कोशिका प्रकारों के बीच संपर्क का परिणाम है जो पुनर्योजी प्रक्रिया में शामिल हैं। स्नायु होमोस्टैसिस और कार्यक्षमता मांसपेशियों के आला और प्रणालीगत संकेत 1 , 2 से उत्पन्न होने वाले संयुक्त सिग्नल द्वारा बनाए जाते हैं। जीवनकाल के दौरान, म्यूएससी की कार्यक्षमता में परिवर्तन, मांसपेशियों की जगह और प्रणालीगत संकेतों की सूचना दी गई है, जिससे बुजुर्गों में कार्यात्मक क्षमता में गिरावट आई है। मुख्यालयों को बेसल लैमीना के नीचे एक जगह में स्थापित किया गया है और, मांसपेशियों की चोट के कारण, क्षतिग्रस्त मांसपेशियों की मरम्मत के लिए सक्रिय कर रहे हैं 4 , 5 । एक उत्पादक पुनर्योजी प्रतिक्रिया को सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि मुकाबला क्विज़सेंस से बाहर निकलने के लिए आवश्यक विभिन्न प्रक्रियाओं का समन्वय करता है, स्व-नवीकरण, और प्रजनन विस्तारित चरण का पालन किया जाता हैMyogenic भेदभाव द्वारा 6 बुजुर्ग और पेशी संबंधी बीमारियों में, इन सभी कार्यों से समझौता किया जाता है, जिससे बदलती पेशी की कार्यक्षमता 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 हो सकती है ।

मैक्रॉटोफॉजी (बाद में आंतों के रूप में उल्लिखित) ऊतक होमोस्टेसिस 14 को संरक्षित करने के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया के रूप में उभर रहा है। स्वाभाविक प्रक्रिया तस्करी तंत्रों को घेरती है, जहां कोशिकालोग, ऑर्गेनेल और प्रोटीन के अंश को vesicles में घिरा हुआ है जो अंततः लाइसोसोम मार्ग से अपमानित हो जाता है, विषाक्त अणुओं को हटाने और मैक्रोमोल के रीसाइक्लिंग को बढ़ावा देता है।cules। यह तनाव या अन्य प्रतिकूल परिस्थितियों में सेल और ऊतक अनुकूलन का समर्थन करने के लिए ऊर्जा-समृद्ध यौगिक प्रदान करता है 15 , 16 । कोशिका-टिशू संदर्भ ( जैसे, सामान्य बनाम कैंसर के ऊतकों) और तनाव उत्तेजनाओं के प्रकार 17 , 18 के आधार पर, कोशिका-अस्तित्व की गतिविधि के साथ, भोजी कोशिका-मृत्यु के रूप में काम कर सकते हैं।

हाल के साक्ष्य इंगित करता है कि मांसपेशियों और माईओफ़िएयर अखंडता 1 9 , 20 को बनाए रखने के लिए भोजी की आवश्यकता होती है और 24 , 25 , 26 , 27 , ड्यूसेन मस्कुलर डिस्ट्रोफी (डीएमडी) 24 , 25 , 26 , 27 सहित विभिन्न मांसपेशी डिस्ट्रोफी 21 , 22 , 23 में खराब होने की सूचना दी गई है। , 28 , 2 9 , 30। इसी तरह, मांसपेशियों के नुकसान के बाद 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , बुजुर्गों में स्वाभाविक प्रक्रिया में प्रगतिशील कमी देखी गई है (जिसे सैर्कोपेनिया कहा जाता है) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , और माय्योफिर में जीवित रहने वाले 38

कंकाल की मांसपेशियों के स्वस्थ और पुनर्योजी क्षमता के बीच घनिष्ठ सम्बन्ध का अनुमान Wagers की प्रयोगशाला से किया गया था, जिसमें पता चलता है कि एक कैलोरी प्रतिबंध मुशाव की उपलब्धता और गतिविधि को बढ़ाता है। यह नहींहाल के अवलोकन के अनुसार, आगे की आशंका को समर्थन दिया गया था कि फॉक्सओ 3-नोटिस अक्ष स्व-नवीकरण 40 और म्यूसिक के संक्रमण के दौरान मौत से उगने वाले राज्य 41 तक आत्मसात करने वाली प्रक्रिया को सक्रिय करता है। ये डेटा उम्र के 42 के दौरान मुख्यालयों की संख्यात्मक और कार्यात्मक गिरावट के साथ-साथ, युवाओं से पुरानी और वृहद मुकाबले के आधारभूत फार्मेजी के प्रगतिशील घटने से सहमत हैं।

हाल ही के एक पेपर में, हमने फार्मेजी और प्रतिपूरक मांसपेशी पुनर्जनन के बीच घनिष्ठ संबंध का प्रदर्शन किया जो डीएमडी की प्रगति के शुरुआती चरणों को अलग करता है। तदनुसार, हम बीमारी की प्रगति के बाद के चरणों में एक कम स्वस्थ फ्लक्स देख चुके हैं, जब मांसपेशियों के पुनर्जन्म का समझौता किया जाता है और फाइब्रोटिक टिशू बयान होता है। दिलचस्प है, हमने दिखाया कि, परिस्थितियों में पुनर्जीवित होने पर, मुकाबला मुशाफिरों में सक्रिय हो जाता है और यह स्वप्रभावपूर्ण प्रक्रिया को म्यूसिक सक्रियण और फ़्यूNctionality 30

कुल मिलाकर, ये आंकड़े सामान्य और रोगजनक परिस्थितियों में और पूरे जीवनकाल में मांसपेशियों के उत्थान के दौरान मुसब्बर में स्वाभाविक प्रक्रिया का पता लगाने के लिए जरूरी बात को उजागर करते हैं। यहां, हम माइक्रोटुबूल से जुड़े प्रोटीन 1 ए / 1 बी-लाइट चेन 3 (एलसी 3), ऑटोजीजी 43 के मार्कर, और माओड, के मार्कर के लिए सीट इट्यूनोस्टेन्सींग में पेश करके मांसपेशी पुनर्योजी स्थितियों में एमओसीएस में आक्सीफैजिक प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। मांसपेशी वंश, नियंत्रण से मांसपेशियों के ऊतक वर्गों और घायल चूहों में। रिपोर्ट की गई पद्धति में एक विशिष्ट सेल डिब्बे में ऑक्सीफैजिक प्रक्रिया की निगरानी करने की अनुमति मिलती है, जो कि एमओएससी, जो मांसपेशियों के उत्थान के आयोजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

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Protocol

मानक पशु सुविधा प्रक्रियाओं के अनुसार चूहे की उत्पत्ति हुई और बनाए रखा, और सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को पशु वेलफेयर एश्योरेंस और आंतरिक पशु अनुसंधान एथिकल कमेटी ने स्वास्थ्य मंत्रालय के अनुसार और केयर और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के साथ अनुपालन किया। प्रयोगशाला पशु

1. मांसपेशियों की चोट और आभासी फ्लक्स के विवो ब्लॉक में

  1. मांसपेशियों की चोट
    1. तीव्र कंकाल की मांसपेशियों की चोट को प्रेरित करने के लिए, 2 महीने पुराने C57BL / 6J चूहों के बाएं टिबिलेस पूर्वकाल (टीए) पेशी में सीधे 10 माइक्रोग्राम कार्डियोटॉक्सिन (सीटीएक्स) स्टॉक के 20 μL को इंजेक्ट करते हैं जो लगभग 20 ग्राम वजन करते हैं। पुरुषों और महिलाओं की समान संख्या का उपयोग करें एक नियंत्रण के रूप में असंतुलित contralateral अंग का उपयोग करें
      नोट: 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में 10 माइक्रोन सीटीएक्स फ़िल्टर (0.22 माइक्रोग्राम पीवीडीएफ फिल्टर) और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र से बचें
    2. एक i का उपयोग करना30 जी सुई के साथ नूसुलिन सिरिंज, टीए के मध्य में सीटीएक्स इंजेक्ट करें। टीए में एक सटीक चोट उत्पन्न करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि सिरिंज की सुई नीचे की ओर से 5 मिमी गहरी, मांसपेशियों के शीर्ष तक ( चित्रा 1 ए ) के बाहर के कंठ पर प्रवेश करती है।
  2. अघोषित और घायल चूहों में स्वस्थ फॉल्स के नाकाबंदी।
    1. ऑटोग्राफिक फ्लक्स का आकलन करने के लिए, 24 घंटे पोस्ट-इंजेरी (पी), इंट्राटेरटोनियल (आईपी) इंजेक्शन ( चित्रा 1 बी ) द्वारा 4 डीएच के लिए प्रत्येक 24 घंटे के लिए 50 मिलीग्राम / किलोग्राम क्लोरोक्विन (सीएलक्यू) का संचालन करें।
      1. पीबीएस 1X में CLQ (10 मिलीग्राम / एमएल) भंग करें और इसे 0.2 माइक्रोन झिल्ली के माध्यम से फिल्टर करें। हर माउस का वजन और इंजेक्शन लगाने के लिए CLQ की मात्रा की गणना।
        नोट: उसी दिन सीएलएक्स समाधान तैयार और प्रयोग करें। CLQ स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस तक एक महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है चूंकि भोजभोज़ एक चयापचय संबंधी प्रक्रिया है, हमेशा सीएलक्यू उपचार हमेशा एक ही समय में करते हैं ( यानी सुबह बीफ़ो मेंफिर से 10 बजे)

2. स्नायु ऊतक अनुभाग

  1. माउस बलिदान
    1. चोट के 5 दिनों के बाद चूहों को कुचक्र करना
    2. ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा या सीओ 2 द्वारा (पुष्टिकरण के लिए ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया जाना) द्वारा इच्छामृत्यु करना चूंकि भोजी प्रक्रिया माउस नींद / खाने की आदतों से संबंधित है, इसलिए हमेशा सुबह में चूहों को बलिदान करते हैं, खासकर सुबह (10 बजे से पहले)।
  2. टीए अलगाव और समावेश
    1. विच्छेदन से पहले, 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे करें।
    2. कैंची के उपयोग से कूल्हों के स्तर पर माउस की पृष्ठीय त्वचा पर एक छोटा, सीधा चीरा (3 मिमी लंबा) बनाते हैं। त्वचा हटाने को सरल बनाने के लिए पूंछ और पैर काट लें पूंछ की ओर त्वचा खींचो और अंतर्निहित मांसपेशियों को उजागर करने के लिए इसे हटा दें; चित्रा 2 ए में दिखाए गए अनुसार टीए मांसपेशियों को स्थानीय बनाना आसान है
    3. दो संदंशों की सहायता से, बाहर की रंध्र को समझो
    4. बाहर का रेशों को काटें; टीए और extensor digitorium लघु (EDL) tendons अक्सर संयुक्त रूप से और बाद में विभाजित कर रहे हैं (कदम 2.2.6 देखें)।
    5. संदंश का प्रयोग करना, टीएनए मांसपेशियों को कण्डरा से पकड़कर रखें और मांसपेशियों को समीपस्थ अंत (घुटने के पास, चित्रा 2 बी ) की तरफ खींचें।
      नोट: इस बिंदु पर, ईडीएल और टीए की मांसपेशियों को आसानी से पहचाना जा सकता है, टीए ईडीएल की तुलना में बड़ा और अधिक सतही है
    6. विपरीत दिशाओं ( चित्रा 2 सी ) में दो बाहर के रंधकों को खींचकर ईडीएल मांसपेशी से टीए को अलग करें।
    7. समीपस्थ कण्डरा काटें
    8. संदंश का प्रयोग, ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना, मांसपेशियों को कवर करने वाली पतली प्रावरणी को हटा दें।
    9. एक कागज तौलिया की सहायता से नमूना में अत्यधिक नमी निकालें। सुनिश्चित करें कि मांसपेशियों में न गीली है, न ही अत्यधिक शुष्क है, क्योंकि अत्यधिक नमी सिग का उत्पादन करेंगेमांसपेशियों को महत्वपूर्ण क्षति और अगले धुंधला हो जाना ख़तरे में डालना
    10. इष्टतम काटना तापमान (ओसीटी) एक ढालना के नीचे स्थित यौगिक और चित्रा 2 डी में दिखाए गए अभिविन्यास में, उसमें पेशी को रखें। एक बीकर में 100% आइसोपेंटाइन जोड़ें जब तक यह लगभग 3-4 सेंटीमीटर की गहराई तक नहीं पहुंचता। एक पोलीस्टीरीन बॉक्स में तरल नाइट्रोजन के संपर्क में बीकर रखें।
    11. तरल नाइट्रोजन बीकर में प्रवेश न करें, क्योंकि यह एक बुदबुदाती फोम का उत्पादन करेगा, जो मांसपेशियों के वर्गों को शामिल करने और नुकसान को प्रभावित कर सकता है।
    12. Isopentane का निरीक्षण करें और जब तक यह उचित तापमान (-140 डिग्री सेल्सियस और -150 डिग्री सेल्सियस के बीच) तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें; उपयुक्त तापमान पर, फ्रोजन इसोपटेटेन की एक ठोस सफेद परत बीकर के नीचे पर स्फटिक होगा।
    13. यदि isopentane पूरी तरह से ठोस जमा देता है, तो अगले चरण में जाने से पहले ठंड तापमान को ठंडा और ठंडा कर देता है।
    14. प्रबलित संदंश का उपयोग करना, नाजुक रूप से ढालनालगभग 20-30 एस के लिए आइसोपेंटेंन ठंडे बर्फ के साथ एक कंटेनर में जमे हुए नमूने रखें जब तक इसे एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र तक स्थानांतरित नहीं किया जाता है।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है
  3. स्नायु ऊतक cryosections
    1. -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक रात्रि के बाद, रोशन करना।
    2. Crystat चाकू और विरोधी रोल प्लेट -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के बाहर ले लो और उन्हें cryostat कैबिनेट में संबंधित समर्थन पर जगह है।
    3. नमूना स्टब पर ओसीटी की एक बूंद डालें और उस पर जमे हुए नमूने रखें, चित्रा 2 डी में विज़ुअल के रूप में ऊर्ध्वाधर एनएस अभिविन्यास में रखें
    4. चक पर नमूना स्टब रखें
    5. चाकू पर विरोधी रोल प्लेट को खींचने के बिना, ओसीटी से छुटकारा पाने के लिए 40 माइक्रोन में कुछ कटौती करें, जिसमें मांसपेशी शामिल नहीं है। जब पेशी दिखाई देती है, तो टुकड़ा मोटाई को 7-8 माइक्रोन तक कम करें
    6. एंटी-रोल प्लेट तक खींचें जब तक कि इसके साथ गठबंधन नहीं किया जाता हैचाकू के किनारे या इसके ऊपर थोड़ा सा।
    7. ट्रांसवर्स्ल अनुभाग 7-8 माइक्रोन मोटी कट करें और हिस्टोलॉजिकल स्लाइड पर 3-4 स्लाइड्स माउंट करें।
      नोट: सुझाए गए क्रिस्टोस्ट तापमान -15 डिग्री सेल्सियस और -23 डिग्री सेल्सियस के बीच है सैटेलाइट आला पोजीशन में पेशी स्टेम सेल को इंगित करने के लिए बाद के विश्लेषण के लिए नमूनों के क्रॉस-सेक्शन आवश्यक हैं।
    8. अनुभाग के अनुपालन को अधिकतम करने के लिए, स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए रखें ताकि एंटीबॉडी ऊष्मायन के दौरान उनकी टुकड़ी को रोका जा सके।
      नोट: वायु सुखाने वाला कदम अनियंत्रित परिणाम को प्रभावित कर सकता है। स्लाइड्स को कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अस्थिर रखा जा सकता है प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।
  4. टीए की मांसपेशियों के cryosections में मांसपेशियों की क्षति के लिए जांच Hematoxylin Eosin (एच एंड ई) धुंधला करके
    1. मांसपेशियों की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए ( यानी चोट की प्रभावशीलता, मांसपेशी अलगाव और सम्मिलितआयन, और रुकने), एक एच एंड ई धुंधला हो जाना प्रत्येक प्रयोगात्मक समय बिंदु के लिए, 10 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ एक स्लाइड को ठीक करें। निर्धारण के बाद, 1x पीबीएस के कई बदलावों में स्लाइड्स को अच्छी तरह धो लें।
      नोट: सावधानी पीएफए ​​कार्सनोजेन है और सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए।
    2. प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए एक स्लाइड ले लीजिए और उन्हें एक धुंधला जार में डाल दिया।
    3. जार 9 ग्राम / एल हेमटॉक्सिलीन के साथ भरें जब तक कि अनुभागों को कवर नहीं किया जाता है और 8 मिनट तक सेते हैं।
    4. हेमटोक्सीकलीन को रीसायकल करें
    5. हेमटोटोक्साइलिन की अधिकता को निकालने के लिए 10 मिनट के लिए पानी चलाने के तहत जार छोड़ दें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि पानी के सीधे धाराओं पर प्रवाह न करें।
    6. निष्फल पानी से धो लें
    7. 1 मिनट के लिए एसिडाइड 90% इथेनॉल में एओसिन 0.5% (डब्ल्यू / वी) के साथ वर्गों सेते हैं।
    8. ईसिन रीसायकल
    9. 3 मिनट / धोने के लिए बाँझ पानी के साथ दो बार धो लें
      नोट: एक रासायनिक हुड पर निम्न चरणों का पालन करें।
    10. 70% इथेनॉल वाले वर्गों को धो लें
    11. धुलाई90% इथेनॉल वाले वर्ग
    12. 100% इथेनॉल वाले वर्गों को धो लें
    13. 0.879 जी / एमएल ओ-एक्सलीन युक्त वर्गों को सेते हैं
      नोट: सावधानी ओ-एक्जिलिन ज्वलनशील और मामूली विषाक्त है रासायनिक हुड के तहत हेरफेर करें, सुरक्षात्मक उपकरण पहने, दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट और एक मुखौटा सहित
    14. ओ-एक्सलीन की रीसायकल
    15. स्लाइड्स को कागज के एक टुकड़े पर रखकर शुष्क करना
    16. एक त्वरित-सख्त, xylene-based mounting माध्यम का उपयोग करके स्लाइड्स को बंद करें।
    17. 10 एक्स बढ़ाई पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत वर्गों की गुणवत्ता की जांच करें ( चित्रा 3 देखें)
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है

3. जख्मी मांसपेशियों के ऊतक अनुभागों में एलसी 3 और माईओडी के लिए प्रतिरक्षण

  1. मांसपेशी ऊतक वर्गों का निर्धारण।
    1. एक ऊष्मायन कक्ष को कागज के एक टुकड़े को गीला करके और एक कोनेबल प्लास्टिक बॉक्स के नीचे रखकर एक उच्च लेकक्ष के अंदर आर्द्रता का नमी 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए) के साथ टिशू वर्गों को ठीक करें
      नोट: नमूना सुखाने से बचने के लिए कागज का एक गीला टुकड़ा उपयोग किया जाता है। ताजा पीएफए ​​तैयार करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर पीएफए ​​का उपयोग करें सावधान। पीएफए ​​विषाक्त है; स्टॉक समाधान करते समय पाउडर को ध्यान से संभाला जाना चाहिए। यह ऑपरेशन एक रासायनिक हुड पर किया जाना चाहिए, जिसमें दस्तकारी, एक प्रयोगशाला कोट और एक मुखौटा सहित सुरक्षात्मक उपकरण शामिल हैं। साथ ही, जब समाधान में, पीएफए ​​को सावधानीपूर्वक आना चाहिए
    2. पीएफए ​​निकालें और 5-7 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ वर्गों को धो लें; इस चरण को 3 बार दोहराएं
  2. मांसपेशियों के ऊतक वर्गों के अनुमोदन।
    1. पैप कलम के उपयोग के ऊतक वर्गों के आसपास एक हाइड्रोफोबिक बाधा डालें।
      नोट: यह चरण ऊतक वर्गों के आसपास की सतह को परिभाषित करता है और चरण 3.4, 3.6, 3.7, और 3.9 में वर्णित एंटीबॉडी के मात्रा को कम करता है।
    2. 200 μL ठंड (-20 डिग्री सेल्सियस) के साथ वर्गों को कवर करेंमेथनॉल और 5 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर के अंदर क्षैतिज रूप से ऊष्मायन कक्ष डाल दिया
    3. फ्रीजर से ऊष्मायन कक्ष को निकालें, मेथनॉल का महाप्राणण करें, और आरटी पर 5-7 मिनट के लिए 1X पीबीएस के साथ वर्गों को धो लें; इस चरण 3x को दोहराएं।
  3. ब्लॉक कर रहा है
    1. पीबीएस 1x में 4% बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन (बीएसए) का एक नया ब्लॉक समाधान तैयार करें।
      नोट: बीएसए समाधान को 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. आरटी पर कम से कम 60 मिनट के लिए ब्लॉक समाधान वाले वर्गों को सेते हैं।
    3. अवरुद्ध समाधान निकालें।
    4. 1 ग्राम पीबीएस में 20 माइक्रोग्राम / एमएल एंटी फैब को कम करके 100 μL विरोधी फैब मिश्रण तैयार करें। आरटी पर 1 घंटे के लिए एंटी-माउस आईजीजी के एक असंबद्ध आत्मीयता-शुद्ध एफ (एबी) टुकड़े के साथ वर्गों सेते हैं।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. 1x पीबीएस में 4% बीएसए में एलसी 3 और माइओडी एंटीबॉडी को भंग करके प्रत्येक स्लाइड के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 100 μL तैयार करें। 5 μg /एंटी-एलसी 3 एमएल (खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी) और 10 एमजी / एल एंटी-माईओडी (माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी)। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण को सेते हैं
  5. धुलाई।
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण निकालें
    2. 10 मिनट के लिए 1X बीबीएस में 1% बीएसए के साथ वर्गों को धो लें; इस चरण 3x को दोहराएं।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. प्रत्येक स्लाइड के लिए 100 μL माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। बकरी विरोधी खरगोश 488 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) और बकरी विरोधी माउस 594 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) 1x पीबीएस में 4% बीएसए में भंग करें।
      नोट: फ्लोरोक्रोम ब्लीचिंग को रोकने के लिए रोशनी से अत्यधिक जोखिम से बचें। अंधेरे में निम्न चरणों का पालन करें।
    2. आरटी पर 45 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ वर्गों को सेते हैं।
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण को निकालें और 5-7 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ वर्गों को धो लें; इस चरण 3x को दोहराएं।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. लमिनी पतलाप्रत्येक स्लाइड के लिए 100 μL मिश्रण का उपयोग करके 1x पीबीएस में 4% बीएसए में एन-2 (α-2-chain) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (0.33 माइक्रोग्राम / एमएल)। आरटी पर 1-2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण में सेक्शन को सेते हैं I
  8. धुलाई।
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण निकालें
    2. 10 मिनट के लिए 1X बीबीएस में 1% बीएसए के साथ वर्गों को धो लें; इस चरण 3x को दोहराएं।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. 1 एस पीबीएस में 4% बीएसए में बकरी एंटी-चूहे 647 (5 माइक्रोग्राम / एमएल) को कम करके प्रत्येक स्लाइड के लिए 100 μL माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। आरटी पर 45 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण में वर्गों सेते हैं।
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण को निकालें और 5-7 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ वर्गों को धो लें; इस चरण 3x को दोहराएं।
  10. 4 ', 6 -मिडीनो-2-फिनाइलंडोल (डीएपीआई) ऊष्मायन।
    1. प्रत्येक स्लाइड के लिए 1x पीबीएस में 300 एनएम डीएपीआई समाधान के 200 μL जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं डीएपीआई समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करेंअंधेरा।
    2. 5-7 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ वर्गों को धो लें; इस चरण 3x को दोहराएं।
  11. दाग पेशी वर्गों बढ़ते
    1. वर्गों से धोने के समाधान से अधिक निकालें।
    2. 1x पीबीएस (3: 1) में ग्लिसरॉल के 10 μL को स्लाइड के मध्य में दाग वाले वर्गों पर रखें और वायु बुलबुले के निर्माण से बचने के लिए एक कवरलिप जोड़ें।

4. कन्फोकल माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण

  1. छवि कैप्चर सिस्टम और विश्लेषणात्मक सॉफ़्टवेयर के साथ एकीकृत चार-लेज़र confocal खुर्दबीन का उपयोग करके चित्र प्राप्त करें।
    नोट: मायाओडी एक 594 डाई के साथ संयुग्मित है जो एक चमकदार लाल फ्लोरोसेंट डाई है, जो आदर्श रूप से 594 एनएम लेजर (उत्तेजना: 590 एनएम, उत्सर्जन: 617 एनएम) के अनुकूल है। एलसी 3 एक 488 डाई के साथ संयुग्मित है जो एक चमकदार हरी-फ्लोरोसेंट डाई है, जो आदर्श रूप से 488 एनएम लेजर लाइन (उत्तेजना: 495 एनएम, उत्सर्जन: 51 9 एनएम) के अनुकूल है। Laminin एक 647 डाई के साथ संयुग्मित है कि है647 एनएम लेजर लाइन (उत्तेजना: 650 एनएम, उत्सर्जन: 668 एनएम) के लिए आदर्श रूप से उपयुक्त उत्तेजना के साथ एक चमकदार दूर-लाल फ्लोरोसेंट डाई।
  2. माइक्रोस्कोप ट्रे में स्लाइड्स रखें और परमाणु संकेतों का पता लगाने के लिए 63x बढ़ाई का उपयोग करें। सक्रिय पुनर्जन्म के क्षेत्रों को केंद्रित करके पुनर्योजी क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करें, मांसपेशियों के आकारिकी पर निर्भर ( चित्रा 4 देखें)।
    नोट: जबकि अघोषित मांसपेशियों में, myofiber आकार लगभग स्थिर ( चित्रा 4 ए ) है, चोट-मध्यस्थता मांसपेशियों में पुनर्जन्म छोटे myofibers की उपस्थिति के द्वारा पहचाना जा सकता है, जो पुनर्जन्म के बाद नवगठित फाइबर हैं। इसके अलावा, सक्रिय पुनर्जनन में मांसपेशी मैक्रोफेज, फाइब्रो-एडीपोजेनिक पूर्ववर्तियों, और पेशी पुनर्जनन ( चित्रा 4 बी ) को व्यवस्थित करने के लिए क्षतिग्रस्त मांसपेशियों में स्थानीयकृत कोशिकाओं द्वारा बनाई गई एक व्यापक घुसपैठ की विशेषता है।
  3. Regen में immunofluorescent धुंधला मूल्यांकनम्यूओसीस के आधारभूत लामिना के तहत स्थित मुसस्करों पर ध्यान केंद्रित करके,
  4. म्यूओसी के धुंधला हो जाने के लिए सकारात्मक हैं और लैमिनिन धुंधला (चिह्नित चित्रा 4 बी , सफेद तीर देखें) द्वारा चिह्नित myofibers के भीतर स्थित MuSCs पर ध्यान दें।
  5. कम से कम 3 चूहों / प्रायोगिक समूह का उपयोग करें और प्रत्येक प्रायोगिक समूह के लिए कम से कम 7 क्षेत्रों की 63x बढ़ाई गई छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  6. एक बार पुनर्योजी क्षेत्रों की पहचान की जाती है, डीएपीआई धुंधला हो जाना और अन्य एकल चैनलों को समायोजित करने पर ध्यान केंद्रित करें।
    1. निम्नलिखित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का प्रयोग करें: चैनल ए 594 पिनहोल 1.2 हवादार इकाई, लाभ 791; चैनल ए488 पिनहोल 1.6 एयरइ यूनिट, लाभ 65 9; चैनल ए 647 पिनहोल 1.4 एयरइ इकाई, लाभ 719
  7. एकल चैनलों के फोकस को समायोजित करने के बाद, छवियों को 1,024 x 1,024 फ्रेम आकार में प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें और 12.61 μs पिक्सेल रहने दें।
  8. MyoD सकारात्मक कोशिकाओं (टी के लिए नियंत्रण के प्रतिशत की गणनावह लैमिना के नीचे सही स्थान) एलसी 3-नकारात्मक और माइओ-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत जो एक एलसी 3 सिग्नल प्रदर्शित करते हैं।
    नोट: माइको-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत जो एलसी 3 धुंधला दिखाना है, इस प्रोटोकॉल का पढ़ना है।

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Representative Results

मांसपेशियों के उत्थान के दौरान यह प्रोटोकॉल मुसब्बर में भोजी का पता लगाने के लिए स्वस्थानी विधि में एक कुशलता का वर्णन करता है।

सीटीएक्स विवो उपचार में:

टीए की मांसपेशियों में मांसपेशियों की क्षति को प्रेरित करने के लिए सीटीएक्स का उपयोग करें और नियंत्रण के रूप में अघोषित मांसपेशियों का उपयोग करें चूंकि भोजी अत्यधिक गतिशील है, सीएलक्यू ( चित्रा 1 ) के आईपी इंजेक्शन के द्वारा ऑटोग्राजिक फ्लक्स को अवरुद्ध करें। सीएलक्यू उपचार आकलन करने के लिए आवश्यक है कि आंशिक फ्लक्स सक्रिय है या बेसल स्तर पर रखा जाता है।

टिबिआलिस पूर्वकाल अलगाव:

चित्रा 2 में वर्णित टीए मांसपेशियों को अलग करें, और एनएस अभिविन्यास में मोल्ड चेंबर में इसे स्थानांतरित करने के लिए बाद में ट्रांसवर्स्ल मांसपेशियों के ऊतक वर्गों को प्राप्त करें। यह कदमवर्गों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और मूवर्स बेसल लैमिना के मुकाबले उचित स्थान पर मुसस्सियों की पहचान करना

सीटीएक्स प्रेरित मांसपेशियों की क्षति की हाइस्टोलॉजिकल परीक्षा

हिस्टोलॉजिकल स्टैनिंग प्रदर्शन करके मांसपेशियों में चोट लग गई है। एचएंडई स्टेंसिंग करें और 10 एक्स बढ़ाई के तहत जांच करें: जबकि अघोषित मांसपेशियों को आम तौर पर अचल मायोफाइबर आकार दिखाए जाते हैं, घायल मांसपेशियों की विशिष्ट विशेषताओं में मायोफ़िब्स के विघटन होता है जो आकार में भिन्न होते हैं और प्रचुर मात्रा में भड़काऊ घुसपैठ करते हैं। एक अन्य पैरामीटर यह पुष्टि करने के लिए कि पुनर्योजी प्रक्रिया हो रही है, मायोफिबरों का केंद्र-न्यूक्लेयेशन है, जो अघोषित मांसपेशियों में अनुपस्थित है और सक्रिय पुनर्जन्म ( चित्रा 3 ) के दौर से गुज़रने वाले चूहों के नए फाइबर के गठन का संकेत है।

भोजी MyoD-po को जोड़ा जाता हैमांसपेशियों के पुनर्जन्म के दौरान बैठे कोशिकाओं:

म्यूओडी-पॉजिटिव के रूप में पहचान की गई, जो कि एक एलसी 3 सिग्नल प्रदर्शित करते हैं, एमयूसीएस का पता लगाने के लिए immunofluorescent धुंधला करते हैं। बेसिन लैमिना ( चित्रा 4 ) के नीचे जगह में उचित स्थिति में मुसस्सियों का पता लगाने के लिए लैमिनिन धुंधला उपयोगी है। Autophagic बेसल स्तर unperturbed कंकाल की मांसपेशियों में भेद और मांसपेशियों पुनर्जन्म के साथ संयोग में काफी वृद्धि 30 । तदनुसार, अचेतन चूहों में कोई एमओएससी सक्रियण नहीं दिखता, जो माओड-पॉजिटिव कोशिकाओं की अनुपस्थिति से पता चलता है और कोई एलसी 3 संकेत नहीं है। इसके विपरीत, मांसपेशियों की क्षति पर, माओड-पॉजिटिव एमओएससी एलसी 3 के लिए सकारात्मक बनते हैं, यह दर्शाते हुए कि सक्रिय उपग्रह कोशिकाओं में मांसपेशी पुनर्जन्म के दौरान स्वस्थ प्रक्रिया सक्रिय है।

पुनर्योजी प्रतिक्रिया के प्रारंभिक चरणों के दौरान, विभिन्न सेलुलर प्रकार टी के स्थल को स्थानीय बनानावह भड़काऊ कोशिकाओं और फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्ववर्ती सहित घाव, घायल इलाकों में भीषण घबराहट पैदा कर रहा है। सभी विभिन्न सेलुलर प्रकारों के बीच भेद करना महत्वपूर्ण है, माइओबैर लामिना के नीचे स्थित म्यूएससी स्थान पर ध्यान केंद्रित करना और मायओड पॉजिटिविटी पर भरोसा करना।

बेसल स्थितियों में, एलसी 3 सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस से मुश्किल से पता लगाया जाता है। ऊंचा भोजी के परिणामस्वरूप, यह धुंधला हो जाना पैटर्न बदलता है और मुख्य रूप से साइटोप्लाज्म में डिटेक्ट किया जाता है। जब MyoD / LC3 धुंधला हो रहा है, तो विचार करें कि म्यूएससी छोटे कोशिकाएं हैं और यह कि साइटोप्लाजिकिक क्षेत्र सीमित है; यही कारण है कि एलसी 3 परिन्यूक्लियर लग सकता है

आकृति 1
चित्रा 1: विटा उपचार में सीटीएक्स। ( ए ) मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाने के लिए, 10 μL सीटीएक्स के 10 μL डायरेक्ट करें2 महीने पुराने डब्ल्यूटीई चूहों की बाईं टीए की मांसपेशियों में टिली। एक नियंत्रण के रूप में contralateral अंग का उपयोग करें ( बी ) कार्डियोटॉक्सिन प्रेरित मांसपेशियों की चोट के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चोट के 24 घंटे बाद, चूहों को 50 मिलीग्राम / किलोग्राम के क्वालिटी के इंट्राटेरिटाइन इंजेक्शन के साथ 4 दिनों के लिए 24 घंटे और फिर जानवरों का त्याग करें। नियंत्रण के रूप में अनुपचारित और घायल चूहों का उपयोग करें यह प्रोटोकॉल मांसपेशियों के उत्थान के दौरान स्वाधीन प्रक्रिया की भागीदारी के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: टीए अलगाव। ( ए ) टीए की प्रतिनिधि छवि क्योंकि यह अलगाव से पहले दिखता है। ( बी ) डिस्टाल कण्डरा को काटने के बाद, टीए मांसपेशियों को कण्डरा और सावधान द्वारा पकड़ोली ने मांसपेशियों को समीपस्थ अंत (घुटने के पास) की ओर खींच लिया ( सी ) टीए मांसपेशी से ईडीएल का भेदभाव करते हैं, जो कि ईडीएल से बड़ा और अधिक सतही है। विपरीत दिशाओं में दो अलग-अलग tendons खींच कर ईडीएल मांसपेशी से टीए को अलग करें। ( डी ) टीए पृथक होने के बाद, एनएस अभिविन्यास में बताए अनुसार, मोल्ड चेंबर में इसे रखें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: सीटीएक्स मस्तिष्क की क्षति लाती है। टीए ट्रांसवर्स्ल ऊतक वर्गों पर नियंत्रण से एच एंड ई के धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियों, असुविधाजनक ( ए ) और 5 डी पीआई ( बी ) डब्ल्यूटीई चूहों एच एंड ई धुंधला नियंत्रण चूहों ( ए ) और मालिश में सामान्य फाइबर आकारिकी का पता चलता हैई मांसपेशियों की क्षति और घायल मांसपेशियों ( बी ) में घुसपैठ, सीटीएक्स इंजेक्शन पर एक विकृत आकृति विज्ञान का प्रदर्शन। स्केल बार = 50 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: मांसपेशियों के पुनर्जन्म के दौरान भानिकी को माओड पॉजिटिव सेल के साथ जोड़ा जाता है। नियंत्रण ( ए ) और घायल ( बी ) डब्ल्यूटी चूहों की टीए अनुभागों की प्रतिनिधि छविएं एलसी 3 (हरे) और मायओड (लाल) के साथ immunostained। लैमिनिन (सियान) धुंधला हो जाना मांसपेशी फाइबर, और नाभिक डीएपीआई (सफेद) के साथ counterstained हैं। सही पैनल मर्ज सिग्नल के प्रतिनिधि चित्र दिखाते हैं। सफेद तीर उपग्रह कोशिकाओं का संकेत देते हैं जो लमिनिन धुंधला द्वारा चिह्नित फाइबर के बेसल लामिना के नीचे हैं। अनुसरणीएनजी प्रोटोकॉल MyoD द्वारा चिह्नित, myogenic वंश के दौर से गुजर मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं में LC3 धुंधला के माध्यम से भोजी को मापने के लिए अनुमति देता है स्केल बार = 50 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि क्षतिपूर्ति मांसपेशियों के उत्थान के दौरान कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं में भोजी की निगरानी कैसे करें। LC3 और MyoD के सह-धुंधला के लिए कई एंटीबॉडी की कोशिश की गई, और जो माउस टिशू अनुभागों में काम करते हैं और सफल परिणाम बनाते हैं उन्हें यहां सूचीबद्ध किया जाता है (देखें सामग्री तालिका )। मेथनॉल के साथ permeabilization (चरण 3.2.2 देखें) सफल धुंधला होने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।

इस प्रोटोकॉल की सीमा को चूहों की आंतरिक परिवर्तनशीलता से जोड़ा जाता है, जो कम से कम 3 चूहों / प्रायोगिक समूह के उपयोग को मजबूर करता है। इस पद्धति में कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन के दौरान भोजी के अध्ययन में एक कदम आगे दर्शाया गया है, क्योंकि अधिकांश परिणाम अब अलग कोशिकाओं में बनाया गया था स्वस्थानी विश्लेषण में प्राकृतिक वातावरण में भोजी के अध्ययन के लिए अनुमति दी गई, बिना कोशिका अलगाव की आवश्यकता के कारण चयापचय प्रक्रियाओं को प्रभावित किया जा सकता है, जैसे कि भोजी

"> स्वाधीन प्रक्रिया की अत्यधिक गतिशील प्रकृति को देखते हुए, सीएलक्यू उपचार विवो में स्वाभाविक प्रक्रिया की निगरानी करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। सीएलक्यू अवरोधक प्रक्रिया के बाद के चरणों को रोकता है, जिससे एलसी 3 संचय होता है, जब भोजी निरंतर रहता है। इसलिए, CLQ उपचार सीटू परीक्षा में एलसी 3 द्वारा पता लगाना एलसी 3 की जांच की जाती है । असंतुलित कंकाल की मांसपेशियों में, सीएलक्यू उपचार से बेसल ऑटोजाजिक प्रक्रिया बढ़ जाती है, जैसा कि पता लगाना एलसी 3 संचय के अभाव से पता चला है। हालांकि, मांसपेशियों को पुनर्जन्म करने में, एलसी 3, सीएलक्यू उपचार पर जम जाता है, एक महत्वपूर्ण कदम सुबह में एक ही समय में चूहों ( यानी 10 बजे) को बलिदान करना है। प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम है, जो म्यूएससी की पहचान है, जिसे किसी अन्य सेलुलर प्रकार से अंतर नहीं किया जाना चाहिए जो क्षतिग्रस्त मांसपेशियों के दौरान क्षतिग्रस्त हो। रीजनेटिव रिस्पांस। बाओल लैमिना के तहत मुसस्कोप की पहचान जो कि माओड पॉजिटिविटी प्रदर्शित करती है कश्मीरउपग्रह कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ey

संक्षेप में, हम म्यूएससी में स्वाधीन प्रक्रिया की भागीदारी का पता लगाने के लिए स्वस्थानी विधि में उपयुक्त प्रस्तुत करते हैं। यह तकनीक भोजी मॉडुलन के लिए औषधीय दृष्टिकोण के परीक्षण के आधार के रूप में सेवा कर सकती है, जो आमतौर पर सामान्य और रोग संबंधी परिस्थितियों में कंकाल की मांसपेशियों के पुनरुत्पादन में सुधार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

यह काम एनआईएएमएस AR064873, एपीगेन प्रोजेक्ट पीबी द्वारा समर्थित था। पी 101.001.01 9 / प्रोगेट्टो बांडीएरा एपिगोनेमिका आईएफटी को एलएलएल

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 WT mice
Cardiotoxin 1 Latoxan L8102
Millex-VV Merck Millipore SLVV033RS Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate salt Sigma-Aldrich C6628 Caution:
Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mL BD 324825
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura Finetek 25608-930
Tissue-Tek Cryomold Intermediate Sakura Finetek 4566
2-Methylbutane Sigma-Aldrich 277258
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma-Aldrich HHS32
Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110132
o-Xylene Sigma-Aldrich X1040 Caution:
Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Caution:
Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Eukitt - Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-007-003
LC3B Antibody Cell signaling Technology 2775
Monoclonal mouse anti-MyoD
(concentrated) clone 5.8A		 DAKO - Agilent Pathology Solutions M3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody Enzo Life Sciences 4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Life technologies A11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody Life technologies A21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306

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सेल्यूलर बायोलॉजी अंक 124 ऑटोफॉजी मांसपेशी स्टेम कोशिका (उपग्रह) मांसपेशियों में पुनर्जनन एलसी 3 MYOD मांसपेशी ऊतक वर्ग
मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं में स्वस्थता के सिटू इम्युनोफ्लोरोइसेंट स्टाइनिंग में
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Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).

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