Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

I situ Immunofluorescerende farging av autophagy i muskelstamceller

Published: June 12, 2017 doi: 10.3791/55908
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2
1Department of Medicine, Institute of Translational Pharmacology, Italian National Research Council, 2Epigenetics and Regenerative Medicine, IRCCS Fondazione Santa Lucia, 3Biological and Environmental Sciences and Engineering Division, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 4Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

Summary

Aktiv autofagi er assosiert med produktiv muskelregenerasjon, noe som er viktig for aktivering av muskelstamceller (MuSC). Her gir vi en protokoll for in situ- deteksjon av LC3, en autophagy markør i MyoD-positive MuSCs av muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus.

Abstract

Økende bevis peker mot autophagy som en avgjørende reguleringsprosess for å bevare vevshemostost. Det er kjent at autofagi er involvert i utvikling av skjelettmuskulatur og regenerering, og den autofagiske prosessen er beskrevet i flere muskulære patologier og aldersrelaterte muskelforstyrrelser. En nylig beskrevet blokk av autofagisk prosess som korrelerer med funksjonell utmattelse av satellittceller under muskelreparasjon støtter ideen om at aktiv autofagi er kombinert med produktiv muskelregenerering. Disse dataene avdekker den avgjørende rollen som autofagi ved satellittcelleaktivering under muskelregenerering i både normale og patologiske forhold, som for eksempel muskeldystrofier. Her gir vi en protokoll for å overvåke autofagisk prosess i voksen Muscle Stem Cell (MuSC) -kammeret under muskelregenerative forhold. Denne protokollen beskriver oppsettmetoden for å utføre in situ immunofluorescensavbildning av LC3, en aUtophagy markør, og MyoD, en myogen linjemarkør, i muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus. Metoden som rapporteres muliggjør overvåking av den autofagiske prosessen i et spesifikt cellefelt, MuSC-kammeret, som spiller en sentral rolle for orkestrering av muskelregenerering.

Introduction

Skeletmuskleregenerering er resultatet av samspillet mellom voksne stamceller (Muscle Satellite Cells, MuSCs) og andre celletyper som er involvert i den regenerative prosessen. Muskel homeostase og funksjonalitet opprettholdes av de kombinerte signalene som oppstår fra muskelnissen og systemiske tegn 1 , 2 . Gjennom hele levetiden er endringer i MuSC-funksjonaliteten, muskelnissen og de systemiske signalene blitt rapportert, noe som fører til nedgangen i funksjonell kapasitet hos eldre 3 . MuSCs er satt i en nisje under basal lamina og, ved muskelskade, aktiveres for å reparere skadede muskler 4 , 5 . For å sikre en produktiv regenerativ respons er det avgjørende at MuSCs koordinerer forskjellige prosesser som er nødvendige for utgang fra hvile, selvfornyelse og det proliferative ekspansjonsstadiet fulgtVed myogen differensiering 6 . Hos eldre og muskulære kroniske sykdommer er alle disse funksjonene kompromittert, noe som fører til endret muskelfunksjonalitet 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .

Makroautofagi (referert heretter som autofagi) oppstår som en avgjørende biologisk prosess som er avgjørende for å bevare vevshomeostase 14 . Den autofagiske prosessen innbefatter handelsmekanismer, hvor deler av cytoplasma, organeller og proteiner blir oppslukt i vesikler som til slutt nedbrytes via lysosomveien, fremmer fjerning av toksiske molekyler og resirkulering av makromolcules. Dette gir energirike forbindelser for å støtte celle- og vevtilpasning under stress eller andre ugunstige forhold 15 , 16 . Sammen med sin celleoverlevelsesaktivitet kan autofagi også fungere som en celledødsinducer, avhengig av cellevevskontekst ( f.eks. Normalt versus kreftvev) og typen stressstimulus 17 , 18 .

Nylige bevis indikerer at autofagi er nødvendig for å opprettholde muskelmasse og myofiberintegritet 19 , 20 og har blitt rapportert å være svekket i forskjellige muskeldystrofier 21 , 22 , 23 , inkludert Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. På samme måte har en progressiv reduksjon av den autofagiske prosessen blitt observert hos eldre 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , etter tap av muskelmasse (referert til som sarkopi) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og i myofiber overlevelse 38 .

Et nært forhold mellom autophagy og regenerativ potensial av skjelettmuskulaturen var forventet ved en studie fra Wagers laboratorium, som viste at en kaloribegrensning øker MuSC tilgjengelighet og aktivitet 39 . Dette nrBle ytterligere støttet av den nylige observasjonen at Foxo3-Notch-aksen aktiverer den autofagiske prosessen under selvfornyelse 40 og MuSC-overgangen fra hvilende til proliferasjonsstaten 41 . Disse dataene stemmer overens med den progressive reduksjonen av basal autofagi fra unge til gamle og geriatriske MuSCs, i forbindelse med den numeriske og funksjonelle nedgangen av MuSCs under aldring 42 .

I et nylig papir viste vi et nært forhold mellom autophagy og kompenserende muskelregenerering som skiller de tidlige stadier av DMD-progresjon. Følgelig observert vi en redusert autofagisk fluss ved senere stadier av sykdomsprogresjon, når muskelregenerering er kompromittert og fibrotisk vevsdeposisjon oppstår. Oppsiktsvekkende viste vi at i regenererende tilstander aktiveres autofagi i MuSCs og den modulerende autofagiske prosessen påvirker MuSC-aktivering og fuNasjonalitet 30 .

Samlet sett fremhever disse dataene haster for å undersøke den autofagiske prosessen i MuSCs under muskelregenerering under normale og patologiske forhold og gjennom hele levetiden. Her gir vi en protokoll for å overvåke autofagisk prosess i muskelregenerative tilstander ved å utføre in situ immunostaining for mikrotubulær assosiert protein 1A / 1B-lettkjede 3 (LC3), en markør for autophagy 43 og MyoD, en markør for Myogen linje, i muskelvevseksjoner fra kontroll og skadede mus. Metoden som rapporteres muliggjør overvåking av den autofagiske prosessen i et spesifikt cellefelt, MuSC, som spiller en nøkkelrolle i orkestrering av muskelregenerering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus ble oppdrettet og opprettholdt i henhold til standard dyrefasilitetsprosedyrene, og alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av Animal Welfare Assurance og den interne dyreforskningsetiske komiteen i henhold til det italienske helsedepartementet og fulgte NIHs retningslinjer for omsorg og bruk av Laboratoriedyr.

1. Muskelskader og In vivo- blokken av autofagisk fluks

  1. Muskelskade.
    1. For å indusere akutt skjelettmuskulær skade, injiser 20 μl 10 μM kardiotoxin (CTX) lager direkte i venstre tibialis anterior (TA) muskel av 2 måneder gamle C57BL / 6J mus som veier ca. 20 g. Bruk like mange menn og kvinner. Bruk den uventede kontralaterale lemmen som en kontroll.
      MERK: 10 μM CTX i 0,9% natriumkloridløsning bør filtreres (0,22 μm PVDF filter) og lagres ved -20 ° C. Unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
    2. Bruke en iNsulin sprøyte med en 30 G nål, injiser CTX i midten av TA. For å indusere en nøyaktig skade i TA, må du forsikre deg om at sprøytenes nål kommer inn i den distale senen, 5 mm dyp, fra bunnen til toppen av muskelen ( Figur 1A ).
  2. Blokkering av den autofagiske fluxen i uperturerte og skadede mus.
    1. For å vurdere den autofagiske fluxen, 24 timer etter skader (pi), administrere 50 mg / kg klorokin (CLQ) hver 24. time for 4 d ved intraperitoneal (IP) injeksjon ( Figur 1B ).
      1. Oppløs CLQ (10 mg / mL) i PBS 1X og filtrer den gjennom en 0,2 μm membran. Vei hver mus og beregne mengden CLQ å injisere.
        MERK: Klargjør og bruk CLQ-løsning på samme dag. CLQ lager kan lagres i opp til en måned ved -20 ° C. Siden autophagy er en metabolsk-relatert prosess, må du alltid utføre CLQ-behandling alltid på samme tid ( dvs. om morgenen befoKl 10:00).

2. Muskelvævsseksjoner

  1. Musoffer.
    1. Euthanize musene 5 dager etter skaden.
    2. Utfør eutanasi ved cervikal dislokasjon eller ved CO 2 (følges av cervikal dislokasjon for bekreftelse). Siden autophagy-prosessen er relatert til musesøvn / matvaner, ofrer du musene samtidig, helst om morgenen ( dvs. før klokken 10.00).
  2. TA isolasjon og inkludering.
    1. Før disseksjonen, spray musen med 70% etanol.
    2. Ved hjelp av saks gjør du en liten, vinkelrett snitt (3 mm lang) på den dorsale huden på musen på hoftens nivå. Klipp halen og føttene for å forenkle hudfjerningen. Trekk huden mot halen og fjern den for å avsløre de underliggende musklene; TA-muskelen er lett å lokalisere, som vist i figur 2A
    3. Ved hjelp av to tanger, ta tak i distale sener.
    4. Kutt de distale senene; TA og extensor digitorium longus (EDL) sener blir ofte kuttet i felles og senere separert (se trinn 2.2.6).
    5. Ved å bruke tang, hold TA-muskelen av senen og trekk muskelen opp mot den proksimale enden (nær kneet, figur 2B ).
      MERK: På dette punktet er EDL- og TA-musklene lett gjenkjennelige, TA er større og mer overfladisk enn EDL.
    6. Separat TA fra EDL muskelen ved å trekke de to distale senene i motsatt retning ( figur 2C ).
    7. Kutt den proksimale senen.
    8. Bruk tau, fjern tynn fascia som dekker muskelen, uten å skade vevet.
    9. Fjern overflødig fuktighet i prøven ved hjelp av et papirhåndkle. Sørg for at muskelen ikke er våt eller overdreven tørr, da overdreven fuktighet vil produsere segVesentlig skade på muskelen og fare for neste farging.
    10. Plasser Optimal Cutting Temperature (OCT) sammensatt på bunnen av en form og legg muskelen inn i den, i retningen vist i Figur 2D . Tilsett 100% isopentan til et beger til det når en dybde på ca 3-4 cm. Plasser begeret i kontakt med flytende nitrogen i en polystyrenboks.
    11. Ikke la det flytende nitrogenet komme inn i begeret, da det vil produsere et boblende skum, noe som kan påvirke innlemmingen og skade muskelseksjonene.
    12. Vær oppmerksom på isopentanen og vent til den når riktig temperatur (mellom -140 ° C og -150 ° C); Ved riktig temperatur krystalliseres et fast hvitt lag med frosset isopentan på bunnen av begeret.
    13. Hvis isopentanen helt fryser fast, smelter og kyller det til frysetemperatur før du fortsetter til neste trinn.
    14. Ved hjelp av forkjølte tanger, senker du muggene forsiktigIsopentanen i ca 20-30 s. Plasser den frosne prøven i en beholder med tøris, til den overføres til en -80 ° C fryser.
      MERK: Protokollen kan pause her.
  3. Muskelvevkryoseksjoner.
    1. Etter minst en natt ved -80 ° C, utfør cryosectioning.
    2. Ta kryostatkniven og valseplaten ut av fryseren på -20 ° C og legg dem på de respektive støtter i kryostatkabinettet.
    3. Sett en dråpe OCT på prøvestøtten og legg den på den frosne prøven, i vertikal NS-retning, som vist i figur 2D .
    4. Plasser prøvestøtten på chucken.
    5. Uten å trekke anti-rulleplaten ned på kniven, gjør noen kutt på 40 μm for å bli kvitt OCT som ikke inkluderer muskel. Når muskelen blir synlig, reduser du tykkelsen til 7-8 μm.
    6. Trekk ned anti-rulleplaten til den er justert medKanten av kniven eller litt over den.
    7. Klipp transversale seksjoner 7-8 μm tykk og fest 3-4 skiver per histologisk lysbilde.
      MERK: Den foreslåtte kryostatemperaturen er mellom -15 ° C og -23 ° C. Det er nødvendig med tverrsnitt av prøvene for den etterfølgende analysen for å finne muskelstamceller i satellittnisjeposisjonen.
    8. For å maksimere festingen av seksjonen, hold lysbildene ved romtemperatur i 10-15 minutter for å hindre at de løsnes under antistoffinkubering.
      MERK: Lufttørkingstrinnet kan påvirke immunfarging, noe som gir tvetydige resultater. Lysbilder kan lagres unfixed i flere måneder ved -80 ° C. Protokollen kan pause her.
  4. Kontrollerer muskelskade i kryoseksjoner av TA-muskler ved å utføre hematoksylin-eosin (H & E) -farging.
    1. For å evaluere muskelkvaliteten ( dvs. effektiviteten av skaden, muskelisolasjon og inklusjonIon og cryoseksjoner), utfør en H & E-farging. For hvert eksperimentelt tidspunkt, fikser du ett lysbilde med 4% PFA i 10 minutter. Etter fiksering, vask glidene godt i flere endringer på 1x PBS.
      MERK: Forsiktig. PFA er kreftfremkallende og må håndteres forsiktig.
    2. Ta ett lysbilde for hvert eksperimentelt punkt og legg dem i en fargekanne.
    3. Fyll beholderen med 9 g / L hematoksylin til delene er dekket og inkuber i 8 minutter.
    4. Resirkuler hematoksylin.
    5. La glasset stå under rennende vann i 10 minutter for å fjerne overskudd av hematoksylin.
      MERK: Pass på at du ikke strømmer vannet direkte på seksjonene.
    6. Vask med sterilisert vann.
    7. Inkuber seksjonene med eosin 0,5% (w / v) i surgjort 90% etanol i 1 min.
    8. Resirkulere eosin.
    9. Vask to ganger med sterilt vann i 3 min / vask.
      MERK: Utfør følgende trinn på en kjemisk hette.
    10. Vask seksjonene med 70% etanol.
    11. vaskDelene med 90% etanol.
    12. Vask seksjonene med 100% etanol.
    13. Inkuber seksjonene med 0,879 g / ml o-xylen.
      MERK: Forsiktig. O-Xylen er brannfarlig og moderat giftig. Manipuler det under kjemisk hette, bruk verneutstyr, inkludert hansker, et laboratoriejakke og en maske.
    14. Gjenvinn o-Xylen.
    15. Sett lysbildene over et stykke papir for å tørke.
    16. Lukk lysbildene ved hjelp av et hurtigherdende, xylenbasert monteringsmedium.
    17. Kontroller kvaliteten på seksjonene under et optisk mikroskop ved 10X forstørrelse (se figur 3 )
      MERK: Protokollen kan pause her.

3. Immunostaining for LC3 og MyoD i injiserte muskelvævsseksjoner

  1. Fiksering av muskelvevsseksjoner.
    1. Klargjør et inkubasjonskammer ved å vaske et stykke papir og plassere det på bunnen av en lukkbar plastkasse for å opprettholde en høy leFuktighet inne i kammeret. Fest vevseksjoner med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 10 minutter.
      MERK: Et vått stykke papir brukes for å unngå tørking av prøven. Forbered fersk PFA eller bruk PFA lagret ved -20 ° C. Forsiktighet. PFA er toksisk; Pulveret må håndteres med forsiktighet ved oppbevaring av stamopløsningen. Denne operasjonen må utføres på en kjemisk hette, med beskyttelsesutstyr, inkludert hansker, labbelegg og maske. Også når det er i oppløsning, bør PFA manipuleres nøye.
    2. Fjern PFA og vask seksjonene med 1x PBS i 5-7 minutter; Gjenta dette trinnet 3 ganger.
  2. Permeabilisering av muskelvevseksjoner.
    1. Tegn en hydrofob barriere rundt vevseksjonene ved hjelp av en pappenn.
      MERK: Dette trinnet definerer overflaten rundt vevseksjonene og minimerer volumet av antistoffer beskrevet i trinn 3.4, 3.6, 3.7 og 3.9.
    2. Dekk delene med 200 μL kaldt (-20 ° C)Metanol og sett inkubasjonskammeret horisontalt i en fryser ved -20 ° C i 5 minutter.
    3. Fjern inkubasjonskammeret fra fryseren, aspirer metanolen og vask seksjonene med 1X PBS i 5-7 minutter ved RT; Gjenta dette trinnet 3x.
  3. blokkering
    1. Forbered en ny blokkløsning av 4% bovint serumalbumin (BSA) i PBS 1x.
      MERK: BSA-oppløsningen kan lagres i 1 uke ved 4 ° C.
    2. Inkubér seksjonene med blokkløsning i minst 60 minutter ved RT.
    3. Fjern blokkeringsløsningen.
    4. Forbered 100 μl anti-Fab-blanding ved å fortynne 20 μg / ml anti-Fab i 1x PBS. Inkuber seksjonene med et ukonjugert affinitetsrenset F (ab) -fragment av anti-mus IgG i 1 time ved RT.
  4. Primær antistoff inkubasjon.
    1. Forbered 100 μl primær antistoffblanding for hvert lysbilde ved å oppløse LC3- og MyoD-antistoffer i 4% BSA i 1x PBS. Bruk 5 μg /Ml anti-LC3 (kanin polyklonalt antistoff) og 10 mg / l anti-MyoD (musmonoklonalt antistoff). Inkubér den primære antistoffblandingen over natten ved 4 ° C.
  5. Vasker.
    1. Fjern den primære antistoffblandingen.
    2. Vask seksjonene med 1% BSA i 1X PBS i 10 minutter; Gjenta dette trinnet 3x.
  6. Sekundær antistoff inkubasjon.
    1. Forbered 100 μL sekundær antistoffblanding for hvert lysbilde. Oppløs geit-anti-kanin 488 (5 μg / ml) og geit-anti-mus 594 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1x PBS.
      MERK: Unngå overdreven eksponering for lys for å forhindre fluorokrombleking. Utfør følgende trinn i mørket.
    2. Inkubér seksjonene med sekundær antistoffblanding i 45 minutter ved RT.
    3. Fjern sekundær antistoffblanding og vask seksjonene med 1x PBS i 5-7 minutter; Gjenta dette trinnet 3x.
  7. Primær antistoff inkubasjon.
    1. Fortynn laminiN-2 (a-2-kjede) monoklonalt antistoff (0,33 μg / mL) i 4% BSA i 1x PBS ved å bruke 100 μl blanding for hvert lysbilde. Inkubér seksjonene i den primære antistoffblandingen i 1-2 timer ved RT.
  8. Vasker.
    1. Fjern den primære antistoffblandingen.
    2. Vask seksjonene med 1% BSA i 1X PBS i 10 minutter; Gjenta dette trinnet 3x.
  9. Sekundær antistoff inkubasjon.
    1. Forbered 100 μL sekundær antistoffblanding for hvert lysbilde ved å fortynne geit-anti-rotte 647 (5 μg / ml) i 4% BSA i 1X PBS. Inkubér seksjonene i sekundær antistoffblanding i 45 min ved RT.
    2. Fjern sekundær antistoffblanding og vask seksjonene med 1x PBS i 5-7 minutter; Gjenta dette trinnet 3x.
  10. 4 ', 6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) inkubasjon.
    1. Tilsett 200 μL 300 nM DAPI-løsning i 1x PBS til hvert lysbilde. Inkuber i 5 minutter ved RT. Oppbevar DAPI-løsningen ved 4 ° C imørk.
    2. Vask seksjonene med 1x PBS i 5-7 minutter; Gjenta dette trinnet 3x.
  11. Montering av flekkete muskelseksjoner.
    1. Fjern overskytende vaskeoppløsning fra seksjonene.
    2. Plasser 10 μl glyserol i 1x PBS (3: 1) på de fargede seksjonene i midten av lysbildet og legg til et deksel, unngår dannelsen av luftbobler.

4. Konkok mikroskopi oppkjøp

  1. Oppnå bildene ved hjelp av et fire-laser konfokalmikroskop integrert med et bildeopptakssystem og analytisk programvare.
    MERK: MyoD er konjugert med et 594 fargestoff som er et lyse rødt fluorescerende fargestoff, med eksitasjon som er ideell til 594 nm-laseren (eksitasjon: 590 nm, utslipp: 617 nm). LC3 er konjugert med et 488 fargestoff som er et lyse grønt-fluorescerende fargestoff, med eksitasjon som er ideell til 488 nm laserlinjen (excitasjon: 495 nm, utslipp: 519 nm). Laminin er konjugert med et 647 fargestoff som erEt lyst farrødt fluorescerende fargestoff, med eksitasjon som passer perfekt til 647 nm laserlinjen (excitasjon: 650 nm, utslipp: 668 nm).
  2. Plasser lysbildene i mikroskopfeltet og bruk 63X forstørrelse for å oppdage kjernefysiske signaler. Man kan fokusere på de regenerative områdene ved å sentrere feltene for aktiv regenerering, avhengig av muskelmorfologi (se figur 4 ).
    MERK: Selv om myofiber-størrelsen er nesten konstant ( figur 4A ), kan skademediert muskelregenerasjon gjenkjennes ved utseendet av mindre myofibere, som er de nydannede fiberene etter regenerering. Videre er muskelen i aktiv regenerering preget av et omfattende infiltrat som er laget av makrofager, fibroadipogene forløpere og celler som er lokalisert til de skadede muskler for å orkestre muskelregenerering ( figur 4B ).
  3. Evaluer immunfluorescerende farging i regnErative områder ved å fokusere på MuSCs som befinner seg under myofibers basale lamina.
  4. Fokus på MuSCs som er positive for MyoD-farging og plassert i myofibere merket med lamininfarging (se figur 4B , hvite piler).
  5. Bruk minst 3 mus / eksperimentell gruppe og bruk mikroskopet til å skaffe 63X forstørringsbilder av minst 7 felt for hver eksperimentell gruppe.
  6. Når de regenerative områdene er identifisert, fokuser du ved hjelp av DAPI-farging og juster deretter de andre enkeltkanalene.
    1. Bruk følgende mikroskopinnstillinger: Kanal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Kanal A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Kanal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719.
  7. Etter å ha justert fokuset på de enkelte kanalene, fortsett å skaffe bildene med en 1,024 x 1,024 rammestørrelse og en 12,61 μs pixel dwell.
  8. Telle prosentandelen av MyoD-positive celler (kontroll for tHan korrigerer plassering under laminatet) som er LC3-negativ og prosentandelen av MyoD-positive celler som viser et LC3-signal.
    MERK: Prosentdelen av MyoD-positive celler som utviser LC3-farging, er avlesningen av denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver en effektiv in situ- metode for å oppdage autophagy i MuSCs under muskelregenerering.

CTX In vivo Behandlinger:

Bruk CTX til å indusere muskelskade i TA-muskler og bruk uperturerte muskler som kontroller. Siden autophagy er svært dynamisk, blokkere autophagic flux ved å utføre IP injeksjoner av CLQ ( Figur 1 ). CLQ-behandling er avgjørende for å vurdere om den autofagiske fluxen er aktiv eller oppbevares ved basale nivåer.

Tibialis fremre isolasjon:

Isoler TA-muskelen, som beskrevet i figur 2 , og plasser den i et formkammer i NS-orientering for deretter å oppnå transversale muskelvevseksjoner. Dette trinnetEr avgjørende for å oppnå seksjoner og å identifisere MuSCs på riktig sted under myofiber basal lamina.

Hystologisk undersøkelse av CTX-indusert muskelskade

Bekreft at muskelskade oppstod ved å utføre histologisk farging. Utfør H & E-farging og kontroller under 10X forstørrelse: Mens uoppsummerte muskler viser generelt uforanderlige myofiber-størrelser, omfatter de typiske egenskapene til skadede muskler forstyrrelsen av myofibere som er forskjellige i størrelse og rikelig med inflammatorisk infiltrasjon. En annen parameter for å bekrefte at den regenerative prosessen finner sted er sentro-nukleasjonen av myofibere, som er fraværende i uperturerte muskler og er et tegn på dannelsen av nye fibre i mus som gjennomgår aktiv regenerering ( figur 3 ).

Autophagy er koblet til MyoD-poSitive celler under muskelregenerering:

Utfør immunfluorescerende farging for å oppdage MuSCs, identifisert som MyoD-positiv, som viser et LC3-signal. Lamininfarging er nyttig for å lokalisere MuSCs i riktig stilling i nisje under basallamina ( Figur 4 ). Autophagic basal nivåer skiller ubøyelig skjelettmuskulatur og øker signifikant sammenfall med muskelregenerering 30 . Følgelig viser ikke-skadede mus noen MuSC-aktivering, oppdaget ved fravær av MyoD-positive celler og ikke LC3-signal. Omvendt, etter muskelskade, blir MyoD-positive MuSCs positive for LC3, noe som demonstrerer at autofagisk prosess aktiveres under muskelregenerering i aktiverte satellittceller.

Under de første trinnene av regenerativ respons lokaliserer forskjellige celletyper til stedet for tHan lesjon, inkludert inflammatoriske celler og fibro-adipogene forløpere, noe som gjør det skadede området tett overfylt. Det er avgjørende å skille mellom alle forskjellige celletyper, med fokus på MuSC-posisjonen under myofiber-laminatet og stole på MyoD-positivitet.

I basale forhold uttrykkes LC3 ubiquitously og er knappt påvist ved immunofluorescens. Som et resultat av forhøyet autophagy, endres dette fargemønsteret og blir detekterbart hovedsakelig i cytoplasma. Når du vurderer MyoD / LC3-farging, må du vurdere at MuSC er små celler og at cytoplasmatiske regionen er begrenset. Dette hvorfor LC3 kan se perinuclear.

Figur 1
Figur 1: CTX In vivo Behandlinger. ( A ) For å indusere muskelskade, injiser 10 μL 10 μM CTX direcTly i venstre TA muskler av 2 måneder gamle WT mus. Bruk den kontralaterale lemmen som en kontroll. ( B ) Skjematisk fremstilling av kardiotoxin-indusert muskelskade. 24 timer etter skade, behandle musene med intraperitoneale injeksjoner på 50 mg / kg CLQ hver 24. time i 4 dager og deretter ofre dyrene. Bruk ubehandlede, ikke-skadede og skadede mus som kontroller. Denne protokollen tillater studiet av involvering av den autofagiske prosessen under muskelregenerering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: TA Isolasjon. ( A ) Representativt bilde av TA som det ser ut før isolasjon. ( B ) Etter å ha kuttet den distale senen, hold TA muskelen av senen og forsiktigLy trekk muskelen opp mot den proksimale enden (nær kneet). ( C ) Diskriminere EDL fra TA-muskelen, som er større og mer overfladisk enn EDL. Separat TA fra EDL muskelen ved å trekke de to distale senene i motsatte retninger. ( D ) Når TA er isolert, plasser den i formkammeret, som beskrevet, i NS-orientering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: CTX fremkaller muskelskade. Representative bilder av H & E-farging på TA-transversale vevseksjoner fra kontroll, uninjured ( A ) og 5 dpi ( B ) WT-mus. H & E-farging avslører normal fibermorfologi i kontrollmus ( A ) og massivE muskelskade og infiltrere i skadede muskler ( B ), som demonstrerer en svekket morfologi ved CTX injeksjon. Skalbjelke = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Autophagy er koblet til MyoD-positive celler under muskelregenerering. Representative bilder av TA-seksjoner fra kontroll ( A ) og skadede ( B ) WT-mus immunfargede med LC3 (grønn) og MyoD (rød). Laminin (cyan) farging markerer muskelfibre, og kjerner er motfargede med DAPI (hvit). De høyre panelene viser representative bilder av sammenslåingssignalet. Hvite piler indikerer satellittceller som er under fiberens basale lamina markert med lamininfarvning. FølgendeNg-protokollen tillater å måle autophagy gjennom LC3-farging i muskelstamceller som gjennomgår myogen linje, preget av MyoD. Skalbjelke = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan man overvåker autofagi i skjelettmuskulaturstamceller under kompenserende muskelregenerering. Flere antistoffer for co-farging av LC3 og MyoD ble prøvd, og de som jobber i musvevsnitt og oppretter vellykkede resultater, er oppført her (se Materialebord ). Permeabiliseringen med metanol (se trinn 3.2.2) anbefales sterkt for vellykket farging.

Begrensningen av denne protokollen er knyttet til musens indre variabilitet, noe som tvinger bruken av minst 3 mus / eksperimentell gruppe. Denne metoden reflekterer et skritt fremover i studien av autofagi under skjelettmuskleregenerering, da hovedparten av resultatene oppstår Til nå ble det laget i isolerte celler. In situ- analysen tillates for studiet av autofagi i det naturlige miljøet, uten behov for en celleisolasjon som kan påvirke metabolske prosesser, slik som autofagi.

"> På grunn av den autofagiske prosessens svært dynamiske natur er CLQ-behandlingene et kritisk skritt for å overvåke den autofagiske prosessen in vivo. CLQ blokkerer de senere stadier av autofagisk prosess, noe som fører til akkumulering av LC3 når autofagi opprettholdes. Derfor er CLQ-behandling Gjør LC3 påviselig ved in situ- undersøkelse. I uperturerte skjelettmuskler blir den basale autofagiske prosessen ikke ytterligere økt ved CLQ-behandling, som avslørt ved fravær av påvisbar LC3-akkumulering. Imidlertid akkumuleres LC3 ved regenerering av muskler ved CLQ-behandling, som demonstrerer autofag aktivering Et kritisk trinn er å ofre musene samtidig om morgenen ( dvs. klokken 10.00). Et annet kritisk trinn i protokollen er identifikasjonen av MuSC, som ikke må byttes med en annen celletype som befolker skadet muskel under Regenerativ respons. Identifikasjonen av MuSC under basal lamina som viser MyoD positivitet er kØye for å fokusere på satellittceller.

Sammendrag presenterer vi en egnet in situ- metode for å oppdage involvering av den autofagiske prosessen i MuSCs. Denne teknikken kan tjene som grunnlag for tester av farmakologiske tilnærminger til autofagmodulasjon, som kan brukes til å forbedre skjelettmuskleregenerering under normale og patologiske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT til LL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 WT mice
Cardiotoxin 1 Latoxan L8102
Millex-VV Merck Millipore SLVV033RS Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate salt Sigma-Aldrich C6628 Caution:
Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mL BD 324825
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura Finetek 25608-930
Tissue-Tek Cryomold Intermediate Sakura Finetek 4566
2-Methylbutane Sigma-Aldrich 277258
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma-Aldrich HHS32
Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110132
o-Xylene Sigma-Aldrich X1040 Caution:
Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Caution:
Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Eukitt - Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-007-003
LC3B Antibody Cell signaling Technology 2775
Monoclonal mouse anti-MyoD
(concentrated) clone 5.8A		 DAKO - Agilent Pathology Solutions M3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody Enzo Life Sciences 4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Life technologies A11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody Life technologies A21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
  2. Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
  3. Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
  4. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
  5. Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
  6. Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  7. Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
  8. Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
  9. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
  10. Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
  11. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  12. Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
  13. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  14. Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
  15. Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
  16. Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
  17. Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
  18. Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
  19. Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
  20. Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
  21. Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
  22. Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
  23. Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
  24. De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
  25. Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
  26. Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
  27. Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
  28. Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
  29. Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
  30. Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
  31. Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
  32. Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
  33. Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
  34. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
  35. Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
  36. Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
  37. Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
  38. Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
  39. Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
  40. Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
  41. Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
  42. Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
  43. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).

Tags

Cellular Biology Autophagy muskel stamceller (satellitter) muskel regenerering LC3 MYOD muskelvev seksjoner
<em>I situ</em> Immunofluorescerende farging av autophagy i muskelstamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castagnetti, F., Fiacco, E.,… More

Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter