Summary
L'autofagia attiva è associata alla rigenerazione muscolare produttiva, che è indispensabile per l'attivazione della mucosa muscolare (MuSC). Qui forniamo un protocollo per la rilevazione in situ di LC3, un marker di autofagia in MuOs MyoD positivi delle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti.
Abstract
L'aumento delle evidenze indica l'autofagia come un processo regolatorio cruciale per preservare l'omeostasi dei tessuti. È noto che l'autofagia è coinvolta nello sviluppo e nella rigenerazione muscolare dello scheletro, e il processo autofagico è stato descritto in molte patologie muscolari e nei disturbi muscolari legati all'età. Un blocco recentemente descritto del processo autofagico che è correlato con l'esaurimento funzionale delle cellule satellitari durante la riparazione muscolare supporta la nozione che l'autofagia attiva è accoppiata con la rigenerazione muscolare produttiva. Questi dati scoprono il ruolo cruciale dell'autofagia nell'attivazione delle cellule satellite durante la rigenerazione muscolare sia nelle condizioni normali che patologiche, come le distrofie muscolari. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico nel vano adulto di cellule staminali muscolari (MuSC) durante le condizioni di rigenerazione muscolare. Questo protocollo descrive la metodologia di setup per eseguire in situ immunofluorescenza imaging di LC3, un aMarcatore di utopia, e MyoD, un marcatore di linee miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il compartimento MuSC, che svolge un ruolo centrale nell'orchestrare la rigenerazione muscolare.
Introduction
La rigenerazione muscolare scheletrica è il risultato dell'interazione tra cellule staminali adulte (Cellule Muscle Satellite, MuSCs) e altri tipi di cellule che sono coinvolti nel processo rigenerativo. L'omeostasi muscolare e la funzionalità vengono mantenuti dai segnali combinati derivanti dalla nicchia muscolare e dai segnali sistemici 1 , 2 . Durante tutta la vita, sono stati segnalati cambiamenti nella funzionalità MuSC, nella nicchia muscolare e nei segnali sistemici, portando al declino delle capacità funzionali negli anziani 3 . Gli MuSC sono posizionati in una nicchia sotto la lamina basale e, dopo lesioni muscolari, vengono attivate per riparare i muscoli danneggiati 4 , 5 . Al fine di garantire una risposta produttiva rigenerativa, è fondamentale che i MuSC coordinino diversi processi necessari per l'uscita dalla quiescenza, l'autoconsapimento e la fase di espansione proliferativaDalla differenziazione myogenica 6 . Negli anziani e nelle malattie croniche muscolari, tutte queste funzioni sono compromesse, portando a alterate funzionalità muscolare 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Macroautophagy (qui di seguito chiamata autofagia) sta emergendo come un processo biologico essenziale essenziale per preservare l'omeostasi dei tessuti 14 . Il processo autofagico racchiude meccanismi di traffico, in cui parti di citoplasma, organelli e proteine vengono inglobate in vescicole che alla fine sono degradate attraverso il sentiero lisosomico, promuovendo la rimozione di molecole tossiche e il riciclaggio di macromolomolecole. Ciò fornisce composti ricchi di energia per supportare l'adattamento cellulare e tessuto sotto stress o altre condizioni avverse 15 , 16 . Insieme all'attività di sopravvivenza della cellula, l'autofagia può anche funzionare come induttore di cellule-morte, a seconda del contesto dei tessuti cellulari ( ad es. Normale rispetto al tessuto tumorale) e del tipo di stress 17 , 18 .
Recenti evidenze indicheranno che l'autofagia è necessaria per mantenere la massa muscolare e l'integrità miofibra 19 e 20 ed è stato riportato di essere alterato nelle distrofie muscolari differenti 21 , 22 , 23 , tra cui la distrofia muscolare Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 31 , 32 , 33 , 34 , 35 dopo una perdita di massa muscolare (chiamata sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , e nella sopravvivenza di myofiber 38 .
Un rapporto stretto tra l'autofagia e il potenziale rigenerativo dei muscoli scheletrici è stato anticipato da uno studio del laboratorio di Wagers, che ha dimostrato che una restrizione calorica aumenta la disponibilità e l'attività 39 di MuSC. Questo noÈ stato ulteriormente sostenuto dalla recente osservazione che l'asse Foxo3-Notch attiva il processo autofagico durante l'autocompensamento 40 e la transizione MuSC dalla quiescenza allo stato proliferante 41 . Questi dati sono d'accordo con la progressiva riduzione dell'autofagia basale da giovani a muSC vecchi e geriatriche, in associazione al declino numerico e funzionale delle mucsi durante l'invecchiamento 42 .
In un recente studio abbiamo dimostrato una stretta relazione tra l'autofagia e la rigenerazione muscolare compensativa che distingue le prime fasi della progressione del DMD. Di conseguenza, abbiamo osservato un flusso autofagico ridotto nelle fasi successive della progressione della malattia, quando si compromette la rigenerazione muscolare e si verifica la deposizione di tessuti fibrotici. Intrigante, abbiamo mostrato che, in condizioni di rigenerazione, l'autofagia è attivata in MuSCs e che la modulazione del processo autofagico impatta l'attivazione di MuSC e fuNicità 30 .
Complessivamente, questi dati evidenziano l'urgenza di esplorare il processo autofagico in MuSC durante la rigenerazione muscolare in condizioni normali e patologiche e per tutta la durata della vita. Qui forniamo un protocollo per monitorare il processo autofagico in MuSCs in condizioni di rigenerazione muscolare eseguendo in immunoterapia in situ la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3), un marker di autophagy 43 e MyoD, un marker di Lineage miogenico, nelle sezioni del tessuto muscolare da topi di controllo e feriti. La metodologia riportata consente di monitorare il processo autofagico in uno specifico compartimento cellulare, il MuSC, che svolge un ruolo chiave nell'orchestrare la rigenerazione muscolare.
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Protocol
I topi sono stati allevati e mantenuti secondo le procedure standard degli animali, e tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Assicurazione per la Protezione degli Animali e dal Comitato Etico Comunitario per la Ricerca sugli Animali secondo il Ministero della Salute italiano e hanno rispettato la Guida NIH per la cura e l'uso di Animali da laboratorio.
1. Lesioni muscolari e il blocco in vivo del flusso autofagico
- Lesioni muscolari.
- Per indurre lesioni muscolari scheletriche acute, iniettare 20 μL di 10 μM cardiotossina (CTX) direttamente nel muscolo anteriore (TA) di sinistra di tibiale anteriore di due mesi di vecchi C57BL / 6J che pesano circa 20 g. Utilizzare un numero uguale di maschi e femmine. Utilizzare l'arto contralaterale non trattato come un controllo.
NOTA: 10 μM CTX in soluzione di cloruro di sodio 0,9% deve essere filtrato (0,22 μm di filtro PVDF) e conservato a -20 ° C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. - Utilizzando un iLa siringa di nsulin con un ago da 30 G, inietta CTX nel mezzo dell'AT. Per indurre una lesione accurata nell'AT, assicurarsi che l'ago della siringa entri vicino al tendine distale, profondo da 5 mm, dal basso verso l'alto del muscolo ( figura 1A ).
- Per indurre lesioni muscolari scheletriche acute, iniettare 20 μL di 10 μM cardiotossina (CTX) direttamente nel muscolo anteriore (TA) di sinistra di tibiale anteriore di due mesi di vecchi C57BL / 6J che pesano circa 20 g. Utilizzare un numero uguale di maschi e femmine. Utilizzare l'arto contralaterale non trattato come un controllo.
- Blocco del flusso autofagico in topi non feriti e feriti.
- Per valutare il flusso autofagico, 24 h Post-Injury (pi), somministrare 50 mg / kg di clorochina (CLQ) ogni 24 ore per 4 d mediante iniezione intraperitoneale (IP) ( Figura 1B ).
- Sciogliere CLQ (10 mg / mL) in PBS 1X e filtrarlo attraverso una membrana da 0,2 μm. Pesare ogni mouse e calcolare la quantità di CLQ da iniettare.
NOTA: Preparare e utilizzare la soluzione CLQ nello stesso giorno. La riserva CLQ può essere conservata fino a un mese a -20 ° C. Poiché l'autofagia è un processo metabolico, eseguire sempre il trattamento CLQ sempre allo stesso tempo ( cioè al mattino befoOre 10.00).
- Sciogliere CLQ (10 mg / mL) in PBS 1X e filtrarlo attraverso una membrana da 0,2 μm. Pesare ogni mouse e calcolare la quantità di CLQ da iniettare.
- Per valutare il flusso autofagico, 24 h Post-Injury (pi), somministrare 50 mg / kg di clorochina (CLQ) ogni 24 ore per 4 d mediante iniezione intraperitoneale (IP) ( Figura 1B ).
2. Sezioni del tessuto muscolare
- Sacrificare il mouse.
- Eutanizzare i topi 5 giorni dopo l'infortunio.
- Effettuare l'eutanasia da dislocazione cervicale o da CO 2 (da seguire da dislocazione cervicale per conferma). Poiché il processo di autofagia è legato alle abitudini di dormire / mangiare del mouse, sacrifica sempre i topi contemporaneamente, preferibilmente alla mattina ( vale a dire prima delle 10.00).
- Isolamento e inclusione della TA.
- Prima della dissezione, spruzzare il mouse con il 70% di etanolo.
- Utilizzando forbici, fare una piccola incisione perpendicolare (3 mm di lunghezza) sulla pelle dorsale del mouse al livello dei fianchi. Tagliare la coda ei piedi per semplificare la rimozione della pelle. Tirare la pelle verso la coda e rimuoverla per esporre i muscoli sottostanti; Il muscolo TA è facile da localizzare, come mostrato nella Figura 2A
- Con l'aiuto di due pinze, afferrare i tendini distali.
- Tagli i tendini distali; I tendini TA e extensor digitorium longus (EDL) vengono spesso tagliati congiuntamente e successivamente separati (vedi punto 2.2.6).
- Usando le pinze, tenere il muscolo TA dal tendine e tirare con attenzione il muscolo verso l'estremità prossimale (vicino al ginocchio, Figura 2B ).
NOTA: A questo punto i muscoli EDL e TA sono facilmente riconoscibili, l'TA è più grande e superficiale rispetto all'EDL. - Separare l'TA dal muscolo EDL tirando i due tendini distali nelle direzioni opposte ( figura 2C ).
- Tagliare il tendine prossimale.
- Usando le pinze, rimuovere la fascia sottile che copre il muscolo, senza danneggiare il tessuto.
- Rimuovere l'umidità eccessiva nel campione con l'aiuto di un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il muscolo non sia né umido né eccessivamente asciutto, poiché l'umidità eccessiva produrrà sigDanni nocivi al muscolo e compromettono la prossima colorazione.
- Posizionare il composto ottimale di taglio (OCT) sul fondo di uno stampo e collocare il muscolo in esso, nell'orientamento mostrato nella figura 2D . Aggiungere il 100% isopentane ad un bicchiere fino a raggiungere una profondità di circa 3-4 cm. Mettere il bicchiere in contatto con l'azoto liquido in una scatola di polistirolo.
- Non lasciare che l'azoto liquido entri nel bicchiere, in quanto produrrà una schiuma bubbling, che può influenzare l'inclusione e danneggiare le sezioni muscolari.
- Osservare l'isopentane e aspettare fino a raggiungere la temperatura corretta (tra -140 ° C e -150 ° C); Alla temperatura appropriata, uno strato bianco solido di isopentano congelato si cristallizzerà sul fondo del bicchiere.
- Se l'isopentane interamente blocca il solido, sciogliere e raffreddare a temperatura di congelamento prima di procedere al passo successivo.
- Utilizzando pinze prechillate, abbassare delicatamente lo stampoL'isopentano per circa 20-30 s. Posizionare il campione congelato in un contenitore con ghiaccio secco fino a trasferirlo in un congelatore da -80 ° C.
NOTA: il protocollo può essere sospeso qui.
- Criosezioni del tessuto muscolare.
- Dopo almeno una notte a -80 ° C, eseguire la criocuzione.
- Prendere il coltello criostato e la lastra antirollio dal congelatore -20 ° C e posizionarli sui rispettivi supporti nell'armadio criostato.
- Mettere una goccia di OCT sullo stub del campione e posizionarla sul campione congelato, in orientamento verticale NS, come mostrato nella Figura 2D .
- Posizionare il tappo del campione sul mandrino.
- Senza tirare la piastra anti-roll verso il basso sul coltello, fare alcuni tagli a 40 μm per sbarazzarsi di OCT che non include muscoli. Quando il muscolo diventa visibile, ridurre lo spessore della fetta a 7-8 μm.
- Tirare verso il basso la piastra antirumbo fino a che non sia allineataIl bordo del coltello o un poco sopra di esso.
- Tagliare le sezioni trasversali 7-8 μm di spessore e montare 3-4 fette per diapositiva istologica.
NOTA: la temperatura di criostato suggerita è compresa tra -15 ° C e -23 ° C. Le sezioni trasversali dei campioni sono necessarie per la successiva analisi per individuare le cellule staminali muscolari nella posizione di nicchia satellitare. - Per massimizzare l'aderenza della sezione, tenere le diapositive a temperatura ambiente per 10-15 minuti per evitare il loro distacco durante l'incubazione degli anticorpi.
NOTA: La fase di asciugatura dell'aria potrebbe influenzare l'immunostaining, fornendo risultati ambigui. Le diapositive possono essere immagazzinate per diversi mesi a -80 ° C. Il protocollo può essere interrotto qui.
- Controllo dei danni muscolari nelle criose dei muscoli TA mediante la colorazione di Hematoxylin Eosin (H & E).
- Per valutare la qualità del muscolo ( cioè l'efficacia del danno, dell'isolamento muscolare e inclusoIone e criose), eseguire una colorazione H & E. Per ogni punto temporale sperimentale, fissare una diapositiva con 4% PFA per 10 minuti. Dopo la fissazione, lavare bene le diapositive in vari cambiamenti di 1x PBS.
NOTA: Attenzione. PFA è cancerogeno e deve essere manipolato con cura. - Prendete una diapositiva per ogni punto sperimentale e metteteli in un vaso di colorazione.
- Riempire il vaso con 9 mg / l di ematoxilina fino a quando le sezioni sono coperte e incubare per 8 min.
- Riciclare l'ematossilina.
- Lasciare il vaso sotto acqua corrente per 10 minuti per rimuovere l'eccesso di ematossilina.
NOTA: Assicurarsi di non scorrere l'acqua direttamente sulle sezioni. - Lavare con acqua sterilizzata.
- Incubare le sezioni con eosina 0,5% (w / v) in etanolo acidificato al 90% per 1 min.
- Riciclare l'eosina.
- Lavare due volte con acqua sterile per 3 minuti / lavaggio.
NOTA: eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio chimico. - Lavare le sezioni con il 70% di etanolo.
- lavaggioLe sezioni con etanolo al 90%.
- Lavare le sezioni con etanolo al 100%.
- Incubare le sezioni con 0,879 g / mL o-xilene.
NOTA: Attenzione. O-xilene è infiammabile e moderatamente tossico. Manipolarlo sotto cappuccio chimico, indossando equipaggiamento protettivo, compresi guanti, un cappotto da laboratorio e una maschera. - Riciclare l'o-xilene.
- Mettere le diapositive su un pezzo di carta per asciugare.
- Chiudere le diapositive utilizzando un supporto di montaggio a base di xilene a rapido indurimento.
- Controllare la qualità delle sezioni con un microscopio ottico a 10x ingrandimento (vedere la figura 3 )
NOTA: il protocollo può essere sospeso qui.
- Per valutare la qualità del muscolo ( cioè l'efficacia del danno, dell'isolamento muscolare e inclusoIone e criose), eseguire una colorazione H & E. Per ogni punto temporale sperimentale, fissare una diapositiva con 4% PFA per 10 minuti. Dopo la fissazione, lavare bene le diapositive in vari cambiamenti di 1x PBS.
3. Immunostaining per LC3 e MyoD nelle sezioni muscolari del tessuto muscolare
- Fissazione delle sezioni del tessuto muscolare.
- Preparare una camera di incubazione bagnando un pezzo di carta e posizionandolo sul fondo di una scatola di plastica chiusa per mantenere unDi umidità all'interno della camera. Separare le sezioni dei tessuti con 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS per 10 min.
NOTA: viene utilizzato un foglio di carta bagnato per evitare l'essiccazione del campione. Preparare PFA fresco o utilizzare PFA conservato a -20 ° C. Attenzione. PFA è tossico; La polvere deve essere manipolata con cura quando si effettua la soluzione di magazzino. Questa operazione deve essere eseguita in un cappuccio chimico, con equipaggiamento protettivo, compresi guanti, un cappotto di laboratorio e una maschera. Inoltre, quando in soluzione, il PFA deve essere manipolato con attenzione. - Rimuovere il PFA e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3 volte.
- Preparare una camera di incubazione bagnando un pezzo di carta e posizionandolo sul fondo di una scatola di plastica chiusa per mantenere unDi umidità all'interno della camera. Separare le sezioni dei tessuti con 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS per 10 min.
- Permeabilizzazione delle sezioni del tessuto muscolare.
- Disegnare una barriera idrofobica attorno alle sezioni del tessuto utilizzando una penna opaca.
NOTA: Questo passaggio definisce la superficie attorno alle sezioni del tessuto e minimizza il volume degli anticorpi descritti nei passaggi 3.4, 3.6, 3.7 e 3.9. - Coprire le sezioni con 200 μl di freddo (-20 ° C)Metanolo e mettere la camera di incubazione orizzontalmente all'interno di un congelatore a -20 ° C per 5 min.
- Rimuovere la camera di incubazione dal congelatore, aspirare il metanolo e lavare le sezioni con X PBS per 5-7 minuti a RT; Ripetere questo passaggio 3x.
- Disegnare una barriera idrofobica attorno alle sezioni del tessuto utilizzando una penna opaca.
- Blocco
- Preparare una soluzione di blocco fresco del 4% di albumina serica bovina (BSA) in PBS 1x.
NOTA: la soluzione BSA può essere conservata per una settimana a 4 ° C. - Incubare le sezioni con soluzione di blocco per almeno 60 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione di blocco.
- Preparare 100 μL di miscela anti-Fab diluendo 20 μg / mL anti-Fab in 1x PBS. Incubare le sezioni con un frammento F (ab) di IgM anti-mouse purificato affinità per 1 ora a RT.
- Preparare una soluzione di blocco fresco del 4% di albumina serica bovina (BSA) in PBS 1x.
- Incubazione primaria dell'anticorpo.
- Preparare 100 μL di miscela anticorpale primaria per ciascuna diapositiva sciogliendo gli anticorpi LC3 e MyoD nel 4% di BSA in 1x PBS. Utilizzare 5 μg /Ml di anti-LC3 (anticorpo policlonale coniglio) e 10 mg / L di anti-MyoD (anticorpo monoclonale del mouse). Incubare la miscela anticorpale primaria a notte a 4 ° C.
- Lavaggi.
- Rimuovere il mix di anticorpi primario.
- Lavare le sezioni con 1% BSA in 1X PBS per 10 min; Ripetere questo passaggio 3x.
- Incubazione secondaria anticorpale.
- Preparare 100 μL di miscela anticorpale secondaria per ogni diapositiva. Sciogliere l'anti-coniglio caprino 488 (5 μg / mL) e l'anti-topo di capra 594 (5 μg / mL) in 4% BSA in 1x PBS.
NOTA: Evitare un'eccessiva esposizione alla luce per evitare lo sbiancamento fluorochrome. Eseguire le seguenti operazioni al buio. - Incubare le sezioni con il miscuglio secondario anticorpale per 45 minuti a RT.
- Rimuovere il miscuglio secondario anticorpale e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x.
- Preparare 100 μL di miscela anticorpale secondaria per ogni diapositiva. Sciogliere l'anti-coniglio caprino 488 (5 μg / mL) e l'anti-topo di capra 594 (5 μg / mL) in 4% BSA in 1x PBS.
- Incubazione primaria dell'anticorpo.
- Diluire le laminiN-2 (α-2-chain) anticorpo monoclonale (0,33 μg / mL) in 4% BSA in 1x PBS utilizzando 100 μL di miscela per ogni diapositiva. Incubare le sezioni nel mix di anticorpi primario per 1-2 h a RT.
- Lavaggi.
- Rimuovere il mix di anticorpi primario.
- Lavare le sezioni con 1% BSA in 1X PBS per 10 min; Ripetere questo passaggio 3x.
- Incubazione secondaria anticorpale.
- Preparare 100 μL di miscela anticorpale secondaria per ogni diapositiva diluendo 647 (5 μg / mL) di capra anti-rat 64% in BSA in 1X PBS. Incubare le sezioni in miscela anticorpale secondaria per 45 minuti a RT.
- Rimuovere il miscuglio secondario anticorpale e lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x.
- 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
- Aggiungere 200 μL di 300 nM DAPI soluzione in 1x PBS a ciascuna diapositiva. Incubare per 5 minuti a RT. Conservare la soluzione DAPI a 4 ° C nelbuio.
- Lavare le sezioni con 1x PBS per 5-7 min; Ripetere questo passaggio 3x.
- Montaggio delle sezioni muscolari macchiate.
- Rimuovere l'eccesso di soluzione di lavaggio dalle sezioni.
- Posizionare 10 μL di glicerolo in 1x PBS (3: 1) sulle sezioni macchiate in mezzo alla diapositiva e aggiungere una copertura, evitando la formazione di bolle d'aria.
4. Acquisizione microscopica confocale
- Acquisite le immagini usando un microscopio confocale a quattro laser integrato con un sistema di acquisizione di immagini e software analitico.
NOTA: MyoD è coniugato con un colorante 594 che è un colorante rosso-fluorescente luminoso, con eccitazione ideale per il laser a 594 nm (eccitazione: 590 nm, emissione: 617 nm). LC3 è coniugato con un colorante 488 che è un colorante verde-fluorescente brillante, con eccitazione idealmente adatta alla linea laser 488 nm (eccitazione: 495 nm, emissione: 519 nm). Laminina è coniugata con un colorante 647 che èUn colorante fluorescente a grana lunga e luminosa, con eccitazione ideali per la linea laser a 647 nm (eccitazione: 650 nm, emissione: 668 nm). - Posizionare le diapositive nel vassoio del microscopio e utilizzare l'ingrandimento 63X per rilevare i segnali nucleari. Attenersi a metodi di rigenerazione centrando i campi della rigenerazione attiva, basandosi sulla morfologia muscolare (vedere la figura 4 ).
NOTA: Mentre in muscoli imperturbabili, la dimensione del miofibra è praticamente costante ( Figura 4A ), la rigenerazione muscolare mediata da lesioni può essere riconosciuta dalla comparsa di miofibri più piccoli, che sono le fibre appena formate dopo la rigenerazione. Inoltre, il muscolo in rigenerazione attiva è caratterizzato da un ampio infiltrato fatto di macrofagi, precursori fibro-adipogenici e cellule localizzate ai muscoli danneggiati per orchestrare la rigenerazione muscolare ( Figura 4B ). - Valutare la colorazione immunofluorescenza in regenAree focalizzandosi su MuSC che si trovano sotto la lamina basale delle miofibere.
- Focus su MuSCs positivi per la colorazione MyoD e posizionati all'interno di miopi contrassegnati dalla colorazione laminina (vedi figura 4B , frecce bianche).
- Utilizzare almeno 3 topi / gruppo sperimentale e utilizzare il microscopio per acquisire immagini di ingrandimento 63X di almeno 7 campi per ogni gruppo sperimentale.
- Una volta individuate le aree rigenerative, concentrarsi utilizzando la colorazione DAPI e quindi regolare gli altri singoli canali.
- Utilizzare le seguenti impostazioni del microscopio: Canale A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, guadagno 791; Canale A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, guadagno 659; Canale A647 Pinhole 1.4 Aerea, guadagno 719.
- Dopo aver regolato la messa a fuoco dei singoli canali, procedere per acquisire le immagini con una dimensione di fotogramma di 1.024 x 1.024 e un dimensione di pixel di 12.61 μs.
- Conte la percentuale di cellule MyoD positive (controllo per tPosizione corretta sotto la lamina) che sono LC3-negativi e la percentuale di cellule MyoD-positive che visualizzano un segnale LC3.
NOTA: la percentuale di cellule MyoD-positive che presentano la colorazione LC3 è la lettura di questo protocollo.
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Representative Results
Questo protocollo descrive un metodo efficace in situ per rilevare l'autofagia in MuSC durante la rigenerazione muscolare.
CTX trattamenti in vivo :
Utilizzare CTX per indurre danni muscolari nei muscoli TA e utilizzare i muscoli non protetti come controlli. Poiché l'autofagia è altamente dinamico, bloccare il flusso autofagico eseguendo iniezioni IP di CLQ ( Figura 1 ). Il trattamento CLQ è essenziale per valutare se il flusso autofagico è attivo o è mantenuto a livelli basali.
Tibialis Isolamento anteriore:
Isolare il muscolo TA, come descritto in Figura 2 , e collocarlo in una camera di stampo in orientamento NS per ottenere successivamente le sezioni trasversali del tessuto muscolare. Questo passoÈ fondamentale per ottenere le sezioni e per identificare i MuSC nella posizione corretta sotto la lamina basale di miofibra.
Esame istologico del danno muscolare indotto da CTX
Verificare che la lesione muscolare si è verificata eseguendo macchie istologiche. Effettuare la colorazione H & E e controllare l'ingrandimento sotto 10X: mentre i muscoli imperturbati visualizzano dimensioni generalmente invariabili del miofibra, le caratteristiche tipiche dei muscoli danneggiati includono la rottura delle miopi che hanno dimensioni diverse e abbondanti infiltrazioni infiammatorie. Un altro parametro per confermare che il processo rigenerativo sta avvenendo è la nucleazione nucleare delle miofibere, che è assente nei muscoli imperturbabili ed è un segno della formazione di nuove fibre in topi sottoposti a rigenerazione attiva ( Figura 3 ).
L'autofagia è accoppiata a MyoD-poCellule sessuali durante la rigenerazione muscolare:
Eseguire la colorazione immunofluorescenti per rilevare gli MuSC, identificati come MyoD-positivi, che presentano un segnale LC3. La colorazione di Laminin è utile per individuare i MuSCs nella posizione corretta nella nicchia sotto la lamina basale ( Figura 4 ). I livelli basali autofagici distinguono i muscoli scheletrici non disturbati e aumentano significativamente in coincidenza con la rigenerazione muscolare 30 . Di conseguenza, i topi maligni non mostrano alcuna attivazione di MuSC, rilevata dall'assenza di cellule MyoD-positive e nessun segnale LC3. Al contrario, a causa dei danni muscolari, i muoidi MyoD positivi diventano positivi per LC3, dimostrando che il processo autofagico è attivato durante la rigenerazione muscolare in cellule satellitari attivate.
Durante le fasi iniziali della risposta rigenerativa, diversi tipi cellulari localizzano sul sito di tLesione, comprese le cellule infiammatorie ei precursori fibro-adipogenici, rendendo la zona danneggiata densamente sovraffollata. È fondamentale distinguere tra tutti i diversi tipi cellulari, concentrandosi sulla posizione MuSC sotto la lamina di miofiffi e basandosi su positività MyoD.
Nelle condizioni basali, LC3 è espresso in modo omnicomprensivo ed è appena individuato mediante immunofluorescenza. A seguito di elevata autofagia, questo pattern di colorazione cambia e diventa rilevabile principalmente nel citoplasma. Durante la valutazione della colorazione MyoD / LC3, considerare che i MuSC sono piccole cellule e che la regione citoplasmatica è limitata; Questo perché LC3 può sembrare perinucleare.
Figura 1: Trattamenti CTX In Vivo . ( A ) Per indurre danni muscolari, iniettare 10 μL di 10 μM CTX direcNei muscoli di sinistra TA di topi WT di 2 mesi. Utilizzare l'arto contralaterale come un controllo. ( B ) Rappresentazione schematica del danno muscolare indotto da cardiotossina. 24 h post-lesioni, trattare i topi con iniezioni intraperitoneali di 50 mg / kg CLQ ogni 24 ore per 4 giorni e poi sacrificare gli animali. Usa i topi non trattati e non feriti come controlli. Questo protocollo consente lo studio del coinvolgimento del processo autofagico durante la rigenerazione muscolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento TA. ( A ) Immagine rappresentativa dell'AT come sembra prima dell'isolamento. ( B ) Dopo aver tagliato il tendine distale, tenere il muscolo TA dal tendine e attentoTirare il muscolo verso l'alto verso l'estremità prossimale (vicino al ginocchio). ( C ) Discriminare l'EDL dal muscolo TA, che è più grande e superficiale del EDL. Separare l'TA dal muscolo EDL tirando i due tendini distali in direzioni opposte. ( D ) Una volta che il TA è isolato, posizionarlo nella camera di stampo, come descritto, nell'orientamento NS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: CTX induce danni muscolari. Le immagini rappresentative della colorazione H & E sulle sezioni trasversali del tessuto TA da topi di controllo, non murato ( A ) e 5 d pi ( B ) WT. La colorazione H & E rivela la morfologia normale della fibra nei topi di controllo ( A ) e massivE danni muscolari e infiltrarsi nei muscoli feriti ( B ), dimostrando una morfologia compromessa all'iniezione CTX. Barra di scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'autofagia è accoppiata a cellule positive MyoD durante la rigenerazione muscolare. Le immagini rappresentative delle sezioni di TA dai topi di controllo ( A ) e feriti ( B ) WT immunociti con LC3 (verde) e MyoD (rosso). Le macchie di Laminin (ciano) marcano le fibre muscolari ei nuclei vengono contratti con DAPI (bianco). I pannelli a destra mostrano immagini rappresentative del segnale di fusione. Le frecce bianche indicano le cellule satellitari che si trovano sotto la lamina basale della fibra contrassegnata dalla colorazione laminina. I followiNg permette di misurare l'autofagia attraverso la colorazione LC3 nelle cellule staminali muscolari sottoposte a lineage miogenico, contrassegnate da MyoD. Barra di scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive come monitorare l'autofagia nelle cellule staminali muscolari scheletriche durante la rigenerazione muscolare compensatoria. Diversi anticorpi per la co-colorazione di LC3 e MyoD sono stati testati e quelli che lavorano nelle sezioni dei tessuti del mouse e creano risultati efficaci sono elencati qui (vedi tabella dei materiali ). La permeabilizzazione con metanolo (vedere la fase 3.2.2) è altamente raccomandata per una corretta colorazione.
La limitazione di questo protocollo è legata alla variabilità intrinseca dei topi, che costringe l'uso di almeno 3 topi / gruppo sperimentale. Questa metodologia riflette un passo avanti nello studio dell'autofagia durante la rigenerazione muscolare scheletrica, in quanto la maggior parte dei risultati Adesso sono state fatte in cellule isolate. L'analisi in situ ha consentito lo studio dell'autofagia nell'ambiente naturale, senza la necessità di un isolamento cellulare che potrebbe influire sui processi metabolici, come l'autofagia.
"> Considerata la natura altamente dinamica del processo autofagico, i trattamenti CLQ rappresentano un passo fondamentale per il monitoraggio del processo autofagico in vivo. CLQ blocca le fasi successive del processo autofagico, portando all'accumulo di LC3 quando l'autofagia è sostenuta. Rende il LC3 rilevabile in esame in situ . Nei muscoli scheletrici non trattati, il trattamento basale dell'autofagia non viene ulteriormente aumentato con il trattamento CLQ, come dimostrato dall'assenza di accumulo LC3 rilevabile. Tuttavia, nel rigenerare i muscoli, LC3 si accumula sul trattamento CLQ, dimostrando l'attivazione autofagica Un passo critico è quello di sacrificare i topi allo stesso tempo al mattino ( cioè alle 10 del mattino). Un altro passo critico nel protocollo è l'identificazione di MuSC, che non deve essere intercettato con un altro tipo cellulare che popola i muscoli danneggiati durante il L'identificazione di MuSC sotto la lamina basale che mostra la positività MyoD è il kEy per concentrarsi sulle celle satellitari.In sintesi, presentiamo un metodo in situ appropriato per rilevare il coinvolgimento del processo autofagico in MuSCs. Questa tecnica può servire da base per i test di approcci farmacologici alla modulazione dell'autofagia, che potrebbero essere utilizzati per migliorare la rigenerazione muscolare scheletrica in condizioni normali e patologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
References
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
