Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

doi: 10.3791/55908 Published: June 12, 2017

Summary

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

Abstract

הגדלת ראיות נקודות autophagy כתהליך חיוני רגולציה כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. ידוע כי autophagy מעורב בפיתוח שריר השלד התחדשות, ואת תהליך autophagic תוארה בכמה פתולוגיות שרירים והפרעות שרירים הקשורים לגיל. בלוק המתואר לאחרונה של תהליך autophagic כי בקורלציה עם התשישות תפקודית של תאים לווין במהלך תיקון שרירים תומך ברעיון autophagy פעיל הוא בשילוב עם התחדשות שריר פרודוקטיבי. נתונים אלה לחשוף את התפקיד המכריע של autophagy הפעלה תא הלוויין במהלך התחדשות שריר בתנאים נורמליים ופתולוגיים, כגון דיסטרופיות שרירים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לפקח על תהליך autophagic בתא גזע מבוגר גזע תא גזע (MuSC) במהלך שריר תנאי regenerative. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ההתקנה לבצע הדמיה immunofluorescence באתרה של LC3, אסמן אוטופגי, ו- MyoD, סמן השושלת myogenic, בחלקי רקמת השריר של שליטה ועכברים שנפגעו. המתודולוגיה דיווח מאפשר מעקב אחר תהליך autophagic תא תא מסוים אחד, תא MuSC, אשר ממלא תפקיד מרכזי בתזמון שריר תזמור.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התחדשות שריר השלד היא תוצאה של האינטראקציה בין תאי גזע בוגרים (תאי שריר תאים, MuSCs) וסוגים אחרים של תאים המעורבים בתהליך הרגנרציה. שריר הומיאוסטזיס ופונקציונליות נשמרים על ידי האותות המשולבים הנובעים נישה שרירים רמזים מערכתית 1 , 2 . לאורך כל תקופת החיים, דווח על שינויים בפונקציונליות ה- MuSC, בנישת השרירים וברמזים המערכתיים, דבר שהוביל לירידה ביכולת התפקוד בקרב קשישים. MuSCs ממוקמים בנישה מתחת הלמידה הבסיסית, על פגיעה בשריר, מופעלים לתקן שרירים פגומים 4 , 5 . כדי להבטיח תגובה משופרת יצרנית, חיוני כי MuSCs לתאם תהליכים שונים הדרושים ליציאה מן השלווה, את ההתחדשות העצמית, ואת שלב ההתפשטות השגשוג ואחריועל ידי בידול myogenic 6 . אצל קשישים ובמחלות כרוניות שריריות, כל הפונקציות האלה נפגעות, מה שמוביל לפונקציונליות שריר שונה 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .

Macroautophagy (המכונה להלן autophagy) מתעוררים כתהליך ביולוגי חיוני חיוני לשמר הומאוסטזיס רקמות 14 . התהליך האוטופאגי כולל בתוכו מנגנוני סחר, שבהם חלקים של ציטופלזמה, אברונים וחלבונים נבלעים לתוך שלפוחית ​​שבסופו של דבר מושפלים דרך מסלול הליזוזום, המקדמים את הסרת המולקולות הרעילות ואת מיחזור המאקרומולהCules. זה מספק תרכובות עשירות באנרגיה כדי לתמוך הסתגלות התא והרקמה תחת מתח או תנאים שליליים אחרים 15 , 16 . יחד עם פעילות ההישרדות של התא, autophagy יכול גם לעבוד כגורם למוות של תאים, בהתאם להקשר רקמות התא ( למשל, נורמלי לעומת רקמת סרטן) ואת סוג של גירוי מתח 17 , 18 .

עדויות עדכניות מצביעות על כך ש- autophagy נדרש לשמור על מסת שריר ועל שלמות מיופייר 19 , 20 ודווח כי נפגעות בניוון שרירים שונים 21 , 22 , 23 , כולל Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , לאחר אובדן מסת שריר (המכונה סרקופניה) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , ובהישרדות.

קשר הדוק בין אוטופאגי לבין הפוטנציאל המשובי של שרירי השלד היה צפוי על ידי מחקר ממעבדה של ואגרס, אשר הראה כי הגבלת קלוריות משפר זמינות MuSC ופעילות 39 . זה לאTion נתמך עוד יותר על ידי התצפית האחרונות כי ציר Foxo3-Notch מפעיל את תהליך autophagic במהלך התחדשות עצמית 40 ו- MuSC המעבר מן שקט אל המדינה מתרבים 41 . נתונים אלה מסכימים עם הפחתה הדרגתית של autophagy בסיסית מ - MSCs צעירים עד גילאים גרפיים, יחד עם הירידה המספרי והתפקודי של MuSCs במהלך ההזדקנות 42 .

במאמר שפורסם לאחרונה, הראינו קשר הדוק בין autophagy לבין התחדשות שרירים מפצה אשר מבדיל את השלבים המוקדמים של התקדמות DMD. לפיכך, ראינו שטף autophagic מופחת בשלבים מאוחרים יותר של התקדמות המחלה, כאשר התחדשות שריר נפגעת בתצהיר רקמות fibrotic מתרחשת. מסקרן, הראינו כי, בתנאים התחדשות, autophagy מופעל ב MuSCs וכי modulating את תהליך autophagic משפיע הפעלת MuSC ו פו30 .

בסך הכל, נתונים אלה מדגישים את הדחיפות לחקור את תהליך autophagic ב MuSCs במהלך התחדשות שריר בתנאים נורמליים ופתולוגיים לאורך כל החיים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לפקח על תהליך autophagic ב MuSCs בתנאים regenerative שרירים על ידי ביצוע immunostaining באתרו עבור חלבון הקשורים microtubule 1A / 1B-Light שרשרת 3 (LC3), סימן של autophagy 43 , ו MyoD, סימן של השושלת myogenic, ב רקמות שריר סעיפים מ שליטה ועכברים שנפגעו. המתודולוגיה דיווחה מאפשרת מעקב אחר תהליך autophagic בתא תא מסוים אחד, MuSC, אשר ממלא תפקיד מפתח תזמון שריר תזמורתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עכברים היו bred ו נשמר על פי תקן מתקן בעלי חיים, וכל הפרוטוקולים הניסוי אושרו על ידי ביטוח רווחת בעלי חיים ואת הפנים ועדת מחקר אתיים פנימיים על פי משרד הבריאות האיטלקי ו נענה עם המדריך NIH עבור טיפול ושימוש חיות מעבדה.

1. פגיעה בשריר ואת בלוק ויוו של שטף autophagic

  1. פגיעה בשרירים.
    1. כדי לגרום לפציעה חריפה של שריר השלד, להזריק 20 μL של 10 מיקרומטר cardiotoxin (CTX) המניה ישירות בשריר tibialis הקדמי (TA) השמאלי של עכברים C57BL / 6J בן חודש שמשקלם כ 20 גרם. השתמש במספר שווה של זכרים ונקבות. השתמש באיבר הנגדי ללא הפרעות כבקרה.
      הערה: 10 μM CTX ב 0.9% נתרן כלורי פתרון צריך להיות מסונן (0.22 מיקרומטר PVDF מסנן) ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס. הימנע חוזרים להקפיא להפשיר מחזורי.
    2. שימוש ב- iמזרק nsulin עם מחט G 30, להזריק CTX באמצע ת"א. כדי לגרום לפציעה מדויקת של ת"א, להבטיח את המחט של מזרק נכנס ליד גיד דיסטלי, 5 מ"מ עמוק, מלמטה אל החלק העליון של השריר ( איור 1 א ).
  2. חסימה של שטף autophagic בעכברים לא מופרעים ופצועים.
    1. כדי להעריך את השטף autophagic, 24 שעות שלאחר הפציעה (pi), לנהל 50 מ"ג / ק"ג כלורוקין (CLQ) כל 24 שעות במשך 4 ד על ידי הזרקת intraperitoneal (IP) 1 ( איור 1 ב ).
      1. ממיסים CLQ (10 מ"ג / מ"ל) ב PBS 1X ומסנן אותו באמצעות קרום 0.2 מיקרומטר. לשקול כל עכבר ולחשב את כמות CLQ להזריק.
        הערה: הכן והשתמש בפתרון CLQ באותו יום. מלאי CLQ ניתן לאחסן עד חודש אחד ב -20 מעלות צלזיוס. מאז autophagy הוא תהליך הקשורים מטבולית, תמיד לבצע טיפול CLQ תמיד באותו זמן ( כלומר בבוקר befoמחדש 10 בבוקר).

2. שריר רקמות מדורים

  1. הקרבה בעכבר.
    1. להרדים את העכברים 5 ימים לאחר הפציעה.
    2. ביצוע המתת חסד על ידי פריקה צוואר הרחם או על ידי CO 2 (כדי להיות ואחריו נקע צוואר הרחם לאישור). מאז תהליך autophagy קשורה הרגלי שינה / אכילה העכבר, תמיד להקריב את העכברים באותו זמן, רצוי בבוקר ( כלומר לפני 10 בבוקר).
  2. בידוד והכללה.
    1. לפני לנתיחה, לרסס את העכבר עם אתנול 70%.
    2. באמצעות מספריים לעשות חתך קטן, בניצב (3 מ"מ) על העור הגבי של העכבר ברמה של הירכיים. חותכים את הזנב ואת הרגליים כדי לפשט את הסרת העור. משוך את העור לכיוון הזנב והסר אותו כדי לחשוף את השרירים הבסיסיים; שריר ת"א קל למקם, כפי שמוצג באיור 2 א
    3. בעזרת שני מלקחיים, לתפוס את הגידים דיסטלי.
    4. חותכים את הגידים הדיסטליים; את גידולי TA ו extensor digusium longus (EDL) הם לעתים קרובות לחתוך במשותף מופרדים מאוחר יותר (ראה שלב 2.2.6).
    5. באמצעות מלקחיים, להחזיק את שריר TA על ידי הגיד בזהירות למשוך את השריר כלפי הסוף הפרוקסימלי (ליד הברך, איור 2 ב ).
      הערה: בשלב זה, את שרירי EDL ו TA הם בקלות לזיהוי, ת"א להיות גדול יותר שטחי יותר מאשר EDL.
    6. להפריד את ת"א מן השריר EDL על ידי משיכת שני גידים דיסטלי בכיוונים מנוגדים ( איור 2 ג ).
    7. חותכים את הגיד הפרוקסימלי.
    8. בעזרת מלקחיים, להסיר את fascia דק המכסה את השריר, מבלי לפגוע ברקמה.
    9. הסר לחות מוגזמת במדגם בעזרת מגבת נייר. ודא כי השריר הוא לא רטוב, ולא יבש מדי, כמו לחות מוגזמת יפיק sigנזק משמעותי לשריר ולסכן את מכתים הבא.
    10. מקום אופטימלי חיתוך טמפרטורה (OCT) המתחם בחלק התחתון של עובש ומכניסים את השריר לתוכו, בכיוון שמוצג באיור 2D . מוסיפים 100% איזופנטן לכוס עד שהוא מגיע לעומק של כ 3-4 ס"מ. מניחים את הכוס במגע עם חנקן נוזלי בתיבת קלקר.
    11. אל תתנו חנקן נוזלי להזין את הכוס, כפי שהוא יפיק קצף מבעבע, אשר יכול להשפיע על הכללה ופגיעה בשרירים.
    12. שים לב לאיזופנטן והמתן עד שהוא מגיע לטמפרטורה הנכונה (בין -140 ° C ל -150 ° C); בטמפרטורה המתאימה, שכבה לבנה מוצקה של איזופנטן קפוא יהיה להתגבש על החלק התחתון של הכוס.
    13. אם האיזופנטן מקפיא לחלוטין את מוצק, ממיסים וקוררים אותו לטמפרטורת הקיפאון לפני שאתם ממשיכים לשלב הבא.
    14. באמצעות מלקחיים prechilled, בעדינות להקטין את התבנית לתוךאת isopentane עבור כ 20-30 s. מניחים את המדגם קפוא לתוך מיכל עם קרח יבש עד שהוא מועבר במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  3. שריר רקמות cryosections.
    1. אחרי לפחות לילה אחד ב -80 מעלות צלזיוס, לבצע cryosectioning.
    2. קח את סכין cryostat ואת נגד רול צלחת מתוך מקפיא -20 ° C ומניחים אותם על תומך בהתאמה לתוך ארון cryostat.
    3. שים טיפה של אוקטובר על דגימת המדגם ומניחים עליו את המדגם קפוא, בכיוון אוריינטציה אנכית, כמו דמיינו באיור 2D .
    4. מניחים את דגימת המדגם על הצ'אק.
    5. מבלי למשוך את לוח נגד רול למטה על הסכין, לעשות כמה חתכים ב 40 מיקרומטר להיפטר אוקטובר שאינו כולל שריר. כאשר השריר הופך גלוי, להפחית את עובי הפרוסה ל 7-8 מיקרומטר.
    6. משוך את לוחית האנטי-רול עד שהיא מיושרתאת קצה הסכין או קצת מעליה.
    7. חותכים חלקים רוחביים 7-8 מיקרומטר עבה הר 3-4 פרוסות לכל שקופית היסטולוגית.
      הערה: טמפרטורת הקריאוסטט המוצעת היא בין 15 ° C ל -23 ° C. חתכים של דגימות נדרשים לניתוח הבאים כדי לאתר את תאי גזע השריר בעמדה נישה הלוויין.
    8. כדי למקסם את הדבקות של החלק, לשמור את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות כל כך כדי למנוע ניתוק שלהם במהלך הדגירה נוגדן.
      הערה: שלב ייבוש האוויר עלול להשפיע על החיסונים, דבר המספק תוצאות מעורפלות. שקופיות ניתן לאחסן unfixed במשך מספר חודשים ב -80 ° C. ניתן להפסיק את הפרוטוקול כאן.
  4. בדיקת נזק שרירים cryosections של שרירי ת"א על ​​ידי ביצוע מכתים Ectin Hematoxylin (H & E).
    1. כדי להעריך את איכות השריר ( כלומר את היעילות של הפציעה, בידוד שרירים ושליפהיון, cryosections), לבצע מכתים H & E. עבור כל נקודת זמן ניסיוני, לתקן שקופית אחת עם PFA 4% במשך 10 דקות. לאחר קיבוע, לשטוף את השקופיות היטב במספר שינויים של 1x PBS.
      הערה: זהירות. PFA הוא מסרטן ויש לטפל בו בזהירות.
    2. קח שקופית אחת עבור כל נקודת הניסוי והכניס אותם צנצנת מכתים.
    3. ממלאים את הצנצנת עם 9 גרם / hematoxylin L עד הסעיפים מכוסים דגירה של 8 דקות.
    4. מחזר את hematoxylin.
    5. השאירו את הצנצנת מתחת למים זורמים במשך 10 דקות כדי להסיר את עודף hematoxylin.
      הערה: הקפד לא לזרום את המים ישירות על החלקים.
    6. לשטוף באמצעות מים מעוקרים.
    7. לדגור את החלקים עם eosin 0.5% (w / v) באתנול 90% acidified עבור 1 דקות.
    8. למחזר את eosin.
    9. לשטוף פעמיים עם מים סטריליים במשך 3 דקות / לשטוף.
      הערה: בצע את השלבים הבאים במכסה כימי.
    10. שטפו את הסעיפים עם אתנול 70%.
    11. לִשְׁטוֹףאת הסעיפים עם אתנול 90%.
    12. שטפו את הסעיפים עם אתנול 100%.
    13. דגירה הסעיפים עם 0.879 גרם / מ"ל ​​o-Xylene.
      הערה: זהירות. O-Xylene הוא דליק ומרעיל למדי. לתפעל אותו תחת ברדס כימי, לובש ציוד מגן, כולל כפפות, מעיל מעבדה, ומסכה.
    14. מחזר את o-Xylene.
    15. שים את השקופיות על פיסת נייר לייבוש.
    16. סגור את השקופיות באמצעות בינוני הרכבה מהירה, קסילן מבוססי הרכבה.
    17. בדוק את איכות הסעיפים תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 10X (ראה איור 3 )
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. Immunostaining עבור LC3 ו MyoD ב נפגע שריר רקמות רקמות

  1. קיבוע של קטעי רקמת שריר.
    1. הכן חדר הדגירה על ידי הרטבת פיסת נייר ומניחים אותו על החלק התחתון של קופסת פלסטיק נסגר לשמור על le גבוהקרום של לחות בתוך החדר. תקן סעיפים רקמה עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1x PBS במשך 10 דקות.
      הערה: פיסת נייר רטובה משמשת כדי למנוע ייבוש המדגם. הכן PFA טרי או להשתמש PFA מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. זְהִירוּת. PFA הוא רעיל; את אבקת יש לטפל בזהירות בעת ביצוע פתרון המניות. פעולה זו צריכה להתבצע במכסה כימי, עם ציוד מגן, כולל כפפות, מעיל מעבדה, ומסכה. כמו כן, כאשר הפתרון, PFA צריך להיות מניפולציה בזהירות.
    2. הסר את PFA ולשטוף את הסעיפים עם 1x PBS עבור 5-7 דקות; חזור על שלב זה 3 פעמים.
  2. Permeabilization של קטעי רקמת שריר.
    1. צייר מחסום הידרופובי סביב סעיפים רקמות באמצעות עט pap.
      הערה: שלב זה מגדיר את פני השטח סביב סעיפים רקמות וממזער את נפח הנוגדנים המתוארים בשלבים 3.4, 3.6, 3.7, ו 3.9.
    2. לכסות את הסעיפים עם μL 200 של קר (-20 מעלות צלזיוס)מתנול ולשים את החדר דגירה אופקית בתוך מקפיא ב -20 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    3. הסר את החדר דגירה מן המקפיא, לשאוב את המתנול, לשטוף את הסעיפים עם PBS 1X עבור 5-7 דקות ב RT; חזור על שלב זה 3x.
  3. חסימה
    1. הכן פתרון בלוק טרי של 4% בסרום אלבומין בסרום (BSA) ב PBS 1x.
      הערה: פתרון BSA ניתן לאחסן עד שבוע 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. דגירה הסעיפים עם פתרון בלוק לפחות 60 דקות ב RT.
    3. הסר את פתרון החסימה.
    4. הכן 100 μL של תערובת anti-Fab על ידי דילול 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​אנטי Fab ב 1x PBS. דגירה את החלקים עם זיקה מטוהרים F מטוהרים (AB) שבר של אנטי עכבר IgG עבור 1 שעה ב RT.
  4. הדגירה נוגדן ראשוני.
    1. הכן 100 μL של תערובת נוגדן ראשוני עבור כל שקופית על ידי המסת LC3 ו נוגדנים MyoD ב BSA 4% 1x PBS. השתמש 5 מיקרוגרם /מ"ל של LC3 (נוגדנים פוליקלון ארנב) ו 10 מ"ג / ליטר של אנטי MyoD (נוגדנים עכברים מונוקלונליים). דגירה תערובת הנוגדן העיקרי לילה 4 מעלות צלזיוס.
  5. שוטף.
    1. הסר את תערובת הנוגדן העיקרי.
    2. שטפו את הסעיפים עם BSA 1% 1X PBS במשך 10 דקות; חזור על שלב זה 3x.
  6. הדגירה נוגדן משני.
    1. הכן 100 μL של תערובת נוגדן משני עבור כל שקופית. ממיסים נגד ארנב 488 (5 מיקרוגרם / מ"ל) ו עז נגד עכבר 594 (5 מיקרוגרם / מ"ל) ב 4% BSA ב 1x PBS.
      הערה: הימנע מחשיפה מוגזמת לאור כדי למנוע הלבנת fluorochrome. בצע את השלבים הבאים בחושך.
    2. דגירה הסעיפים עם תערובת הנוגדנים המשניים במשך 45 דקות ב RT.
    3. הסר את תערובת נוגדנים משני לשטוף את הסעיפים עם 1x PBS עבור 5-7 דקות; חזור על שלב זה 3x.
  7. הדגירה נוגדן ראשוני.
    1. לדלל laminiN-2 (α-2-chain) נוגדן חד שבטי (0.33 מיקרוגרם / מ"ל) ב 4% BSA ב 1x PBS באמצעות 100 μL של תערובת עבור כל שקופית. לדגור את הקטעים בתערובת נוגדן העיקרי עבור 1-2 שעות ב RT.
  8. שוטף.
    1. הסר את תערובת הנוגדן העיקרי.
    2. שטפו את הסעיפים עם BSA 1% 1X PBS במשך 10 דקות; חזור על שלב זה 3x.
  9. הדגירה נוגדן משני.
    1. הכן 100 μL של תערובת נוגדנים משני עבור כל שקופית על ידי דילול עז נגד חולדה 647 (5 מיקרוגרם / מ"ל) ב 4% BSA 1X PBS. לדגור את הקטעים בתערובת נוגדנים משני עבור 45 דקות ב RT.
    2. הסר את תערובת נוגדנים משני לשטוף את הסעיפים עם 1x PBS עבור 5-7 דקות; חזור על שלב זה 3x.
  10. 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) הדגירה.
    1. הוסף 200 μL של פתרון 300 NM DAPI 1x PBS לכל שקופית. דגירה של 5 דקות ב RT. אחסן את הפתרון DAPI ב 4 מעלות צלזיוס באפל.
    2. שטפו את הסעיפים עם 1x PBS עבור 5-7 דקות; חזור על שלב זה 3x.
  11. הרכבה של חלקי שרירים מוכתמים.
    1. הסר את עודף של פתרון כביסה מן הסעיפים.
    2. מקום 10 μL של גליצרול 1x PBS (3: 1) על קטעים מוכתמים באמצע השקופית ולהוסיף coverslip, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.

4. מיקרוסקופיה Confocal רכישה

  1. לרכוש את התמונות באמצעות מיקרוסקופ ארבעה confocal לייזר משולבת עם מערכת לכידת תמונות ותוכנה אנליטית.
    הערה: MyoD הוא מצומדות עם צבע 594 כי הוא צבע אדום בהיר פלורסנט, עם עירור אידיאלי מתאים ל 594 ננומטר לייזר (עירור: 590 ננומטר, פליטה: 617 ננומטר). LC3 הוא מצומדות עם צבע 488 כי הוא צבע ירוק בהיר פלורסנט, עם עירור אידיאלי מתאים לקו לייזר 488 ננומטר (עירור: 495 ננומטר, פליטה: 519 ננומטר). Laminin הוא מצומדות עם 647 צבע זהצבע אדום בהיר ניאון רב, עם עירור אידיאלי מתאים לקו לייזר 647 ננומטר (עירור: 650 ננומטר, פליטה: 668 ננומטר).
  2. מניחים את השקופיות במגש מיקרוסקופ ולהשתמש הגדלה 63X כדי לזהות אותות גרעיניים.תמקד באופן ידני על אזורים regenerative על ידי ריכוז שדות התחדשות פעילה, בהסתמך על מורפולוגיה שריר (ראה איור 4 ).
    הערה: בעוד שריר unperturbed, גודל myofiber הוא כמעט קבוע ( איור 4 א ), התחדשות שריר פציעה בתיווך יכול להיות מוכר על ידי הופעת myofibers קטנים יותר, המהווים את הסיבים החדש שנוצר לאחר התחדשות. יתר על כן, השריר ב התחדשות פעילה מאופיין חדירה נרחב כי הוא עשוי מקרופאגים, מבשרי פיברו אדיפוגניים, ותאים הממוקמים השרירים פגום לתזמר התחדשות שרירים ( איור 4 ב ).
  3. להעריך את מכתים immunofluorescent ב regenעל ידי התמקדות ב- MuSCs הממוקמים מתחת ללמינה הבסיסית של המיאוביפים.
  4. דגש על MuSCs כי הם חיוביים עבור מכתים MyoD וממוקם בתוך myofibers מסומן על ידי מכתים laminin (ראה איור 4 ב , חצים לבנים).
  5. השתמש לפחות 3 עכברים / קבוצת הניסוי להשתמש במיקרוסקופ לרכוש תמונות הגדלה של 63X של לפחות 7 שדות עבור כל קבוצה ניסיונית.
  6. לאחר אזורים regenerative מזוהים, להתמקד באמצעות מכתים DAPI ולאחר מכן להתאים את ערוצי יחיד אחרים.
    1. השתמש בהגדרות המיקרוסקופ הבאות: ערוץ A594 חריר 1.2 יחידה אוורירי, רווח 791; ערוץ A488 חריר 1.6 יחידה אוורירי, רווח 659; ערוץ A647 חריר 1.4 יחידה איירי, רווח 719.
  7. לאחר התאמת המוקד של ערוצים בודדים, להמשיך לרכוש את התמונות ב 1,024 x 1,024 גודל מסגרת ו 12.61 μs פיקסל לשכון.
  8. ספירת אחוז תאים חיוביים MyoD (שליטה על tהוא לתקן מיקום תחת lamina) כי הם LC3 שלילי אחוז אחוז תאים חיוביים MyoD המציגים אות LC3.
    הערה: אחוז תאים חיוביים MyoD כי התערוכה LC3 מכתים הוא readout של פרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה באתרה לזהות autophagy ב MuSCs במהלך התחדשות שרירים.

CTX בטיפולים Vivo :

השתמש ב- CTX כדי לגרום נזק שרירים בשרירים ת"א ולהשתמש בשרירים unperturbed כמו שולטת. מאז autophagy הוא דינמי מאוד, לחסום את השטף autophagic ידי ביצוע זריקות IP של CLQ ( איור 1 ). טיפול CLQ הוא חיוני כדי להעריך אם השטף autopagic פעיל או נשמר ברמה הבסיסית.

Tibialis בידוד קדמי:

לבודד את שריר ת"א, כמתואר באיור 2 , ומניחים אותו בחדר עובש בכיוון נורט כדי לקבל לאחר מכן קטעים רקמות שריר רוחבי. צעד זההוא חיוני כדי להשיג סעיפים לזהות MuSCs במיקום הנכון מתחת למימינה lamina הבסיס.

בדיקה היסטולוגית של CTX הנגרמת נזק שרירים

ודא כי פגיעה בשריר התרחשה על ידי ביצוע מכתים היסטולוגית. ביצוע H & E מכתים ולבדוק תחת הגדלה 10X: בעוד השרירים unperturbed להציג בגדלים קבועים מיופיבר, התכונות האופייניות של השרירים הפצועים כוללים הפרעה של myofibers כי הם שונים בגודל וחדירה דלקתית שופע. פרמטר נוסף כדי לאשר כי תהליך התחדשות מתרחש הוא centro-nucleation של myofibers, אשר נעדר בשרירים unperturbed והוא סימן להיווצרות של סיבים חדשים בעכברים עוברים התחדשות פעילה ( איור 3 ).

Autophagy מצמידים MyoD-poתאים סדירים במהלך התחדשות שריר:

בצע מכתים immunofluorescent לזהות MuSCs, מזוהה MyoD חיובי, המציגים אות LC3. מכתים Laminin מועיל לאתר MuSCs במצב הנכון בנישה מתחת הלמידה הבסיסית ( איור 4 ). רמות הבסיס האוטופאגי להבחין שרירי השלד unperururbed להגדיל באופן משמעותי בצירוף מקרים עם התחדשות שרירים 30 . לפיכך, עכברים uninjured לא מראים כל הפעלה MuSC, זוהה על ידי היעדר תאים MyoD חיובי ולא אות LC3. לעומת זאת, על נזק לשרירים, Myoc חיובי Myocs להיות חיובי עבור LC3, הוכחת כי תהליך autophagic מופעל במהלך התחדשות שרירים בתאי הלוויין מופעל.

בשלבים הראשונים של התגובה המתחדשת, סוגים שונים של תאים סלולריים מתמקמים באתר tהוא lesion, כולל תאים דלקתיים מבשרי פיברו adipogenic, מה שהופך את האזור הפגוע צפוף צפוף. חשוב להבחין בין כל סוגי הסלולר השונים, תוך התמקדות מיקום MuSC מתחת lamina myofiber להסתמך על חיוביות MyoD.

בתנאים הבסיסיים, LC3 מתבטא בכל מקום והוא בקושי זוהה על ידי immunofluorescence. כתוצאה של autophagy מוגבה, דפוס מכתים זה משתנה ולהיות לזיהוי בעיקר בציטופלזמה. בעת הערכת MyoD / LC3 מכתים, לשקול כי הם MuSCs תאים קטנים, כי אזור cytoplasmic מוגבל; זה למה LC3 עשוי להיראות perinuclear.

איור 1
איור 1: CTX בטיפולים Vivo . ( א ) כדי לגרום נזק לשריר, להזריק 10 μL של 10 מיקרומטר CTX direcTly בשרידי שמאל של עכברים של עכבר WT בן חודשיים. השתמש באיבר הנגדי כבקרה. ( ב ) ייצוג סכמטי של פגיעה בשריר הקרדיוטוקסין. 24 שעות לאחר הפציעה, לטפל בעכברים עם זריקות intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג CLQ כל 24 שעות במשך 4 ימים ולאחר מכן להקריב את החיות. השתמש untjated unnjured ועכברים נפגע כמו שולטת. פרוטוקול זה מאפשר את המחקר של מעורבות של תהליך autophagic במהלך התחדשות שרירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: בידוד ת"א. ( א ) נציג תמונה של ת"א כפי שהוא נראה לפני בידוד. ( ב ) לאחר חיתוך גיד דיסטלי, להחזיק את שריר ת"א על ​​ידי גיד זהירLy למשוך את השריר כלפי הסוף הפרוקסימלי (ליד הברך). ( ג ) להפלות את EDL מן שריר TA, שהוא גדול יותר שטחי יותר מאשר EDL. להפריד את ת"א מן השריר EDL על ידי משיכת שני הגידים דיסטלי בכיוונים מנוגדים. ( ד ) לאחר ת"א הוא מבודד, במקום אותו בחדר עובש, כמתואר, בכיוון נ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: CTX גורם נזק לשרירים. תמונות נציג של H & E מכתים על מקטעי רקמות transveral TA מ שליטה, uninjured ( א ) ו 5 ד pi ( B ) עכברים WT. H & E מכתים מגלה מורפולוגיה סיבים נורמליים בעכברים שליטה ( א ) ו massivE שריר נזק לחדור בשרירים נפצעו ( B ), הוכחת מורפולוגיה לקוי על הזרקת CTX. סולם בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: Autophagy מצמידים תאים MyoD חיובי במהלך התחדשות שריר. תמונות נציג של קטעים TA מ שליטה ( א ) ו פצוע ( B ) עכברים WT immunostained עם LC3 (ירוק) ו MyoD (אדום). Laminin (ציאן) מכתים סימני שריר סיבים, גרעינים הם counterstained עם DAPI (לבן). הפאנלים הנכונים מציגים תמונות מייצגות של האות המיזוג. חצים לבנים מצביעים על תאי לוויין הנמצאים מתחת ללמינה הבסיסית של סיבים המסומנים על ידי מכתים laminin. הבאNg פרוטוקול מאפשר למדידת autophagy דרך מכתים LC3 בתאי גזע שריר העובר השושלת myogenic, מסומן על ידי MyoD. סולם בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר כיצד לפקח autophagy בתאי גזע שריר השלד במהלך התחדשות שרירים מפצה. מספר נוגדנים עבור שיתוף מכתים של LC3 ו MyoD נשפטו, ואת אלה שעובדים קטעי רקמת העכבר וליצור תוצאות מוצלחות מופיעים כאן (ראה טבלה חומרים ). Permeabilization עם מתנול (ראה שלב 3.2.2) מומלץ מאוד מכתים מוצלח.

המגבלה של פרוטוקול זה קשור ההשתנות המהותית של העכברים, אשר מחייב את השימוש לפחות 3 עכברים / קבוצה ניסיונית.מתודולוגיה זו משקפת צעד קדימה במחקר autophagy במהלך התחדשות שריר השלד, כמו רוב התוצאות מעלה עד עכשיו נעשו בתאים מבודדים. הניתוח באתרו איפשר את המחקר של autophagy בסביבה הטבעית, ללא צורך בבידוד התא אשר עשוי להשפיע על תהליכים מטבוליים, כגון autophagy.

לאור הטיב הדינמי של התהליך האוטופגי, טיפולי ה- CLQ הם צעד קריטי לניטור התהליך האוטופאגי ב- vivo. CLQ חוסמת את השלבים המאוחרים יותר של התהליך האוטופאגי, מה שמוביל לצטברות LC3 כאשר אוטופאגי מתמשכת, ולכן טיפול CLQ עושה LC3 לזיהוי על ידי בדיקה באתרה.בשלבים שרירי השלד ללא הפרעה, תהליך autopagic בסיסית לא גדל עוד על ידי טיפול CLQ, כפי שנחשף על ידי היעדר הצטברות LC3 לזיהוי.עם זאת, ב regenerating השרירים, LC3 מצטבר על טיפול CLQ, הוכחת הפעלה autopagic שלב קריטי נוסף בפרוטוקול הוא הזיהוי של ה- MuSC, אשר לא ניתן להחליף אותו עם סוג סלולרי אחר המאכלס שריר פגום במהלך הזמן. תגובה משובי .הזיהוי של MuSCs תחת הלמידה הבסיסית המציגים את החיוביות MyoD הוא kEy להתמקד בתאי הלוויין.

לסיכום, אנו מציגים שיטה מתאימה באתרו כדי לזהות את מעורבותו של תהליך autophagic ב MuSCs. טכניקה זו יכולה לשמש בסיס לבדיקות של גישות פרמקולוגיות כדי אפנון autophagy, אשר עשוי לשמש כדי לשפר את התחדשות שריר השלד בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT ל LL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 WT mice
Cardiotoxin 1 Latoxan L8102
Millex-VV Merck Millipore SLVV033RS Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate salt Sigma-Aldrich C6628 Caution:
Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mL BD 324825
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura Finetek 25608-930
Tissue-Tek Cryomold Intermediate Sakura Finetek 4566
2-Methylbutane Sigma-Aldrich 277258
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma-Aldrich HHS32
Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110132
o-Xylene Sigma-Aldrich X1040 Caution:
Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Caution:
Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Eukitt - Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-007-003
LC3B Antibody Cell signaling Technology 2775
Monoclonal mouse anti-MyoD
(concentrated) clone 5.8A
DAKO - Agilent Pathology Solutions M3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody Enzo Life Sciences 4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Life technologies A11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody Life technologies A21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3, (1), (2013).
  2. Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490, (7420), 355-360 (2012).
  3. Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
  4. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (6), 329-340 (2013).
  5. Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4, (10), 1338-1341 (2005).
  6. Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  7. Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20, (3), 265-271 (2014).
  8. Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20, (3), 255-264 (2014).
  9. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506, (7488), 316-321 (2014).
  10. Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37 (2015).
  11. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20, (10), 1174-1181 (2014).
  12. Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20, (10), 1182-1186 (2014).
  13. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280, (17), 4100-4108 (2013).
  14. Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40, (2), 280-293 (2010).
  15. Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23, (2), 198-206 (2011).
  16. Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24, (1), 69-79 (2014).
  17. Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
  18. Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8, (1), e53664 (2013).
  19. Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24, (12), 635-643 (2013).
  20. Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584, (7), 1411-1416 (2010).
  21. Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16, (11), 1313-1320 (2010).
  22. Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11, (12), 2142-2152 (2015).
  23. Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7, (4), 426-428 (2011).
  24. De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418 (2012).
  25. Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23, (6), 1492-1505 (2014).
  26. Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181, (2), 583-592 (2012).
  27. Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
  28. Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12, (4), 705-706 (2016).
  29. Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (41), 12864-12869 (2015).
  30. Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23, (11), 1839-1849 (2016).
  31. Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (9), 3374-3379 (2008).
  32. Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146, (5), 682-695 (2011).
  33. Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325, (5937), 201-204 (2009).
  34. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, (1), 27-42 (2008).
  35. Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14, (3), 422-428 (2016).
  36. Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106, (48), 20405-20410 (2009).
  37. Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. (2014).
  38. Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126, (Pt 23), 5325-5333 (2013).
  39. Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10, (5), 515-519 (2012).
  40. Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2, (4), 414-426 (2014).
  41. Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33, (23), 2782-2797 (2014).
  42. Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529, (7584), 37-42 (2016).
  43. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, (1), 1-222 (2016).
<em>ב Situ</em> Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).More

Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter