Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

Published: August 1, 2017 doi: 10.3791/55912
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute

Summary

تصف هذه المخطوطة طرق لتطبيق تقنية ميكروأري الببتيد على التنميط خصوصية الأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس والتعديلات بعد متعدية لها.

Abstract

يتم دراسة التعديلات بعد متعدية (بتمس) على البروتينات هيستون على نطاق واسع لدورها في تنظيم هيكل الكروماتين والتعبير الجيني. وقد سهل الإنتاج الضخم وتوزيع الأجسام المضادة المحددة ل هيستون بتمس إلى حد كبير البحث على هذه العلامات. كما هيستون الأجسام المضادة بتم هي الكواشف الرئيسية للعديد من الكروماتين تطبيقات الكيمياء الحيوية، تحليل دقيق للخصوصية الأجسام المضادة ضروري لتفسير البيانات دقيقة والتقدم المستمر في هذا المجال. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب متكامل لتصميم وتصنيع واستخدام ميكروأرس الببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة هيستون. يتم تسهيل جوانب التصميم والتحليل من هذا الإجراء من قبل أرينينيا، مفتوحة المصدر وتفاعلية حزمة البرامج التي قمنا بتطويرها مؤخرا لتبسيط تخصيص صيغ الطباعة ميكروأري. وقد استخدمت هذه الأنابيب لفحص عدد كبير من المتاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع هيستون بتم أنتيبوديs، والبيانات التي تم إنشاؤها من هذه التجارب متاحة بحرية من خلال قاعدة بيانات خصوصية هيستون الأجسام المضادة على الانترنت وتوسيعها. ما وراء الهستونات، المنهجية العامة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتحليل الأجسام المضادة بتم محددة.

Introduction

يتم تعبئة الحمض النووي الجيني بشكل أنيق داخل النواة النواة النواة النواة مع بروتينات هيستون لتكوين الكروماتين. وحدة فرعية من الكروماتين تكرار هو نوكليوسوم، والذي يتكون من 147 زوجا قاعدة من الحمض النووي ملفوفة حول جوهر أوكتامريك من البروتينات هيستون - H2A، H2B، H3، و H4 1 . وينظم الكروماتين على نطاق واسع في يوكروماتين معبأة فضفاضة ومجالات هيتيروكروماتين معبأة بإحكام. درجة ضغط الكروماتين ينظم المدى الذي يمكن للأجهزة البروتين الوصول إلى الحمض النووي الأساسي لتنفيذ العمليات الأساسية الحمض النووي مثل النسخ المتماثل، والنسخ، وإصلاح.

المنظمين الرئيسيين للوصول الجينوم في سياق لونين هي بتمس على الذيل غير المهيكلة والنطاقات الأساسية للبروتينات هيستون 2 ، 3 . هيستون بتمس وظيفة مباشرة من خلال التأثير على بنية لونين 4 وغير مباشر ثروغح تجنيد بروتينات القارئ والمجمعات الجزيئات المرتبطة بها التي لديها إعادة عرض لونين، الأنزيمية، والأنشطة السقالات 5 . دراسات على وظيفة هيستون بتم على مدى العقدين الماضيين تقترح بأغلبية ساحقة هذه العلامات تلعب الأدوار الرئيسية في تنظيم مصير الخلية، والتنمية الكائن الحي، ومرض بدء / التقدم. مدعوم من التقدم في تكنولوجيا الطيف الكتلي المستندة إلى البروتين، تم اكتشاف أكثر من 20 بتمس هيستون فريدة من نوعها على أكثر من 80 مخلفات هيستون متميزة 6 . ومن الجدير بالذكر أن هذه التعديلات غالبا ما تحدث في توليفات، وتمشيا مع فرضية "هيستون كود"، العديد من الدراسات تشير إلى أن البروتينات القارئ تستهدف مناطق منفصلة من الكروماتين من خلال الاعتراف مجموعات محددة من هيستون بتمس 7 ، 8 ، 9 . والتحدي الرئيسي الذي سيتحرك إلى الأمام هو تعيين وظائف إلى غربسبب قائمة هيتمون بتمس وتحديد كيفية تركيبات محددة من هيستون بتمس أوركسترات وظائف ديناميكية المرتبطة بالكروماتين.

الأجسام المضادة هي الكواشف لينكبين للكشف عن هيستون بتمس. وعلى هذا النحو، فقد تم تطوير أكثر من 1000 هيستون من الأجسام المضادة المتمثلة في هيتمون تجاريا لاستخدامها في أبحاث الكيمياء الحيوية للكروماتين. مع التطور السريع لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية، وتستخدم هذه الكواشف على نطاق واسع من قبل المحققين الفردية وعلى نطاق واسع إبيجنوميكس "خارطة الطريق" المبادرات (على سبيل المثال ، إنكود و بوبرينت) في تشيب-سيق (الكروماتين مناعي إلى جانب الجيل القادم التسلسل ) لتوليد خرائط المكانية عالية الدقة لتوزيع هيستون بتم على نطاق الجينوم 10 ، 11 . ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن خصوصية الأجسام المضادة هيستون بتم يمكن أن تكون متغيرة للغاية، وأن هذه الكواشف تظهر غير صالحة ( مثل ، أحادي أو ثنائي أو ثلاثي ميليليسين) 12 و 13 و 14 و 15 ، 16 ، 17 ، 18 . لذلك، مراقبة الجودة الصارمة من هيستون بتم-الكواشف الأجسام المضادة محددة ضروري لتفسير البيانات التي تم إنشاؤها بدقة مع هذه الكواشف القيمة.

تكنولوجيا ميكروأري تمكن الاستجواب في وقت واحد من الآلاف من التفاعلات الجزيئية في إنتاجية عالية، استنساخه، وتصغيرها الشكل. لهذا السبب، تم إنشاء مجموعة متنوعة من منصات ميكروأري لتحليل البروتين الحمض النووي 19 ،"> 20 والبروتينات البروتين 21 ، والتفاعلات الببتيد البروتين 22. في الواقع، وقد ظهرت ميكروأرس الببتيد هيستون كمنصة اكتشاف بالمعلومات للبحوث الكيمياء الحيوية لونين، مما يتيح التنميط الإنتاجية العالية للكتاب، محايات، وقراء هيستون بتمس 15 ، 23 ، 24 ، وأيضا لتحليل هيستون خصوصية الأجسام المضادة 17 ، 25. أبعد من تطبيقها في الكروماتين والبحوث علم الوراثة، صفائف الببتيد هيستون لها فائدة محتملة كاختبار التشخيص / النذير لذئبة الحمامية الجهازية وأمراض المناعة الذاتية الأخرى حيث المضادة للالتهابات، يتم إنشاء الأجسام المضادة لونين 26 ، 27 .

هنا، نحن تصف خط أنابيب المتكاملة التي وضعناها لتصميم، تلفيق، و كيوريجين هيبتون ميكروأرس هيستون لتوليد ملامح خصوصية للأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس و بتمس بهم. ويسهل خط الأنابيب من قبل أرينينيا، مفتوح المصدر، وتطبيق البرمجيات التفاعلية التي قمنا بتطويرها مؤخرا، والذي يدمج مراحل التصميم والتحليل من التجارب ميكروأري 28 . تعمل أرينينيا بشكل أفضل في غوغل كروم. باختصار، يتم استخدام طابعة ميكروأري الاتصال الروبوتية لإيداع مكتبة من البيوتين هيتون الببتيدات مترافق البيوتين في مواقف محددة على شرائح المجهر الزجاج ستريبتافيدين المغلفة. صفائف يمكن بعد ذلك أن تستخدم في شكل مقايسة تنافسية ومتوازية لاستجواب التفاعلات الأجسام المضادة-حاتمة ( الشكل 1 ). تتكون مكتبة الببتيد من مئات من الببتيدات الاصطناعية الفريدة التي تؤوي بتمس (ليسين أسيتيلاتيون، ليسين / أرجينين مثيلة، و سيرين / ثريونين فسفوريلاتيون) وحدها وفي توليفات ذات صلة مستمدة إلى حد كبير من مجموعات بروتيوميكس. طرق لتوليف الببتيد والتحقق من صحة مفصلة في مكان آخر 23 . يتم تخزين البيانات التي تم إنشاؤها من جهودنا الحالية هيستون بتم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام هذه المنصة مجموعة على الموارد على شبكة الإنترنت العامة، وهيستون هيتيون الأجسام المضادة قاعدة بيانات (www.histoneantibodies.com). ومن الجدير بالذكر أن هيستون الببتيد ميكروأرس ملفقة مع الاختلافات من هذا البروتوكول كما استخدمت على نطاق واسع لتوصيف نشاط هيستون بتم القارئ المجالات 8 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ومؤخرا إلى ملف هيستون بتم الكاتب و الممحاة الأنشطة 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
الشكل 1: رسم كاريكاتوري من الإجراء تدريجي لفحص الأجسام المضادة على هيستون الببتيد ميكروأري. الببتيدات هيستون البيروكسيديز الإيواء تعريف التعديلات بعد متعدية (الدوائر الحمراء والزرقاء) هي شارك في طباعة مع البيوتين فلوريسئين على الزجاج المغلفة ستريبتافيدين. يتم تصور التفاعلات الإيجابية كما مضان أحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تثبيت وتشغيل أرينينيا

  1. تحميل وتثبيت أوراكل صندوق الظاهري من www.virtualbox.org.
  2. تحميل وفك ضغط الجهاز الظاهري أرينينيا (فم) من http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. فتح مربع الظاهري وإضافة أرينينيا فم عن طريق النقر على 'آلة'، 'إضافة'، وحدد arrayninja.vbox من المجلد حيث تم حفظ أرينينيا فم.
  4. بدء أرينينيا عن طريق تحديده داخل المربع الظاهري والنقر على السهم الأخضر "بداية".
  5. سوف مربع الظاهري فتح نافذة جديدة وعرض رسالة مفادها أن فم يمكن الوصول إليها عن طريق التنقل في متصفح الويب إلى لوكالهوست: 2080.60. ملاحظة: نسخة حاوية من أرينينيا متاح أيضا عبر hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. تصميم شريحة الصفيف والمصدر تخطيط لوحة

  1. تحت عنوان "تخطيط تخطيط الشريحة" على واجهة أرينينيا، انقر على الرابط الذي يتوافق مع الطابعة ميكروأري المستخدمة.
    ملاحظة: تم برمجة أرينينيا لمحاكاة الحركة الروبوتية من اثنين من الطابعات ميكروأري تستخدم عادة (انظر الجدول1). التوافق مع أرايرز أخرى يمكن تكوين عند الطلب.
  2. انقر داخل مربع الحوار "تحميل لوحة"، واكتب "فارغة"، وانقر على "إدخال". انظر الشكل 2 للحصول على لقطة من وحدة تصميم أرينينيا.
  3. ضبط القطر بقعة إلى 275 ميكرون وتباعد البقعة إلى 375 ميكرون. ضبط الإعدادات المتبقية (لوحة كتل / صف لوحة، مجموع الصفوف الصف، مكررات، وميزات في ص، صفائف سوبر، سوبيرا الهراء؛ انظر الشكل 2 ) لتخصيص كيف ستظهر الميزات على الشريحة ميكروأري.
    ملاحظة: يتم تحديد قطر بقعة من حجم دبوس ميكروأري. كما يتم تعديل هذه الإعدادات، سيتم تحديث الشريحة الكرتون في الوقت الحقيقي. استخدام هذا الكرتون لمعاينة كيف كل إعداد هو تعديل تخطيط الشريحة النهائية.
  4. بعد الانتهاء من تخطيط الميزات على الشريحة، الماوس فوق كل ميزة فريدة من نوعها وأدخل معرف ميزة في مربع الحوار المنبثقة.
    ملاحظة: يمكن أن تتكون معرفات الخصائص من أرقام أو أحرف أو مجموعات. هذا مطلوب فقط للميزات الفريدة، ولن يظهر مربع حوار عند تحديد النسخ المتماثلة.
  5. بعد تعيين جميع الميزات الفريدة لمعرف، انقر على "ملء". أدخل اسما لتخطيط الشريحة وانقر على "طباعة اللوحة" لحفظها. سيتم فتح صفحة جديدة لعرض عدد من لوحات مصدر 384 جيدا اللازمة لتصنيع تصميم الشريحة المختارة وجدول رسم الخرائط الموقع الفعلي لكل ميزة ليتم تحميلها في لوحة المصدر (ق).
    ملاحظة: تذكر هذا الاسم، حيث سيتم استخدامه لتذكير هذا التصميم عند تحليل البيانات ميكروأري (انظر القسم 6.2). النقر على "طباعة لوحة الخاص بك" يحفظ تخطيط داخل أرينينيا.

الشكل 2
الشكل 2: أرينينيا وحدة التصميم. لقطة شاشة من يظهر أرينينيا وحدة التصميم في خط منقط. تظهر لوحة التحكم (أعلى) كافة المعلمات التي يمكن تغييرها على طابعة ميكروأري. كما يتم تعديل هذه المعلمات، صورة الكرتون من تخطيط الشريحة (أسفل اليسار) التحديثات في الوقت الحقيقي. بعد تعيين تخطيط، يمكن للمستخدم الماوس على البقع الفردية لإدخال المعرفات ميزة فريدة من نوعها. أرينينيا يبني من هذا إدخال المستخدم خريطة موقف كل ميزة في لوحة المصدر (ق) (أسفل اليمين) اللازمة لافتعال تخطيط الشريحة ميكروأري المحدد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تصنيع ميكروأرس

  1. إعداد لوحة المصدر
    1. استخدام الخريطة التي تم إنشاؤها مع أرينينيا في القسم 2.5 لإنشاء لوحة مصدر 384 جيدا (ق).
      ملاحظة: وصف مفصل من الببتيدات الاستعلام على هذا المنبر يمكن العثور عليها في أي مكان آخرs = "كريف"> 17.
    2. إيداع 1 - 2 ميكرولتر من كل ميزة (على سبيل المثال ، الببتيد هيستون الببتيد البيروكسيديز) في البئر الصحيح من لوحة مصدر 384 جيدا (ق).
      ملاحظة: عادة ما تودع الببتيدات هيستون البيروكسيديز من 200 - 400 ميكرومتر حلول الأسهم، وهو ما يعادل 10 إلى 25 أضعاف الفائض المولي من الببتيد لمواقع ملزمة ستريبتافيدين في بقعة صفيف واحد. ويحسب ذلك باستخدام المعادلة:
      معادلة
      حيث V هو حجم تسليمها من قبل دبوس، [ P ] هو تركيز الميزة التي يجري طباعتها، N A هو رقم أفوغادرو، و S هو مساحة سطح بقعة. C هو تغطية الشريحة، وأعرب عن عدد من جزيئات ستريبتافيدين لكل وحدة المساحة مضروبا في ثلاثة (متوسط ​​عدد المواقع المتاحة ستريبتافيدين ملزمة). يتم الحصول على V و C من قبل الشركة المصنعة المعنية. ميزات أخرى قدتتطلب تركيزات مختلفة اعتمادا على حجم جزيء حيوي حيث الازدحام قد يكون مصدر قلق. وينبغي اختبار مجموعة من تركيزات الطباعة لكل نوع جديد من الميزات تجريبيا لتحديد تركيز الطباعة الأمثل.
    3. تمييع كل ميزة 10 أضعاف مع 1X الطباعة العازلة تستكمل مع 1٪ ألبومين المصل البقري (بسا). تدور لوحة المصدر (ق) في 500 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: ويوصى بإدراج البيوتين المسمى فلوريسئين (5 ميكروغرام / ميكرولتر) في المخزن المؤقت الطباعة باعتبارها السيطرة على اكتشاف وكمساعدة البصرية لتسهيل المحاذاة صفيف المناسبة أثناء التحليل (انظر الشكل 4 ).
  2. بروتوكول الطباعة ( الشكل 3A - B ).
    1. إعداد المصفاة عن طريق إفراغ حاوية جمع النفايات وملء حاوية الحل غسل وحاوية مرطب مع الماء المقطر العقيمة.
    2. أدخل المعلمات uسيد لتصميم الشريحة في أرينينيا (القسم 2 والشكل 2 ) في برنامج التحكم طابعة ميكروأري.
    3. باستخدام برنامج التحكم الطابعة ميكروأري، تعيين إجراء الغسيل لغسل 1 ثانية مع الغمر واحد. تعيين إعدادات ما بعد غسل لإعادة تراجع دبابيس 5 مرات بعد كل غسل. تعيين الرطوبة إلى 60٪.
      ملاحظة: قد يختلف تكوين غسل الأمثل اعتمادا على الطابعة ميكروأري المستخدمة. قد يختلف التكوين الأمثل تراجع دبوس بعد غسل اعتمادا على الطابعة ميكروأري المستخدمة.
    4. إدراج الشرائح فونكتيوناليزد (على سبيل المثال ، والزجاج ستريبتافيدين المغلفة) في بلاتينس الركيزة ووضع جميع بلاتنس في المصعد الصوانى. إدراج لوحة المصدر (ق) في حامل لوحة (ق) ومكان في المصعد لوحة المصدر.
    5. انقر فوق "طباعة". مراقبة عملية الطباعة لبضع جولات من ترسب ميزة لضمان جميع إعدادات غسل وتراجع صحيحة. عند اكتمال تشغيل الطباعة، قم بإزالةلوحات الركيزة من المصل.
      ملاحظة: عندما تدير الطباعة الكبيرة تحظر الانتهاء من خطوات حجب في غضون يوم واحد، يمكن أن تحضن الشرائح المطبوعة في غرفة ترطيب في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. احتضان الشرائح بجانب كوب صغير من الماء داخل صندوق من الورق المقوى مختومة مع غلاف بلاستيكي.
    6. منع الشرائح مع العازلة حظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط.
    7. غسل الشرائح 2 × 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، ودرجة الحموضة 7.6 مع الخلط. تجفيف الشرائح عن طريق الغزل في الطرد المركزي الشريحة ميكروأري لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: لمعالجة عدد كبير من الشرائح في آن واحد، يمكن أن تستخدم عالية الإنتاجية المجهر الشريحة غسل الغرفة، والسماح 50 الشرائح ليتم غسلها في موازاة ذلك.
    8. للشرائح المصممة لتكون مقسمة بالشمع، انتقل إلى القسم 4.1. لجميع التصاميم الأخرى، مخزن الشرائح في 4 درجات مئوية محمية من الضوء والرطوبة.
      ملاحظة: الببتيدات هيستون البيروكسيديز المطبوعةمستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل عند تخزينها بهذه الطريقة.

4. تقسيم شرائح ميكروأري

  1. مسعور الشمع القلم ( الشكل 3C )
    1. تطبيق الشمع حول المناطق التي تحتوي على ميزات باستخدام القلم الشمع. السماح الشمع للهواء الجاف لمدة 5 دقائق قبل الشروع في القسم 5.
      ملاحظة: بعد الحجب، يمكن أن تكون البقع صفيف من الصعب جدا لتصور عن طريق العين. تصميم الشريحة من أرينينيا يمكن طباعتها على نطاق واستخدامها كدليل لتطبيق الشمع.
  2. سيليكون طوقا ( الشكل 3D )
    1. قشر الفيلم واضحة من الجزء الخلفي من مجموعة طوقا ووضع الجانب لاصق أسفل على الشريحة ميكروأري.
    2. أمسك الحشية في مكانها لمدة 5 ثوان قبل الانتقال إلى القسم 5.
  3. الشمع بصمة ( الشكل 3E )
    1. للشرائح المصممة لتكون مقسمة بالشمع، طباعة شريحة اختبار على الزجاج العادي باستخدام 10٪ بسا. استخدام هذه الشريحة اختبار لتحسين الشمع إمبرينتر أدلة أو مجموعة إعدادات لضمان جميع الميزات ستكون داخل غرف الشمع العفن.
    2. تسخين ميكروأري الشمع إمبرينتر إلى 85 درجة مئوية حتى يتم ذاب كل الشمع تماما، ما يقرب من 30 دقيقة.
    3. إدراج الشريحة مع الجانب المطبوعة التي تواجه أسفل ودفع الشريحة على طول الطريق إلى الدليل الصحيح على ميكروأري السلب. سحب ما يصل ذراع لجلب القالب في اتصال مع سطح الشريحة. عقد لمدة 2 ثانية.
      ملاحظة: يمكن تغيير الوقت عقد لتحقيق أقصى سماكة الحدود الشمع.
    4. إزالة بسرعة الشريحة وتفحص بصريا الحدود الشمع لضمان جميع الآبار المغلقة وأن الحدود ليست سميكة بحيث أنها تنتهك على البقع. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية محمية من الرطوبة والضوء.
      ملاحظة: يمكن زيادة وقت الانتظار أو انخفاض للحصول على حدود سمكا أو أرق.

الشكل 3: تصنيع ميكروأري. (A) هيستون الببتيد ميكروأري تلفيق على شرائح المجهر المغلفة ستريبتافيدين باستخدام طابعة ميكروأري الاتصال. (ب) ميكروأرز ملفقة مع 3 الرهانات من 48 × 48 شبكة من ميزات الببتيد. فصل (C) 3 سوبرايس مع القلم الشمع مسعور، (D) 2 الرهانات مع لاصق السيليكون، و (E) 48 الرهائن مع بصمة الشمع. كل ميكروأرس أظهرت ملفقة باستخدام 25 × 75 مم المجهر الشرائح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. تهجين هيستون بتم الأجسام المضادة مع ميكروأري الببتيد

  1. إعداد العازلة التهجين (بس، ودرجة الحموضة 7.6، 5٪ بسا، 0.1٪ توين -20).
  2. موازنة الشريحة في المخزن المؤقت التهجينوذلك باستخدام سفينة التهجين. تغطية تماما الشريحة بأكملها في العازلة التهجين واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على شاكر المداري في سرعة منخفضة.
  3. إعداد حل يحتوي على المخفف هيستون بتم الأجسام المضادة في التهجين العازلة.
    ملاحظة: في المثال البيانات، تم تخفيف كل من الهيستون الأجسام المضادة # 1 والجسم المضاد رقم 2 1: 1000 في المخزن المؤقت التهجين. ويوصى مجموعة التخفيف مماثلة لتلك المستخدمة ل إمونوبلوتينغ كنقطة انطلاق.
  4. احتضان الصفيف مع حل الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. إزالة الحل الأجسام المضادة وغسل صفيف 3 مرات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع برنامج تلفزيوني الباردة، ودرجة الحموضة 7.6.
  5. إعداد 1: 5،000 - 1: 10،000 التخفيف من الفلورسنت صبغ مترافق الأجسام المضادة الثانوية في العازلة التهجين.
  6. احتضان مصفوفة مع حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الشريحة ميكروأري 3 مرات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.6. غطسميكروأري في أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني 0.1X، ودرجة الحموضة 7.6 لإزالة الملح الزائد في درجة حرارة الغرفة. تجفيف الشريحة في الطرد المركزي الشريحة ميكروأري في درجة حرارة الغرفة.
  7. مسح الشريحة مع ماسح ضوئي ميكروأري في 25 ميكرون قرار أو أعلى، بعد بروتوكول المسح الضوئي ميكروأري الماسح الضوئي الصانع الموصى بها.
    ملاحظة: إذا فلوريسئين المسمى التتبع البيوتين موجود، مسح كل من القناة الخضراء (على سبيل المثال: 488 نانومتر، م: 509 نانومتر) والقناة التي تتوافق مع الأجسام المضادة الثانوية صبغ مترافق الفلورسنت، وعادة الحمراء (على سبيل المثال: 635 نانومتر، م : 677 نانومتر). الهدف من المسح هو الحصول على ملفات .tif قناة واحدة يمكن دمجها في ملف .png واحد (كما هو موضح في القسم 6.1).

6. تحليل البيانات ميكروأري باستخدام أرينينيا

  1. إعداد صورة ميكروأري المدمجة
    ملاحظة: الهدف من هذا القسم هو إنشاء ملف صورة. ينغ الذي يدمج ملفين .tif أحادية القناة (تم الحصول عليها في القسم 5). هذههو تنسيق الصورة الوحيدة المتوافقة مع وحدة تحليل أرينينيا. تمثل الإرشادات التالية إحدى الطرق الممكنة للحصول على ملف صورة مدمج. ومع ذلك، تتوفر حلول أخرى (على سبيل المثال ، إيميجيج مجانية).
    1. من سطر الأوامر في محطة باش لجهاز كمبيوتر مع إيماجيماجيك مثبت، انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات .tif قناة واحدة ونسخ / لصق الخطوات التالية، وضرب 'إدخال' بين كل خطوة (6.1.4 - 6.1 0.7).
      ملاحظة: يجب استبدال أسماء الملفات بأحرف كبيرة (على سبيل المثال ، RED_CHANNEL) باسم ملف الصور الشريحة ميكروأري.
    2. إذا لزم الأمر، أولا عكس الصور باستخدام الأمر "تحويل INPUT.tif -negate OUTPUT.tif". هذا مطلوب إذا كان الماسح الضوئي يحفظ ملفات .tif مع إشارة باللون الأبيض والخلفية باللون الأسود.
      1. كونفيرت -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel غب -evaluate سيت 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. التحويلإرت - العمق 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel رب -evaluate سيت 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. كونفيرت-ديبث 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel رغ -evaluate سيت 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. كونفيرت out.png outa.png outB.png -set colourspace رغف -combine merged.png.
        ملاحظة: سيتم حفظ ملف باسم 'merged.png' في نفس المجلد مثل ملفات .tif الأصلية.
  2. قياس البيانات باستخدام أرينينيا
    1. فتح أرينينيا وانقر على وصلة طابعة ميكروأري المناسبة تحت عنوان "لتحديد الصور التي لديها لوحة المصدر المعروفة." اكتب اسم تصميم الشريحة المحفوظة (الخطوة 2.5) في مربع الحوار "لوحة التحميل" وانقر على "إدخال". انظر الشكل 4 للحصول على لقطة من وحدة تحليل أرينينيا.
    2. انقر على "اختيار ملف" وانتقل إلى وحدد الملف "merged.png" الذي تم إنشاؤه في القسم 6.1. الصورة المدمجةe تحميل فضلا عن شبكة لتخطيط الشريحة.
    3. استخدام المتزلجون في الجزء السفلي من لوحة التحكم أرينينيا لضبط التباين والسطوع، ومنتصف.
      ملاحظة: هذه التعديلات هي لأغراض التصور فقط وليس لها تأثير على القياس الكمي.
    4. حدد "الدقة" وأدخل القيمة التي تتطابق مع دقة الصورة الممسوحة ضوئيا. استخدام "الجانب الهامش" و "الهامش العلوي" لتحريك الشبكة إلى محاذاة مع البقع على الصفيف. ضبط حسب الحاجة للحصول على الشبكة كما محاذاة بشكل وثيق على كل بقعة ممكن.
    5. انقر فوق 'سبوت سيك' وانتظر حتى يعود الزر إلى اللون الرمادي الأصلي.
      ملاحظة: هذا يمكن أن يتكرر عدة مرات إلى مركز الدوائر الشبكة على بقع الفردية. وظيفة البحث يريح الشبكة نحو كل بقعة لضبط محاذاة.
    6. تغيير قيمة "سوبر صفائف" إلى "1" للعمل على كل لوحة صفيف فرعي بشكل فردي (إذا رغبت في ذلك). إذا كنت تستخدم 4x 12 الشمع بصمة تخطيط الشريحة ( الشكل 3E )، استخدم "إيبين" "جبين" و "سوبا" الضوابط لإيقاف الميزات لتحليل أي مزيج المطلوب من 4 × 12 الآبار. على سبيل المثال، لتحليل أعلى اليسار وأعلى يمين الآبار كما مكررات لبعضها البعض، أدخل "1 4" في إيبين، "1 1" في جبين و "1 4" في سوبا. اضغط على "إنتر".
    7. مرر الماوس فوق النقاط الفردية لعرض هوية هذه الميزة.
    8. انقر فوق "تبديل التكبير" لمراجعة الميزات بعناية أكبر. حدد النقاط المرجعية الخلفية عن طريق الضغط على مفتاح 'R' في حين أن الماوس هو أكثر من بقعة. سيتم إبراز النقاط المرجعية باللون البرتقالي.
      ملاحظة: في وضع "تبديل الزوم"، يتم عرض صورة مكبرة للميزة أن الماوس قد انتهت في الزاوية اليمنى العليا. ونوقشت مناقشة مفصلة لخصائص التصحيح الخلفية الإضافية في أرينينيا في أماكن أخرى 28 .
    9. تبديل البقع (مع متنوعة على نطاق واسع مورفولوجيا بقعة أو الحطام التي من شأنها أن تؤثر على كمية دقيقة) عن طريق الضغط على مفتاح 'A' في حين تحوم الماوس فوق البقع المصابة. ستتحول البقع المعطلة إلى اللون الأبيض.
    10. انقر على "تعبئة" متبوعا ب "إرسال" لتحديد النقاط.
      ملاحظة: سيتم فتح علامة تبويب جديدة وعرض الرسم البياني الشريطي للبيانات تطبيع لألمع متوسط ​​البقعة. يحتوي الجدول أدناه الرسم البياني الشريطي على قيم البيانات المعيارية و الخام. يمكن نسخ هذا الجدول إلى جدول بيانات للأرشفة وإجراء مزيد من التحليل.

الشكل 4
الشكل 4: أرينينيا وحدة التحليل. يتم عرض لقطة شاشة وحدة تحليل أرينينيا. لوحة التحكم (أعلى اليسار) يظهر كل المعلمات التي يمكن تعديلها لتصور الصفيف، والعثور على البقع، ومحاذاة شبكة فوقصورة صفيف. يؤدي تحريك مؤشر الماوس فوق إحدى الميزات إلى عرض التكبير / التصغير (أعلى اليسار) ويعرض نافذة منبثقة تحتوي على معلومات التعريف المرتبطة بهذه الميزة (أسفل). النقاط المرجعية المختارة لتصحيح الخلفية هي البرتقال. الميزات التي سيتم استبعادها من التحليل المصب هي بيضاء. أرينينيا يحتوي على ميزة البحث القائم على النص الذي يسلط الضوء على ميزات مطابقة باللون الأصفر، كما هو مبين في المثال ل H4K16. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم استخدام هذا البروتوكول لتصميم وتصنيع منصة ميكروأري الببتيد لتحليل هيستون بتم الضد خصوصية. الصفيف يستعلم مكتبة من أكثر من 300 ميزات الببتيد فريدة من نوعها (20 - 40 بقايا في الطول) تمثل العديد من مجموعات معروفة من بتمس وجدت على الأساسية والبروتينات هيستون البديل 38 . وقد كان هذا خط أنابيب العمود الفقري لفحص العديد من الأجسام المضادة هيستون بتم المستخدمة على نطاق واسع والمتاحة تجاريا، ومجموعات البيانات الكاملة متوفرة على قاعدة بيانات هيستون الأجسام المضادة خصوصية (www.histoneantibodies.com). 17

العمود الفقري لخط أنابيب لدينا هو أرينينيا، وهو تطبيق البرمجيات مفتوحة المصدر التي قمنا بتطويرها مؤخرا، والذي يدمج مراحل التخطيط والتحليل من ميكروأري العمل 28 . وحدة تحليل أرينينيا يتيح للمستخدمين التفاعل في إنفورماطرق مع ملف صورة صفيف الخام. يتم دمج هويات ميزة المطبوعة تلقائيا مع الصورة، ويمكن الكشف عن هذه الهويات عن طريق تحوم مؤشر الماوس فوق بقعة. هذا التكامل يتيح أيضا البحث السريع عن ميزات الفائدة بالاسم واستبعاد الميزات من التحليل المصب. كما يوفر أرينينيا خيارات لتصحيح الضوضاء الخلفية المحلية وغير المحلية فضلا عن مخطط التصحيح الذي يتكيف مع بقعة التشكل. ويمكن الاطلاع على تفاصيل كاملة من أرينينيا وقدراتها في مكان آخر 28 .

أرينينيا بحساب كثافة إشارة لكل ميزة الببتيد وتجميع تلك الشدة إلى المتوسطات مع الخطأ استنادا إلى هوية الميزة. يتم إرجاع متوسطات الإشارة الخام والمطبيعة، حيث يتم تحديد ثابت التطبيع من خلال ألمع متوسط ​​للميزة. ويمكن استخدام شدة الإشارة لكل الببتيد لمقارنة التقارب النسبي من الأجسام المضادة بين الميزات على ميكروأري. هنا، وتبين لنا مجموعات البيانات تمثيلية لأجسام مضادة اثنين لمحة مع هذا الخط، وتسليط الضوء على خصائص التعرف على حاتمة التي ينبغي النظر فيها عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الكواشف ( الشكل 5 ).

الاعتراف خارج الهدف هو مصدر قلق لجميع الأجسام المضادة، و القواسم المشتركة في الحواتم المحيطة بقايا هيستون قابلة للتعديل يجعل هذا تحديا خاصا للأجسام المضادة هيستون بتم. في الواقع، الأجسام المضادة التي تم رفعها إلى الاعتراف ثلاثي ميثيلات يسين 9 على هيستون H3 (H3K9me3) يربط الببتيدات ثلاثي ميثيلد في H3K18، H3K27، ويسين 20 على هيستون H4 (H4K20me3) وكذلك أو أفضل من H3K9me3 ( الشكل 5A ). يتم حفظ تسلسل المحيطة H3K9 (أركس) مع H3K27، والتفاعل عبر الأجسام المضادة هيستون بتم والمنظمين الكروماتين التي ربط وتعديل هذه المواقع لوحظ في مكان آخرسس = "كريف"> 15 ، 39 ، 40 ، 41 . ولاحظ آخر ممتلكات الاعتراف خارج الهدف المشترك للأجسام المضادة ميثيل يسين هو عدم القدرة على التمييز ترتيب الميثيل. ويتجلى هذا من خلال النتائج التي تم الحصول عليها مع الأجسام المضادة H3K4me3، الذي يتفاعل مع H3K4me2 و H3K4me1 الببتيدات ( الشكل 5B ). التمييز بين أمر ميثيل مهم، كما أظهرت الدراسات أن H3K4me3، H3K4me2، و H3K4me1 يتم توزيعها بشكل مختلف عبر الجينوم، ومن المحتمل أن تعمل بطرق مختلفة 42 ، 43 . على سبيل المثال، يقع H3K4me3 في مواقع بدء النسخ من الجينات المكتوبة بشكل فعال، في حين أن المعززات النشطة تتميز عادة ب H3K4me1 44 .

بالإضافة إلى الاعتراف خارج الهدف، تأثير إيجابي وسلبيةه من قبل بتمس المجاورة هو ملكية لوحظ عادة من الأجسام المضادة هيستون. ويتأثر الجسم المضاد H3K9me3 هو مبين في الشكل 5A إيجابيا من مجموعات الأسيتيل على بقايا ليسين المجاورة. في الواقع، يظهر التحليل الطيفي الكتلة الأخيرة أن مجموعات الأسيتيل، وخاصة H3K14ac، وكثيرا ما تتزامن مع H3K9me3 38 . ويتأثر الجسم المضاد H3K4me3 هو مبين في الشكل 5B سلبا من الفسفرة المجاورة في ثريونين 6 (H3T6p). ومن المعروف H3T6p أن يكون لها تأثير إيجابي وسلب على حد سواء الاعتراف H3K4me3 من البروتينات القارئ، وهذا قد يكون بمثابة آلية ديناميكية لتنظيم توظيف عوامل لونين محددة 15 ، 45 .

الشكل 5
الشكل 5: تحليل الأجسام المضادة على ميكروأرس الببتيد. تحليل (A) H3K9me3 (الأجسام المضادة رقم 1) و (B) H3K4me3 (الأجسام المضادة # 2) الأجسام المضادة على ميكروأرس الببتيد. خطوط خضراء / قضبان تشير إلى الببتيد تؤوي فقط الهدف بتم المستهدفة. وتشير الخطوط / البارات الرمادية إلى الببتيدات التي لا تختلف شدة الإشارة اختلافا كبيرا (p> 0.05) عن الخط الأخضر / البار المحسوب باستخدام أنوفا أحادي الاتجاه يقارن متوسط ​​الكثافة النسبية لجميع الببتيدات إلى الببتيد المستهدف. وتشير الخطوط الحمراء والزرقاء / الحانات إلى إشارة تنخفض أو تزداد بشكل ملحوظ (p <0.05) من الخط الأخضر / الشريط الأخضر على التوالي. خطوط البرتقال / أشرطة تشير الببتيدات خارج الهدف. يتم عرض البيانات كما (يسار) صورة مرئية من تعقيد بتم على الببتيدات التي تغطي المناطق N- محطة من ذيول H3 و H4، حيث عرض كل سطر يتوافق مع كثافة النسبية قياس لتلك الميزة الببتيد، (يمين) الرسوم البيانية الشريطية وعرض متوسط ​​شدة الإشارة النسبية ± سيم من 6 قياس بقعة الفرديةعلى ميكروأرس. جميع الببتيدات المدرجة في هذا التحليل هي 20 الأحماض الأمينية في طول المقابلة إما هيستون H3 الأحماض الأمينية 1-20 أو 15-34. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

موثوقية الأجسام المضادة في تطبيقات البحوث الطبية الحيوية أمر بالغ الأهمية 46 ، 47 . هذا صحيح بشكل خاص في الكيمياء الحيوية لونين نظرا لموقف الأجسام المضادة كأدوات رئيسية لغالبية التقنيات المتقدمة لتوصيف وفرة وتوزيع هيتمون بتمس. بروتوكول المعروضة هنا تفاصيل خط أنابيب الأمثل لتصميم وتصنيع، واستخدام ميكروأرس الببتيد لتحليل خصوصية هيستون بتم الضد. وقد تم استخدام هذا الخط لفحص عدد كبير من الأجسام المضادة هيستون بتم المتاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع، والبيانات التي تم إنشاؤها من هذه التجارب متاحة بحرية من خلال الانترنت وتوسع قاعدة بيانات هيستون الأجسام المضادة (www.histoneantibodies.com) 17 .

واضح من عملنا وآخرون هي حالات متكررة من السلوك المضاد الهيستون بتم الضار التي يمكن أن تعقد الترجمة الفوريةأيون من البيانات التي تم إنشاؤها مع هذه الكواشف 12 ، 15 ، 17 . ولذلك فإن هناك حاجة إلى تدابير صارمة وشاملة لمراقبة الجودة من شركات الأجسام المضادة. ويتعين على الزعماء التجريبيين وقادة كونسورتيوم إبيجينوم (على سبيل المثال ، إنكود، بلبرينت) أن يظهروا أيضا صرامة في تقييمهم الخاص للأجسام المضادة هيستون بتم عند اختيار كاشف لدراستهم. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجهود الرامية إلى التقليل من التقلبات إلى دفعة إلى الحد الأدنى، وتوحيد استخدام الكواشف تقارب التحقق من صحة عالية عبر منصات رسم الخرائط إبيجنوم، وتطوير أدوات التقارب البديلة كلها عناصر قابلة للتنفيذ لمعالجة هذه المشكلة البحثية.

ميكروأرس لديها عدد من المزايا على المقايسات القائمة على ميكروبلات (على سبيل المثال ، إليسا) التي تجعلها مفيدة بشكل خاص لتوصيف خصوصية هيستون بتم الأجسام المضادة. ميكروأرس تمكن تحليل مواز وتنافسية الآلاف من الببتيد-التفاعلات الأجسام المضادة مع الحد الأدنى من استهلاك المواد. في البروتوكول الموصوفة هنا، 700 بيكومولز من كل ميزة الببتيد كافية لإنتاج 100 الشرائح ميكروأري. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكتمل تحليل الأجسام المضادة باستخدام أقل من 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة، والأشكال مجموعة مخصصة تمكين الأجسام المضادة متعددة ومختلف التخفيفات الأجسام المضادة ليتم فحصها في موازاة ذلك.

تصميم تخطيطات ميزة مخصصة على ميكروأرس يمكن أن تكون مهمة شاقة. بالإضافة إلى ذلك، كل تصميم جديد ميكروأري يتطلب بناء قالب تحليل جديد. وجدنا هذا أن تكون باهظة لتحقيق الاستفادة الكاملة من التكنولوجيا ميكروأري. هذا الدافع لدينا التنمية من أرينينيا، وهو تطبيق البرمجيات مفتوحة المصدر التفاعلية التي تدمج بسلاسة جوانب التصميم والتحليل من التجارب ميكروأري 28 . وحدة التصميم من أرينينيا يسمح للمستخدم بتصميم تفاعلي شريحة لتناسب تخطيط المطلوبة لتجربة. أرينينيا فيرتأو خرائط حركة الروبوتية للطابعة وترجم هذا إلى تخطيط لوحة المصدر لتصميم شريحة معينة ( الشكل 2 ). إنشاء أشكال مصفوفة مخصصة هو الآن ممارسة سريعة وروتينية. سمة رئيسية أخرى من أرينينيا هو الاتصال بين تصميم وتحليل الخطوات من العمل ميكروأري. مع إعدادات المعرفة من وحدة التصميم، أرينينيا تراكب شبكة تفاعلية على صورة ميكروأري الممسوحة ضوئيا، مما يتيح للمستخدم الماوس فوق أي ميزة للكشف عن هويتها أو البحث عن ميزات الفائدة ( الشكل 4 ).

ومن الجدير بالذكر عدة خطوات حاسمة في هذا الخط. أولا، عند تصميم تخطيط الطباعة، ينبغي النظر في تضمين ما يكفي من البقع المكررة من أجل تحقيق أهمية في جمع البيانات. بالإضافة إلى ذلك، لحساب التباين بين دبوس إلى دبوس، يجب أن تودع كل ميزة من قبل اثنين على الأقل من دبابيس مختلفة. وأخيرا، ربما تكون الخطوة الأكثر أهمية هي التوليد الماديأيون من لوحة المصدر. الاستخدام الناجح لل ميكروأرس عالية الكثافة الموصوفة في هذا البروتوكول يعتمد على القدرة على رسم خريطة هوية كل ميزة لموقعها الفعلي على الشريحة النهائية. هذه مهمة رسم الخرائط ليست تافهة، ولكن أرينينيا يسهل إلى حد كبير هذه الخطوة من خلال توفير خريطة لوحة. أي انحرافات لهذه الخريطة أثناء إنشاء لوحات المصدر سوف يؤدي إلى استنتاجات غير صحيحة أثناء التحليل.

من المهم النظر في القيود المفروضة على استخدام ميكروأرس لتحليل خصوصية الأجسام المضادة. في حين تم الكشف عن خارج الهدف هيستون بتم الأجسام المضادة الخصائص التي تم التقاطها على مجموعة لترجمة إلى نهج تجريبية مع ظروف التهجين مماثلة (على سبيل المثال ، إمونوبلوت) 17 ، 18 ، وإلى أي مدى التنميط القائم على مجموعة من الأجسام المضادة خصوصية يترجم إلى بروتوكولات رقاقة موحية 14 ، 17 ولكن واررانتس تقييم أكثر أهمية.

وقد وصفت الاختلافات في هذا الخط سابقا لتحليل القراء هيستون والكتاب، والمحايات 23 ، 24 . تعديل هذا النظام الأساسي للمنفعة خارج البحوث علم الوراثة يمكن تكييفها بسهولة لأي مكتبة قابلة للطباعة من الفائدة. ومن الممكن أيضا أن المواد أكثر تعقيدا من الببتيدات يمكن استخدامها لبناء ميكروأرس للبحوث الكيمياء الحيوية لونين. على سبيل المثال، يتم الآن إنشاء نوكلأوسومات المؤتلف عرض مختلف بتمس بشكل روتيني في إعداد المختبر 48 وتحديد خصائص خصوصية الأجسام المضادة هيستون بتم في سياق هذه الوحدة ذات الكروماتين فسيولوجيا ذات الصلة فسيولوجيا ستكون منطقة مثيرة للدراسة في المستقبل.

يستخدم نهج بديل على نطاق واسع للبروتوكول الموصوفة هنا تكنولوجيا صفيف سبوت، حيث يتم تصنيعها مئات الببتيدات مباشرة على الخلية الخلويةتفقد دعم الغشاء 49 . ويمكن بعد ذلك استخدام الغشاء نفسه لتطبيقات ميكروأري 50 . تكنولوجيا سبوت هو مفيد من وجهة نظر تعقيد المكتبة وتكلفة التوليف. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن نقاء الببتيدات توليفها باستخدام طريقة سبوت لتختلف، ومراقبة الجودة وتنقية تدابير مشتركة لتوليد الببتيد الصلبة المرحلة (على سبيل المثال ، هبلك ومطياف الكتلة) لا يتم بشكل روتيني 50 ، 51 . بالإضافة إلى ذلك، عرض الببتيد على النيتروسليلوز ليست موحدة ويمكن درع الحواتم. ومن الجدير بالذكر أن كلا النوعين من منصات هيستون الببتيد مجموعة متاحة تجاريا للمستخدمين الذين لا يستطيعون الوصول إلى المعدات المتخصصة اللازمة لتجميع الببتيدات وتصنيع صفائف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من معهد بحوث فان أندل ومنحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (CA181343) ل سبر

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. International Human Epigenome Consortium. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the "histone code" . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. "On silico" peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 126، ميكروأرس الببتيد، هيستون التعديلات بعد متعدية، الأجسام المضادة، رمز هيستون، علم الوراثة، الكروماتين
تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornett, E. M., Dickson, B. M.,… More

Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter