Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

Published: August 1, 2017 doi: 10.3791/55912
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute

Summary

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

Abstract

לאחר שינויים טרנסלציוניים (PTM) על חלבונים היסטון נחקרים באופן נרחב עבור תפקידים שלהם ויסות מבנה הכרומטין ביטוי גנים. ייצור המוני והפצה של נוגדנים ספציפיים PTMs היסטון יש להקל מאוד מחקר על סימנים אלה. כמו נוגדנים PTM היסטון הם ריאגנטים מפתח עבור יישומים ביוכימיה רבים הכרומטין, ניתוח קפדני של נוגדנים הספציפיות נחוץ לפרש נתונים מדויק והמשך ההתקדמות בתחום. פרוטוקול זה מתאר צינור משולב עבור ייצור, ייצור ושימוש של microprays פפטיד עבור אפיון הספציפיות של נוגדנים היסטון. עיצוב וניתוח היבטים של הליך זה הם הקלו על ידי ArrayNinja, קוד פתוח וחבילת תוכנה אינטראקטיבית פיתחנו לאחרונה כדי לייעל את ההתאמה האישית של פורמטים להדפיס microarray. צינור זה שימש למסך מספר רב של antibodie PTM זמין מסחרית בשימוש נרחבS, ונתונים שנוצרו בניסויים אלה זמינים באופן חופשי דרך האינטרנט והרחבת ההיסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים. מעבר היסטונים, המתודולוגיה הכללית המתוארת כאן ניתן ליישם באופן רחב לניתוח של נוגדנים ספציפיים PTM.

Introduction

הדנ"א הגנומי הוא ארוז באלגנטיות בתוך גרעין התא האוקריוטים עם חלבונים היסטון ליצירת הכרומטין. יחידת המשנה של הכרומטין היא הנוקלאוזום, המורכב מ -147 זוגות בסיס של דנ"א עטופים סביב ליבה אוקטמית של חלבונים היסטוניים - H2A, H2B, H3 ו- H4 1 . הכרומטין מאורגן באופן כללי לתוך euchromatin ארוז רופף ותחומים heterochromatin ארוז בחוזקה. מידת הדחיסה הכרומטין מסדירה את המידה שבה machineries חלבון יכול לגשת DNA הבסיסית לבצע תהליכים בסיסיים DNA תבניות כמו שכפול, שעתוק, ותיקון.

רגולטורים עיקריים של נגישות הגנום בהקשר של הכרומטין הם PTM על זנב בלתי מובנה ותחומי הליבה של חלבונים היסטון 2 , 3 . Histone PTMs לתפקד ישירות על ידי השפעה על המבנה של הכרומטין 4 בעקיפין througH גיוס של חלבונים הקורא מתחמי macromolecular הקשורים להם כירומטין שיפוץ, פעילויות אנזימטיות, פיגומים 5 . מחקרים של פונקציה PTM היסטון במהלך שני העשורים האחרונים להצביע על הסימנים האלה לשחק תפקידים מרכזיים בוויסות גורל התא, התפתחות אורגניזמים, ואת תחילת המחלה / התקדמות. מונעת על ידי ההתקדמות של הטכנולוגיה מבוסס proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה, יותר מ -20 PTMs היסטון ייחודי על יותר מ 80 שאריות היסטון שונים התגלו 6 . יש לציין כי שינויים אלה מתרחשים לעיתים קרובות בשילובים, ועולים בקנה אחד עם ההשערה "קוד היסטון", מחקרים רבים מציעים כי חלבונים הקורא ממוקדות אזורים נפרדים של הכרומטין באמצעות הכרה של שילובים ספציפיים של PTMs היסטון 7 , 8 , 9 . אתגר מפתח להתקדם יהיה להקצות פונקציות לגררשימה של htone PTMs ולקבוע כיצד שילובים ספציפיים של PTMs היסטון לתזמר את הפונקציות דינמי הקשורים הכרומטין.

נוגדנים הם ריאגנטים lynchpin עבור זיהוי של PTMs היסטון. ככזה, יותר מ -1,000 נוגדנים ספציפיים PTM ספציפי היסטון פותחו מסחרית לשימוש במחקר ביוכימיה הכרומטין. עם התפתחות מהירה של התפוקה גבוהה דנ"א טכנולוגיית רצף, ריאגנטים אלה נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים בודדים בקנה מידה גדול epigenomics "מפת הדרכים" יוזמות ( למשל , ENCODE ו BLUEPRINT) ב שבב- seq (כרום immunoprecipitation הכרומטין עם הדור הבא רצף ) צינורות ליצור ברזולוציה גבוהה מפות מרחביות של היסטון PTM היסטון גנום רחב 10 , 11 . עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הספציפיות של נוגדנים PTM היסטון יכול להיות משתנה מאוד וכי ריאגנטים אלה התערוכה unf תכונות אבורייביות כגון הכרה ב- epitope מחוץ להשפעה, השפעה חיובית ושלילית חזקה על-ידי PTM שכנות וקושי בהבחנה של סדר השינוי על שאריות מסוימת ( לדוגמה , מונו-די- או טרי-מתילייזין) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . לכן, בקרת איכות קפדנית של ריאגנטים נוגדנים ספציפיים היסטון PTM יש צורך לפרש במדויק נתונים שנוצרו עם אלה ריאגנטים יקר.

טכנולוגיית Microarray מאפשרת חקירה סימולטנית של אלפי אינטראקציות macromolecular בתפוקה גבוהה, לשחזור, ואת פורמט ממוזער. מסיבה זו, מגוון של פלטפורמות microarray נוצרו לנתח חלבון DNA 19 ,"20, חלבון 21 חלבון, אינטראקציות חלבונים פפטיד 22. אכן, microstrays פפטיד היסטון צמחו כפלטפורמה גילוי אינפורמטיבי עבור מחקר ביוכימיה הכרומטין, המאפשר פרופיל התפוקה גבוהה של סופרים, מחקים, ו הקוראים של PTMs היסטון 15 , 23 , 24 , וכן לניתוח של נוגדנים הנוגדן היסטון 17 , 25. מעבר ליישום שלהם במחקר הכרומטין ו epigenetics, מערכי פפטיד היסטון יש פוטנציאל השירות כמו אבחון / בדיקה פרוגנוסטית זאבת מערכתית אריתמטוס ומחלות אוטואימוניות אחרות שבו אנטי- נוגדנים עצמיים הכרומטין נוצרים 26 , 27 .

כאן, אנו מתארים צינור משולב שפיתחנו עבור עיצוב, בודה, queRyan histone microptrays פפטיד כדי ליצור פרופילים ספציפיות עבור נוגדנים לזהות histones ו PTM שלהם. צינור הוא הקל על ידי ArrayNinja, קוד פתוח, יישום תוכנה אינטראקטיבית כי פיתחנו לאחרונה, המשלבת את שלבי התכנון והניתוח של ניסויים microarray 28 . ArrayNinja עובד הכי טוב ב- Google Chrome. בקצרה, מדפסת microarray קשר רובוטית משמש להפקיד ספריה של פפטידים היסטון ביוטין מצומדות במיקומים מוגדרים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית streptavidin מצופה. מערכים לאחר מכן ניתן להשתמש בפורמט assay תחרותי במקביל לחקור אינטראקציות נוגדן-epitope ( איור 1 ). הספריה פפטיד מורכב מאות פפטידים סינתטיים ייחודי מחסה PTMs (ליזין acetylation, ליזין / מתילציה ארגינין, ו serine / threonine זרחון) לבד בשילובים רלוונטיים נגזר בעיקר מן הנתונים datasets proteomics. שיטות סינתזה פפטיד ואימות מפורטים במקום אחר 23. נתונים שנוצרו על ידי המתמשך שלנו histone PTM נוגדנים בדיקות הסינון באמצעות פלטפורמת מערך זה מאוחסנים על משאב אינטרנט ציבורי, היסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים (www.histoneantibodies.com). יש לציין, כי microarrays היסטון פפטיד מפוברק עם וריאציות של פרוטוקול זה שימשו גם בהרחבה כדי לאפיין את פעילותם של תחומים הקורא PTM היסטון 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 ולאחרונה פרופיל היסטון PTM סופר ומחק פעילויות 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
איור 1: תיאור קריקטורה של נוהל שלב של הקרנת נוגדנים על micropray פפטיד היסטון. פפטידים היסטון Biotinylated מחסה שינויים שלאחר טרנסלציה מוגדרים (עיגולים אדומים וכחולים) מודפסים בשיתוף עם biotin-fluorescein על זכוכית מצופה streptavidin. אינטראקציות חיוביות הם דמיינו כמו פלואורסצנטי אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התקנה והפעלת ArrayNinja

  1. הורד והתקן את Oracle Virtual Box מתוך www.virtualbox.org.
  2. הורד או לבטל את הדחיסה של מכונה וירטואלית ArrayNinja (VM) מ http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. פתח Virtual Box ולהוסיף את ArrayNinja VM על ידי לחיצה על 'מחשב', 'הוסף', ובחר arrayninja.vbox מהתיקייה שבה נשמר ArrayNinja VM.
  4. התחל ArrayNinja על ידי בחירת אותו בתוך Virtual Box ולחיצה על החץ 'התחל' ירוק.
  5. Virtual Box יפתח חלון חדש ויציג הודעה כי VM ניתן לגשת על ידי ניווט בדפדפן האינטרנט כדי localhost: 2080.60; הערה: גרסה של containerized של ArrayNinja זמינה גם דרך hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. עיצוב מערך שקופית ואת מקור פלייט פריסה

  1. תחת "תוכנית פריסה שקופית" כותרת על ממשק ArrayNinja, לחץ על הקישור המתאים למדפסת microarray בשימוש.
    הערה: ArrayNinja כבר מתוכנת לחקות את התנועה הרובוטית של שני מדפסות microarray נפוץ (ראה טבלה1). תאימות עם arrayers אחרים ניתן להגדיר לפי בקשה.
  2. לחץ בתוך תיבת הדו-שיח 'טען צלחת', הקלד "ריק" ולחץ על 'Enter'. ראה איור 2 עבור צילום מסך של מודול העיצוב ArrayNinja.
  3. להתאים את קוטר ספוט ל 275 מיקרומטר ואת המרווח נקודה ל 375 מיקרומטר. התאם את ההגדרות הנותרות (בלוקים צלחת / שורה צלחת, סה"כ שורות צלחת, משכפל, תכונות y, מערכים סופר, פאדג 'סופר, ראה איור 2 ) כדי להתאים אישית את התכונות יופיעו על השקופית microarray.
    הערה: קוטר הנקודה נקבע על ידי גודל של סיכת microarray. כמו הגדרות אלה מותאמים, שקופית קריקטורה יעדכן בזמן אמת. השתמש בקריקטורה זו כדי לראות כיצד כל הגדרה משנה את פריסת השקופית הסופית.
  4. לאחר פריסת התכונות בשקופית הסופית, העכבר מעל כל תכונה ייחודית והזן את מזהה התכונה בתיבת הדו-שיח המוקפצת.
    הערה: מזהי תכונות יכולים להכיל מספרים, אותיות או שילובים. זה נדרש רק עבור תכונות ייחודיות, תיבת הדו שיח לא יופיע כאשר משוכפלים מסומנים.
  5. לאחר שכל התכונות הייחודיות הוקצו למזהה, לחץ על 'מאכלס'. הזן שם לפריסת השקפים ולחץ על 'הדפס את הצלחת' כדי לשמור. דף חדש יפתח המציג את מספר 384-well המקור לוחות צורך לפברק את השקופית שקופית נבחר טבלה מיפוי המיקום הפיזי של כל תכונה להיות נטען בצלחת המקור (ים).
    הערה: זכור את השם הזה, שכן הוא ישמש כדי לזכור עיצוב זה בעת ניתוח נתוני microarray (ראה סעיף 6.2). לחיצה על "הדפס את הצלחת שלך שומר את הפריסה בתוך ArrayNinja.

איור 2
איור 2: מודול עיצוב ArrayNinja. צילום מסך של מודול העיצוב ArrayNinja מוצג בשורה מנוקדת. לוח הבקרה (למעלה) מציג את כל הפרמטרים שניתן לשנות במדפסת microarray. כמו פרמטרים אלה מותאמים, התמונה הקריקטורה של פריסת השקופית (למטה משמאל) עדכונים בזמן אמת. לאחר הפריסה, המשתמש יכול לעבור על נקודות בודדות כדי להזין מזהי תכונות ייחודיים. ArrayNinja בונה קלט משתמש זה מפה של המיקום של כל תכונה בצלחת המקור (ים) (מימין למטה) צורך לפברק פריסה שקופית microarray שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. בודה Microarrays

  1. הכנת לוח המקור
    1. השתמש המפה שנוצר עם ArrayNinja בסעיף 2.5 כדי ליצור את הצלחת 384 גם מקור (ים).
      הערה: תיאורים מפורטים של פפטידים queried על פלטפורמה זו ניתן למצוא במקום אחרS = "xref"> 17.
    2. הפקדה 1 - 2 μL של כל תכונה ( למשל , פפטיד היסטון biotinylated) לתוך הבאר הנכון של צלחת 384 גם מקור (ים).
      הערה: פפטידים היסטון Biotinylated מופקדים בדרך כלל מ 200-400 פתרונות מניות מיקרומטר, אשר משווה את 10 עד 25 פי הטבעת עודף של פפטיד לאתרים streptavidin מחייב במקום מערך אחד. זה מחושב באמצעות המשוואה:
      משוואה
      כאשר V הוא הנפח מועבר על ידי סיכה, [טז] הוא הריכוז של התכונה מודפס, N A הוא מספר אבוגדרו, ו- S הוא שטח הפנים של נקודה. C הוא הכיסוי של השקופית, לידי ביטוי כמספר המולקולות streptavidin ליחידת שטח כפול שלוש (המספר הממוצע של אתרי מחייב streptavidin זמין). V ו- C מתקבלים על ידי היצרן בהתאמה. תכונות אחרות עשויות להיותדורשים ריכוזים שונים בהתאם לגודל של ביומולקולה שבו הצפיפות עשויה להיות דאגה. מגוון של ריכוזי הדפסה עבור כל סוג חדש של תכונה צריך להיבדק באופן אמפירי כדי לקבוע את הריכוז הדפוס האופטימלי.
    3. לדלל כל תכונה 10 פי עם חיץ הדפסה 1x בתוספת 1% אלבומין בסרום שור (BSA). ספין את צלחת המקור (ים) ב 500 xg למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: הכללה של biotin שכותרתו fluorescein (5 מיקרוגרם / μL) במאגר ההדפסה מומלץ כבקרת תצפית וכסיוע חזותי כדי להקל על יישור מערך תקין במהלך ניתוח (ראה איור 4 ).
  2. פרוטוקול הדפסה ( איור 3 א - ב ).
    1. הכן את המערך על ידי ריקון מיכל איסוף פסולת ומלא את מיכל פתרון לשטוף ומיכל אדים עם מים מזוקקים סטריליים.
    2. הזן את הפרמטרים uSed לעצב את השקופית ArrayNinja (סעיף 2 ואיור 2 ) לתוך תוכנית בקרת מדפסת microarray.
    3. באמצעות תוכנית בקרת מדפסת microarray, להגדיר את הליך הכביסה לשטוף 1 עם טבילה אחת. הגדר את ההגדרות לאחר כביסה כדי לטבול מחדש את הפינים 5 פעמים לאחר כל לשטוף. הגדר את הלחות ל -60%.
      הערה: תצורת השטיפה האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם למדפסת microarray בשימוש. תצורת הטבילה האופטימלית לאחר השטיפה עשויה להשתנות בהתאם למדפסת microarray בשימוש.
    4. הכנס שקופיות פונקציונלי ( למשל , זכוכית streptavidin מצופה) לתוך לוחות המצע ומכניסים את כל platens לתוך המעלית platen. הכנס את צלחת המקור (ים) לתוך מחזיק הצלחת (ים) והכנס למעלית המקלחת.
    5. לחץ על 'הדפס'. לפקח על תהליך ההדפסה עבור כמה סיבובים של בתצהיר תכונה כדי להבטיח את כל הגדרות לשטוף לטבול נכונים. לאחר השלמת ההדפסה, הסראת המצע platens מן המערך.
      הערה: כאשר ריצות הדפסה גדולות אוסרים על השלמת שלבי חסימה בתוך יום אחד, שקופיות מודפס יכול להיות מודגרת בתא humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. דגירה את השקופיות ליד כוס קטנה של מים בתוך קופסת קרטון חתום בעטיפה פלסטיק.
    6. לחסום את השקפים עם חיץ חסימת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב.
    7. שטפו את השקופיות 2 x 10 דקות בטמפרטורת החדר ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), pH 7.6 עם ערבוב. יבש את השקופיות על ידי ספינינג צנטריפוגה שקופיות microarray במשך 30 s בטמפרטורת החדר.
      הערה: לעיבוד מספר גדול של שקופיות בבת אחת, תפוקה גבוהה מיקרוסקופ שקופית כביסה החדר ניתן להשתמש, המאפשר 50 שקופיות להישטף במקביל.
    8. עבור שקופיות שנועדו להיות מחולקת עם שעווה, המשך לסעיף 4.1. עבור כל עיצובים אחרים, שקופיות חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור ולחות.
      הערה: מודפס פפטידים היסטון biotinylatedיציבים במשך לפחות 6 חודשים כאשר מאוחסנים בדרך זו.

4. מחיצות Microarray שקופיות

  1. הידרופובי עט שעווה ( איור 3 ג )
    1. החל שעווה סביב אזורים המכילים תכונות באמצעות עט שעווה. אפשר שעווה לאוויר יבש במשך 5 דקות לפני שתמשיך סעיף 5.
      הערה: לאחר חסימה, נקודות המערך יכול להיות קשה מאוד לדמיין לפי העין. עיצוב שקופית מ ArrayNinja ניתן להדפיס בקנה מידה ומשמש מדריך עבור החלת שעווה.
  2. אטם הסיליקון ( איור 3D )
    1. לקלף את הסרט ברור את החלק האחורי של אטם מערך במקום בצד דבק על גבי השקופית microarray.
    2. החזק את האטם במקום למשך 5 שניות לפני שתמשיך לסעיף 5.
  3. שעווה חותם ( איור 3E )
    1. עבור שקופיות שנועדו להיות partitioned על ידי שעווה, להדפיס שקופית הבדיקה על זכוכית רגילה באמצעות BSA 10%. השתמש בשקופית הבדיקה הזו כדי לייעל את המדריכים imminter שעווה או הגדרות מערך כדי להבטיח את כל התכונות יהיו בתוך החדרים עובש שעווה.
    2. מחממים את השעווה microarray שעווה ל 85 מעלות צלזיוס עד כל שעווה הוא נמסה לחלוטין, כ 30 דקות.
    3. הכנס את השקופית עם הצד המודפס פונה כלפי מטה ולדחוף את השקופית כל הדרך אל המדריך הנכון על ההופעה microarray. משוך את הידית כדי להביא את התבנית במגע עם פני השטח של השקופית. החזק במשך 2 שניות.
      הערה: זמן ההחזקה יכול להיות שונה כדי להשיג עובי גבול שעווה אופטימלי.
    4. להסיר במהירות את השקופית ואת חזותית לבדוק את גבולות השעווה כדי להבטיח את כל הבארות סגורים כי הגבולות הם לא כל כך עבה כי הם לחרוק על כתמים. שקופיות חנות ב 4 ° C מוגן מפני לחות ואור.
      הערה: ניתן להגדיל או להקטין את זמן ההחזקה כדי להגיע לגבולות עבים או דקים יותר.

"איור איור 3: ייצור Microarray. (א) Histone פפטיד microarray ייצור על שקופיות מיקרוסקופ streptavidin מצופה באמצעות מדפסת microarray מגע. (ב) Microarrays מפוברק עם 3 subrarays של 48 x 48 רשת של תכונות פפטיד. הפרדה של ג ( 3 ) תת-שערים עם עט שעווה הידרופובי, (D) 2 תת-דומייתי עם דבק סיליקון, ו- (E) 48 תת-שכבות עם טביעת שעווה. כל microarrays מוצגים מפוברקים באמצעות שקופיות 25 x 75 מ"מ מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. הכלאה של נוגדנים PTM היסטון עם Microarray פפטיד

  1. הכן חיץ הכלאה (PBS, pH 7.6, BSA 5%, 0.1% Tween-20).
  2. לאזן את השקופית במאגר הכלאהבאמצעות כלי הכלאה. לגמרי לכסות את השקופית כולה חיץ הכלאה דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית במהירות נמוכה.
  3. הכן פתרון המכיל נוגדנים PTM נוגדן היסטון במאגר הכלאה.
    הערה: בנתונים לדוגמה, הן נוגדנים היסטון # 1 ונוגדן # 2 היו מדולל 1: 1,000 במאגר הכלאה. טווח דילול דומה לזה המשמש immunoblotting מומלץ כנקודת התחלה.
  4. לדגור את המערך עם פתרון נוגדנים עבור 1 שעות ב 4 ° C. הסר את הפתרון נוגדנים לשטוף את המערך 3 פעמים במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם PBS קר, pH 7.6.
  5. הכן 1: 5000 - 1: 10,000 דילול של נוגדן משני פלואורסצנטי מצומדות לצבוע במאגר הכלאה.
  6. לדגור את המערך עם פתרון נוגדנים משני עבור 30 דקות ב 4 ° C מוגן מפני האור. הסר את הפתרון נוגדנים משני לשטוף את השקופית microarray 3 פעמים במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם PBS, pH 7.6. לִטבּוֹלMicroarray בצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 0.1x PBS, pH 7.6 להסיר מלח עודף בטמפרטורת החדר. יבש את השקופית בצנטריפוגה שקופיות microarray בטמפרטורת החדר.
  7. סרוק את השקופית עם סורק microarray ברזולוציה 25 מיקרומטר או גבוה יותר, בעקבות פרוטוקול הסריקה המומלץ של היצרן microarray סורק.
    הערה: אם נותב biotin שכותרתו פלואורסצין קיים, סרוק את הערוץ הירוק (לדוגמה: 488 ננומטר, em: 509 ננומטר) והערוץ המתאים לצבע הנוגדנים המשניים של צבע ניאון פלואורסצנטי, בדרך כלל אדום (לדוגמה: 635 ננומטר, em : 677 ננומטר). מטרת הסריקה היא להשיג קבצי .tif ערוץ יחיד שניתן למזג לקובץ .png יחיד (כמתואר בסעיף 6.1).

6. ניתוח של נתונים Microarray באמצעות ArrayNinja

  1. הכנת תמונה microarray ממוזג
    הערה: מטרתו של סעיף זה היא ליצור קובץ תמונה .png שממזג את שני קבצי .tif החד-ערוציים (שהתקבלו בסעיף 5). זֶההוא פורמט התמונה היחיד התואם את המודול ניתוח ArrayNinja. ההוראות הבאות מייצגות דרך אחת להשיג קובץ תמונה ממוזג. עם זאת, פתרונות אחרים זמינים ( למשל , ImageJ חופשית).
    1. משורת הפקודה במסוף bash של מחשב עם תוכנת ImageMagick התקינה, נווט לתיקיה שמכילה את הקבצים .tif הערוץ היחיד, להעתיק / להדביק את השלבים הבאים, להכות 'Enter' בין כל צעד (6.1.4 - 6.1 .7).
      הערה: יש להחליף את שמות הקבצים באותיות רישיות ( לדוגמה , RED_CHANNEL) בשם הקובץ של תמונות השקופיות של microarray.
    2. במידת הצורך, תחילה להפוך את התמונות באמצעות הפקודה 'להמיר INPUT.tif -Negate OUTPUT.tif'. פעולה זו נדרשת אם הסורק חוסך קבצים .tif עם האות הלבן והרקע בשחור.
      1. המרה -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel GB-resaluation set 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. המרותErt - עומק 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0-ערוץ RB- הערכה מחדש להגדיר 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. המרת -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel RG-Revaluate set 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. המרת out.png outa.png outB.png -set colorpace RGV -combine merged.png.
        הערה: קובץ בשם 'merged.png' יישמר באותה תיקייה כמו קבצי tif המקוריים.
  2. כימות נתונים באמצעות ArrayNinja
    1. פתח ArrayNinja ולחץ על הקישור המתאים מדפסת microarray תחת "כדי לכמת תמונות אשר יש צלחת מקור ידוע." הקלד את שם עיצוב השקפים שנשמרו (שלב 2.5) בתיבת הדו-שיח "טעינת עומס" ולחץ על 'Enter'. ראה איור 4 עבור צילום מסך של מודול ניתוח ArrayNinja.
    2. לחץ על 'בחר קובץ' וניווט ובחר את הקובץ 'merged.png' שנוצר בסעיף 6.1. הדמיון הממוזגE יהיה לטעון כמו גם רשת עבור פריסת השקופית.
    3. השתמש במחוונים בחלק התחתון של לוח הבקרה ArrayNinja כדי להתאים את הניגודיות, את הבהירות ואת נקודת האמצע.
      הערה: התאמות אלה מיועדות להדמיה בלבד ואין להן השפעה על הכימות.
    4. בחר "רזולוציה" והזן את הערך התואם את הרזולוציה של התמונה הסרוקה. השתמש "בצד השוליים" ו "שולי הדף" כדי להזיז את הרשת לתוך יישור עם כתמים על המערך. התאם לפי הצורך כדי לקבל את הרשת כפי מיושר מקרוב על כל נקודה ככל האפשר.
    5. לחץ על 'חיפוש ספוט' והמתן עד שהלחצן יחזור לצבע האפור המקורי.
      הערה: ניתן לחזור על זה מספר פעמים כדי למרכז את עיגולי הרשת בנקודות מסוימות. הפונקציה Seek מרגיעה את הרשת לעבר כל נקודה כדי לכוונן את היישור.
    6. שנה את הערך "Super Arrays" ל - "1" כדי לעבוד על כל לוח מערך משנה בנפרד (אם תרצה). אם באמצעות 4X 12 שעווה טביעת פריסה שקופית ( איור 3E ), להשתמש "iPin" "jPin" ו "subA" שולטת כדי לכבות תכונות לנתח את כל השילוב הרצוי של 4 x 12 בארות. לדוגמה, כדי לנתח את בארות ימין למעלה ולמטה העליון כמו משכפלים זה לזה, הזן "1 4" לתוך iPin, "1 1" לתוך jPin ו "1 4" לתוך תת. לחץ אנטר'.
    7. העבר את העכבר מעל נקודות מסוימות כדי להציג את הזהות של תכונה זו.
    8. לחץ על 'החלף זום' כדי לסקור תכונות ביתר קפדנות. בחר נקודות התייחסות הרקע על ידי לחיצה על מקש 'R' בזמן העכבר הוא מעל נקודה. נקודות ייחוס יודגשו בכתום.
      הערה: במצב "מעבר לזום", תמונה מוגדלת של התכונה שהעכבר נגמר מוצגת בפינה הימנית העליונה. דיון מפורט של תכונות נוספות ברקע תיקון ArrayNinja נדון במקומות אחרים 28 .
    9. החלף את המקומות (עם מורפולוגיה ספורטיבית מגוונת או פסולת שתשפיע על כימות מדויק) על ידי לחיצה על מקש 'A' תוך כדי ריחוף העכבר מעל הנקודות המושפעות. כתמים בלתי פעילים יהפכו לבנים.
    10. לחץ על 'מאכלס' ולאחר מכן על 'שלח' כדי לכמת את הנקודות.
      הערה: כרטיסייה חדשה תפתח ותציג תרשים עמודות של נתונים מנורמל לממוצע הנקודה הבהיר ביותר. טבלה מתחת לתרשים העמודות מכילה הן את ערכי הנתונים המנורמלים והן את הנתונים הגולמיים. ניתן להעתיק טבלה זו לגיליון אלקטרוני לצורך אחסון בארכיון וניתוח נוסף.

איור 4
איור 4: מודול ניתוח ArrayNinja. צילום מסך של מודול ניתוח ArrayNinja מוצג. לוח הבקרה (משמאל למעלה) מציג את כל הפרמטרים שניתן לכוונן כדי להציג את המערך, למצוא נקודות, וליישר רשת מעלתמונת מערך. מעבר עם העכבר מעל לתכונה מציג תצוגה מוגדלת (מימין למעלה) ומציג חלון קופץ שמכיל את פרטי הזיהוי המשויכים לתכונה זו (למטה). נקודות ייחוס שנבחרו עבור תיקון רקע הן כתום. תכונות להיות מחוץ לניתוח downstream הם לבנים. ArrayNinja מכיל תכונת חיפוש מבוססת טקסט המדגישה תכונות תואמות בצהוב, כפי שמוצג בדוגמה עבור H4K16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה שימש לעיצוב לפברק פלטפורמת microarray פפטיד לניתוח של סגוליות נוגדנים PTM היסטון. מערך שאילתות ספריה של יותר מ -300 תכונות פפטיד ייחודי (20 - 40 שאריות באורך) המייצג רבים של שילובים ידוע של PTMs למצוא על הליבה חלבונים היסטון חלופה 38 . צינור זה כבר סוס עבודה להקרנה של נוגדנים רבים PTM היסטון בשימוש נרחב מסחרית זמין, ומאגרי נתונים מלאים זמינים על מסד הנתונים נוגדנים היסטון Histone (www.histoneantibodies.com). 17

עמוד השדרה של הצינור שלנו הוא ArrayNinja, יישום קוד פתוח יישום אשר פיתחנו לאחרונה, המשלבת את שלבי התכנון והניתוח של עבודה microarray 28 . המודול ניתוח ArrayNinja מאפשר למשתמשים אינטראקציה informaTive עם קובץ המערך הגלם שלהם. זהויות התכונה המודפסת משולבות באופן אוטומטי עם התמונה, וניתן לחשוף זהויות אלה על-ידי העברת סמן העכבר מעל נקודה. שילוב זה מאפשר גם חיפוש מהיר של תכונות של עניין לפי שם והדרה של תכונות מניתוח במורד הזרם. ArrayNinja גם מספק אפשרויות עבור תיקון רעש רקע מקומי ולא nonocalocal, כמו גם ערכת תיקון שמתאים מורפולוגיה ספוט. פרטים מלאים של ArrayNinja ויכולותיה ניתן למצוא במקום אחר 28 .

ArrayNinja מחשבת עוצמת האות עבור כל תכונה פפטיד ו aggregates אותם עוצמות ממוצעים עם שגיאה המבוססת על זהות תכונה. ממוצעים אותיים גולמיים ונורמלים מוחזרים, כאשר קבוע הנורמליזציה נקבע על ידי הממוצע הבהיר ביותר. עוצמת האות עבור כל פפטיד ניתן להשתמש כדי להשוות את זיקה יחסית של הנוגדן בין תכונות על microarray. כאן, אנו מציגים datasets נציג עבור שני נוגדנים צדודית עם צינור זה, הדגשת אפיטיפוס תכונות הכרה שיש לשקול כאשר מפרשים תוצאות שהושגו עם ריאגנטים אלה ( איור 5 ).

Off-Target הכרה היא דאגה עבור כל נוגדנים, ו commonalities ב epitopes סביב שאריות היסטון לשינוי עושה את זה אתגר מסוים עבור נוגדנים PTM היסטון. ואכן, נוגדנים שהועלו כדי לזהות 3 ליטר מתילציה על היסטון H3 (H3K9me3) נקשר פפטידים tri-methylated ב H3K18, H3K27, ו lysine 20 על היסטון H4 (H4K20me3) גם כן או יותר מאשר H3K9me3 ( איור 5 א ). רצף סביב H3K9 (ARKS) נשמר עם H3K27, ו-תגובתיות של נוגדנים PTM היסטון ו הרגולטורים הכרומטין כי לאגד ולשנות אתרים אלה צוין במקום אחרSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . עוד זיהה מטרה מחוץ לזהות נכס משותף נוגדנים מתיל ליזין הוא חוסר יכולת להפלות סדר מתיל. זה מודגם על ידי תוצאות שהושגו עם נוגדן H3K4me3, אשר חוצה מגיב עם H3K4me2 ו H3K4me1 פפטידים ( איור 5 ב ). ההבחנה בין סדר המתיל חשובה, שכן מחקרים הראו כי H3K4me3, H3K4me2, ו- H3K4me1 מופצים בצורה שונה על פני הגנום ומן הסתם פועלים בדרכים שונות 42 , 43 . לדוגמה, H3K4me3 ממוקמת באתרי ההעתקה של שעתוק הגנים המעתיקים באופן פעיל, בעוד שמפעילים פעילים מסומנים בדרך כלל על ידי H3K4me1 44 .

בנוסף לזיהוי היעד, השפעה חיובית ושליליתE על ידי PTM השכנה היא תכונה הנצפית בדרך כלל של נוגדנים היסטון. נוגדן H3K9me3 שמוצג באיור 5A מושפע באופן חיובי על ידי קבוצות אצטיל על שאריות ליזין שכנות. ואכן, אנליזה ספקטרומטריית מסה לאחרונה מראה כי קבוצות אצטיל, במיוחד H3K14ac, לעתים קרובות שיתוף להתרחש עם H3K9me3 38 . נוגדן H3K4me3 שמוצג באיור 5B מושפע לרעה על ידי זרחון השכנה ב threonine 6 (H3T6p). H3T6p ידוע יש השפעה חיובית ושלילית על ההכרה של H3K4me3 על ידי חלבונים הקורא, וזה עשוי לשמש מנגנון דינמי להסדיר גיוס של גורמים הכרומטין ספציפיים 15 , 45 .

איור 5
איור 5: ניתוח נוגדנים על Microprays פפטיד. ניתוח של (A) H3K9me3 (# נוגדן 1) ו- (ב) H3K4me3 (נוגדן # 2) נוגדנים על microarrays פפטיד. קווים ירוקים / ברים מציינים את הפפטיד שמכיל רק את ה- PTM המיועד. קווים / ברים אפורים מציינים פפטידים שעוצמת האות שלהם אינה שונה באופן משמעותי (p> 0.05) מהקו הירוק / בר, המחושבת באמצעות ANOVA חד-כיווני המשווה את עוצמתם היחסית הממוצעת של כל הפפטידים לפפטיד המטרה. קווים אדומים וכחולים / ברים מציינים אות שהורד או גדל באופן משמעותי (p <0.05) מהקו הירוק / בר, בהתאמה. קווים כתומים / כתום מצביעים על פפטידים מחוץ לכוון. הנתונים מוצגים (משמאל) איור חזותי של המורכבות PTM על פפטידים פורש N- אזורים מסוף של זנבות H3 ו H4, שבו רוחב של כל שורה תואמת את העוצמה היחסית נמדדת עבור תכונה זו פפטיד, (מימין) בר גרפים הצגת ממוצע עוצמת האות ממוצעים ± SEM מ -6 נקודה בודדת נקודהMents על microarrays. כל הפפטידים הכלולים בניתוח זה הם 20 חומצות אמינו באורך המתאים או היסטון H3 חומצות אמינו 1 - 20 או 15 - 34. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אמינות נוגדנים ביישומים רפואיים ביו-רפואיים היא בעלת חשיבות עליונה 46 , 47 . זה נכון במיוחד בביוכימיה הכרומטין בהתחשב בעמדה של נוגדנים כמו כלי מפתח עבור רוב הטכניקות שפותחו כדי לאפיין את שפע והפצה של PTMs היסטון. הפרוטוקול המוצג כאן פרטים צינור אופטימיזציה עבור עיצוב, ייצור, ושימוש microarrays פפטיד לנתח היסטון PTM נוגדנים היסטון. צינור זה שימש למסך מספר רב של נוגדנים PTM היסטון זמין מסחרית בשימוש נרחב, והנתונים שנוצרו בניסויים אלה זמינים באופן חופשי באמצעות מקוון והרחבת היסטון נוגדנים ספציפיות מסד נתונים (www.histoneantibodies.com) 17 .

לכאורה מן העבודה שלנו ושל אחרים הם מקרים תכופים של התנהגות נוגדנים PTM של היסטון htone שיכולים לסבך את הפרשנותיון של נתונים שנוצרו עם ריאגנטים אלה 12 , 15 , 17 . לפיכך, נדרשים אמצעי בקרת איכות קפדניים ומקיפים יותר מחברות נוגדן. ניסויים ומנהיגי קונסורציום של אפיגנום ( למשל , ENCODE, BLUEPRINT) צריכים גם להראות קריטיות בהערכתם העצמית של נוגדנים PTM היסטון בעת ​​בחירת מגיב עבור המחקר שלהם. בנוסף, המאמצים למזער השתנות אצווה אל אצווה, סטנדרטיזציה של שימוש ריאגנטים זיקה מאומתים על פני פלטפורמות מיפוי epigenome, ולפתח כלים זיקה חלופית כל הפריטים לפעולה כדי להתמודד עם בעיה זו מחקר.

Microarrays יש מספר יתרונות על פני מבחני microplate מבוססי ( למשל , ELISA) שהופכים אותם שימושיים במיוחד לאפיון ספציפיות PTM נוגדנים היסטון. Microarrays מאפשרים ניתוח מקביל ותחרותי של אלפי פפטידים בודדים,אינטראקציות נוגדן עם צריכת חומרים מינימלית. בפרוטוקול המתואר כאן, 700 picomoles של כל תכונה פפטיד מספיק כדי לייצר 100 שקופיות microarray. בנוסף, ניתוח נוגדנים ניתן להשלים באמצעות פחות מ 1 מיקרוגרם של נוגדן, ופורמטים מותאמים אישית מערך לאפשר נוגדנים מרובים ודילולים נוגדן שונים כדי להיות מוקרן במקביל.

עיצוב פריסות תכונה מותאמת אישית על microarrays יכול להיות משימה קשה. בנוסף, כל עיצוב microarray חדש דורש לבנות מתוך תבנית ניתוח חדשה. מצאנו את זה להיות אוסרני להגשמת השירות המלא של הטכנולוגיה microarray. זה המניע את הפיתוח של ArrayNinja, אינטראקטיבי, קוד פתוח יישום תוכנה זה משלב בצורה חלקה את ההיבטים עיצוב וניתוח של ניסויים microarray 28 . מודול העיצוב של ArrayNinja מאפשר למשתמש לעצב באופן אינטראקטיבי שקופית כדי להתאים את הפריסה הנדרשת לניסוי. ArrayNinja וירטואליתUally מפות את התנועה הרובוטית של המדפסת ומתרגם את זה לפריסת צלחת המקור עבור עיצוב שקופית נתון ( איור 2 ). יצירת פורמטים של מערך מותאם אישית היא כעת תרגול מהיר ושגרתי. מאפיין מפתח נוסף של ArrayNinja הוא הקשר בין שלבי התכנון והניתוח של עבודה microarray. עם הגדרות המוגדרות על ידי משתמש מודול עיצוב, ArrayNinja שכבות על רשת אינטראקטיבית על התמונה microarray סרק, המאפשר למשתמש העכבר על כל תכונה לחשוף את זהותו או לחפש תכונות של עניין ( איור 4 ).

כמה צעדים קריטיים של צינור זה ראוי לציין. ראשית, בעת עיצוב פריסת ההדפסה, יש לקחת בחשבון לכלול מספיק כתמים משוכפלים כדי להשיג משמעות איסוף הנתונים. בנוסף, כדי להסביר את ההשתנות בין פינים לפינים, כל תכונה צריכה להיות מופקדת על ידי לפחות שני סיכות שונות. לבסוף, אולי הצעד הקריטי ביותר הוא הגנרל הפיזייון של צלחת המקור. שימוש מוצלח של microarrays צפיפות גבוהה המתואר בפרוטוקול זה מסתמך על היכולת למפות את הזהות של כל תכונה למיקום הפיזי שלהם בשקופית האחרונה. משימה זו מיפוי אינו טריוויאלי, אבל ArrayNinja מאוד מקל על שלב זה על ידי מתן מפה צלחת. כל חריגה למפה זו תוך יצירת לוחות המקור תוביל למסקנות שגויות במהלך הניתוח.

חשוב לשקול את המגבלות של שימוש microarrays לניתוח ספציפיות נוגדן. בעוד שאובייקט נוגדנים מסוג PTM של היסטון מסוג PTM שנלכד במערך הוכח לתרגום לגישות ניסוייות עם תנאי הכלאה דומים ( למשל , אימונובלוט) 17 , 18 , המידה שבה אפיון מבוסס פרופיל המבוסס על סגוליות נוגדנים מתרגם לפרוטוקולים של שבב הוא בעל רמיזות 14 , 17 אבל waRrants הערכה קריטית יותר.

וריאציות לצינור זה תוארו קודם לכן לניתוח קוראי ההיסטון, סופרים ומחקים 23 , 24 . שינוי פלטפורמה זו עבור השירות מעבר המחקר epigenetics יכול להיות מותאם בקלות עבור כל ספריה להדפסה של עניין. זה אפשרי גם כי החומר מורכב יותר מאשר פפטידים ניתן להשתמש כדי לבנות microarrays עבור מחקר ביוכימיה הכרומטין. לדוגמה, נוקלאוזומים רקומביננטיים המציגים PTM שונים נמצאים כעת באופן שגרתי בתהליך המעבדה, 48 ומפרטת הספציפיות של נוגדנים PTM היסטון בהקשר של יחידה זו הכרומטין פיזיולוגית רלוונטי יהיה אזור מרגש של מחקר עתידי.

גישה חלופית בשימוש נרחב הפרוטוקול המתואר כאן מנצל טכנולוגיה מערך SPOT, שבו מאות פפטידים הם מסונתז ישירות על celluלאבד תמיכת קרום 49. הממברנה עצמה לאחר מכן ניתן להשתמש ביישומים microarray 50 . טכנולוגיית SPOT היא יתרון מבחינת נקודת המורכבות של הספריה ועלות הסינתזה. עם זאת, טוהר של פפטידים מסונתז באמצעות השיטה SPOT דווחו להשתנות, בקרת איכות וטיהור אמצעים משותף סינתזה שלב מוצק פפטיד ( למשל , HPLC ו ספקטרומטריית מסה) לא מבוצעות באופן שגרתי 50 , 51 . בנוסף, מצגת פפטיד על ניטרוצלולוזה אינו אחיד עשוי להגן על epitopes. יש לציין, שני סוגים של פלטפורמות מערך פפטיד היסטון זמינים מסחרית עבור משתמשים שאין להם גישה לציוד המקצועי הדרוש כדי לסנתז פפטידים ומערכים לפברק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מכון המחקר ואן אנדל ומענק מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות (CA181343) כדי SBR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311 (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159 (2), 458 (2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19 (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40 (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. International Human Epigenome Consortium. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167 (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6 (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4 (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the "histone code" . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33 (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. "On silico" peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18 (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4 (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49 (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27 (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6 (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6 (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7 (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16 (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87 (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24 (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276 (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21 (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17 (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30 (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6 (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518 (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11 (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 126 microarrays פפטיד היסטון שלאחר שינויים translational נוגדנים קוד היסטון אפיגנטיקה הכרומטין
ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornett, E. M., Dickson, B. M.,… More

Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter