Summary
Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü.
Abstract
Artan kanıtlar, doku homeostazını korumak için önemli bir düzenleyici süreç olarak otofajiye işaret ediyor. Otofajinin iskelet kası gelişiminde ve yenilenmesinde rol aldığı bilinmektedir ve otofajik süreç birkaç kas patolojisinde ve yaşla ilgili kas bozukluklarında tanımlanmıştır. Otofajik işlemin kısa bir süre önce açıklanan, kas onarımında uydu hücrelerinin işlevsel tükenişiyle ilişkili olan bloğu, aktif otofajinin üretken kas rejenerasyonu ile birleştiğini desteklemektedir. Bu veriler, kas distrofileri gibi hem normal hem de patolojik koşullarda kas rejenerasyonu sırasında uydu hücresinin aktivasyonunda otofajinin önemli rolünü ortaya çıkarmaktadır. Burada, kas rejeneratif koşulları sırasında yetişkin Kas Hücresi (MuSC) bölmesindeki otofajik süreci izlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol LC3'ün in situ immünofloresans görüntülemesini gerçekleştirmek için kurulum metodolojisini açıklamaktadır.Utofagy markeri ve MyoD, miyojenik soy işaretleyicisini, kontrol ve hasar gören farelerdeki kas dokusu kesitleri içinde göstermektedir. Bildirilen metodoloji, kas rejenerasyonunun düzenlenmesinde merkezi bir rol oynayan bir özel hücre bölmesindeki MuSC bölmesindeki otofajik prosedürün izlenmesine izin verir.
Introduction
İskelet kası rejenerasyonu, yetişkin kök hücreler (Kas Uydu Hücreleri, MuSCs) ve rejeneratif süreçte yer alan diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimin bir sonucudur. Kasların homeostazı ve işlevselliği, kas nişinden ve sistemik ipuçlarından 1 , 2 oluşan kombine sinyaller tarafından sağlanır. Yaşam boyu MuSC işlevselliği, kas nişindeki değişiklikler ve sistemik ipuçları bildirildi ve yaşlılarda fonksiyonel kapasitelerin azalmasına neden oldu3. MuSC'ler bazal tabakanın altında bir niş halinde bulunur ve kas hasarına bağlı olarak hasar görmüş kasları onarmak için harekete geçirilir 4 , 5 . Üretken bir rejeneratif tepki sağlamak için, MuSC'lerin sessizliğe, kendi kendini yenilemeye ve proliferatif genişleme aşaması için gerekli olan farklı süreçleri koordine etmeleri çok önemlidirMiyojenik farklılaşma ile 6 . Yaşlılarda ve kas kronik hastalıklarında, bu işlevlerin tümüyle tehlikeye girer ve kas işlevlerinde değişikliklere yol açar 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
Macroautophagy (bundan böyle otofaji olarak anılacaktır), doku homeostazını korumak için hayati bir biyolojik süreç olarak ortaya çıkmaktadır14. Otofajik süreç, sitoplazmanın, organellerin ve proteinlerin kısımlarının sonunda lizozom yolu ile bozunduğu toksik moleküllerin çıkarılmasını ve makromolefin geri dönüşümünü teşvik eden kaçakçılık mekanizmalarını kapsarcules. Bu, stres veya diğer olumsuz koşullar altında hücre ve doku adaptasyonunu desteklemek için enerji açısından zengin bileşikler sağlar 15 , 16 . Otofajy, hücre sağkalımı aktivitesi ile birlikte, hücre dokusu bağlamına ( örn. Kanser dokusuna karşı normal) ve stres uyarımının tipine ( 17 , 18 ) bağlı olarak bir hücre ölüm indüksiyonu olarak da çalışabilir.
Yeni kanıtlar, kas kütlesi ve miyofiber bütünlüğünü korumak için otofajinin gerekli olduğunu göstermektedir 19,20 ve Duchenne Musküler Distrofi (DMD) dahil olmak üzere farklı kas distrofileri 21 , 22 , 23'de bozulmuş olduğu bildirilmiştir 24 , 25 , 26 , 27 32 , 33 , 34 , 35 yaşlarında yaşlılarda otofajik progresifin ilerleyici bir azalması gözlemlenmiştir ( 32 , 33 , 34 , 35 ) , 35 , 36 , 37 ve myofiber sağkalımda 38 .
Otofaji ile iskelet kasının rejeneratif potansiyeli arasındaki yakın ilişki Wagers laboratuarında yapılan bir çalışmada öngörüldü ve kalori kısıtlamasının MuSC'nin kullanılabilirliğini ve aktivitesini arttırdığını gösterdi 39 . Bu hayırFoxo3-Notch ekseni, kendi kendine yenileme 40 sırasında otofajik işlemi aktive etti ve MuSC geçişi durdurma durumundan prolifere hale getirme durumuna geçtiğine dair son gözlem tarafından desteklendi 41 . Bu veriler, genç yaşlı ve geriatrik MuSC'lere bazal otofajinin kademeli olarak azaltılması ve 42 yaşındaki MUHS'lerin sayısal ve fonksiyonel düşüşüyle birlikte kabul edilmektedir.
Yeni bir makalede, otofaji ile DMD progresyonunun erken safhalarını ayıran telafi edici kas rejenerasyonu arasında yakın bir ilişki olduğunu gösterdik. Buna göre, kas yenilenmesinden ödün verildiğinde ve fibrotik doku birikimi oluştuğunda, hastalığın ilerlemesinin ilerleyen aşamalarında azaltılmış otofajik akı bulduk. İlginçtir ki, yenilenen koşullarda otofajinin MuSC'lerde aktive edildiğini ve otofajik süreci modüle etmenin MuSC aktivasyonunu ve fu'yu etkilediğini gösterdikNasyonellik 30 .
Tamamı, bu veriler normal ve patolojik koşullarda ve ömrü boyunca kas yenilenmesi sırasında MuSC'lerde otofajik süreci araştırmanın aciliyetini vurguluyor. Burada, kas yenileme koşullarında MuSC'lerde otofajik işlemi izleyen bir protokol, otofajinin 43'ü olan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) ve MyoD'nin bir markörü olan in situ immün boyama işlemi gerçekleştirerek Miyogenik soy, kontrol ve yaralı farelerin kas dokusu bölümlerinde. Bildirilen metodoloji, kas rejenerasyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan MuSC adlı belirli bir hücre bölmesindeki otofajik sürecin izlenmesine izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler, standart hayvan tesisi prosedürlerine göre yetiştirildi ve muhafaza edildi ve tüm deney protokolleri, Hayvan Refahı Güvencesi ve İtalyan Sağlık Bakanlığı'na göre dahili Hayvan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı ve NIH'nin Bakım ve Kullanım Kılavuzu'na Laboratuar hayvanları.
1. Otofajik Flux'ın Kası Yaralanması ve In Vivo Blokları
- Kas yaralanması.
- Akut iskelet kası hasarını uyandırmak için yaklaşık 20 g ağırlığındaki 2 aylık C57BL / 6J farelerin sol tibialis anterior (TA) kas içine 20 uL 10 uM kardiyotoksin (CTX) stoğu enjekte edin. Eş sayıda erkek ve kadın kullanın. Hareketsiz kontralateral kolu bir kontrol olarak kullanın.
NOT:% 0.9 sodyum klorür çözeltisi içinde 10 uM CTX süzülmeli (0.22 μm PVDF filtre) ve -20 ° C'de saklanmalıdır. Dondurma-çözme döngülerini tekrar tekrar kullanmaktan kaçının. - Bir i kullanma30 G'lik bir iğne ile nsulin şırınga, TA'nın ortasına CTX enjekte edin. TA'da doğru bir yaralanmaya neden olmak için, şırınganın iğnesinin, kasın altından üstüne doğru 5 mm derinliğinde tendonun yakınına girdiğinden emin olun ( Şekil 1A ).
- Akut iskelet kası hasarını uyandırmak için yaklaşık 20 g ağırlığındaki 2 aylık C57BL / 6J farelerin sol tibialis anterior (TA) kas içine 20 uL 10 uM kardiyotoksin (CTX) stoğu enjekte edin. Eş sayıda erkek ve kadın kullanın. Hareketsiz kontralateral kolu bir kontrol olarak kullanın.
- Pertürbantsız ve yaralı farelerde otofajik akının tıkanması.
- Otofajik akı, 24 saat Yaralanma Sonrası (pi) değerlendirmek için intraperitoneal (IP) enjeksiyonla 24 saatte bir 50 mg / kg klorokin (CLQ) uygulayın ( Şekil 1B ).
- CLQ'yu (10 mg / mL) PBS 1X içinde eritin ve 0.2 um'lik bir membran boyunca filtreleyin. Her fareyi tartın ve enjekte edilecek CLQ miktarını hesaplayın.
NOT: Aynı gün CLQ çözümünü hazırlayın ve kullanın. CLQ stoğu -20 ° C'de bir aya kadar saklanabilir. Otofaji metabolik bir süreç olduğundan, daima aynı anda ( örn . Sabah befo) CLQ tedavisini uygulayınSaat 10:00).
- CLQ'yu (10 mg / mL) PBS 1X içinde eritin ve 0.2 um'lik bir membran boyunca filtreleyin. Her fareyi tartın ve enjekte edilecek CLQ miktarını hesaplayın.
- Otofajik akı, 24 saat Yaralanma Sonrası (pi) değerlendirmek için intraperitoneal (IP) enjeksiyonla 24 saatte bir 50 mg / kg klorokin (CLQ) uygulayın ( Şekil 1B ).
2. Kas Doku Bölümleri
- Fare feda et.
- Yaralanmadan 5 gün sonra fareleri euthanize edin.
- Servikal dislokasyon veya CO 2 ile ötanazi uygulayın (onay için servikal çıkığı takip edin). Otofaji işlemi fare uykusu / beslenme alışkanlıklarıyla ilişkili olduğu için, fareleri daima tercihen aynı sabah, tercihen sabah 10: 00'dan önce feda edin.
- TA izolasyonu ve kapsama.
- Diseksiyontan önce, fare içine% 70 etanol püskürtün.
- Makas kullanmak, farenin dorsal cildi üzerinde kalçalarda küçük, dikey bir kesi (3 mm uzunluğunda) yapar. Cildin alınmasını basitleştirmek için kuyruğu ve ayakları kesin. Deriyi kuyruğa doğru çekin ve alttaki kasları açığa çıkartmak için çıkarın; Şekil 2A'da gösterildiği gibi, TA kasının lokalize edilmesi kolaydır
- İki forseps yardımıyla distal tendonları tutun.
- Distal tendonları kesin; TA ve ekstansör digitorium longus (EDL) tendonları sıklıkla birlikte kesilir ve daha sonra ayrılır (bkz. Adım 2.2.6).
- Forseps kullanarak TA kasını tendonla tutun ve kası proksimal uca doğru dikkatle çekin ( Şekil 2B ).
NOT: Bu noktada, EDL ve TA kasları kolayca tanınabilir; TA, EDL'den daha büyük ve yüzeyseltir. - İki distal tendonu ters yönde çekerek TA'yi EDL kasından ayırın ( Şekil 2C ).
- Proksimal tendonu kesin.
- Forseps kullanarak, dokuyu hasar görmeden kasları örten ince baş başparmağını kaldırın.
- Kağıt havlu yardımı ile numunedeki aşırı nemi giderin. Aşırı nemin sig'i üreteceğinden kasın ne ıslak ne de aşırı kuru olduğundan emin olun.Kaslara önemli miktarda hasar verir ve sonraki boyayı tehlikeye atar.
- Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiğini bir kalıbın altına yerleştirin ve kası Şekil 2D'de gösterilen oryantasyona yerleştirin. Yaklaşık 3-4 cm'lik bir derinliğe ulaşana kadar bir behere% 100 izopentan ilave edin. Bir polistren kutusunda beher likit azot ile temas halinde yerleştirin.
- Sıvı azottan behere girmesine izin vermeyin, çünkü bu kabarcık köpük üreterek içerikleri etkileyebilir ve kas bölümlerine zarar verebilir.
- Izopentana dikkat edin ve uygun sıcaklığa ulaşana kadar bekleyin (-140 ° C ile -150 ° C arasında); Uygun sıcaklıkta, donmuş izopentan katı beyaz bir tabaka, beherin altında kristalleşecektir.
- İzopentan tamamen katılaşırsa eritin ve bir sonraki adıma geçmeden önce soğutucu sıcaklığa soğutun.
- Önceden soğutulmuş forseps kullanarak, kalıbı dikkatli bir şekildeIzopentan yaklaşık 20-30 s. Dondurulmuş numuneyi, -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarılıncaya kadar kuru buzlu bir kaba yerleştirin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- Kas dokusu kriyoseksiyonları.
- -80 ° C'de en az bir gece sonra, kriyoterapi uygulayın.
- Kriyostat bıçağını ve anti-roll plakasını -20 ° C'lik dondurucudan çıkarıp kriyostat kabinindeki ilgili desteklerin üzerine koyun.
- Şekil 2D'de görüldüğü gibi, örnek saplama üzerine bir damla OCT koyun ve üzerine dikey NS yönünde dondurulmuş örneği yerleştirin.
- Numuneyi saplamanın üzerine yerleştirin.
- Rulo önleyici plakayı bıçak üzerine çekmeden kas dahil olmayan OCT'den kurtulmak için 40 μm'de kesimler yapın. Kas görünür hale geldiğinde, dilim kalınlığını 7-8 μm'ye düşürün.
- Rulo önleyici plakayı,Bıçağın kenarından veya biraz üstünden.
- Enine kesitleri 7-8 μm kalınlığında kesin ve histolojik slayt başına 3-4 dilim yerleştirin.
NOT: Önerilen kriyostat sıcaklığı -15 ° C ile -23 ° C arasındadır. Numunelerin kesitleri, kas kök hücrelerini uydu niş pozisyonunda tespit etmek için müteakip analiz için gereklidir. - Bölümün yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için, antikor inkübasyonu sırasında ayrılmalarını önlemek için slaytları oda sıcaklığında 10-15 dakika tutun.
NOT: Hava ile kurutma basamağı, belirsiz sonuç veren immün boyayı etkileyebilir. Slaytlar aylarca sabit olarak -80 ° C'de saklanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.
- Hematoksilin Eozin (H & E) boyama yaparak TA kaslarının kriyoseksiyonlarında kas hasarını kontrol etme.
- Kasın kalitesini değerlendirmek ( yani yaralanmanın etkinliği, kas izolasyonu ve inklusu)Iyon ve cryosections), bir H & E boyama yapın. Her deney zamanı için bir slaydı 10 dakika% 4 PFA ile düzeltin. Fiksasyondan sonra, slaytları bir kaç PBS değişiklikleri ile iyice yıkayın.
NOT: Dikkat. PFA kanserojendir ve dikkatli kullanılmalıdır. - Her deney noktası için bir slayt alın ve bir boyama kavanozuna koyun.
- Bölümler kaplanana kadar kavanozu 9 g / L hematoksilen ile doldurun ve 8 dakika inkübe edin.
- Hematoksilini geri dönüştürün.
- Hematoksilen fazlalığını gidermek için kavanozu akan suyun altında 10 dakika bırakın.
NOT: Suları direkt olarak bölümlere akmamaya dikkat edin. - Steril su kullanarak yıkayın.
- Kesitleri 1 dakika süreyle asitlendirilmiş% 90 etanol içindeki eozin ile% 0.5 (w / v) inkübe edin.
- Eozini geri dönüştürün.
- 3 dk / yıkama için steril su ile iki kez yıkayın.
NOT: Aşağıdaki basamakları kimyasal bir kaputta gerçekleştirin. - Kesitleri% 70 etanol ile yıkayın.
- Yıkama% 90 etanol içeren bölümler.
- Kesitleri% 100 etanol ile yıkayın.
- Kesitleri 0.879 g / mL o-Ksilen ile inkübe edin.
NOT: Dikkat. O-Xylene yanıcı ve orta derecede toksiktir. Kimyasal kaputun altına, eldivenler, laboratuar önlüğü ve maske de dahil olmak üzere koruyucu ekipmanlar giyerek onları değiştirin. - O-Ksileni geri dönüştürün.
- Slaytları kurutmak için bir kağıt parçası üzerine koyun.
- Hızlı sertleşen, ksilen bazlı montaj ortamı kullanarak slaytları kapatın.
- Bölümlerin kalitesini 10X büyütmede optik mikroskop altında kontrol edin (bkz. Şekil 3 )
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- Kasın kalitesini değerlendirmek ( yani yaralanmanın etkinliği, kas izolasyonu ve inklusu)Iyon ve cryosections), bir H & E boyama yapın. Her deney zamanı için bir slaydı 10 dakika% 4 PFA ile düzeltin. Fiksasyondan sonra, slaytları bir kaç PBS değişiklikleri ile iyice yıkayın.
3. Hasar Görmüş Kas Dokusu Bölümlerinde LC3 ve MyoD için İmmünizasyon
- Kas doku kesitlerinin fiksasyonu.
- Bir kağıt parçasını ıslatarak ve kapatılabilir bir plastik kutusunun altına koyarak yüksek inklüzyon korumak için bir kuluçka haznesi hazırlayın.Oda içinde neme karşı. 10 dakika boyunca 1x PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile doku bölümleri düzeltin.
NOT: Numunenin kurutulmasını önlemek için ıslak bir kağıt parçası kullanılır. Yeni PFA hazırlayın veya -20 ° C'de saklanan PFA kullanın. Dikkat. PFA toksiktir; Stok çözeltisi yapılırken tozun özenle ele alınması gerekir. Bu işlem, eldiven, laboratuar önlüğü ve maske de dahil olmak üzere koruyucu bir ekipmanla kimyasal bir kaputta yapılmalıdır. Ayrıca, çözüldüğünde, PFA dikkatle manipüle edilmelidir. - PFA çıkarın ve 5-7 dakika için bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Bir kağıt parçasını ıslatarak ve kapatılabilir bir plastik kutusunun altına koyarak yüksek inklüzyon korumak için bir kuluçka haznesi hazırlayın.Oda içinde neme karşı. 10 dakika boyunca 1x PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile doku bölümleri düzeltin.
- Kas doku kesitlerinin geçirgenleştirilmesi.
- Bir kalem kullanarak doku bölümlerinin çevresine bir hidrofobik bariyer çizin.
NOT: Bu adım, doku kesitlerinin çevresini tanımlar ve adım 3.4, 3.6, 3.7 ve 3.9'da açıklanan antikor hacmini en aza indirir. - Bölümleri 200 μL soğuk (-20 ° C)Metanol ile inkübe edin ve kuluçka odasını yatay olarak 5 dakika için -20 ° C'de bir dondurucuya koyun.
- Dondurucudan kuluçka bölmesini çıkartın, metanolü aspire edin ve bölümleri oda sıcaklığında 5-7 dakika boyunca 1X PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Bir kalem kullanarak doku bölümlerinin çevresine bir hidrofobik bariyer çizin.
- bloke etme
- PBS 1x içinde% 4 Sığır Serum Albüminin (BSA) taze bir blok solüsyonu hazırlayın.
NOT: BSA çözeltisi 1 ° C'de 4 ° C'de saklanabilir. - Bölümleri oda sıcaklığında en az 60 dakika blok çözeltisi ile inkübe edin.
- Bloke edici çözeltiyi çıkarın.
- 1x PBS'de 20 μg / mL anti-Fabrika seyrelterek 100 μL anti-Fab karışımı hazırlayın. Bölümleri RT'de 1 saat boyunca anti-fare IgG'sinin birleştirilmiş konformasyonlu afinite ile saflaştırılmış F (ab) parçası ile inkübe edin.
- PBS 1x içinde% 4 Sığır Serum Albüminin (BSA) taze bir blok solüsyonu hazırlayın.
- Birincil antikor kuluçka.
- 1x PBS'de% 4 BSA içinde LC3 ve MyoD antikorlarını eriterek her slayt için birincil antikor karışımı 100 mcL hazırlayın. 5 μg /ML anti-LC3 (tavşan poliklonal antikoru) ve 10 mg / L anti-MyoD (fare monoklonal antikoru). Primer antikor karışımını gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Yıkar.
- Primer antikor karışımını çıkarın.
- 10 dakika boyunca 1X PBS'de% 1 BSA ile bölümleri yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- İkincil antikor inkübasyonu.
- Her bir slayt için 100 uL ikincil antikor karışımı hazırlayın. 1x PBS içinde% 4 BSA içinde keçi anti-tavşan 488 (5 μg / mL) ve keçi anti-fare 594 (5 μg / mL) çözün.
NOT: Florokrom ağartmayı önlemek için ışığa aşırı maruz bırakmaktan kaçının. Karanlıkta aşağıdaki adımları uygulayın. - Bölümleri ikincil antikor karışımı ile oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
- İkincil antikor karışımı çıkarın ve 5-7 dakika boyunca bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Her bir slayt için 100 uL ikincil antikor karışımı hazırlayın. 1x PBS içinde% 4 BSA içinde keçi anti-tavşan 488 (5 μg / mL) ve keçi anti-fare 594 (5 μg / mL) çözün.
- Birincil antikor kuluçka.
- Lamini inceltinHer bir slayt için 100 uL karışım kullanılarak 1x PBS içinde% 4 BSA içerisinde n-2 (a-2-zincir) monoklonal antikor (0.33 ug / mL). Birinci antikor karışımı içindeki bölümleri oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
- Yıkar.
- Primer antikor karışımını çıkarın.
- 10 dakika boyunca 1X PBS'de% 1 BSA ile bölümleri yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- İkincil antikor inkübasyonu.
- 1X PBS'de% 4 BSA içinde keçi anti-sıçan 647 (5 μg / mL) seyrelterek her slayt için 100 uL ikincil antikor karışımı hazırlayın. Kısımları sekonder antikor karışımı içerisinde oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
- İkincil antikor karışımı çıkarın ve 5-7 dakika boyunca bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kuluçka.
- Her bir slayda 1x PBS'de 200 nL DAPI çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. DAPI özümünü 4 ° C deKaranlık.
- 5-7 dakika boyunca bölümleri 1x PBS ile yıkayın; Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Montaj lekeli kas parçaları.
- Fazla yıkama solüsyonunu bölümlerden çıkarın.
- Slayt ortasında lekeli bölümlerde 1x PBS (3: 1) gliserol 10 mcL yerleştirin ve hava kabarcıkları oluşumunu önlemek, bir lamel eklemek.
4. Konfokal Mikroskopi Edinimi
- Görüntü yakalama sistemi ve analitik yazılım ile entegre dört lazer konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri elde edin.
NOT: MyoD, 594 nm lazer (uyarma: 590 nm, emisyon: 617 nm) için uyartım ile parlak kırmızı-flüoresan boya olan 594 boya ile konjuge edilmiştir. LC3, 488 nm lazer hattına (uyarma: 495 nm, emisyon: 519 nm) uyanlmasıyla uyaran, parlak yeşil-flüoresan bir boya olan 488 boya ile konjuge edilir. Laminin, bir 647 boya ile konjuge edilir.647 nm lazer çizgisine (uyarılma: 650 nm, emisyon: 668 nm) uyanlmasıyla uyarılmış, parlak, uzak-kırmızı-flüoresan bir boya. - Slaytları mikroskop tepsisinde yerleştirin ve nükleer sinyalleri algılamak için 63X büyütme kullanın. Elle rejeneratif alanlara, kas oluşumuna dayanarak aktif mukavemet alanlarını ortalayarak odaklayın (bkz. Şekil 4 ).
NOT: Miyofibre büyüklüğü hemen hemen sabitken ( Şekil 4A ), yaralanmadan kaynaklanan kas yenilenmesi, rejenerasyondan sonra yeni oluşturulmuş lifler olan daha küçük miyofiberlerin ortaya çıkmasıyla anlaşılabilir. Dahası, aktif rejenerasyondaki kas, makrofajlardan, fibro-adipojenik prekürsörlerden ve hasar gören kaslara lokalize olan kas rejenerasyonunu düzenleyen hücrelerden oluşan geniş bir sızıntı ile karakterizedir ( Şekil 4B ). - Yeniden oluşturulan immünofloresan boyayı değerlendirinMiyofiberlerinin bazal tabakasının altında bulunan MuSC'lere odaklanarak,
- MyoD boyaması için pozitif olan ve laminin boyaması ile işaretlenmiş miyofiberler içine yerleştirilen MuSC'lere odaklanın (bkz. Şekil 4B , beyaz oklar).
- En az 3 fare / deney grubu kullanın ve her deney grubu için en az 7 alan 63X büyütme görüntüsü elde etmek için mikroskop kullanın.
- Rejeneratif alanlar belirlendikten sonra, DAPI boyama ile odaklanır ve diğer tek kanalları ayarlar.
- Aşağıdaki mikroskop ayarlarını kullanın: Kanal A594 İğne deliği 1.2 Airy Ünitesi, Kazanç 791; Kanal A488 İğne deliği 1.6 Hava Durumu Birimi, Kazanç 659; Kanal A647 İğne deliği 1.4 Hava Yolu Ünitesi, Kazanç 719.
- Tek kanalların odağını ayarladıktan sonra, görüntüleri 1,024 x 1,024 çerçeve boyutunda ve 12,61 μs piksel sürede elde etmeye devam edin.
- MyoD pozitif hücrelerin yüzdesini sayın (tLC3 negatif olan yeri ve lamina altında doğru konumu belirtir) ve bir LC3 sinyali gösteren MyoD pozitif hücrelerin yüzdesi.
NOT: LC3 boyaması gösteren MyoD-pozitif hücrelerin yüzdesi, bu protokolün okunmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, kas rejenerasyonu sırasında MuSC'lerde otofajiyi saptamak için etkin bir in situ metodu tarif eder.
CTX In Vivo Tedaviler:
TA kaslarındaki kas hasarını uyandırmak ve kontrolsüz kasları kontrol olarak kullanmak için CTX kullanın. Otofaji oldukça dinamik olduğu için, CLP'nin IP enjeksiyonları gerçekleştirerek otofajik akıyı bloke edin ( Şekil 1 ). Otofajik akının aktif olup olmadığının veya bazal seviyelerde tutulmasının değerlendirilmesi için CLQ tedavisi gereklidir.
Tibialis Ön İzolasyon:
TA kasını Şekil 2'de açıklandığı gibi izole edin ve daha sonra çapraz kas dokusu bölümleri elde etmek için NS yönünde bir kalıp bölmesine yerleştirin. Bu adımBölümlere erişmek ve miyofiber bazal tabakanın altında uygun yerlerde MuSC'leri belirlemek için çok önemlidir.
CTX kaynaklı kas hasarının histolojik incelenmesi
Kas yaralanmasının histolojik boyama yaparak oluştuğunu doğrulayın. H & E boyama yapın ve 10X büyütme altında kontrol edin: rahatsız edici olmayan kaslar genellikle değişmez miyofiber boyutları sergilerken, yaralı kasların tipik özellikleri, boyutları farklı olan ve inflamatuar infiltratı farklı olan miyofiberlerin bozulmasını içerir. Rejeneratif işlemin gerçekleştiğini doğrulamak için bir başka parametre, morfofarmanın merkezsiz çekirdeklenmesidir ve bu da pertürbasyonsuz kaslarda yoktur ve aktif rejenerasyon geçiren farelerde yeni liflerin oluşumunun bir işaretidir ( Şekil 3 ).
Otofaji MyoD-po ile birleştirilirKas Gelişiminde Sitive Hücreler:
Bir LC3 sinyali gösteren MyoD pozitif olarak tanımlanan MuSC'leri tespit etmek için immünofloresan boyama uygulayın. Lamininin boyanması, Mucevherleri bazal laminanın altındaki nişte uygun konumda konumlandırmak için yararlıdır ( Şekil 4 ). Otofajik bazal düzeyler, sarsılmamış iskelet kaslarını ayırt eder ve kas rejenerasyonu ile rastlantısal olarak artar 30 . Buna göre, yaralanmamış fareler, MyoD-pozitif hücrelerin olmaması ve hiçbir LC3 sinyali bulunmayan herhangi bir MuSC aktivasyonu göstermez. Aksine kas hasarına bağlı olarak, MyoD pozitif MuSC'ler LC3 için pozitif hale gelir ve aktifleştirilmiş uydu hücrelerinde kas rejenerasyonu sırasında otofajik sürecin aktive olduğunu gösterir.
Rejeneratif cevabın başlangıç aşamalarında, farklı hücresel tipler tInflamatuvar hücreler ve fibro-adipojenik prekürsörler de dahil olmak üzere lezyon, yaralı alanı yoğun bir şekilde kalabalık hale getirir. Miyofiber tabakanın altındaki MuSC konumuna odaklanarak ve MyoD pozitifliğine dayanarak, tüm farklı hücresel tipleri ayırt etmek önemlidir.
Bazal koşullarda, LC3 her yerde bulunur ve immünofloresan ile zar zor tespit edilir. Yüksek otofajinin bir sonucu olarak, bu boyama paterni değişir ve esas olarak sitoplazmada saptanabilir hale gelir. MyoD / LC3 boyamasını değerlendirirken, MuSC'lerin küçük hücreler olduğunu ve sitoplazmik bölgenin sınırlı olduğunu; Bu nedenle LC3 perinükleer görünebilir.
Şekil 1: In vivo Tedavilerde CTX. ( A ) Kas hasarını indüklemek için, 10 uM CTX direc2 aylık WT fare- lerinin sol TA kaslarında görüldü. Karşı tarafı bir kontrol olarak kullanın. ( B ) Kardiyotoksin kaynaklı kas hasarının şematik gösterimi. Yaralanmadan 24 saat sonra fareleri 4 günde bir 24 saat boyunca 50 mg / kg CLQ enjeksiyonu ile tedavi edin ve sonra hayvanları feda edin. Tedavi edilmemiş yaralanmamış ve yaralı fareler kontrol olarak kullanın. Bu protokol, kas rejenerasyonu sırasında otofajik sürecin tutulumunun incelenmesine izin verir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: TA İzolasyonu. ( A ) TA'nın izole edilmeden önce göründüğü şeklindeki temsilci görüntüsü. ( B ) Distal tendonu kestikten sonra TA kasını tendonla tutun ve dikkatli olunKası proksimal uca doğru (diz yakınında) çekin. ( C ) EDL'yi, EDL'den daha büyük ve yüzeysel olan TA kasından ayırt edin. İki distal tendonu ters yönde çekerek TA'yı EDL kasından ayırın. ( D ) TA izole edildikten sonra, tarif edildiği gibi NS yönünde kalıp odasına yerleştirin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: CTX, Kas Hasarını İndükler. Kontrolten, hasar görmemiş ( A ) ve 5 d pi ( B ) WT farelerinden TA transversal doku kesitleri üzerindeki H & E boyamasının temsili görüntüleri. H & E boyama, kontrol farelerinde ( A ) ve massivde normal lif morfolojisini açığa çıkarırKas hasarı ve yaralı kaslara sızma ( B ), CTX enjeksiyonu üzerine bozulmuş morfolojiyi gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Otofaji, Kas Yenilenmesi Sırasında MyoD Pozitif Hücrelerle Birleştirilir. LC3 (yeşil) ve MyoD (kırmızı) ile immünosente edilen kontrol ( A ) ve yaralı ( B ) WT farelerinden alınan TA bölümlerinin temsili görüntüleri. Laminin (camgöbeği) boyama, kas liflerine işaret eder ve çekirdekler, DAPI (beyaz) ile zıt renk alır. Sağ paneller birleştirme sinyalinin temsili görüntülerini gösterir. Beyaz oklar, laminin boyaması ile işaretlenmiş lifin bazal laminasında bulunan uydu hücrelerini belirtmektedir. TakipNg protokolü MyoD ile işaretlenmiş miyojenik soyları olan kas kök hücrelerinde LC3 boyaması yoluyla otofajiyi ölçmeye izin verir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol telafi edici kas rejenerasyonu sırasında iskelet kası kök hücrelerinde otofajinin nasıl izleneceğini açıklamaktadır. LC3 ve MyoD'nin birlikte lekelenmesi için çeşitli antikorlar denendi ve fare dokusu kesitlerinde çalışan ve başarılı sonuçlar oluşturan antikorlar burada listelenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu ). Başarılı bir boyama için metanol ile permeabilizasyon (bkz. Adım 3.2.2) önerilir.
Bu protokolün sınırlandırılması, en az 3 farenin / deney grubunun kullanımını zorlayan, farelerin içsel değişkenliği ile bağlantılıdır. Bu metodoloji, iskelet kası yenilenmesi sırasında otofajinin ilerlemesine bir adım önermektedir; sonuçların çoğu Şimdi izole edilmiş hücrelerde yapıldı. Yerinde yapılan analiz, otofaji gibi metabolik süreçleri etkileyebilecek bir hücre izolasyonuna ihtiyaç duymadan, otofajinin doğal ortamda incelenmesine izin verdi.
"> Otofajik işlemin son derece dinamik doğası göz önüne alındığında, CLQ tedavileri, otofajik işlemi in vivo olarak izlemek için kritik bir adımdır CLQ, otofajik devam ettiği zaman LC3 birikimine yol açan otofajik işlemin sonraki aşamalarını engellediğinden, CLQ tedavisi LC3'ü in situ inceleme ile saptanabilir hale getirir.Multranızlaşmış iskelet kaslarında, bazal otofajik süreç, tespit edilebilir LC3 birikimi olmadığı için ortaya çıktığı gibi, CLQ tedavisi ile daha da artmaz.Ancak, yeniden canlandırıcı kaslarda, LC3, CLQ tedavisi üzerine birikir ve otofajik aktivasyonu gösterir Kritik bir adım, sabahları aynı saatte ( yani saat 10: 00'da) farelerden kurtulmaktır Protokoldeki bir diğer kritik adım, MuSC'nin tanımlanmasıdır; bu MuSC, hasar gören kasları dolduran başka bir hücresel tipli ile değiştirilmemelidir. Rejeneratif cevap .MyOD pozitifliğini gösteren bazal lamina altındaki MuSC'lerin tanımlanması, kEy uydu hücrelere odaklanmak için.Özetle, MKK'larda otofajik işlemin rolünü tespit etmek için uygun bir yerinde yöntem sunmaktayız. Bu teknik, normal ve patolojik koşullarda iskelet kası yenilenmesini iyileştirmek için kullanılabilecek otofaji modülasyonuna yönelik farmakolojik yaklaşımların testleri için temel oluşturabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok
Acknowledgments
Bu çalışma, NIAMS AR064873, Epigen Project PB tarafından desteklendi. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT - LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
References
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
