Summary
La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.
Abstract
La creciente evidencia apunta a la autofagia como un proceso regulador crucial para preservar la homeostasis de los tejidos. Se sabe que la autofagia está implicada en el desarrollo y regeneración del músculo esquelético, y el proceso autofágico ha sido descrito en varias patologías musculares y trastornos musculares relacionados con la edad. Un bloque recientemente descrito del proceso autofágico que se correlaciona con el agotamiento funcional de las células satélites durante la reparación muscular apoya la noción de que la autofagia activa se combina con la regeneración muscular productiva. Estos datos revelan el papel crucial de la autofagia en la activación de las células satélite durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas, como las distrofias musculares. Aquí, proporcionamos un protocolo para supervisar el proceso autofágico en el adulto Muscle Stem Cell (MuSC) compartimento durante el músculo regenerativas condiciones. Este protocolo describe la metodología de configuración para realizar imágenes de inmunofluorescencia in situ de LC3, aMarcador de utofagia y MyoD, un marcador de linaje miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones controlados y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el compartimiento MuSC, que desempeña un papel central en la orquestación de la regeneración muscular.
Introduction
La regeneración del músculo esquelético es el resultado de la interacción entre las células madre adultas (Muscle Satellite Cells, MuSCs) y otros tipos de células que intervienen en el proceso regenerativo. La homeostasis muscular y la funcionalidad se mantienen por las señales combinadas que surgen del nicho muscular y las señales sistémicas 1 , 2 . A lo largo de la vida, se han reportado cambios en la funcionalidad MuSC, el nicho muscular y las señales sistémicas, lo que conduce a la disminución de las capacidades funcionales en los ancianos 3 . MuSCs se establecen en un nicho por debajo de la lámina basal y, a la lesión muscular, se activan para reparar los músculos dañados [ 4 , 5] . Para asegurar una respuesta regenerativa productiva, es crucial que las MuSCs coordinen los diferentes procesos necesarios para que la salida de la quiescencia, la auto-renovación y la etapa de expansión proliferativa siganPor la diferenciación miogénica 6 . En los ancianos y en las enfermedades crónicas musculares, todas estas funciones están comprometidas, lo que conduce a la alteración de la funcionalidad muscular 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .
La macroautofagia (denominada en lo sucesivo autofagia) está emergiendo como un proceso biológico crucial esencial para preservar la homeostasis tisular 14 . El proceso autofágico incluye mecanismos de tráfico, donde porciones de citoplasma, orgánulos y proteínas se envuelven en vesículas que eventualmente se degradan a través de la vía lisosoma, promoviendo la eliminación de moléculas tóxicas y el reciclaje de macromolCulos Esto proporciona compuestos ricos en energía para apoyar la adaptación de células y tejidos bajo estrés u otras condiciones adversas 15 , 16 . Junto con su actividad de supervivencia celular, la autofagia también puede funcionar como un inductor de la muerte celular, dependiendo del contexto del tejido celular ( por ejemplo, tejido normal frente al cáncer) y el tipo de estímulo de estrés 17 , 18 .
La evidencia reciente indica que la autofagia es necesaria para mantener la masa muscular y la integridad de la miofibra 19 , 20 y se ha reportado que está alterada en diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluyendo la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. De igual modo, se ha observado una reducción progresiva del proceso autofágico en los ancianos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , después de una pérdida de masa muscular (denominada sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , y en la supervivencia de miofibras 38 .
Una relación estrecha entre la autofagia y el potencial regenerativo de los músculos esqueléticos fue anticipada por un estudio del laboratorio de Wagers, que mostró que una restricción de calorías mejora la disponibilidad y la actividad de MuSC [ 39] . Esto noLa reciente observación de que el eje Foxo3-Notch activa el proceso autofágico durante la auto-renovación [ 40] y la transición de MuSC desde el estado quiescente al estado de proliferación [ 41] . Estos datos concuerdan con la reducción progresiva de la autofagia basal de jóvenes a ancianos y geriátricos MuSCs, en asociación con el descenso numérico y funcional de MuSCs durante el envejecimiento [ 42] .
En un artículo reciente, demostró una estrecha relación entre la autofagia y la regeneración muscular compensatoria que distingue las primeras etapas de la progresión de la DMD. En consecuencia, se observó una reducción del flujo autofágico en etapas posteriores de la progresión de la enfermedad, cuando la regeneración muscular se ve comprometida y deposición de tejido fibrótico se produce. Curiosamente, se demostró que, en condiciones de regeneración, la autofagia se activa en MuSCs y que la modulación del proceso autofágico impacta la activación MuSC y fuNcionalidad 30 .
En conjunto, estos datos ponen de relieve la urgencia de explorar el proceso autofágico en MuSCs durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas ya lo largo de la vida. En este sentido, proporcionamos un protocolo para monitorear el proceso autofágico en MuSCs en condiciones de regeneración muscular mediante la realización in situ de inmunotinción para los microtúbulos asociados a la proteína 1A / 1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador de autofagia [ 43] , y MyoD, un marcador de Miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones control y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el MuSC, que desempeña un papel clave en la orquestación de la regeneración muscular.
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Protocol
Los ratones fueron criados y mantenidos de acuerdo con los procedimientos de la instalación animal estándar y todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Aseguramiento de Bienestar Animal y el Comité de Ética de Investigación Animal interno según el Ministerio de Salud italiano y cumplieron con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Lesión muscular y el bloque in vivo de flujo autofágico
- Lesión muscular.
- Para inducir una lesión aguda del músculo esquelético, inyectar 20 μL de stock de cardiotoxina 10 μM (CTX) directamente en el músculo tibial anterior (TA) izquierdo de ratones C57BL / 6J de 2 meses de edad que pesan aproximadamente 20 g. Use un número igual de machos y hembras. Utilice la extremidad contralateral no perturbada como control.
NOTA: CTX 10 μM en solución de cloruro de sodio al 0,9% debe filtrarse (filtro PVDF 0,22 μm) y almacenarse a -20 ° C. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. - Usando un iNsulin con una aguja de 30 G, inyecte CTX en el centro de la TA. Para inducir una lesión precisa en el TA, asegúrese de que la aguja de la jeringa entre cerca del tendón distal, de 5 mm de profundidad, desde el fondo hasta la parte superior del músculo ( Figura 1A ).
- Para inducir una lesión aguda del músculo esquelético, inyectar 20 μL de stock de cardiotoxina 10 μM (CTX) directamente en el músculo tibial anterior (TA) izquierdo de ratones C57BL / 6J de 2 meses de edad que pesan aproximadamente 20 g. Use un número igual de machos y hembras. Utilice la extremidad contralateral no perturbada como control.
- Bloqueo del flujo autofágico en ratones no perturbados y lesionados.
- Para evaluar el flujo autofágico, 24 h después de la lesión (pi), administrar 50 mg / kg de cloroquina (CLQ) cada 24 h durante 4 días por inyección intraperitoneal (IP) ( Figura 1B ).
- Disolver CLQ (10 mg / ml) en PBS 1X y filtrar a través de una membrana de 0,2 μm. Pesar cada ratón y calcular la cantidad de CLQ para inyectar.
NOTA: Prepare y utilice la solución CLQ el mismo día. Las existencias de CLQ pueden almacenarse hasta por un mes a -20 ° C. Dado que la autofagia es un proceso relacionado con el metabolismo, siempre se realiza un tratamiento de CLQ siempre al mismo tiempo ( es decir, en la mañana antesRe 10 AM).
- Disolver CLQ (10 mg / ml) en PBS 1X y filtrar a través de una membrana de 0,2 μm. Pesar cada ratón y calcular la cantidad de CLQ para inyectar.
- Para evaluar el flujo autofágico, 24 h después de la lesión (pi), administrar 50 mg / kg de cloroquina (CLQ) cada 24 h durante 4 días por inyección intraperitoneal (IP) ( Figura 1B ).
2. Secciones de los tejidos musculares
- Sacrificio del ratón.
- Eutanasia los ratones 5 días después de la lesión.
- Realizar la eutanasia por dislocación cervical o por CO 2 (a seguir por dislocación cervical para confirmación). Dado que el proceso de autofagia está relacionado con el sueño del ratón / hábitos alimenticios, siempre sacrificar los ratones al mismo tiempo, preferiblemente por la mañana ( es decir, antes de las 10 AM).
- TA aislamiento e inclusión.
- Antes de la disección, rocíe el ratón con etanol al 70%.
- Usando unas tijeras, haga una pequeña incisión perpendicular (3 mm de largo) sobre la piel dorsal del ratón a nivel de las caderas. Corte la cola y los pies para simplificar la eliminación de la piel. Tire de la piel hacia la cola y retirarla para exponer los músculos subyacentes; El músculo TA es fácil de localizar, como se muestra en la Figura 2A
- Con la ayuda de dos fórceps, agarre los tendones distales.
- Cortar los tendones distales; Los tendones del TA y extensor del extensor del dedo largo (EDL) se cortan a menudo conjuntamente y se separan más adelante (véase el paso 2.2.6).
- Usando una pinza, sostenga el músculo TA por el tendón y tire con cuidado del músculo hacia el extremo proximal (cerca de la rodilla, Figura 2B ).
NOTA: En este punto, los músculos EDL y TA son fácilmente reconocibles, siendo el TA más grande y más superficial que el EDL. - Separar el TA del músculo EDL tirando de los dos tendones distales en las direcciones opuestas ( Figura 2C ).
- Corte el tendón proximal.
- Usando fórceps, quite la fascia fina que cubre el músculo, sin dañar el tejido.
- Retire la humedad excesiva en la muestra con la ayuda de una toalla de papel. Asegúrese de que el músculo no esté mojado ni excesivamente seco, ya que la humedad excesiva producirá sigDaños significativos en el músculo y poner en peligro la siguiente tinción.
- Coloque el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en la parte inferior de un molde y coloque el músculo en él, en la orientación que se muestra en la figura 2D . Añadir 100% de isopentano a un vaso de precipitados hasta que alcance una profundidad de aproximadamente 3-4 cm. Colocar el vaso en contacto con nitrógeno líquido en una caja de poliestireno.
- No deje que el nitrógeno líquido entre en el vaso, ya que producirá una espuma burbujeante, que puede afectar la inclusión y dañar las secciones musculares.
- Observar el isopentano y esperar hasta que alcance la temperatura adecuada (entre -140 ° C y -150 ° C); A la temperatura apropiada, una capa blanca sólida de isopentano congelado cristalizará en el fondo del vaso de precipitados.
- Si el isopentano congela por completo el sólido, se funde y se enfría a la temperatura de congelación antes de pasar al siguiente paso.
- Usando pinzas precargadas, baje delicadamente el moldeEl isopentano durante aproximadamente 20-30 s. Coloque la muestra congelada en un recipiente con hielo seco hasta que se transfiera a un congelador de -80 ° C.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
- Criosecciones de tejidos musculares.
- Después de al menos una noche a -80 ° C, realizar cryosectioning.
- Saque el cuchillo de criostato y la placa antirrobo del congelador de -20 ° C y colóquelos en los soportes respectivos en el gabinete del criostato.
- Coloque una gota de OCT en el trozo de muestra y coloque en ella la muestra congelada, en orientación NS vertical, tal como se visualiza en la figura 2D .
- Coloque el trozo de muestra en el portabrocas.
- Sin tirar de la placa anti-rollo hacia abajo en el cuchillo, hacer algunos cortes a 40 μ m para deshacerse de OCT que no incluye el músculo. Cuando el músculo se vuelve visible, reduzca el grosor de la rebanada a 7-8 μm.
- Tire de la placa antirrobo hasta que esté alineada conEl borde del cuchillo o un poco por encima.
- Corte secciones transversales de 7-8 μm de espesor y monte 3-4 rebanadas por diapositiva histológica.
NOTA: La temperatura del criostato sugerida está entre -15 ° C y -23 ° C. Se necesitan secciones transversales de las muestras para el análisis subsiguiente para identificar con precisión las células madre musculares en la posición del nicho satélite. - Para maximizar la adherencia de la sección, mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10-15 min para evitar su separación durante la incubación del anticuerpo.
NOTA: El paso de secado al aire podría afectar la inmunotinción, proporcionando resultados ambiguos. Los portaobjetos se pueden almacenar sin fijar durante varios meses a -80 ° C. El protocolo se puede pausar aquí.
- Comprobación del daño muscular en criosecciones de los músculos TA mediante la tinción con Hematoxilina Eosina (H & E).
- Evaluar la calidad del músculo ( es decir, la efectividad de la lesión, aislamiento muscular eIon y criosecciones), realizan una tinción de H & E. Para cada punto de tiempo experimental, fijar una diapositiva con PFA al 4% durante 10 min. Después de la fijación, lavar los portaobjetos bien en varios cambios de 1x PBS.
NOTA: Precaución. PFA es carcinógeno y debe ser manejado cuidadosamente. - Tomar una diapositiva para cada punto experimental y ponerlos en un frasco de tinción.
- Llenar el frasco con 9 g / L hematoxilina hasta que las secciones se cubren e incubar durante 8 min.
- Recicle la hematoxilina.
- Dejar el frasco bajo agua corriente durante 10 minutos para eliminar el exceso de hematoxilina.
NOTA: Asegúrese de no fluir el agua directamente sobre las secciones. - Lavar con agua esterilizada.
- Incubar las secciones con eosina al 0,5% (p / v) en etanol al 90% acidificado durante 1 min.
- Recicle la eosina.
- Lavar dos veces con agua estéril durante 3 minutos / lavado.
NOTA: Realice los siguientes pasos en un capó químico. - Lavar las secciones con etanol al 70%.
- lavarLas secciones con etanol al 90%.
- Lave las secciones con etanol al 100%.
- Incubar las secciones con 0,879 g / ml de o-xileno.
NOTA: Precaución. O-xileno es inflamable y moderadamente tóxico. Manipúlelo bajo el capó químico, usando equipo protector, incluyendo guantes, una bata de laboratorio y una máscara. - Recicle el o-Xileno.
- Ponga las diapositivas sobre un trozo de papel para secar.
- Cierre los portaobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno de endurecimiento rápido.
- Compruebe la calidad de las secciones bajo un microscopio óptico con una ampliación de 10X (consulte la Figura 3 )
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
- Evaluar la calidad del músculo ( es decir, la efectividad de la lesión, aislamiento muscular eIon y criosecciones), realizan una tinción de H & E. Para cada punto de tiempo experimental, fijar una diapositiva con PFA al 4% durante 10 min. Después de la fijación, lavar los portaobjetos bien en varios cambios de 1x PBS.
3. Inmunotinción para LC3 y MyoD en secciones de tejidos musculares lesionados
- Fijación de secciones de tejido muscular.
- Preparar una cámara de incubación mojando un pedazo de papel y colocándolo en el fondo de una caja de plástico cerrable para mantener un altoDe humedad dentro de la cámara. Fijar las secciones de tejido con paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS durante 10 min.
NOTA: Se utiliza un trozo de papel húmedo para evitar el secado de la muestra. Preparar PFA fresco o utilizar PFA almacenado a -20 ° C. Precaución. PFA es tóxico; El polvo debe ser manipulado con cuidado al hacer la solución madre. Esta operación debe realizarse en un capó químico, con equipo de protección, incluyendo guantes, una bata de laboratorio y una máscara. También, cuando en la solución, el PFA debe ser manipulado cuidadosamente. - Eliminar el PFA y lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3 veces.
- Preparar una cámara de incubación mojando un pedazo de papel y colocándolo en el fondo de una caja de plástico cerrable para mantener un altoDe humedad dentro de la cámara. Fijar las secciones de tejido con paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS durante 10 min.
- Permeabilización de secciones de tejido muscular.
- Dibuje una barrera hidrófoba alrededor de las secciones de tejido usando una pluma de pap.
NOTA: Este paso define la superficie alrededor de las secciones de tejido y minimiza el volumen de anticuerpos descritos en los pasos 3.4, 3.6, 3.7 y 3.9. - Cubra las secciones con 200 μl de agua fría (-20 ° C)Metanol y poner la cámara de incubación horizontalmente dentro de un congelador a -20 ° C durante 5 min.
- Quitar la cámara de incubación del congelador, aspirar el metanol y lavar las secciones con PBS 1X durante 5-7 min a TA; Repita este paso 3x.
- Dibuje una barrera hidrófoba alrededor de las secciones de tejido usando una pluma de pap.
- Bloqueo
- Preparar una nueva solución en bloque de 4% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1x.
NOTA: La solución de BSA se puede almacenar durante 1 semana a 4 ° C. - Incubar las secciones con solución de bloque durante al menos 60 min a RT.
- Retire la solución de bloqueo.
- Preparar 100 μL de mezcla anti-Fab mediante la dilución de 20 μg / ml de anti-Fab en 1x PBS. Incubar las secciones con un fragmento F (ab) purificado por afinidad no conjugado de IgG anti-ratón durante 1 h a RT.
- Preparar una nueva solución en bloque de 4% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1x.
- Incubación de anticuerpos primarios.
- Preparar 100 μL de la mezcla de anticuerpos primarios para cada diapositiva mediante la disolución de anticuerpos LC3 y MyoD en BSA al 4% en 1x PBS. Utilice 5 μg /Ml de anti-LC3 (anticuerpo policlonal de conejo) y 10 mg / l de anti-MyoD (anticuerpo monoclonal de ratón). Incubar la mezcla de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C.
- Se lava.
- Eliminar la mezcla de anticuerpos primarios.
- Lavar las secciones con BSA al 1% en PBS 1X durante 10 min; Repita este paso 3x.
- Incubación de anticuerpos secundarios.
- Prepare 100 μl de mezcla de anticuerpos secundarios para cada diapositiva. Disolver anticuerpo de cabra anti-conejo 488 (5 μg / ml) y cabra anti-ratón 594 (5 μg / ml) en BSA al 4% en 1x PBS.
NOTA: Evite la exposición excesiva a la luz para evitar el blanqueo con fluorocromo. Realice los siguientes pasos en la oscuridad. - Incubar las secciones con la mezcla de anticuerpos secundarios durante 45 min a RT.
- Eliminar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3x.
- Prepare 100 μl de mezcla de anticuerpos secundarios para cada diapositiva. Disolver anticuerpo de cabra anti-conejo 488 (5 μg / ml) y cabra anti-ratón 594 (5 μg / ml) en BSA al 4% en 1x PBS.
- Incubación de anticuerpos primarios.
- Laminas diluidasN-2 (cadena α-2) (0,33 μg / ml) en BSA al 4% en 1x PBS usando 100 μl de mezcla para cada portaobjetos. Incubar las secciones en la mezcla de anticuerpos primarios durante 1-2 h a RT.
- Se lava.
- Eliminar la mezcla de anticuerpos primarios.
- Lavar las secciones con BSA al 1% en PBS 1X durante 10 min; Repita este paso 3x.
- Incubación de anticuerpos secundarios.
- Preparar 100 μl de la mezcla de anticuerpos secundarios para cada diapositiva diluyendo 647 de cabra anti-rata (5 μg / mL) en BSA al 4% en 1X PBS. Incubar las secciones en la mezcla de anticuerpos secundarios durante 45 min a RT.
- Eliminar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3x.
- 4 ', 6 - Diamidino - 2 - fenilindol (DAPI).
- Añadir 200 μl de 300 nM DAPI solución en 1x PBS a cada diapositiva. Incubar durante 5 min a RT. Guarde la solución DAPI a 4 ° C en laoscuro.
- Lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3x.
- Montaje de las secciones de los músculos teñidos.
- Retire el exceso de solución de lavado de las secciones.
- Coloque 10 μL de glicerol en 1x PBS (3: 1) sobre las secciones teñidas en el centro de la diapositiva y agregue un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas de aire.
4. Adquisición de Microscopía Confocal
- Adquirir las imágenes utilizando un microscopio confocal de cuatro láser integrado con un sistema de captura de imágenes y software analítico.
NOTA: MyoD se conjuga con un colorante 594 que es un colorante fluorescente rojo brillante, con una excitación ideal para el láser de 594 nm (excitación: 590 nm, emisión: 617 nm). LC3 se conjuga con un colorante 488 que es un colorante verde fluorescente brillante, con excitación idealmente adaptada a la línea láser de 488 nm (excitación: 495 nm, emisión: 519 nm). La laminina se conjuga con un colorante 647 que esUn colorante fluorescente brillante de color rojo intenso, con excitación ideal para la línea láser de 647 nm (excitación: 650 nm, emisión: 668 nm). - Coloque los portaobjetos en la bandeja del microscopio y use una ampliación de 63X para detectar señales nucleares. Enfóquese manualmente en las áreas regenerativas centrando los campos de regeneración activa, dependiendo de la morfología muscular (ver Figura 4 ).
NOTA: Mientras que en el músculo no perturbado, el tamaño de la miofibra es prácticamente constante ( Figura 4A ), la regeneración muscular mediada por lesión puede ser reconocida por la aparición de miofibras más pequeñas, que son las fibras recién formadas después de la regeneración. Por otra parte, el músculo en la regeneración activa se caracteriza por un extenso infiltrado que está compuesto de macrófagos, precursores fibro-adipogénicos y células que se localizan en los músculos dañados para orquestar la regeneración muscular ( Figura 4B ). - Evaluar la tinción inmunofluorescente en regenEnfocándose en los muSCs que se encuentran bajo la lámina basal de las miofibras.
- Centrarse en MuSCs que son positivos para MyoD tinción y posicionado dentro de miofibras marcado por laminina tinción (véase la Figura 4B , flechas blancas).
- Utilizar al menos 3 ratones / grupo experimental y utilizar el microscopio para adquirir imágenes de aumento de 63X de al menos 7 campos para cada grupo experimental.
- Una vez que las áreas regenerativas se identifican, enfoque utilizando la tinción DAPI y luego ajustar los otros canales individuales.
- Utilice los siguientes ajustes de microscopio: Canal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Canal A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Canal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Ganancia 719.
- Después de ajustar el enfoque de los canales individuales, proceda a adquirir las imágenes con un tamaño de trama de 1.024 x 1.024 y una tolerancia de 12.61 μs.
- Cuente el porcentaje de células MyoD-positivas (control para tLa ubicación correcta debajo de la lámina) que son LC3-negativos y el porcentaje de células MyoD-positivas que muestran una señal LC3.
NOTA: El porcentaje de células MyoD-positivas que muestran tinción LC3 es la lectura de este protocolo.
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Representative Results
Este protocolo describe un eficiente método in situ para detectar la autofagia en MuSCs durante la regeneración muscular.
CTX In Vivo Tratamientos:
Utilice CTX para inducir el daño muscular en los músculos TA y utilizar los músculos no perturbados como controles. Dado que la autofagia es altamente dinámica, bloquear el flujo autofágico mediante la realización de inyecciones de IP de CLQ ( Figura 1 ]. El tratamiento con CLQ es esencial para evaluar si el flujo autofágico está activo o se mantiene a niveles basales.
Tibialis Aislamiento Anterior:
Aislar el músculo TA, tal como se describe en la Figura 2 , y colocarlo en una cámara de moldeo en orientación NS para obtener posteriormente secciones transversales de tejido muscular. Este pasoEs crucial para obtener secciones e identificar los muSC en la ubicación apropiada debajo de la lámina basal de miofibras.
Examen histológico del daño muscular inducido por CTX
Verifique que la lesión muscular se produjo mediante la realización de tinción histológica. Efectúe la tinción de H & E y compruebe bajo una ampliación de 10X: mientras que los músculos imperturbados exhiben generalmente tamaños invariables de la miofibra, las características típicas de los músculos dañados incluyen la interrupción de las miofibras que son diferentes en tamaño y abundante infiltrado inflamatorio. Otro parámetro para confirmar que el proceso regenerativo tiene lugar es la centro-nucleación de las miofibras, que está ausente en los músculos no perturbados y es un signo de la formación de nuevas fibras en ratones sometidos a regeneración activa ( Figura 3 ).
Autofagia se une a MyoD-poSitive durante la regeneración del músculo:
Realizar tinción inmunofluorescente para detectar MuSCs, identificado como MyoD-positivo, que muestran una señal LC3. Tinción de laminina es útil para localizar MuSCs en la posición adecuada en el nicho bajo la lámina basal ( Figura 4 ]. Los niveles basales autofágicos distinguen los músculos esqueléticos no perturbados y aumentan significativamente en coincidencia con la regeneración muscular 30 . Por consiguiente, los ratones no dañados no muestran ninguna activación de MuSC, detectada por la ausencia de células MyoD-positivas y ninguna señal de LC3. Por el contrario, al producirse daño muscular, los MuSC positivos para MyoD resultan positivos para LC3, lo que demuestra que el proceso autofágico se activa durante la regeneración muscular en células satélites activadas.
Durante las etapas iniciales de la respuesta regenerativa, diferentes tipos celulares se localizan en el sitio de tIncluyendo las células inflamatorias y los precursores fibroadipógenos, lo que hace que el área lesionada esté densamente sobrepoblada. Es crucial distinguir entre todos los tipos celulares diferentes, centrándose en la localización de MuSC debajo de la lámina del myofiber y confiando en positividad de MyoD.
En condiciones basales, LC3 se expresa ubicuosamente y apenas se detecta por inmunofluorescencia. Como resultado de la autofagia elevada, este patrón de tinción cambia y se hace detectable principalmente en el citoplasma. Cuando se evalúa la tinción de MyoD / LC3, considere que los MuSCs son células pequeñas y que la región citoplasmática es limitada; Esto por lo que LC3 puede parecer perinuclear.
Figura 1: Tratamientos In Vivo de CTX. ( A ) Para inducir daño muscular, inyectar 10 μL de 10 μM CTX direcEn los músculos TA de ratones WT de 2 meses de edad. Utilice la extremidad contralateral como control. ( B ) Representación esquemática de la lesión muscular inducida por cardiotoxinas. 24 h después de la lesión, tratar a los ratones con inyecciones intraperitoneales de 50 mg / kg CLQ cada 24 h durante 4 días y luego sacrificar los animales. Utilice ratones no lesionados y lesionados como controles. Este protocolo permite el estudio de la implicación del proceso autofágico durante la regeneración muscular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aislamiento TA. ( A ) Imagen representativa de la AT tal como se ve antes del aislamiento. ( B ) Después de cortar el tendón distal, mantenga el músculo TA por el tendón y cuidadoEl músculo hacia el extremo proximal (cerca de la rodilla). ( C ) Discriminar la EDL del músculo TA, que es más grande y más superficial que el EDL. Separar el TA del músculo EDL tirando de los dos tendones distales en direcciones opuestas. ( D ) Una vez que el TA está aislado, colóquelo en la cámara del molde, como se describe, en la orientación NS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: CTX Induce Daño Muscular. Imágenes representativas de tinción de H & E en secciones de tejido transversal TA de ratones WT control, no dañados ( A ) y 5 d pi ( B ). La tinción con H & E revela la morfología normal de la fibra en ratones control ( A ) y massivE daño muscular e infiltrarse en los músculos lesionados ( B ), demostrando una morfología alterada tras la inyección de CTX. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La autofagia se une a células MyoD-positivas durante la regeneración muscular. Imágenes representativas de secciones TA de ratones WT control ( A ) y lesionados ( B ) inmunotinados con LC3 (verde) y MyoD (rojo). La tinción con laminina (cian) marca las fibras musculares, y los núcleos se contrastan con DAPI (blanco). Los paneles de la derecha muestran imágenes representativas de la señal de fusión. Las flechas blancas indican células satélite que están por debajo de la lámina basal de la fibra marcada por tinción con laminina. El siguienteNg permite medir la autofagia mediante tinción de LC3 en células madre musculares sometidas a linaje miogénico, marcadas por MyoD. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe cómo monitorear la autofagia en las células madre del músculo esquelético durante la regeneración muscular compensatoria. Varios anticuerpos para la co-tinción de LC3 y MyoD fueron probados, y los que trabajan en las secciones de tejido de ratón y crear resultados exitosos se enumeran aquí (ver Tabla de Materiales ). La permeabilización con metanol (ver paso 3.2.2) es altamente recomendada para la tinción exitosa.
La limitación de este protocolo está vinculada a la variabilidad intrínseca de los ratones, lo que obliga al uso de al menos 3 ratones / grupo experimental. Esta metodología refleja un paso adelante en el estudio de la autofagia durante la regeneración del músculo esquelético, ya que la mayoría de los resultados A ahora se hicieron en células aisladas. El análisis in situ permitió el estudio de la autofagia en el medio natural, sin necesidad de un aislamiento celular que pudiera afectar procesos metabólicos, como la autofagia.
"> Dada la naturaleza altamente dinámica del proceso autofágico, los tratamientos CLQ son un paso crítico para monitorear el proceso autofágico in vivo, CLQ bloquea las etapas posteriores del proceso autofágico, llevando a la acumulación de LC3 cuando se sostiene la autofagia. Hace que la LC3 sea detectable por el examen in situ.En los músculos esqueléticos no perturbados, el proceso autofágico basal no se incrementa más con el tratamiento con CLQ, como lo demuestra la ausencia de acumulación detectable de LC3. Otro paso crítico en el protocolo es la identificación de MuSC, que no debe ser intercambiado con otro tipo celular que puebla el músculo dañado durante la fase La identificación de MuSCs bajo la lámina basal que muestran la positividad de MyoD es la kEy para centrarse en las células satélites.En resumen, se presenta un método adecuado in situ para detectar la participación del proceso autofágico en MuSCs. Esta técnica puede servir de base para las pruebas de los enfoques farmacológicos de la modulación de la autofagia, que podrían utilizarse para mejorar la regeneración del músculo esquelético en condiciones normales y patológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NIAMS AR064873, Epigen Proyecto PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
References
- Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
- Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
- Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
- Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
- Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
- Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
- Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
- Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
- Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
- Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664 (2013).
- Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
- Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
- Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
- Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
- Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
- De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
- Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
- Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
- Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
- Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
- Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
- Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
- Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
- Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
- Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
- Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
- Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
- Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
- Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
- Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
- Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
- Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
- Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
