Summary
활성 autophagy는 근육 줄기 세포 (MuSC) 활성화에 필수적인 생산적인 근육 재생과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 LC3의 현장 검출을위한 프로토콜을 제공합니다. LC3는 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편의 MyoD- 양성 MuSC에서의자가 작용 마커입니다.
Abstract
증가하는 증거는 조직 항상성을 보존하기위한 중요한 조절 과정으로서의 autophagy를 가리킨다. autophagy는 골격근 발달과 재생에 관여하며, autophagic 과정은 여러 가지 근육 병리학 및 연령 관련 근육 질환에 기술되어있는 것으로 알려져 있습니다. 근육 수리 중 위성 세포의 기능적 고갈과 관련이있는 최근에 설명 된 autophagic 과정의 블록은 활동적인 autophagy가 생산적인 근육 재생과 결합된다는 개념을지지합니다. 이 자료는 근이영양증과 같은 정상 및 병리학 적 조건 모두에서 근육 재생 중에 인공위성 세포 활성화에서의 autophagy의 중요한 역할을 밝힙니다. 여기, 우리는 근육 재생 조건 동안 성인 근육 줄기 세포 (MuSC) 구획에서 autophagic 과정을 모니터링하기위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 LC3의 현장 면역 형광 이미징을 수행하는 설치 방법을 설명합니다.utophagy 마커, MyoD, 근원 계통 마커를 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편에서 관찰 하였다. 보고 된 방법론은 근육 재생을 조율하는 데 중심적인 역할을하는 특정 세포 구획 인 MuSC 구획에서자가 식사 과정을 모니터링 할 수있게합니다.
Introduction
골격근 재생은 성체 줄기 세포 (Muscle Satellite Cells, MuSCs)와 재생 과정에 관여하는 다른 세포 유형 사이의 상호 작용의 결과입니다. 근육의 항상성과 기능은 근육 틈새와 전신 신호 1 , 2 에서 발생하는 결합 된 신호에 의해 유지됩니다. 평생 동안 MuSC 기능, 근육 틈새 및 체계적 단서의 변화가보고되어 고령자의 기능적 능력이 저하됩니다 3 . MuSC는 기저 층 아래의 틈새에 설치되며, 근육 손상시 손상된 근육을 복구하기 위해 활성화됩니다 4 , 5 . 생산적인 재생 반응을 보장하기 위해서는 MuSC가 정지, 자기 재생 및 증식 단계에서 벗어나는 데 필요한 여러 과정을 조정하는 것이 중요합니다근원적 인 차별화 6 . 노인과 근력 만성 질환에서 이러한 모든 기능이 손상되어 근육 기능이 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13으로 변경 됩니다.
Macroautophagy (이하 autophagy 라 함)는 조직의 항상성 유지에 필수적인 중요한 생물학적 과정으로 부상하고 있습니다. autophagic 과정은 세포질, 세포 소기관 및 단백질의 일부가 최종적으로 lysosome 경로를 통해 분해되어 독성 분자의 제거와 거대 분자의 재생을 촉진시키는 소포로 삼켜지는 인신 매매 (trafficking) 메커니즘을 포함합니다cules. 이것은 스트레스 나 다른 악조건 하에서 세포 및 조직 적응을 돕기 위해 에너지가 풍부한 화합물을 제공합니다 15 , 16 . 그것의 세포 생존 활동과 함께, autophagy는 또한 세포 조직 문맥 ( 예를 들면, 정상 조직 대 암 조직) 및 긴장 자극 17,18 의 유형에 따라서 세포 죽음 유도자로 작동 할 수있다.
최근의 증거에 따르면 autophagy는 근육 질량과 근육 섬유 무결성을 유지하는 데 필요하며 Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) 24 , 25 , 26 , 27을 비롯한 다양한 근이영양증 21 , 22 , 23 에서 장애가 있다고보고되었습니다 32 , 33 , 34 , 35 , 근육 질량의 감소 (sarcopenia라고도 함) 32 , 33 , 34 (p> , 28 , 29 , 30) 와 같은 노인에서 autophagic 과정의 점진적 감소가 관찰되었다. , 35 , 36 , 37 그리고 근전도 생존 38 .
autophagy와 골격 근육의 재생 잠재력 사이의 밀접한 관계는 Wagers 실험실의 연구에서 칼로리 제한이 MuSC 가용성과 활동을 향상 시킨다는 것을 보여주었습니다 39 . 이 아니오기능은 Foxo3-Notch 축이자가 재생 과정에서 자아 식 과정을 활성화시키고 MuSC가 정지 상태에서 증식 상태로 전환된다는 최근 관찰에 의해 뒷받침되었다. 이 데이터는 노화 동안 MuSC의 수치 적 및 기능적 감소와 관련하여 젊은에서 노인 및 노인 성인 MuSC 로의 기저 autophagy의 점진적인 감소와 일치한다.
최근 논문에서, 우리는 DMDF 진행의 초기 단계를 구별하는 보상 근육 재생과 autophagy 사이의 밀접한 관계를 증명했습니다. 따라서, 우리는 근육 재생이 손상되고 섬유화 조직 침착이 발생하는 질병 진행의 후기 단계에서 감소 된자가 연쇄 플럭스를 관찰했다. 흥미롭게도 우리는 재생 조건에서 autophagy가 MuSC에서 활성화되고, autophagic 과정을 조절하는 것이 MuSC 활성화 및 fu의무 30 .
종합적으로, 이러한 데이터는 정상 및 병리학 적 조건에서 그리고 수명 전반에 걸쳐 근육 재생 동안 MuSC에서 자이 필드 과정을 탐색 할 긴급 성을 강조한다. 여기에서 우리는 autophagy 43 의 마커 인 미세 소관 연합 단백질 1A / 1B-L 鎖 사슬 3 (LC3)과 MyoD의 마커 인 in situ immunostaining을 수행함으로써 근육 재생 조건에서 MuSC에서의 autophagic 과정을 모니터링하는 프로토콜을 제공합니다. myogenic 혈통, 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편에서. 보고 된 방법론은 근육 재생을 조율하는 데 핵심적인 역할을하는 특정 세포 구획 인 MuSC에서자가 식사 과정을 모니터링 할 수있게합니다.
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Protocol
마우스를 표준 동물 시설 절차에 따라 사육하고 유지하였으며, 모든 실험 프로토콜은 동물 복지 보장 및 이탈리아 동물 보건부의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았으며, NIH의 관리 및 사용 가이드 실험실 동물.
1. Autophagic Flux의 근육 손상과 In Vivo 블록
- 근육 부상.
- 급성 골격근 손상을 유도하기 위해 약 20 g 무게의 2 개월 된 C57BL / 6J 마우스의 왼쪽 경골 전방 (TA) 근육에 10 μM cardiotoxin (CTX) 스톡 20 μL를 직접 주입하십시오. 동등한 수의 남성과 여성을 사용하십시오. 교란되지 않은 반대쪽 다리를 대조군으로 사용하십시오.
참고 : 0.9 % 염화나트륨 용액에서 10 μM CTX는 여과해야하며 (0.22 μm PVDF 필터) -20 ° C에서 보관해야합니다. 반복 된 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. - i를 사용하여30 G 주사 바늘이 달린 주사 주사기 NS의 중앙에 CTX를 주사하십시오. TA에서 정확한 손상을 유도하려면 주사기의 바늘이 근육의 바닥에서 꼭대기까지 5 mm 깊이의 말단 힘줄 근처에 들어서는지 확인하십시오 ( 그림 1A ).
- 급성 골격근 손상을 유도하기 위해 약 20 g 무게의 2 개월 된 C57BL / 6J 마우스의 왼쪽 경골 전방 (TA) 근육에 10 μM cardiotoxin (CTX) 스톡 20 μL를 직접 주입하십시오. 동등한 수의 남성과 여성을 사용하십시오. 교란되지 않은 반대쪽 다리를 대조군으로 사용하십시오.
- 교란이없는 손상된 쥐에서의 자폐증 플럭스 차단.
- autophagic 플럭스, 24 h Post-Injury (pi)를 평가하기 위해 복강 내 (IP) 주입 ( 그림 1B )에 의해 24 시간마다 50 mg / kg 클로로퀸 (CLQ)을 4 일간 투여하십시오.
- PBS 1 X에 CLQ (10 MG / ML)를 용해하고 0.2 μm의 막을 통해 그것을 필터링합니다. 모든 마우스의 무게를 측정하고 주입 할 CLQ 양을 계산합니다.
참고 : 같은 날 CLQ 솔루션을 준비하고 사용하십시오. CLQ 보관은 -20 ° C에서 1 개월까지 보관할 수 있습니다. autophagy는 대사 관련 과정이기 때문에 항상 CLQ 치료를 항상 동시에 수행하십시오 ( 예 : 아침에 befo오전 10시).
- PBS 1 X에 CLQ (10 MG / ML)를 용해하고 0.2 μm의 막을 통해 그것을 필터링합니다. 모든 마우스의 무게를 측정하고 주입 할 CLQ 양을 계산합니다.
- autophagic 플럭스, 24 h Post-Injury (pi)를 평가하기 위해 복강 내 (IP) 주입 ( 그림 1B )에 의해 24 시간마다 50 mg / kg 클로로퀸 (CLQ)을 4 일간 투여하십시오.
2. 근육 조직 섹션
- 마우스 희생.
- 상해 5 일 후 마우스를 안락사.
- 자궁 경부 탈구 또는 CO 2 에 의한 안락사 수행 (확인을 위해 자궁 경관 전위가 뒤따라야 함). autophagy 과정은 마우스의 수면 / 습관과 관련이 있기 때문에 항상 아침에 ( 예 : 오전 10시 이전에) 마우스를 동시에 희생합니다.
- TA 격리 및 포함.
- 해부하기 전에 70 % 에탄올을 마우스에 뿌리십시오.
- 가위를 사용하면 허리의 높이에서 마우스의 등쪽 피부에 작고 수직 인 절개 (길이 3 mm)를 만듭니다. 꼬리와 발을 잘라서 피부 제거를 단순화하십시오. 피부를 꼬리쪽으로 당기고 제거하여 밑에있는 근육을 노출시킵니다. 도 2A 에 도시 된 바와 같이, TA 근육은 국소화하기 쉽다
- 두 포셉의 도움으로 말초 힘줄을 파악하십시오.
- 원위 힘줄을 자르십시오; TA와 extensor digitorium longus (EDL) 힘줄은 종종 절단되어 나중에 분리됩니다 (2.2.6 단계 참조).
- 집게를 사용하여 힘줄로 조교근을 잡고 조심스럽게 근육을 근위 말단 (무릎 부근; 그림 2B )쪽으로 당깁니다.
참고 :이 시점에서 EDL 및 TA 근육은 쉽게 인식 할 수 있으며 TA는 EDL보다 크고 표면적입니다. - 두 개의 말초 힘줄을 반대 방향으로 잡아 당김으로써 TA를 EDL 근육과 분리하십시오 ( 그림 2C ).
- 근위 힘줄을 자르십시오.
- 포셉을 사용하여 조직을 손상시키지 않고 근육을 덮고있는 얇은 근막을 제거하십시오.
- 종이 타월로 시료의 과도한 수분을 제거하십시오. 과도한 수분이 sig를 생성하므로 근육이 젖지도 않고 지나치게 건조하지 않도록하십시오.근육에 심각한 손상을 입히고 다음 염색을 위태롭게합니다.
- 몰드 바닥에 최적 절단 온도 (OCT) 화합물을 놓고 그림 2D에 표시된 방향으로 그 안에 근육을 놓습니다. 100 % 이소 펜탄을 약 3 ~ 4cm 깊이에 도달 할 때까지 비이커에 넣으십시오. 비커를 폴리스티렌 상자에 액체 질소와 접촉시킵니다.
- 액체 질소가 비커에 들어 가지 않도록하십시오. 발포성 포말이 생기므로 포말에 영향을 미치고 근육 부위가 손상 될 수 있습니다.
- 이소 펜탄을 관찰하고 적절한 온도 (-140 ° C ~ -150 ° C)에 도달 할 때까지 기다리십시오. 적절한 온도에서 냉동 된 이소 펜탄의 단단한 흰색 층이 비이커 바닥에서 결정화됩니다.
- 이소 펜탄이 완전히 고체가 얼면 녹고 다음 단계로 진행하기 전에 얼어서 온도를 낮추십시오.
- prechilled 집게를 사용하여 미묘하게 곰팡이를로 낮추십시오약 20-30 초 동안 이소 펜탄. 냉동 샘플을 -80 ° C의 냉동고에 옮길 때까지 드라이 아이스가 담긴 용기에 넣으십시오.
참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다.
- 근육 조직 cryosections.
- -80 ° C에서 적어도 한 밤 후, cryosectioning을 수행하십시오.
- -20 ° C의 냉동고에서 저온 유지 장치 나이프와 안티 롤 플레이트를 꺼내어 각각의 지지대에 저온 유지 장치 캐비닛에 놓습니다.
- 샘플 스텁에 OCT 한 방울을 올려 놓고 그림 2D 에서 시각화 된 바와 같이 고정 된 샘플을 수직 NS 방향으로 놓습니다.
- 샘플 스터브를 척에 올려 놓습니다.
- 안티 - 롤 플레이트를 칼에서 당기지 않고 40μm에서 약간의 절개를하여 근육을 포함하지 않는 OCT를 제거하십시오. 근육이 보일 때 슬라이스 두께를 7-8 μm로 줄이십시오.
- 롤 방지 플레이트가 제자리에 고정 될 때까지 당깁니다.칼의 가장자리 또는 조금 위에.
- 조직 절편 당 7-8 μm 두께의 횡단면 절편을 만들고 3-4 절편을 장착하십시오.
참고 : 권장되는 저온 유지 장치 온도는 -15 ° C ~ -23 ° C입니다. 샘플의 횡단면은 위성 틈새 위치에서 근육 줄기 세포를 찾아내는 후속 분석에 필요합니다. - 섹션의 준수를 극대화하기 위해 슬라이드를 실온에서 10-15 분 동안 유지하여 항체 배양 중 분리를 방지하십시오.
참고 : 공기 건조 단계는 모호한 결과를 제공하는 면역 염색에 영향을 줄 수 있습니다. 슬라이드는 -80 ° C에서 몇 달 동안 비 고정으로 보관할 수 있습니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다.
- Hematoxylin Eosin (H & E) 염색을 시행하여 TA 근육의 절제술시 근육 손상을 검사합니다.
- 근육의 품질을 평가하기 위해 ( 즉 , 부상, 근육 격리 및 inclus의 효과이온 및 cryosections), H & E 얼룩을 수행합니다. 모든 실험 시점에 대해 하나의 슬라이드를 4 % PFA로 10 분 동안 고정시킵니다. 고정 후 1x PBS의 여러 변화에서 슬라이드를 잘 씻어.
참고 :주의. PFA는 발암 물질이므로 신중하게 취급해야합니다. - 모든 실험 포인트에 대해 하나의 슬라이드를 가져 와서 염색 용기에 넣으십시오.
- 섹션이 덮여 8 분 동안 품어 때까지 9g / L hematoxylin 항아리를 채우십시오.
- 헤 마톡 실린을 재활용하십시오.
- 항아리를 흐르는 물에 10 분 동안 두어 과량의 헤 마톡 실린을 제거하십시오.
참고 : 섹션에 직접 물이 흐르지 않도록하십시오. - 멸균 된 물로 씻으십시오.
- 산성화 된 90 % 에탄올에서 0.5 분 (w / v)의 에오신으로 1 분간 절편을 부화시킨다.
- eosin을 재활용하십시오.
- 3 분 / 세척을 위해 멸균 물로 두 번 씻으십시오.
참고 : 화학 물질 후드에서 다음 단계를 수행하십시오. - 절편을 70 % 에탄올로 씻으십시오.
- 빨래90 % 에탄올이있는 섹션.
- 섹션을 100 % 에탄올로 씻으십시오.
- 절편을 0.879 g / mL o-Xylene으로 배양하십시오.
참고 :주의. o-Xylene은 인화성이며 중독성이 있습니다. 장갑, 실험용 코트 및 가면을 포함하여 보호 장비를 착용하고 화학 약품으로 처리하십시오. - o-Xylene을 재활용하십시오.
- 슬라이드를 종이 위에 올려 건조시킵니다.
- 빠른 경화, 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 닫습니다.
- 광학 현미경으로 단면 배율을 10 배로 확인하십시오 ( 그림 3 참조)
참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다.
- 근육의 품질을 평가하기 위해 ( 즉 , 부상, 근육 격리 및 inclus의 효과이온 및 cryosections), H & E 얼룩을 수행합니다. 모든 실험 시점에 대해 하나의 슬라이드를 4 % PFA로 10 분 동안 고정시킵니다. 고정 후 1x PBS의 여러 변화에서 슬라이드를 잘 씻어.
3. 손상된 근육 조직 섹션의 LC3 및 MyoD에 대한 면역 염색
- 근육 조직 섹션의 고정.
- 종이를 적신 후 높은 파일을 유지하기 위해 닫을 수있는 플라스틱 상자의 바닥에 배치하여 부화 챔버를 준비하십시오챔버 내의 습도 (vel). 10 분 동안 1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 조직 절편을 고정시킨다.
참고 : 젖은 종이는 시료 건조를 방지하는 데 사용됩니다. 신선한 PFA를 준비하거나 -20 ° C에 보관 된 PFA를 사용하십시오. 주의. PFA는 독성이있다. 원액을 만들 때 파우더를 조심스럽게 다루어야합니다. 이 작업은 장갑, 실험용 코트 및 마스크와 같은 보호 장비가있는 화학 물질 후드에서 수행해야합니다. 또한 용액에있을 때 PFA는 조심스럽게 조작되어야합니다. - PFA를 제거하고 5-7 분 1X PBS로 섹션을 씻어; 이 단계를 3 번 반복하십시오.
- 종이를 적신 후 높은 파일을 유지하기 위해 닫을 수있는 플라스틱 상자의 바닥에 배치하여 부화 챔버를 준비하십시오챔버 내의 습도 (vel). 10 분 동안 1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 조직 절편을 고정시킨다.
- 근육 조직 절편의 침투.
- pap 펜을 사용하여 조직 절편 주위에 소수성 장벽을 그립니다.
참고 :이 단계는 조직 절편 주위의 표면을 정의하고 3.4, 3.6, 3.7 및 3.9 단계에서 설명한 항체의 양을 최소화합니다. - 저온 (-20 ° C) 200 μL,메탄올로 옮기고 -20 ° C에서 5 분 동안 냉동기 안에 수평으로 배양 챔버를 놓습니다.
- 냉동실에서 부화 챔버를 제거하고, 메탄올을 대기음, RT에서 5-7 분 동안 1X PBS로 섹션을 씻어 라. 이 단계를 3 번 반복하십시오.
- pap 펜을 사용하여 조직 절편 주위에 소수성 장벽을 그립니다.
- 블로킹
- PBS 1x에 4 % Bovine Serum Albumin (BSA)의 새로운 블록 용액을 준비하십시오.
참고 : BSA 용액은 4 ° C에서 1 주일 동안 저장할 수 있습니다. - RT에서 최소 60 분 동안 블록 솔루션으로 섹션을 품어.
- 차단 용액을 제거하십시오.
- 1x PBS에서 20 μg / mL anti-Fab를 희석하여 항 Fab 혼합물 100 μL를 준비합니다. 절편을 RT에서 1 시간 동안 항 - 마우스 IgG의 비 - 결합 친화도 - 정제 F (ab) 단편으로 인큐베이션한다.
- PBS 1x에 4 % Bovine Serum Albumin (BSA)의 새로운 블록 용액을 준비하십시오.
- 일차 항체 배양.
- 1 배 PBS에서 4 % BSA에 LC3 및 MyoD 항체를 용해하여 각 슬라이드에 대한 기본 항체 믹스 100 μL를 준비합니다. 5 μg /mL의 항 -LC3 (토끼 폴리 클론 항체) 및 10mg / L의 항 -MyoD (마우스 모노클로 날 항체)를 첨가 하였다. 밤새 1 차 항체 혼합물을 4 ° C에서 인큐베이션하십시오.
- 세척.
- 일차 항체 혼합물을 제거합니다.
- 10 분 1X PBS에서 1 % BSA로 섹션을 씻으십시오; 이 단계를 3 번 반복하십시오.
- 이차 항체 배양.
- 각 슬라이드에 대한 보조 항체 믹스 100 μL를 준비합니다. 1x PBS에 4 % BSA에서 염소 안티 - 토끼 488 (5 μg / ML)과 염소 안티 - 마우스 594 (5 μg / ML)를 해산.
참고 : 형광 염색 표백을 방지하기 위해 빛에 과도한 노출을 피하십시오. 어둠 속에서 다음 단계를 수행하십시오. - RT에서 45 분 동안 보조 항체 믹스와 섹션을 품어.
- 2 차 항체 혼합물을 제거하고 5-7 분 1x PBS로 섹션을 씻어; 이 단계를 3 번 반복하십시오.
- 각 슬라이드에 대한 보조 항체 믹스 100 μL를 준비합니다. 1x PBS에 4 % BSA에서 염소 안티 - 토끼 488 (5 μg / ML)과 염소 안티 - 마우스 594 (5 μg / ML)를 해산.
- 일차 항체 배양.
- 희석 층각 슬라이드에 대해 100 μL의 혼합물을 사용하여 1x PBS 중 4 % BSA에서 n-2 (α-2-chain) 단일 클론 항체 (0.33 μg / mL) RT에서 1 ~ 2 시간 동안 기본 항체 믹스의 섹션을 품어.
- 세척.
- 일차 항체 혼합물을 제거합니다.
- 10 분 1X PBS에서 1 % BSA로 섹션을 씻으십시오; 이 단계를 3 번 반복하십시오.
- 이차 항체 배양.
- 1X PBS에 4 % BSA에 염소 방지 쥐 647 (5 μg / ML)을 희석하여 각 슬라이드에 대한 보조 항체 믹스 100 μL를 준비합니다. RT에서 45 분 동안 보조 항체 믹스의 섹션을 품어.
- 2 차 항체 혼합물을 제거하고 5-7 분 1x PBS로 섹션을 씻어; 이 단계를 3 번 반복하십시오.
- 4 ', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌 (DAPI) 배양.
- 각 슬라이드에 1x PBS에 300nM DAPI 솔루션 200μL를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 품어 둡니다. 4 ℃에서 DAPI 용액을 보관하십시오.어두운.
- 5-7 분 동안 1x PBS로 절편을 씻으십시오. 이 단계를 3 번 반복하십시오.
- 마운트 스테인드 근육 섹션.
- 섹션에서 과량의 세척액을 제거하십시오.
- 슬라이드 중간에 얼룩 섹션에 1x PBS (3시 1 분)에 글리세롤 10 μL를 넣고 공기 방울의 형성을 피하기 coverslip을 추가합니다.
4. 공 촛점 현미경 수집
- 이미지 캡처 시스템 및 분석 소프트웨어와 통합 된 4 레이저 공 촛점 현미경을 사용하여 이미지를 수집하십시오.
참고 : MyoD는 밝은 적색 형광 염료 인 594 염료와 함께 결합되어 594 nm 레이저 (여기 : 590 nm, 방출 : 617 nm)에 이상적으로 적합합니다. LC3는 밝은 녹색 형광 염료 인 488 염료와 결합되어 488 nm 레이저 라인 (여기 : 495 nm, 방출 : 519 nm)에 이상적으로 적합합니다. 라미닌은 647 염료와 결합되어 있습니다.647 nm 레이저 라인 (excitation : 650 nm, emission : 668 nm)에 이상적으로 적합한 여기에 밝은 원적외선 형광 염료입니다. - 현미경 트레이에 슬라이드를 놓고 핵 신호를 검출하기 위해 63 배 확대를 사용합니다. 근육 형태에 의존하는 활성 재생 분야를 중심으로 재생 영역에 수동으로 초점을 맞 춥니 다 ( 그림 4 참조).
참고 : 교란이없는 근육에서 근섬유의 크기는 거의 일정합니다 ( 그림 4A ). 상처가 매개되는 근육 재생은 재생 후 새로 형성된 섬유 인 작은 근육 섬유의 출현으로인지 할 수 있습니다. 또한, 활성 재생의 근육은 대 식세포, 섬유 - 지방 형성 전구 물질 및 손상된 근육에 국한되어 근육 재생을 조율하는 세포 ( 도 4B )로 이루어진 광범위한 침윤을 특징으로한다. - 재생에서 면역 형광 염색을 평가하십시오.myofibers의 기초 얇은 판 밑에 위치한 MuSCs에 초점을 맞춤으로써 비균진적인 영역을 발견 할 수 있습니다.
- MyoD 염색에 양성이고 laminin 염색으로 표시된 myofibers 내에 위치하는 MuSC에 초점을 맞 춥니 다 ( 그림 4B , 흰색 화살표 참조).
- 최소 3 마리의 실험용 그룹을 사용하고 현미경을 사용하여 각 실험 그룹에 대해 최소 7 개 필드의 63 배 확대 이미지를 얻습니다.
- 재생 영역이 확인되면 DAPI 얼룩을 사용하여 초점을 맞춘 다음 다른 단일 채널을 조정하십시오.
- 다음과 같은 현미경 설정을 사용하십시오 : 채널 A594 핀홀 1.2 에어 유니트, 게인 791; 채널 A488 핀홀 1.6 에어 유니트, 게인 659; 채널 A647 핀홀 1.4 에어 유니트, 게인 719.
- 단일 채널의 초점을 조정 한 후 1,024 x 1,024 프레임 크기 및 12.61 μs 픽셀 거주지에서 이미지를 수집합니다.
- MyoD 양성 세포의 백분율을 계산하십시오 (t그는 LC3 음성 인 MyoD 양성 세포의 백분율 및 LC3 음성 인 백판 아래의 정확한 위치).
참고 : LC3 염색을 나타내는 MyoD 양성 세포의 백분율은이 프로토콜의 판독 값입니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 근육 재생 중에 MuSCs에서 autophagy를 감지하는 효율적인 원위치 방법을 설명합니다.
CTX In Vivo 치료법 :
CT 근육을 사용하여 근육 손상을 유도하고 조절되지 않는 근육을 사용하십시오. autophagy가 매우 동적이기 때문에 CLQ ( 그림 1 )의 IP 주입을 수행하여 autophagic 유량을 차단하십시오. CLQ 처리는자가 식 플럭스가 활성 상태인지 아니면 기저 수준으로 유지되는지를 평가하는 데 필수적입니다.
경골 전방 격리 :
그림 2 에서 설명한 바와 같이 TA 근육을 분리하고 NS 방향으로 몰드 챔버에 넣고 횡단 근육 조직 섹션을 얻습니다. 이 단계절편을 얻고 myofiber basal lamina 아래의 적절한 위치에서 MuSC를 확인하는 것이 중요합니다.
CTX로 인한 근육 손상의 신비학 적 검사
조직 손상을 수행하여 근육 손상이 발생했는지 확인하십시오. H & E 얼룩을 수행하고 10X 배율을 확인하십시오. 교란되지 않은 근육은 일반적으로 변하지 않는 근섬유 크기를 나타내지 만 손상된 근육의 전형적인 특징에는 크기가 다르며 염증성 침윤이 풍부한 근섬유의 파괴가 있습니다. 재생 과정이 일어나고 있음을 확인하는 또 다른 매개 변수는 교란되지 않는 근육에는 존재하지 않는 근섬유의 중심 핵 생성이며 적극적인 재생을받는 쥐에서 새로운 섬유 형성의 신호입니다 ( 그림 3 ).
Autophagy는 MyoD-po와 결합됩니다.근육 재생 중 양성 세포 :
MyoD 양성으로 확인 된 MuSC를 검출하기 위해 면역 형광 염색을 수행하여 LC3 신호를 표시합니다. 라미닌 염색법은 기저막 아래의 틈새에서 적절한 위치에 MuSC를 위치시키는 데 도움이됩니다 ( 그림 4 ). Autophagic 기초 수준은 교란되지 않는 골격 근육을 구별하고 근육 재생과의 일치율이 크게 증가합니다 30 . 따라서, 손상되지 않은 마우스는 MyoD- 양성 세포의 부재 및 LC3 신호의 부재에 의해 검출 된 임의의 MuSC 활성화를 나타내지 않는다. 반대로, 근육 손상시 MyoD 양성 MuSC는 LC3에 양성으로 작용하여 인공 위성 세포에서 근육 재생 중에자가 식사가 활성화됩니다.
재생 반응의 초기 단계 동안, 다른 세포 유형은 t의 위치에 국한된다염증 세포 및 섬유 지방 전구 물질을 포함한 병변으로 인해 손상된 부위가 조밀하게 과밀하게 구성됩니다. myofiber lamina 아래의 MuSC 위치에 초점을 맞추고 MyoD 양성에 의지하여 모든 다른 세포 유형을 구별하는 것이 중요합니다.
기초 조건에서, LC3은 편재되어 발현되며 면역 형광법에 의해 간신히 검출된다. 높은 autophagy의 결과로,이 얼룩 무늬는 변화하고 주로 세포질에서 검출 가능하게됩니다. MyoD / LC3 염색을 평가할 때 MuSC가 작은 세포이고 세포질 영역이 제한되어 있다고 간주하십시오. 이것은 LC3가 핵으로 보일 수있는 이유입니다.
그림 1 : CTX in Vivo Treatment. ( A ) 근육 손상을 유도하기 위해 10 μM CTX direc2 개월 된 WT 생쥐의 왼쪽 TA 근육에 가깝다. 대 측성 사지를 대조군으로 사용하십시오. ( B ) cardiotoxin 유발 근육 손상의 도식 표현. 부상 후 24 시간에 마우스를 50 mg / kg CLQ의 복강 내 주사로 24 시간마다 4 일 동안 처리 한 다음 동물을 희생시킨다. 처리되지 않은 손상되지 않은 마우스를 대조군으로 사용하십시오. 이 프로토콜은 근육 재생 동안 autophagic 과정의 참여의 연구를 허용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : TA 격리. ( A ) 고립되기 전에 보이는 TA의 대표 이미지. ( B ) 말초 힘줄을 절단 한 후 힘줄로 TA 근육을 잡고 조심스럽게근육을 근위 말단 (무릎 근처)쪽으로 끌어 당깁니다. ( C ) EDL보다 더 크고 표면적 인 TA 근육으로부터 EDL을 구별하십시오. 두 개의 말초 힘줄을 반대 방향으로 당김으로써 TA와 EDL 근육을 분리하십시오. ( D ) TA가 단리되면 설명 된대로 NS 방향으로 몰드 챔버에 넣으십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CTX는 근육 손상을 유발합니다. 대조군, 손상되지 않은 ( A ) 및 5d pi ( B ) WT 마우스의 TA 횡단 조직 절편에 대한 H & E 염색의 대표적인 이미지. H & E 염색은 대조군 마우스 ( A )와 종괴근육 손상과 손상된 근육에 침투 ( B ), CTX 주입시 손상된 형태를 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 근육 재생 동안 Autophagy는 MyoD 양성 세포에 결합합니다. LC3 (녹색) 및 MyoD (적색)로 면역 염색 된 대조군 ( A ) 및 손상된 ( B ) WT 마우스의 TA 절편의 대표 이미지. 라미닌 (시안) 염색은 근육 섬유를 표시하고 핵은 DAPI (흰색)로 대조 염색됩니다. 오른쪽 패널에는 병합 신호의 대표 이미지가 표시됩니다. 흰색 화살표는 라미닌 염색으로 표시된 섬유의 기저 층 아래에있는 위성 세포를 나타냅니다. 팔로티프로토콜은 MyoD로 표시되는 근원 계통을 겪고있는 근육 줄기 세포에서 LC3 염색을 통해 autophagy 측정을 허용합니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 보상 근육 재생 중에 골격 근육 줄기 세포에서 autophagy를 모니터링하는 방법을 설명합니다. LC3와 MyoD의 공동 염색을위한 몇 가지 항체가 시도되었으며, 마우스 조직 절편에서 작동하고 성공적인 결과를 창출하는 항체가 여기에 나열되어 있습니다 ( 재료 표 참조). 성공적인 염색을 위해서는 메탄올로 투과성을 높이는 것이 좋습니다 (3.2.2 절 참조).
이 프로토콜의 한계는 최소 3 마리의 마우스 / 실험 그룹의 사용을 강요하는 생쥐의 본질적인 가변성과 관련이있다.이 방법론은 골격근 재생 동안의 autophagy에 대한 연구에서 한 걸음 더 나아 갔다. 지금까지는 고립 된 세포에서 만들어졌다. in situ 분석은 자연 환경에서 autophagy와 같은 대사 과정에 영향을 줄 수있는 세포 격리의 필요성없이 autophagy 연구를 허용했습니다.
"autophagic 과정의 매우 역동적 인 특성을 감안할 때, CLQ 치료법은 생체 내 에서 autophagic 과정을 모니터링하는 중요한 단계입니다 .CLQ는 autophagy 과정의 후기 단계를 차단하여 autophagy가 지속될 때 LC3 축적을 유도하므로 CLQ 치료 LC3 를 현장에서 검사 할 수있게 만든다. 교란이없는 골격근에서는 LC3 축적이 검출되지 않아 CLF 처리에 의해 기초자가식이 과정이 더 이상 증가하지는 않지만, 재생 근육에서는 LC3가 CLQ 처리에 축적되어자가 식사 활성화 중요한 단계는 오전 10시에 아침에 동시에 마우스를 희생시키는 것입니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 MuSC를 확인하는 것입니다. MuSC는 다른 세포 유형과 상호 교환되어서는 안되며, 재생 반응. MyoD 양성을 나타내는 기저막 아래의 MuSC의 동정은 k위성 세포에 초점을 맞추고 있습니다.요약하면, 우리는 MuSCs에서의 autophagic 과정의 관여를 탐지하기위한 적절한 in situ 방법을 제시한다. 이 기술은 정상 및 병리학 적 조건에서 골격근 재생을 개선하는 데 사용될 수있는 자동 식 조절에 대한 약리학 적 접근법의 테스트를위한 기초로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 아무 것도 공개하지 않는다.
Acknowledgments
이 작품은 NIAMS AR064873, Epigen Project PB에서 지원되었습니다. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT에서 LL로
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664 | WT mice |
| Cardiotoxin 1 | Latoxan | L8102 | |
| Millex-VV | Merck Millipore | SLVV033RS | Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Caution: Harmful if swallowed |
| BD Micro-Fine + 0.5 mL | BD | 324825 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Tissue-Tek Cryomold Intermediate | Sakura Finetek | 4566 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | 277258 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| o-Xylene | Sigma-Aldrich | X1040 | Caution: Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Caution: Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Eukitt - Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-007-003 | |
| LC3B Antibody | Cell signaling Technology | 2775 | |
| Monoclonal mouse anti-MyoD (concentrated) clone 5.8A |
DAKO - Agilent Pathology Solutions | M3512 | |
| Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody | Enzo Life Sciences | 4H8-2 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody | Life technologies | A21248 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
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