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Biology

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

doi: 10.3791/55908 Published: June 12, 2017

Summary

La autofagia activa se asocia con la regeneración muscular productiva, que es esencial para la activación de las células madre musculares (MuSC). Aquí, proporcionamos un protocolo para la detección in situ de LC3, un marcador de autofagia en MyoD-positivos MuSCs de secciones de tejido muscular de control y los ratones lesionados.

Abstract

La creciente evidencia apunta a la autofagia como un proceso regulador crucial para preservar la homeostasis de los tejidos. Se sabe que la autofagia está implicada en el desarrollo y regeneración del músculo esquelético, y el proceso autofágico ha sido descrito en varias patologías musculares y trastornos musculares relacionados con la edad. Un bloque recientemente descrito del proceso autofágico que se correlaciona con el agotamiento funcional de las células satélites durante la reparación muscular apoya la noción de que la autofagia activa se combina con la regeneración muscular productiva. Estos datos revelan el papel crucial de la autofagia en la activación de las células satélite durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas, como las distrofias musculares. Aquí, proporcionamos un protocolo para supervisar el proceso autofágico en el adulto Muscle Stem Cell (MuSC) compartimento durante el músculo regenerativas condiciones. Este protocolo describe la metodología de configuración para realizar imágenes de inmunofluorescencia in situ de LC3, aMarcador de utofagia y MyoD, un marcador de linaje miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones controlados y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el compartimiento MuSC, que desempeña un papel central en la orquestación de la regeneración muscular.

Introduction

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La regeneración del músculo esquelético es el resultado de la interacción entre las células madre adultas (Muscle Satellite Cells, MuSCs) y otros tipos de células que intervienen en el proceso regenerativo. La homeostasis muscular y la funcionalidad se mantienen por las señales combinadas que surgen del nicho muscular y las señales sistémicas 1 , 2 . A lo largo de la vida, se han reportado cambios en la funcionalidad MuSC, el nicho muscular y las señales sistémicas, lo que conduce a la disminución de las capacidades funcionales en los ancianos 3 . MuSCs se establecen en un nicho por debajo de la lámina basal y, a la lesión muscular, se activan para reparar los músculos dañados [ 4 , 5] . Para asegurar una respuesta regenerativa productiva, es crucial que las MuSCs coordinen los diferentes procesos necesarios para que la salida de la quiescencia, la auto-renovación y la etapa de expansión proliferativa siganPor la diferenciación miogénica 6 . En los ancianos y en las enfermedades crónicas musculares, todas estas funciones están comprometidas, lo que conduce a la alteración de la funcionalidad muscular 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .

La macroautofagia (denominada en lo sucesivo autofagia) está emergiendo como un proceso biológico crucial esencial para preservar la homeostasis tisular 14 . El proceso autofágico incluye mecanismos de tráfico, donde porciones de citoplasma, orgánulos y proteínas se envuelven en vesículas que eventualmente se degradan a través de la vía lisosoma, promoviendo la eliminación de moléculas tóxicas y el reciclaje de macromolCulos Esto proporciona compuestos ricos en energía para apoyar la adaptación de células y tejidos bajo estrés u otras condiciones adversas 15 , 16 . Junto con su actividad de supervivencia celular, la autofagia también puede funcionar como un inductor de la muerte celular, dependiendo del contexto del tejido celular ( por ejemplo, tejido normal frente al cáncer) y el tipo de estímulo de estrés 17 , 18 .

La evidencia reciente indica que la autofagia es necesaria para mantener la masa muscular y la integridad de la miofibra 19 , 20 y se ha reportado que está alterada en diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluyendo la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. De igual modo, se ha observado una reducción progresiva del proceso autofágico en los ancianos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , después de una pérdida de masa muscular (denominada sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , y en la supervivencia de miofibras 38 .

Una relación estrecha entre la autofagia y el potencial regenerativo de los músculos esqueléticos fue anticipada por un estudio del laboratorio de Wagers, que mostró que una restricción de calorías mejora la disponibilidad y la actividad de MuSC [ 39] . Esto noLa reciente observación de que el eje Foxo3-Notch activa el proceso autofágico durante la auto-renovación [ 40] y la transición de MuSC desde el estado quiescente al estado de proliferación [ 41] . Estos datos concuerdan con la reducción progresiva de la autofagia basal de jóvenes a ancianos y geriátricos MuSCs, en asociación con el descenso numérico y funcional de MuSCs durante el envejecimiento [ 42] .

En un artículo reciente, demostró una estrecha relación entre la autofagia y la regeneración muscular compensatoria que distingue las primeras etapas de la progresión de la DMD. En consecuencia, se observó una reducción del flujo autofágico en etapas posteriores de la progresión de la enfermedad, cuando la regeneración muscular se ve comprometida y deposición de tejido fibrótico se produce. Curiosamente, se demostró que, en condiciones de regeneración, la autofagia se activa en MuSCs y que la modulación del proceso autofágico impacta la activación MuSC y fuNcionalidad 30 .

En conjunto, estos datos ponen de relieve la urgencia de explorar el proceso autofágico en MuSCs durante la regeneración muscular en condiciones normales y patológicas ya lo largo de la vida. En este sentido, proporcionamos un protocolo para monitorear el proceso autofágico en MuSCs en condiciones de regeneración muscular mediante la realización in situ de inmunotinción para los microtúbulos asociados a la proteína 1A / 1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador de autofagia [ 43] , y MyoD, un marcador de Miogénico, en secciones de tejido muscular de ratones control y lesionados. La metodología reportada permite monitorear el proceso autofágico en un compartimento celular específico, el MuSC, que desempeña un papel clave en la orquestación de la regeneración muscular.

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Protocol

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Los ratones fueron criados y mantenidos de acuerdo con los procedimientos de la instalación animal estándar y todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Aseguramiento de Bienestar Animal y el Comité de Ética de Investigación Animal interno según el Ministerio de Salud italiano y cumplieron con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Lesión muscular y el bloque in vivo de flujo autofágico

  1. Lesión muscular.
    1. Para inducir una lesión aguda del músculo esquelético, inyectar 20 μL de stock de cardiotoxina 10 μM (CTX) directamente en el músculo tibial anterior (TA) izquierdo de ratones C57BL / 6J de 2 meses de edad que pesan aproximadamente 20 g. Use un número igual de machos y hembras. Utilice la extremidad contralateral no perturbada como control.
      NOTA: CTX 10 μM en solución de cloruro de sodio al 0,9% debe filtrarse (filtro PVDF 0,22 μm) y almacenarse a -20 ° C. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
    2. Usando un iNsulin con una aguja de 30 G, inyecte CTX en el centro de la TA. Para inducir una lesión precisa en el TA, asegúrese de que la aguja de la jeringa entre cerca del tendón distal, de 5 mm de profundidad, desde el fondo hasta la parte superior del músculo ( Figura 1A ).
  2. Bloqueo del flujo autofágico en ratones no perturbados y lesionados.
    1. Para evaluar el flujo autofágico, 24 h después de la lesión (pi), administrar 50 mg / kg de cloroquina (CLQ) cada 24 h durante 4 días por inyección intraperitoneal (IP) ( Figura 1B ).
      1. Disolver CLQ (10 mg / ml) en PBS 1X y filtrar a través de una membrana de 0,2 μm. Pesar cada ratón y calcular la cantidad de CLQ para inyectar.
        NOTA: Prepare y utilice la solución CLQ el mismo día. Las existencias de CLQ pueden almacenarse hasta por un mes a -20 ° C. Dado que la autofagia es un proceso relacionado con el metabolismo, siempre se realiza un tratamiento de CLQ siempre al mismo tiempo ( es decir, en la mañana antesRe 10 AM).

2. Secciones de los tejidos musculares

  1. Sacrificio del ratón.
    1. Eutanasia los ratones 5 días después de la lesión.
    2. Realizar la eutanasia por dislocación cervical o por CO 2 (a seguir por dislocación cervical para confirmación). Dado que el proceso de autofagia está relacionado con el sueño del ratón / hábitos alimenticios, siempre sacrificar los ratones al mismo tiempo, preferiblemente por la mañana ( es decir, antes de las 10 AM).
  2. TA aislamiento e inclusión.
    1. Antes de la disección, rocíe el ratón con etanol al 70%.
    2. Usando unas tijeras, haga una pequeña incisión perpendicular (3 mm de largo) sobre la piel dorsal del ratón a nivel de las caderas. Corte la cola y los pies para simplificar la eliminación de la piel. Tire de la piel hacia la cola y retirarla para exponer los músculos subyacentes; El músculo TA es fácil de localizar, como se muestra en la Figura 2A
    3. Con la ayuda de dos fórceps, agarre los tendones distales.
    4. Cortar los tendones distales; Los tendones del TA y extensor del extensor del dedo largo (EDL) se cortan a menudo conjuntamente y se separan más adelante (véase el paso 2.2.6).
    5. Usando una pinza, sostenga el músculo TA por el tendón y tire con cuidado del músculo hacia el extremo proximal (cerca de la rodilla, Figura 2B ).
      NOTA: En este punto, los músculos EDL y TA son fácilmente reconocibles, siendo el TA más grande y más superficial que el EDL.
    6. Separar el TA del músculo EDL tirando de los dos tendones distales en las direcciones opuestas ( Figura 2C ).
    7. Corte el tendón proximal.
    8. Usando fórceps, quite la fascia fina que cubre el músculo, sin dañar el tejido.
    9. Retire la humedad excesiva en la muestra con la ayuda de una toalla de papel. Asegúrese de que el músculo no esté mojado ni excesivamente seco, ya que la humedad excesiva producirá sigDaños significativos en el músculo y poner en peligro la siguiente tinción.
    10. Coloque el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en la parte inferior de un molde y coloque el músculo en él, en la orientación que se muestra en la figura 2D . Añadir 100% de isopentano a un vaso de precipitados hasta que alcance una profundidad de aproximadamente 3-4 cm. Colocar el vaso en contacto con nitrógeno líquido en una caja de poliestireno.
    11. No deje que el nitrógeno líquido entre en el vaso, ya que producirá una espuma burbujeante, que puede afectar la inclusión y dañar las secciones musculares.
    12. Observar el isopentano y esperar hasta que alcance la temperatura adecuada (entre -140 ° C y -150 ° C); A la temperatura apropiada, una capa blanca sólida de isopentano congelado cristalizará en el fondo del vaso de precipitados.
    13. Si el isopentano congela por completo el sólido, se funde y se enfría a la temperatura de congelación antes de pasar al siguiente paso.
    14. Usando pinzas precargadas, baje delicadamente el moldeEl isopentano durante aproximadamente 20-30 s. Coloque la muestra congelada en un recipiente con hielo seco hasta que se transfiera a un congelador de -80 ° C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
  3. Criosecciones de tejidos musculares.
    1. Después de al menos una noche a -80 ° C, realizar cryosectioning.
    2. Saque el cuchillo de criostato y la placa antirrobo del congelador de -20 ° C y colóquelos en los soportes respectivos en el gabinete del criostato.
    3. Coloque una gota de OCT en el trozo de muestra y coloque en ella la muestra congelada, en orientación NS vertical, tal como se visualiza en la figura 2D .
    4. Coloque el trozo de muestra en el portabrocas.
    5. Sin tirar de la placa anti-rollo hacia abajo en el cuchillo, hacer algunos cortes a 40 μ m para deshacerse de OCT que no incluye el músculo. Cuando el músculo se vuelve visible, reduzca el grosor de la rebanada a 7-8 μm.
    6. Tire de la placa antirrobo hasta que esté alineada conEl borde del cuchillo o un poco por encima.
    7. Corte secciones transversales de 7-8 μm de espesor y monte 3-4 rebanadas por diapositiva histológica.
      NOTA: La temperatura del criostato sugerida está entre -15 ° C y -23 ° C. Se necesitan secciones transversales de las muestras para el análisis subsiguiente para identificar con precisión las células madre musculares en la posición del nicho satélite.
    8. Para maximizar la adherencia de la sección, mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10-15 min para evitar su separación durante la incubación del anticuerpo.
      NOTA: El paso de secado al aire podría afectar la inmunotinción, proporcionando resultados ambiguos. Los portaobjetos se pueden almacenar sin fijar durante varios meses a -80 ° C. El protocolo se puede pausar aquí.
  4. Comprobación del daño muscular en criosecciones de los músculos TA mediante la tinción con Hematoxilina Eosina (H & E).
    1. Evaluar la calidad del músculo ( es decir, la efectividad de la lesión, aislamiento muscular eIon y criosecciones), realizan una tinción de H & E. Para cada punto de tiempo experimental, fijar una diapositiva con PFA al 4% durante 10 min. Después de la fijación, lavar los portaobjetos bien en varios cambios de 1x PBS.
      NOTA: Precaución. PFA es carcinógeno y debe ser manejado cuidadosamente.
    2. Tomar una diapositiva para cada punto experimental y ponerlos en un frasco de tinción.
    3. Llenar el frasco con 9 g / L hematoxilina hasta que las secciones se cubren e incubar durante 8 min.
    4. Recicle la hematoxilina.
    5. Dejar el frasco bajo agua corriente durante 10 minutos para eliminar el exceso de hematoxilina.
      NOTA: Asegúrese de no fluir el agua directamente sobre las secciones.
    6. Lavar con agua esterilizada.
    7. Incubar las secciones con eosina al 0,5% (p / v) en etanol al 90% acidificado durante 1 min.
    8. Recicle la eosina.
    9. Lavar dos veces con agua estéril durante 3 minutos / lavado.
      NOTA: Realice los siguientes pasos en un capó químico.
    10. Lavar las secciones con etanol al 70%.
    11. lavarLas secciones con etanol al 90%.
    12. Lave las secciones con etanol al 100%.
    13. Incubar las secciones con 0,879 g / ml de o-xileno.
      NOTA: Precaución. O-xileno es inflamable y moderadamente tóxico. Manipúlelo bajo el capó químico, usando equipo protector, incluyendo guantes, una bata de laboratorio y una máscara.
    14. Recicle el o-Xileno.
    15. Ponga las diapositivas sobre un trozo de papel para secar.
    16. Cierre los portaobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno de endurecimiento rápido.
    17. Compruebe la calidad de las secciones bajo un microscopio óptico con una ampliación de 10X (consulte la Figura 3 )
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

3. Inmunotinción para LC3 y MyoD en secciones de tejidos musculares lesionados

  1. Fijación de secciones de tejido muscular.
    1. Preparar una cámara de incubación mojando un pedazo de papel y colocándolo en el fondo de una caja de plástico cerrable para mantener un altoDe humedad dentro de la cámara. Fijar las secciones de tejido con paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS durante 10 min.
      NOTA: Se utiliza un trozo de papel húmedo para evitar el secado de la muestra. Preparar PFA fresco o utilizar PFA almacenado a -20 ° C. Precaución. PFA es tóxico; El polvo debe ser manipulado con cuidado al hacer la solución madre. Esta operación debe realizarse en un capó químico, con equipo de protección, incluyendo guantes, una bata de laboratorio y una máscara. También, cuando en la solución, el PFA debe ser manipulado cuidadosamente.
    2. Eliminar el PFA y lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3 veces.
  2. Permeabilización de secciones de tejido muscular.
    1. Dibuje una barrera hidrófoba alrededor de las secciones de tejido usando una pluma de pap.
      NOTA: Este paso define la superficie alrededor de las secciones de tejido y minimiza el volumen de anticuerpos descritos en los pasos 3.4, 3.6, 3.7 y 3.9.
    2. Cubra las secciones con 200 μl de agua fría (-20 ° C)Metanol y poner la cámara de incubación horizontalmente dentro de un congelador a -20 ° C durante 5 min.
    3. Quitar la cámara de incubación del congelador, aspirar el metanol y lavar las secciones con PBS 1X durante 5-7 min a TA; Repita este paso 3x.
  3. Bloqueo
    1. Preparar una nueva solución en bloque de 4% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS 1x.
      NOTA: La solución de BSA se puede almacenar durante 1 semana a 4 ° C.
    2. Incubar las secciones con solución de bloque durante al menos 60 min a RT.
    3. Retire la solución de bloqueo.
    4. Preparar 100 μL de mezcla anti-Fab mediante la dilución de 20 μg / ml de anti-Fab en 1x PBS. Incubar las secciones con un fragmento F (ab) purificado por afinidad no conjugado de IgG anti-ratón durante 1 h a RT.
  4. Incubación de anticuerpos primarios.
    1. Preparar 100 μL de la mezcla de anticuerpos primarios para cada diapositiva mediante la disolución de anticuerpos LC3 y MyoD en BSA al 4% en 1x PBS. Utilice 5 μg /Ml de anti-LC3 (anticuerpo policlonal de conejo) y 10 mg / l de anti-MyoD (anticuerpo monoclonal de ratón). Incubar la mezcla de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C.
  5. Se lava.
    1. Eliminar la mezcla de anticuerpos primarios.
    2. Lavar las secciones con BSA al 1% en PBS 1X durante 10 min; Repita este paso 3x.
  6. Incubación de anticuerpos secundarios.
    1. Prepare 100 μl de mezcla de anticuerpos secundarios para cada diapositiva. Disolver anticuerpo de cabra anti-conejo 488 (5 μg / ml) y cabra anti-ratón 594 (5 μg / ml) en BSA al 4% en 1x PBS.
      NOTA: Evite la exposición excesiva a la luz para evitar el blanqueo con fluorocromo. Realice los siguientes pasos en la oscuridad.
    2. Incubar las secciones con la mezcla de anticuerpos secundarios durante 45 min a RT.
    3. Eliminar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3x.
  7. Incubación de anticuerpos primarios.
    1. Laminas diluidasN-2 (cadena α-2) (0,33 μg / ml) en BSA al 4% en 1x PBS usando 100 μl de mezcla para cada portaobjetos. Incubar las secciones en la mezcla de anticuerpos primarios durante 1-2 h a RT.
  8. Se lava.
    1. Eliminar la mezcla de anticuerpos primarios.
    2. Lavar las secciones con BSA al 1% en PBS 1X durante 10 min; Repita este paso 3x.
  9. Incubación de anticuerpos secundarios.
    1. Preparar 100 μl de la mezcla de anticuerpos secundarios para cada diapositiva diluyendo 647 de cabra anti-rata (5 μg / mL) en BSA al 4% en 1X PBS. Incubar las secciones en la mezcla de anticuerpos secundarios durante 45 min a RT.
    2. Eliminar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3x.
  10. 4 ', 6 - Diamidino - 2 - fenilindol (DAPI).
    1. Añadir 200 μl de 300 nM DAPI solución en 1x PBS a cada diapositiva. Incubar durante 5 min a RT. Guarde la solución DAPI a 4 ° C en laoscuro.
    2. Lavar las secciones con 1x PBS durante 5-7 min; Repita este paso 3x.
  11. Montaje de las secciones de los músculos teñidos.
    1. Retire el exceso de solución de lavado de las secciones.
    2. Coloque 10 μL de glicerol en 1x PBS (3: 1) sobre las secciones teñidas en el centro de la diapositiva y agregue un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas de aire.

4. Adquisición de Microscopía Confocal

  1. Adquirir las imágenes utilizando un microscopio confocal de cuatro láser integrado con un sistema de captura de imágenes y software analítico.
    NOTA: MyoD se conjuga con un colorante 594 que es un colorante fluorescente rojo brillante, con una excitación ideal para el láser de 594 nm (excitación: 590 nm, emisión: 617 nm). LC3 se conjuga con un colorante 488 que es un colorante verde fluorescente brillante, con excitación idealmente adaptada a la línea láser de 488 nm (excitación: 495 nm, emisión: 519 nm). La laminina se conjuga con un colorante 647 que esUn colorante fluorescente brillante de color rojo intenso, con excitación ideal para la línea láser de 647 nm (excitación: 650 nm, emisión: 668 nm).
  2. Coloque los portaobjetos en la bandeja del microscopio y use una ampliación de 63X para detectar señales nucleares. Enfóquese manualmente en las áreas regenerativas centrando los campos de regeneración activa, dependiendo de la morfología muscular (ver Figura 4 ).
    NOTA: Mientras que en el músculo no perturbado, el tamaño de la miofibra es prácticamente constante ( Figura 4A ), la regeneración muscular mediada por lesión puede ser reconocida por la aparición de miofibras más pequeñas, que son las fibras recién formadas después de la regeneración. Por otra parte, el músculo en la regeneración activa se caracteriza por un extenso infiltrado que está compuesto de macrófagos, precursores fibro-adipogénicos y células que se localizan en los músculos dañados para orquestar la regeneración muscular ( Figura 4B ).
  3. Evaluar la tinción inmunofluorescente en regenEnfocándose en los muSCs que se encuentran bajo la lámina basal de las miofibras.
  4. Centrarse en MuSCs que son positivos para MyoD tinción y posicionado dentro de miofibras marcado por laminina tinción (véase la Figura 4B , flechas blancas).
  5. Utilizar al menos 3 ratones / grupo experimental y utilizar el microscopio para adquirir imágenes de aumento de 63X de al menos 7 campos para cada grupo experimental.
  6. Una vez que las áreas regenerativas se identifican, enfoque utilizando la tinción DAPI y luego ajustar los otros canales individuales.
    1. Utilice los siguientes ajustes de microscopio: Canal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Canal A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Canal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Ganancia 719.
  7. Después de ajustar el enfoque de los canales individuales, proceda a adquirir las imágenes con un tamaño de trama de 1.024 x 1.024 y una tolerancia de 12.61 μs.
  8. Cuente el porcentaje de células MyoD-positivas (control para tLa ubicación correcta debajo de la lámina) que son LC3-negativos y el porcentaje de células MyoD-positivas que muestran una señal LC3.
    NOTA: El porcentaje de células MyoD-positivas que muestran tinción LC3 es la lectura de este protocolo.

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Representative Results

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Este protocolo describe un eficiente método in situ para detectar la autofagia en MuSCs durante la regeneración muscular.

CTX In Vivo Tratamientos:

Utilice CTX para inducir el daño muscular en los músculos TA y utilizar los músculos no perturbados como controles. Dado que la autofagia es altamente dinámica, bloquear el flujo autofágico mediante la realización de inyecciones de IP de CLQ ( Figura 1 ]. El tratamiento con CLQ es esencial para evaluar si el flujo autofágico está activo o se mantiene a niveles basales.

Tibialis Aislamiento Anterior:

Aislar el músculo TA, tal como se describe en la Figura 2 , y colocarlo en una cámara de moldeo en orientación NS para obtener posteriormente secciones transversales de tejido muscular. Este pasoEs crucial para obtener secciones e identificar los muSC en la ubicación apropiada debajo de la lámina basal de miofibras.

Examen histológico del daño muscular inducido por CTX

Verifique que la lesión muscular se produjo mediante la realización de tinción histológica. Efectúe la tinción de H & E y compruebe bajo una ampliación de 10X: mientras que los músculos imperturbados exhiben generalmente tamaños invariables de la miofibra, las características típicas de los músculos dañados incluyen la interrupción de las miofibras que son diferentes en tamaño y abundante infiltrado inflamatorio. Otro parámetro para confirmar que el proceso regenerativo tiene lugar es la centro-nucleación de las miofibras, que está ausente en los músculos no perturbados y es un signo de la formación de nuevas fibras en ratones sometidos a regeneración activa ( Figura 3 ).

Autofagia se une a MyoD-poSitive durante la regeneración del músculo:

Realizar tinción inmunofluorescente para detectar MuSCs, identificado como MyoD-positivo, que muestran una señal LC3. Tinción de laminina es útil para localizar MuSCs en la posición adecuada en el nicho bajo la lámina basal ( Figura 4 ]. Los niveles basales autofágicos distinguen los músculos esqueléticos no perturbados y aumentan significativamente en coincidencia con la regeneración muscular 30 . Por consiguiente, los ratones no dañados no muestran ninguna activación de MuSC, detectada por la ausencia de células MyoD-positivas y ninguna señal de LC3. Por el contrario, al producirse daño muscular, los MuSC positivos para MyoD resultan positivos para LC3, lo que demuestra que el proceso autofágico se activa durante la regeneración muscular en células satélites activadas.

Durante las etapas iniciales de la respuesta regenerativa, diferentes tipos celulares se localizan en el sitio de tIncluyendo las células inflamatorias y los precursores fibroadipógenos, lo que hace que el área lesionada esté densamente sobrepoblada. Es crucial distinguir entre todos los tipos celulares diferentes, centrándose en la localización de MuSC debajo de la lámina del myofiber y confiando en positividad de MyoD.

En condiciones basales, LC3 se expresa ubicuosamente y apenas se detecta por inmunofluorescencia. Como resultado de la autofagia elevada, este patrón de tinción cambia y se hace detectable principalmente en el citoplasma. Cuando se evalúa la tinción de MyoD / LC3, considere que los MuSCs son células pequeñas y que la región citoplasmática es limitada; Esto por lo que LC3 puede parecer perinuclear.

Figura 1
Figura 1: Tratamientos In Vivo de CTX. ( A ) Para inducir daño muscular, inyectar 10 μL de 10 μM CTX direcEn los músculos TA de ratones WT de 2 meses de edad. Utilice la extremidad contralateral como control. ( B ) Representación esquemática de la lesión muscular inducida por cardiotoxinas. 24 h después de la lesión, tratar a los ratones con inyecciones intraperitoneales de 50 mg / kg CLQ cada 24 h durante 4 días y luego sacrificar los animales. Utilice ratones no lesionados y lesionados como controles. Este protocolo permite el estudio de la implicación del proceso autofágico durante la regeneración muscular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Aislamiento TA. ( A ) Imagen representativa de la AT tal como se ve antes del aislamiento. ( B ) Después de cortar el tendón distal, mantenga el músculo TA por el tendón y cuidadoEl músculo hacia el extremo proximal (cerca de la rodilla). ( C ) Discriminar la EDL del músculo TA, que es más grande y más superficial que el EDL. Separar el TA del músculo EDL tirando de los dos tendones distales en direcciones opuestas. ( D ) Una vez que el TA está aislado, colóquelo en la cámara del molde, como se describe, en la orientación NS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: CTX Induce Daño Muscular. Imágenes representativas de tinción de H & E en secciones de tejido transversal TA de ratones WT control, no dañados ( A ) y 5 d pi ( B ). La tinción con H & E revela la morfología normal de la fibra en ratones control ( A ) y massivE daño muscular e infiltrarse en los músculos lesionados ( B ), demostrando una morfología alterada tras la inyección de CTX. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: La autofagia se une a células MyoD-positivas durante la regeneración muscular. Imágenes representativas de secciones TA de ratones WT control ( A ) y lesionados ( B ) inmunotinados con LC3 (verde) y MyoD (rojo). La tinción con laminina (cian) marca las fibras musculares, y los núcleos se contrastan con DAPI (blanco). Los paneles de la derecha muestran imágenes representativas de la señal de fusión. Las flechas blancas indican células satélite que están por debajo de la lámina basal de la fibra marcada por tinción con laminina. El siguienteNg permite medir la autofagia mediante tinción de LC3 en células madre musculares sometidas a linaje miogénico, marcadas por MyoD. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Este protocolo describe cómo monitorear la autofagia en las células madre del músculo esquelético durante la regeneración muscular compensatoria. Varios anticuerpos para la co-tinción de LC3 y MyoD fueron probados, y los que trabajan en las secciones de tejido de ratón y crear resultados exitosos se enumeran aquí (ver Tabla de Materiales ). La permeabilización con metanol (ver paso 3.2.2) es altamente recomendada para la tinción exitosa.

La limitación de este protocolo está vinculada a la variabilidad intrínseca de los ratones, lo que obliga al uso de al menos 3 ratones / grupo experimental. Esta metodología refleja un paso adelante en el estudio de la autofagia durante la regeneración del músculo esquelético, ya que la mayoría de los resultados A ahora se hicieron en células aisladas. El análisis in situ permitió el estudio de la autofagia en el medio natural, sin necesidad de un aislamiento celular que pudiera afectar procesos metabólicos, como la autofagia.

"> Dada la naturaleza altamente dinámica del proceso autofágico, los tratamientos CLQ son un paso crítico para monitorear el proceso autofágico in vivo, CLQ bloquea las etapas posteriores del proceso autofágico, llevando a la acumulación de LC3 cuando se sostiene la autofagia. Hace que la LC3 sea detectable por el examen in situ.En los músculos esqueléticos no perturbados, el proceso autofágico basal no se incrementa más con el tratamiento con CLQ, como lo demuestra la ausencia de acumulación detectable de LC3. Otro paso crítico en el protocolo es la identificación de MuSC, que no debe ser intercambiado con otro tipo celular que puebla el músculo dañado durante la fase La identificación de MuSCs bajo la lámina basal que muestran la positividad de MyoD es la kEy para centrarse en las células satélites.

En resumen, se presenta un método adecuado in situ para detectar la participación del proceso autofágico en MuSCs. Esta técnica puede servir de base para las pruebas de los enfoques farmacológicos de la modulación de la autofagia, que podrían utilizarse para mejorar la regeneración del músculo esquelético en condiciones normales y patológicas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIAMS AR064873, Epigen Proyecto PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT a LL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J The Jackson Laboratory 000664 WT mice
Cardiotoxin 1 Latoxan L8102
Millex-VV Merck Millipore SLVV033RS Syringe Filter Unit, 0.1 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Chloroquine diphosphate salt Sigma-Aldrich C6628 Caution:
Harmful if swallowed
BD Micro-Fine + 0.5 mL BD 324825
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura Finetek 25608-930
Tissue-Tek Cryomold Intermediate Sakura Finetek 4566
2-Methylbutane Sigma-Aldrich 277258
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma-Aldrich HHS32
Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110132
o-Xylene Sigma-Aldrich X1040 Caution:
Flammable liquid and vapour; May be fatal if swallowed and enters airways; Harmful in contact with skin; May cause respiratory irritation; Causes serious eye irritation
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Caution:
Flammable solid; Harmful if swallowed; Causes skin irritation; May cause an allergic skin reaction; Causes serious eye damage; May cause respiratory irritation; Suspected of causing cancer
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-094
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Eukitt - Quick-hardening mounting medium Sigma-Aldrich 3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-007-003
LC3B Antibody Cell signaling Technology 2775
Monoclonal mouse anti-MyoD
(concentrated) clone 5.8A
DAKO - Agilent Pathology Solutions M3512
Laminin-2 (α-2-chain) monoclonal antibody Enzo Life Sciences 4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Life technologies A11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM Antibody Life technologies A21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306

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Tinción Inmunofluorescente <em>In Situ</em> de Autofagia en Células Madre Musculares
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Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).More

Castagnetti, F., Fiacco, E., Imbriano, C., Latella, L. In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells. J. Vis. Exp. (124), e55908, doi:10.3791/55908 (2017).

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