Summary
アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。
Abstract
組織ホメオスタシスを保存するための重要な調節プロセスとして、自食作用が指摘されています。オートファジーは骨格筋の発達と再生に関与していることが知られており、オートファジー過程はいくつかの筋肉病変および加齢に関連する筋肉疾患に記載されている。筋修復中の衛星細胞の機能的枯渇と相関する、最近記載された自食プロセスのブロックは、能動的な自食作用が生産的な筋再生と結びついているという考えを支持する。これらのデータは、筋ジストロフィーのような正常および病的状態の両方における筋肉再生中の衛星細胞活性化におけるオートファジーの重要な役割を明らかにする。ここでは、筋肉再生条件下での成体筋幹細胞（MuSC）コンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコールを提供する。このプロトコールは、LC3のインサイチュ免疫蛍光イメージングを行うためのセットアップ方法論を説明している。対照マウスおよび損傷マウスからの筋肉組織切片中の筋原性マーカーであるMyoDとの間の相互作用を示す。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋肉再生を調整する中心的な役割を果たすMuSCコンパートメントにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。
Introduction
骨格筋再生は、成体幹細胞（Muscle Satellite Cells、MuSCs）と再生過程に関与する他の細胞型との相互作用の結果である。筋肉の恒常性および機能性は、筋肉のニッチおよび全身的な手掛かり1,2から生じる信号を組み合わせることによって維持される。生涯にわたって、MuSC機能、筋肉のニッチ、および全身手がかりの変化が報告され、高齢者の機能的能力の低下3につながる。 MuSCは基底板の下のニッチに設置され、筋肉傷害時に損傷筋肉を修復するために活性化される4,5 。生産的な再生応答を確実にするためには、MuSCが静止からの退出、自己再生、および増殖の拡大段階に必要な異なるプロセスを調整することが重要である筋原性分化6 。高齢者および筋肉慢性疾患では、これらの機能が全て損なわれ、筋機能が変化する（2,3,6,7,8,9,10,11,12,13）。
マクロオートファジー（以下、オートファジーと呼ぶ）は、組織恒常性を維持するために不可欠な重要な生物学的プロセスとして浮上している14 。自食プロセスは、細胞質、細胞小器官、およびタンパク質の一部が最終的にリソソーム経路を介して分解されて小胞に包み込まれ、毒性分子の除去およびマクロモールのリサイクルを促進する輸送メカニズムを包含するcules。これは、ストレスまたは他の悪条件の下での細胞および組織の適応を支援するためのエネルギー豊富な化合物を提供する15,16 。オートファジーは、その細胞生存活性と共に、細胞組織の状況（ 例えば、正常組織と癌組織）およびストレス刺激のタイプに依存して、細胞死誘導因子として働くことができる17,18 。
最近の証拠によれば、オートファジーは筋肉量および筋線維の完全性を維持するために必要とされる19,20 、 Duchenne筋ジストロフィー（DMD）を含む異なる筋ジストロフィー21,22,23で障害されることが報告されている24,25,26,27 、 28,29,30）。 、 35,36,37 、筋電図の生存38 。
オートファジーと骨格筋の再生能力との密接な関係は、カロリー制限がMuSCの利用可能性と活性を高めることを示したWagers研究所の研究によって予想された39 。これはいいえFoxo3-Notch軸が自己再生中に自食作用過程を活性化し、MuSCが静止状態から増殖状態に移行するという最近の観察によってさらに支持された41 。これらのデータは、老化中のMuSCの数値的および機能的低下に関連して、若年から老齢および老人性のMuSCからの基礎的な自食作用の進行的な減少と一致する42 。
最近の論文では、DMDの進行の初期段階を区別する自食作用と代償性筋再生との間に密接な関係があることを示した。従って、我々は、筋肉の再生が損なわれ、線維性組織沈着が起こる、疾患の進行の後期段階で減少した自食作用の流出を観察した。興味深いことに、我々は、再生条件において、オートファジーがMuSCにおいて活性化され、オートファジープロセスを調節することがMuSC活性化およびfuに影響を及ぼすことを示した法律30 。
まとめると、これらのデータは、正常および病理学的状態および生涯にわたる筋肉再生中のMuSCにおける自食作用プロセスを探索する緊急性を強調している。ここでは、オートファジー43のマーカーである微小管関連タンパク質1A / 1B軽鎖3（LC3）およびMyoDマーカーのin situ免疫染色を行うことにより、筋再生状態におけるMuSCにおける自食作用プロセスをモニターするためのプロトコルを提供する。筋原性系統、対照および損傷マウス由来の筋肉組織切片中に存在する。報告された方法論は、1つの特定の細胞コンパートメント、筋再生を調整する上で重要な役割を果たすMuSCにおける自食作用プロセスをモニターすることを可能にする。
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Protocol
マウスを標準動物施設手順に従って飼育し、維持した。すべての実験プロトコールは、動物福祉保証およびイタリア動物保健省の動物実験倫理委員会によって承認され、NIHのケアおよび使用ガイド実験動物。
1.オートファジーフラックスの筋肉傷害およびインビボブロック
- 筋肉傷害。
- 急性骨格筋傷害を誘発するために、約20gの重さの2ヶ月齢のC57BL / 6Jマウスの左脛骨前（TA）筋肉に10μMのカルジオトキシン（CTX）ストック20μLを直接注入する。同数の男性と女性を使用してください。摂動していない対側肢を対照として用いる。
注：0.9％塩化ナトリウム溶液中の10μMCTXはろ過し（0.22μmPVDFフィルター）、-20℃で保存する必要があります。凍結融解サイクルを繰り返さないでください。 - 私は30Gの針を備えたnsulinシリンジ、TAの中央にCTXを注射する。 TAの正確な損傷を誘発するために、注射器の針が筋肉の底部から上部まで5mmの遠位腱の近くに入るようにします（ 図1A ）。
- 急性骨格筋傷害を誘発するために、約20gの重さの2ヶ月齢のC57BL / 6Jマウスの左脛骨前（TA）筋肉に10μMのカルジオトキシン（CTX）ストック20μLを直接注入する。同数の男性と女性を使用してください。摂動していない対側肢を対照として用いる。
- 摂動していないマウスおよび傷害を受けたマウスにおける自食流の遮断。
- 24時間後の傷害（pI）、腹腔内（IP）注射（ 図1B ）により24時間毎に50mg / kgクロロキン（CLQ）を4日間投与する。
- CLQ（10mg / mL）をPBS 1Xに溶かし、0.2μm膜を通してそれをろ過する。すべてのマウスの体重を測定し、注入するCLQの量を計算します。
注：同じ日にCLQソリューションを準備して使用してください。 CLQストックは、-20℃で最大1ヶ月保存することができます。オートファジーは代謝関連のプロセスであるため、常にCLQ治療を常に同時に実行します（ つまり 、朝のbefo午前10時）。
- CLQ（10mg / mL）をPBS 1Xに溶かし、0.2μm膜を通してそれをろ過する。すべてのマウスの体重を測定し、注入するCLQの量を計算します。
- 24時間後の傷害（pI）、腹腔内（IP）注射（ 図1B ）により24時間毎に50mg / kgクロロキン（CLQ）を4日間投与する。
2.筋肉組織セクション
- マウスの犠牲。
- 損傷の5日後にマウスを安楽死させる。
- 頸椎脱臼またはCO 2による安楽死を行う（確認のために頸椎脱臼を行う）。オートファジープロセスはマウスの睡眠/食習慣に関連するので、常に、好ましくは朝（ すなわち午前10時前）にマウスを犠牲にする。
- TA分離および包含。
- 解剖の前に、マウスに70％エタノールを噴霧する。
- はさみを使用すると、腰のレベルでマウスの背部皮膚に小さな、垂直の切開（長さ3mm）を作る。皮膚の除去を簡素化するために尾と足を切断します。皮膚を尾に向かって引っ張り、それを取り除いて下にある筋肉を露出させる; 図2Aに示すように、TA筋肉は局在化するのが容易である
- 2つの鉗子の助けを借りて、遠位腱をつかむ。
- 遠位腱を切断する。 TAとextensor digitorium longus（EDL）腱はしばしば一緒に切断され、後に分離される（2.2.6参照）。
- 鉗子を使用して、腱によるTA筋肉を保持し、筋肉を近位端（膝の近く; 図2B ）に向かって慎重に引き上げる。
注：この時点で、EDLおよびTA筋肉は容易に認識され、TAはEDLより大きく、より表面的である。 - 2つの遠位腱を反対方向に引くことによって、TAをEDL筋肉から分離する（ 図2C ）。
- 近位の腱を切断する。
- 鉗子を使用して、組織を損傷することなく、筋肉を覆う薄い筋膜を除去する。
- ペーパータオルの助けを借りてサンプルの過剰な水分を除去してください。筋肉が濡れていなくても過度に乾燥していないことを確認してください。筋肉に大きなダメージを与え、次の染色を危険にさらします。
- 最適切断温度（OCT）化合物を金型の底に置き、 図2Dに示す向きでその中に筋肉を入れます。 100％イソペンタンを約3〜4cmの深さに達するまでビーカーに加える。ビーカーをポリスチレンボックス内の液体窒素と接触させる。
- 液体窒素がビーカーに入るのを避けてください。発泡泡が生成され、これが筋肉の切片に含まれて損傷することがあります。
- イソペンタンを観察し、適切な温度（-140℃〜-150℃）に達するまで待つ。適切な温度で、凍結イソペンタンの固体白色層がビーカーの底部で結晶化する。
- イソペンタンが完全に凍っている場合は、融解して凍結温度まで冷やしてから次のステップに進みます。
- prechilled鉗子を使用して、微妙に金型を下げるイソペンタンは約20〜30秒間保持する。冷凍サンプルを-80℃冷凍庫に移すまでドライアイスを入れた容器に入れます。
注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。
- 筋肉組織の凍結切片。
- -80℃で少なくとも1夜後、凍結切片作製を行う。
- クライオスタットナイフとアンチロールプレートを-20℃の冷凍庫から取り出し、それぞれのサポートにクライオスタットキャビネットに入れます。
- 図2Dに視覚化されているように、サンプルスタブ上にOCTを滴下し、凍結サンプルを垂直NS方向に置く。
- サンプルスタブをチャック上に置きます。
- アンチロールプレートをナイフに引っ張らずに、筋肉を含まないOCTを取り除くために、40μmのカットをいくつか行います。筋肉が見えるようになったら、スライスの厚さを7〜8μmに減らします。
- アンチロールプレートを下になるまで下に引きますナイフの端またはそれより少し上にある。
- 横断切片を7〜8μmの厚さに切断し、組織学的スライド当たり3〜4枚のスライスを取り付ける。
注：クライオスタットの推奨温度は-15℃〜-23℃です。衛星のニッチ位置で筋幹細胞を特定するために、その後の分析にはサンプルの断面が必要です。 - 切片の接着性を最大にするために、スライドを室温で10〜15分間保ち、抗体インキュベーション中にそれらの分離を防ぐ。
注：空気乾燥工程は免疫染色に影響を与え、あいまいな結果をもたらす可能性があります。スライドは、-80℃で数ヶ月間固定しないで保存することができます。ここでプロトコルを一時停止することができます。
- ヘマトキシリン・エオシン（H＆E）染色を行うことにより、TA筋肉の凍結切片における筋肉損傷をチェックする。
- 筋肉の質（ すなわち 、傷害、筋肉の隔離および包含の有効性）を評価するためにイオン、および凍結切片）を用いて、H＆E染色を行う。すべての実験時点について、スライドを4％PFAで10分間固定する。固定後、1x PBSのいくつかの変更でスライドをよく洗う。
注意：注意してください。 PFAは発癌物質であり、注意深く取り扱わなければならない。 - 実験のポイントごとに1つのスライドを取り、染色瓶に入れます。
- 瓶に9g / Lのヘマトキシリンを充填し、切片を覆い、8分間インキュベートする。
- ヘマトキシリンをリサイクルする。
- 瓶を流水中に10分間放置して、過剰のヘマトキシリンを除去する。
注：セクションに水を直接流さないように注意してください。 - 滅菌水で洗浄する。
- 酸性化90％エタノール中で0.5％（w / v）のエオシンで1分間切片をインキュベートする。
- エオシンをリサイクルしてください。
- 3分間滅菌水で2回洗浄する。
注記：ケミカルフードで以下の手順を実行してください。 - 切片を70％エタノールで洗浄する。
- ウォッシュ90％のエタノールを含むセクション。
- 100％エタノールで切片を洗浄する。
- 切片を0.879g / mLのo-キシレンでインキュベートする。
注意：注意してください。 o-キシレンは引火性があり、適度に有毒である。手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を着用し、化学フードの下で操作してください。 - o-キシレンをリサイクルしてください。
- スライドを紙の上に置き、乾燥させます。
- クイック・ハード・キシレン・ベースのマウント・メディアを使用してスライドを閉じます。
- 光学顕微鏡下で10倍の倍率で断面の品質を確認する（ 図3参照）
注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。
- 筋肉の質（ すなわち 、傷害、筋肉の隔離および包含の有効性）を評価するためにイオン、および凍結切片）を用いて、H＆E染色を行う。すべての実験時点について、スライドを4％PFAで10分間固定する。固定後、1x PBSのいくつかの変更でスライドをよく洗う。
3.損傷した筋肉組織切片におけるLC3およびMyoDの免疫染色
- 筋肉組織切片の固定。
- 1枚の紙を濡らし、それを密閉可能なプラスチック製の箱の底に置くことによってインキュベーションチャンバーを準備し、高レベルを維持するチャンバー内の湿度は非常に高い。 10分間1×PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で組織切片を固定する。
注：湿った紙を使用してサンプルを乾燥させないようにします。新鮮なPFAを調製するか、-20℃で保存したPFAを使用してください。あぶない。 PFAは有毒である。原液を作る際に粉末を注意して取り扱わなければならない。この作業は、手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を備えた化学フードで実施する必要があります。また、溶液中でPFAを注意深く操作する必要があります。 - PFAを除去し、セクションを1×PBSで5〜7分間洗浄する。この手順を3回繰り返します。
- 1枚の紙を濡らし、それを密閉可能なプラスチック製の箱の底に置くことによってインキュベーションチャンバーを準備し、高レベルを維持するチャンバー内の湿度は非常に高い。 10分間1×PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で組織切片を固定する。
- 筋組織切片の透過化。
- パップペンを用いて組織切片の周りに疎水性障壁を描く。
注：このステップは、組織切片の周りの表面を規定し、ステップ3.4,3.6,3.7および3.9に記載される抗体の量を最小にする。 - 切片を200μLの冷（-20℃）メタノールで洗浄し、インキュベーションチャンバーをフリーザー内で水平に-20℃で5分間置く。
- 冷凍庫からインキュベーションチャンバーを取り出し、メタノールを吸引し、RTで5-7分間1X PBSで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。
- パップペンを用いて組織切片の周りに疎水性障壁を描く。
- ブロッキング
- PBS 1x中の4％ウシ血清アルブミン（BSA）の新しいブロック溶液を調製する。
注：BSA溶液は4℃で1週間保存することができます。 - 切片をブロック溶液で少なくとも60分間RTでインキュベートする。
- ブロッキング溶液を除去する。
- 1×PBS中20μg/ mLの抗Fabを希釈することにより100μLの抗Fab混合物を調製する。切片を、抗マウスIgGの非結合親和性精製F（ab）断片と室温で1時間インキュベートする。
- PBS 1x中の4％ウシ血清アルブミン（BSA）の新しいブロック溶液を調製する。
- 一次抗体インキュベーション。
- 1倍PBS中の4％BSAにLC3およびMyoD抗体を溶解することにより、各スライドの100μLの一次抗体混合物を調製する。 5μg/mLの抗LC3（ウサギポリクローナル抗体）および10mg / Lの抗MyoD（マウスモノクローナル抗体）を添加した。一次抗体混合物を4℃で一晩インキュベートする。
- 洗濯。
- 一次抗体混合物を除去する。
- 10分間1X PBS中1％BSAで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。
- 二次抗体インキュベーション。
- 各スライドの二次抗体ミックスを100μL調製します。 1x PBS中の4％BSA中でヤギ抗ウサギ488（5μg/ mL）およびヤギ抗マウス594（5μg/ mL）を溶解する。
注：蛍光色素の漂白を防ぐために、光に過度の暴露を与えないでください。暗い場所で以下の手順を実行します。 - セクションを二次抗体ミックスとRTで45分間インキュベートする。
- 二次抗体混合物を除去し、1×PBSで5〜7分間切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。
- 各スライドの二次抗体ミックスを100μL調製します。 1x PBS中の4％BSA中でヤギ抗ウサギ488（5μg/ mL）およびヤギ抗マウス594（5μg/ mL）を溶解する。
- 一次抗体インキュベーション。
- 薄層スライド1つにつき100μLの混合物を用いて、1×PBS中の4％BSA中のn-2（α-2鎖）モノクローナル抗体（0.33μg/ mL）一次抗体ミックス中の切片をRTで1〜2時間インキュベートする。
- 洗濯。
- 一次抗体混合物を除去する。
- 10分間1X PBS中1％BSAで切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。
- 二次抗体インキュベーション。
- 1X PBS中の4％BSA中のヤギ抗ラット647（5μg/ mL）を希釈することにより、各スライドの二次抗体混合物100μLを調製する。二次抗体ミックス中の切片をRTで45分間インキュベートする。
- 二次抗体混合物を除去し、1×PBSで5〜7分間切片を洗浄する。このステップを3回繰り返します。
- 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）インキュベーション。
- 各スライドに1x PBS中の300nM DAPI溶液200μLを加える。 RTで5分間インキュベートする。 4℃でDAPI溶液をダーク。
- セクションを1×PBSで5〜7分間洗浄する。このステップを3回繰り返します。
- 染色された筋肉部分を取り付ける。
- セクションから余分な洗浄液を除去する。
- スライドの真ん中に染色されたセクションに1×PBS（3：1）にグリセロール10μLを置き、気泡の形成を避けて、カバースリップを加える。
4.共焦点顕微鏡の取得
- 画像キャプチャシステムと分析ソフトウェアを統合した4レーザー共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。
注：MyoDは、594nmレーザー（励起：590nm、発光：617nm）に理想的に適した励起を有する、明るい赤色蛍光色素である594色素とコンジュゲートされる。 LC3は、488nmのレーザーライン（励起：495nm、発光：519nm）に理想的に適した励起を伴って、明るい緑色蛍光色素である488色素と結合している。ラミニンは、647色素とコンジュゲートされており、647nmレーザーライン（励起：650nm、発光：668nm）に理想的に適した、明るい遠赤色蛍光染料である。 - スライドを顕微鏡トレイに置き、核信号を検出するために63倍の倍率を使用します。筋肉の形態に依存して、能動的再生のフィールドを中心にして手動で再生領域に焦点を当てます（ 図4参照）。
注：摂動していない筋肉では、筋繊維のサイズは事実上一定です（ 図4A ）。損傷後の筋肉再生は、再生後に新たに形成された繊維である、より小さな筋繊維の出現によって認識することができます。さらに、能動的再生における筋肉は、マクロファージ、線維脂肪生成前駆体、および損傷した筋肉に局在化して筋再生を調整する細胞（ 図4B ）からなる広範な浸潤物を特徴とする。 - 再生中の免疫蛍光染色を評価するmyofibersの基底板の下に位置するMuSCに焦点を当てることにより、非侵襲性領域を検出する。
- MyoD染色に陽性であり、ラミニン染色で標識された筋線維内に位置するMuSCに焦点を当てる（ 図4B 、白矢印参照）。
- 少なくとも3匹のマウス/実験群を使用し、各実験群について少なくとも7欄の63倍の拡大像を得るために顕微鏡を使用する。
- 再生領域が同定されたら、DAPI染色を用いて焦点を合わせ、他の単一チャネルを調整する。
- 以下の顕微鏡設定を使用してください。チャンネルA594ピンホール1.2エアリーユニット、ゲイン791;チャネルA488ピンホール1.6エアリーユニット、ゲイン659;チャンネルA647ピンホール1.4エアリーユニット、ゲイン719。
- 単一チャンネルの焦点を調整した後、1,024×1,024のフレームサイズと12.61μsのピクセルドウェルで画像を取得します。
- MyoD陽性細胞のパーセンテージをカウントする（tLC3陰性であるMyoD陽性細胞のパーセンテージをLC3シグナルと比較して示す図である。
注：LC3染色を示すMyoD陽性細胞のパーセンテージは、このプロトコールの読み取り値です。
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Representative Results
このプロトコールは、筋肉再生中のMuSCにおける自食作用を検出するための有効なin situ方法を記載している。
CTX インビボ治療：
TA筋肉に筋肉損傷を誘発するためにCTXを使用し、対照として摂動していない筋肉を使用する。オートファジーは非常に動的なので、CLQ（ 図1 ）のIP注射を実行することによってautophagic流束をブロックする。 CLQ治療は、自食性フラックスが活性であるか、または基礎レベルで維持されているかを評価するために不可欠である。
脛骨前部分離：
図2で説明したように、TA筋肉を分離し、それを横断方向の筋肉組織切片を得るためにNS方向の金型チャンバーに入れる。このステップセクションを達成し、筋原基底板の下の適切な位置でMuSCを同定するために重要である。
CTX誘発筋損傷の病理学的検査
組織学的染色を行うことによって筋肉傷害が起こったことを確認する。 H＆E染色を行い、10倍の倍率でチェックする：摂動していない筋肉は一般に不変の筋線維サイズを示すが、損傷した筋肉の典型的な特徴は、大きさが異なり、炎症性浸潤が豊富な筋繊維の破壊である。再生過程が起こっていることを確認するもう1つのパラメータは、摂動していない筋肉には存在しない筋繊維の中心核形成であり、活発な再生を受けるマウスでは新しい繊維の形成の兆候です（ 図3 ）。
オートファジーはMyoD-Poに結合されています筋再生中の陽性細胞：
LC3シグナルを示すMyoD陽性であると同定されたMuSCを検出するために免疫蛍光染色を行う。ラミニン染色は、基底板の下のニッチの適切な位置にMuSCを配置するのに役立ちます（ 図4 ）。オートファジーの基底レベルは、摂動のない骨格筋を区別し、筋肉再生との偶然性が有意に増加する30 。従って、損傷を受けていないマウスは、MyoD陽性細胞の非存在およびLC3シグナルなしで検出されるMuSC活性化を全く示さない。逆に、筋損傷の際、MyoD陽性MuSCはLC3について陽性となり、自家作用プロセスが活性化衛星細胞における筋再生中に活性化されることを実証する。
再生応答の初期段階の間に、異なる細胞型はtの部位に局在する炎症細胞および線維脂肪生成前駆体を含む病変であり、損傷領域が密集し過ぎる。筋電図の下のMuSCの位置に焦点を当て、MyoDの陽性に頼って、すべての異なる細胞型を区別することが重要です。
基底状態では、LC3は遍在的に発現され、免疫蛍光によってほとんど検出されない。上昇したオートファジーの結果、この染色パターンは変化し、主に細胞質において検出可能となる。 MyoD / LC3染色を評価する場合、MuSCは小さい細胞であり、細胞質領域は限られていると考えてください。これはLC3が核周囲に見える理由です。
図1：CTX インビボ治療。 （ A ）筋損傷を誘発するために、10μLの10μMCTX direc2ヵ月齢のWTマウスの左のTA筋肉に罹患した。対側肢を対照として使用する。 （ B ）カルディオトキシン誘発筋傷害の模式図。傷害の24時間後、マウスを24時間毎に50mg / kgのCLQの腹腔内注射で4日間処置し、次いで動物を屠殺する。処置していない損傷していないマウスを対照として使用する。このプロトコールは、筋肉再生中の自食作用過程の関与の研究を可能にする。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：TA分離。 （ A ）分離前に見えるTAの代表的な画像。 （ B ）遠位の腱を切断した後、腱でTA筋肉を保持し、筋肉を近位端（膝の近く）に向かって引き上げる。 （ C ）EDLをEDLよりも大きく、より表面的なTA筋肉から区別する。 2つの遠位腱を反対方向に引っ張って、TAをEDL筋肉から分離する。 （ D ）TAが単離されたら、前述のようにNS方向にモールドチャンバーに入れます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：CTXは筋肉の損傷を誘発します。対照、非損傷（ A ）および5dpi（ B ）WTマウスからのTA横断組織切片上のH＆E染色の代表的画像。 H＆E染色は、対照マウス（ A ）および大腸炎筋肉の損傷および傷害された筋肉への浸潤（ B ）、CTX注入時の形態の異常を示す。スケールバー=50μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：筋肉再生中のオートファジーは、MyoD陽性細胞に結合しています。 LC3（緑）およびMyoD（赤）で免疫染色した対照（ A ）および損傷（ B ）WTマウスからのTA切片の代表的な画像。ラミニン（シアン）染色は筋線維をマークし、核はDAPI（白）で対比染色する。右のパネルは、マージ信号の代表的な画像を示しています。白い矢印は、ラミニン染色によってマークされた繊維の基底板の下にある衛星細胞を示す。フォロイMyoDでマークされた筋原性系統を有する筋肉幹細胞においてLC3染色によりオートファジーを測定することができる。スケールバー=50μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコールは、代償性筋再生中に骨格筋幹細胞におけるオートファジーをモニターする方法を記載する。 LC3とMyoDの同時染色のためのいくつかの抗体が試され、マウス組織切片で働き、成功した結果を創り出す抗体がここに掲載されています（ 材料表を参照）。メタノールによる透過処理（ステップ3.2.2参照）は、染色を成功させるために強く推奨されます。
このプロトコールの限界は、少なくとも3匹のマウス/実験群の使用を強要するマウスの本質的な変動性と関連している。この方法論は、骨格筋再生中のオートファジーの研究における前進を反映しているこれまでのところ、単離された細胞で作製された。 その場分析は、自食作用のような代謝プロセスに影響を与え得る細胞単離を必要とせずに、自然環境でのオートファジーの研究を可能にした。
オートファジープロセスの非常に動的な性質を考慮すると、CLQ処理はインビボでの自食作用プロセスをモニタリングするための重要なステップであり、オートファジープロセスの後期をブロックし、オートファジーが持続するとLC3の蓄積を引き起こす。 LC3の検出が不可能であることから明らかなように、摂食を受けていない骨格筋においては、CLQ処理によって基礎自食作用はさらに増加しないが、筋肉を再生する際にLC3がCLQ処理により蓄積し、午前10時にマウスを犠牲にすることが肝要である。このプロトコールのもう一つの重要なステップは、MuSCの同定である.MuSCは他の細胞型と交換してはならない。 MyoD陽性を示す基底板下のMuSCの同定は、k衛星セルに焦点を当てる。要約すると、本発明者らは、MuSCにおける自食作用プロセスの関与を検出するのに適したin situ方法を提示する。この技術は、正常および病理学的状態における骨格筋再生を改善するために使用され得る、オートファジー調節に対する薬理学的アプローチの試験の基礎として役立ち得る。
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Disclosures
著者は何も開示していない
Acknowledgments
この研究は、NIAMS AR064873、Epigen Project PBによって支持された。 P01.001.019 / Progetto BandieraエピゲノムIFTからLL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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