Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Undersøker von Willebrand faktor Patofysiologien ved hjelp av en Flow Chamber modell av von Willebrand faktor-Platederivert streng formasjon

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/55917

Summary

I dette papir, beskriver vi en metode for å vurdere endothelial von Willebrand faktor utgivelsen og den påfølgende Platederivert fange under væske skjæring stress svar på inflammatorisk stimuli bruker en i vitro flow chamber-system.

Abstract

Von Willebrand faktor (VWF) er en multimeric glykoprotein koagulering faktor som formidler Platederivert vedheft og samling på nettsteder av endothelial skade og som bærer faktor VIII i sirkulasjon. VWF er synthesized av endotelceller og slippes enten constitutively i plasma eller lagres i spesialiserte organelles, kalt Weibel-Palade organer (WPBs), for behovsbetinget utgivelsen svar hemostatic utfordring. Procoagulant og proinflammatory stimuli føre snarlig WPB exocytosis og VWF utgivelse. Fleste VWF utgitt av endotelceller sirkulerer i plasma; Imidlertid er en del av VWF forankret på endothelial celle overflaten. Tilfeller av fysiologiske skjær kan endothelial-forankret VWF binde til blodplater, danner en VWF-Platederivert streng som kan representere nidus av dannelse. Et kammer med system kan brukes til visuelt observere utgivelsen av VWF fra endotelceller og den påfølgende Platederivert fange på en måte som er reproduserbar og relevant i Patofysiologien ved VWF-mediert dannelse. Med denne metoden, endotelceller er kultivert i en flyt kammer og senere stimulert med secretagogues å indusere WPB exocytosis. Vasket blodplater er deretter perfused over aktivert endotelet. Blodplater er aktivert og deretter binde til langstrakte VWF strenger i retning av væskestrøm. Bruke ekstracellulære histones som en procoagulant og proinflammatory stimulans, observerte vi økt VWF-Platederivert streng formasjon på histone-behandlet endotelceller sammenlignet med ubehandlet endotelceller. Denne protokollen beskriver en kvantitativ, visuelle og sanntid vurdering av aktivering av VWF-Platederivert interaksjoner i modeller av tromboser og hemostasen.

Introduction

Blodpropp er en ledende årsak til dødelighet verdensomspennende1 og kan utvikle i svaret todysregulated Platederivert aktivisering og trombin generasjon i begge veinsand arterier. Plasmanivåer av VWF er en viktig regulator av blodpropp, der lave nivåer (< 50%) føre til blødning uorden kalles von Willebrand sykdom (VWD)2 og høye nivåer (> 150%) er assosiert med økt risiko for venøs3 og arterial4 trombose.

VWF er en multimeric glykoprotein syntetisert av megakaryocytes og endotelceller og lagret i blodplater α-korn og WPBs, henholdsvis. På hemostatic utfordring, kan VWF frigis fra endotelial WPBs å tjore sirkulerende blodplater aktivert endotelceller5 eller utsatt kollagen på fartøyet veggen6. Forankring av VWF til endotelceller har vist seg å være formidlet av P-selectin7 og integrin αvβ38. Etterfølgende utgivelsen av blodplater α-granulen butikker kan øke lokaliserte VWF konsentrasjoner å stabilisere blodplater-Platederivert samhandlinger for Platederivert plug formasjon, stillaset nødvendig for spredning av koagulasjonssystemet cascade og fibrin deponering. Blodplater-bindende aktiviteten til VWF er regulert av multimeric strukturen, med høy-molekylær vekt multimers besitter større hemostatic aktivitet9,10. I omløp fungerer VWF også som en bærer for koagulering faktor VIII.

Flytende skjær stress er en viktig regulator av VWF fysiologi. I fravær av skjæring stress finnes VWF i en globular form, skjuler bindende domener for Platederivert glykoprotein Ib vedheft11. Når skjæring stress, er cleavage området for en metalloprotease, en disintegrin og metalloprotease med thrombospondin motiv (ADAMTS13), utsatt. ADAMTS13 innstiftet naken og blodplater innredede VWF strenger å regulere multimer størrelse, og dermed redusere sin hemostatic aktivitet12.

VWF er en akutt fase protein, og mange stimuli, inkludert hypoksi13, infeksjon14og proinflammatory cytokiner, har vist seg å megle VWF utgivelse fra endotelceller. Ligner andre inflammatoriske agenter, ekstracellulære histones har også blitt vist å indusere systemisk VWF utgivelse i mus15,16 og aktivering av blodplater i vitro17,18, 19. dette viste seg å være avhengig av histone undertypen, som forskjeller i lysin og arginin innhold kan påvirke funksjonen15. Vår studie tar sikte på å etablere en flyt kammer modell for å undersøke påvirkning av lysin-rik (HK) og arginin-rik (HR) histone subtyper og secretagogues på endothelial VWF utgivelse og sanntid Platederivert fange, potensielle tidlig hendelser i betennelse-indusert trombose.

Denne flyten kammer metodikken viser i vivo interaksjoner mellom subendothelial kollagen, endotelceller, VWF og blodplater i en i vitro system som er visuelt, reproduserbare og målbare. Det gir mulighet for sanntids vurdering av alle aspekter av veien som regulerer VWF-Platederivert interaksjoner, inkludert WPB sekresjon, blodplater aktivisering og VWF proteolyse. Studier av VWF under kontrollerte skjæring stress forhold har blitt brukt til å evaluere VWD mutasjoner som svekke VWF utgivelse og blodplater-bindende funksjon20, WPB fysiologi21og VWF spalting av ADAMTS135. Vi bruker denne metodikken for å kvantifisere VWF-Platederivert streng dannelsen av en inflammatorisk stimulans: ekstracellulære histones.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Disse studiene ble godkjent av forskning etikk styret av Queen's University, Canada.

1. endothelial celle stimulering

  1. Kollagen-coat en 6-og vev kultur plate.
    1. 24 timer i forveien, lag en 6-og vev kultur plate på 37 ° C med 1 mL av kollagen buffer (50 µg/mL rotte hale kollagen type 1 med 0.02 M iseddik).
    2. Vask brønnene to ganger med 2 mL av Hanks balansert Salt løsning (HBSS).
      Merk: Plater kan være pakket i tinn folie og lagret i en lufttett plastpose i 4 ° C.
  2. Ætt endotelceller på en tetthet av 1 x 106 celler per brønn i 2 mL vekst medium som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS). Inkuber celler for 24 h på 37 ° C (5% CO2).
    Merk: Her, blod utvekst endotelceller (BOECs) mellom passasjer 5 og 15 ble brukt. BOECs ble isolert fra friske frivillige med en wildtype VWF sekvens med en metode i Starke et al. 22 på samme måte som en tidligere beskrevet av JoVE23.
  3. Fjerne mediet etter 24 h og vask cellene med HBSS.
  4. Legge 1 mL av serum-free medium (minimal viktig vekst medium uten FBS) som inneholder phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; 100 nM), unfractionated histone (UH), og HK eller HR (alle på 25 µg/mL) til cellene for 2t på 37 ° C (5% CO2).
    Merk: Denne konsentrasjonen av histone var basert på tidligere i vitro cytotoksisitet rapporter av Xu et al. 24 og Abrams et al. 25 brukte 50 µg/mL.
  5. Samle mediet etter 2 timer og lagre den på 20 ° C før analysen.

2. VWF kvantifisering av enzymet knyttet Immunosorbent analysen (ELISA)

  1. Coat en microplate med 100 µL av belegg buffer (10 mM dibasic natrium fosfat og 145 mM natriumklorid, pH 7.2) inneholder 10 µg/mL polyklonale anti-VWF antistoff overnatting på 4 ° C.
  2. Vaske platen tre ganger med 250 µL av vaskebuffer (10 mM dibasic natrium fosfat, 500 mM natriumklorid og 0,1% mellom 20, pH 7.2).
  3. Fortynne middels prøvene 1:2 og 1:4 med vaskebuffer og bruke normal referanse plasma for en standard kurve, begynnelsen på en 1:10 fortynning.
  4. Plate 100 µL av fortynnede prøver og standarder overnatting på 4 ° C.
  5. Vaske platen tre ganger med 250 µL av vaskebuffer.
  6. Legg 100 µL av utvannet anti-VWF, gjenkjenning av HRP-konjugerte antistoffer (1.1 µg/µL i vaskebuffer) til platen og ruge 1t ved romtemperatur.
  7. Vask platen og ruge i 10 min med O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD)-reagens, ifølge instruksjonene fra produsenten.
  8. Stoppe reaksjon med 100 µL av H 1 M24 og lese platen ved 492 nm.

3. solid-fase Histone-VWF bindende analysen

  1. Pels en microplate med histones fortynnet i 0,5% natrium deoxycholate 50 mM karbonat buffer (pH 9.6) til 10 µg/mL overnatting på 4 ° C.
  2. Vaske platen tre ganger med 250 µL av PBS med 0,1% mellom 20, rugende i 10 min mellom vasker.
  3. Blokkere platen med 200 µL av PBS med 0,1% mellom 20 og 1% bovin serum albumin (BSA) 1t ved romtemperatur.
  4. Gjenta trinn 3.2.
  5. Serielt fortynne plasma-avledet menneskelige VWF/faktor VIII komplekse fra 200 mU/mL til 25 mU/mL i saltvann buffer (10 mM dibasic natrium fosfat, 500 mM natriumklorid, og 0,1% mellom 20, pH 7.2). Legge til 100 µL platen i 2 timer ved romtemperatur.
  6. Gjenta trinn 3.2.
  7. Oppdage binding av VWF til immobilisert histone bruker 100 µL av en løsning som inneholder PBS-0.1% mellom 20 og 1:1,000 kanin polyklonale anti-VWF antistoff konjugert til HRP 1t ved romtemperatur.
  8. Gjenta trinn 3.2.
  9. Inkuber platen i 30 min med 100 µL av OPD-reagensen og stoppe reaksjon med 100 µL av H 1 M24. Måle optisk densitet ved 492 nm.

4. seeding endotelceller på flyt Chambers

  1. Legg 0,5 mL kollagen belegg bufferen (beskrevet i trinn 2.1) i en Luer-lock 1-mL sprøyte.
  2. Tvinn Luer-lock slutten av sprøyten til reservoaret en flow chamber lysbilde.
  3. Trykke stempelet sakte til hele lane er belagt og hver reservoaret er fullt. Gjenta for hver bane og ruge kammeret ved 37 ° C i 24 timer.
  4. Sug opp kollagen belegg buffer med en 200 μL pipette. Laste inn en annen sprøyte med 1 mL HBSS og trykker stempelet sakte vaske hver bane av flow chamber. Sug opp vask med en 200 μL pipette på motsatte slutten av flow chamber. Gjenta to ganger.
  5. Pipetter ca 100 µL av en 3 x 106 celler/mL endothelial celle (BOEC) løsning i vekst medium med 10% FBS i kjørefelt av en flyt kammer.
    Merk: Seeding tettheten av endotelceller overstiger kapasiteten til kammeret. Denne er å sikre maksimal kanaler; ikke-tilhenger celler fjernes i senere vaskes trinn.
  6. Inkuber kammeret ved 37 ° C i 24 h. endring mediet hver 8-12 h med engangssprøyter med Luer-lock (som trinn 4.4). Kontroller at det er ingen synlige bobler i banene.

5. isolere blodplater fra menneskelig fullblod

  1. I en biologisk sikkerhet regjering med en 30 G nål, legge til 300 µL av syre-citrate druesukker buffer (85 mM trisodium citrate, 111 mM D-glukose og 71 mM sitronsyre, pH 4.5) et tilsetningsstoff-gratis 3 mL blod samling vacutainer.
  2. Samle hele blod fra friske frivillige (gratis fra anti-Platederivert og ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler for sju dager) av venipuncture (tre rør 3 ml), etter en protokoll lik som utgitt av Bernardo et al26.
  3. Kaste den første tuben, som den første vevsskade knyttet til venipuncture kan forårsake spontan Platederivert aktivisering.
  4. Forsiktig invertere vacutainers tre ganger for å blande blodet med antikoagulerende.
  5. Sentrifuge vacutainers på 150 x g i 15 min på 24 ° C (romtemperatur).
  6. Fjern sakte blodplater-rich plasma (supernatant) med en pipette i en biologiske sikkerhetskabinett skap og nøye overføre den til en 15-mL konisk rør. Overføre blodplater-rich volumet av hver vacutainer til en konisk enkeltrør å unngå potensielle kryss-aktivering.
    Merk: Platederivert isolasjon skal utføres i en biologisk sikkerhet regjering å hindre bakteriell forurensning og potensielle kunstig blodplater og/eller endothelial aktivisering.
  7. Sentrifuge konisk rør 900 x g i 10 min på 24 ° C (romtemperatur) til pellets blodplater.
  8. Pipetter og kast blodplater-fattige nedbryting.
  9. Vask pellets med 1 mL av citrate glukose natrium (CGS) buffer (13 mM natriumsitrat, 30 mM D-glukose og 120 mM natriumklorid, pH 7.0).
    Merk: Blodplater vises i dott-lignende formasjoner når CGS bufferen er lagt og pellet er forsiktig resuspended. I prøver forurenset av blodplater aktivisering, blodplater vil ikke lett resuspend og vises klumpete.
  10. Når fullt resuspended, sentrifuge prøvene 900 x g i 10 min på 24 ° C (romtemperatur).
  11. Fjern vaskebuffer CGS og resuspend pellet i 3 mL Tyrode's buffer (138 mM natriumklorid, 5,5 D-glukose, 12 mM natriumbikarbonat, 2,9 mM kalium klorid og 0.36 mM dibasic natrium fosfat, pH 7.4). Sikre resuspendering av blodplater og hvis samlinger er observert, forkaste prøven.
  12. Legge til 1,5 µL fra en 20 mM DiOC6 lagerløsning (oppløsning 57.25 mg i 5 mL av metanol) hver 3 mL konisk tube vasket blodplater for en siste konsentrasjon på 1 µM.
    Merk: DIOC6 er en grønn fluorescerende mitokondrie fargestoff brukes i dette eksperimentet til etiketten blodplater.
  13. Aliquot 1 mL av vasket Platederivert løsningen tre 1.5-mL microcentrifuge rør.
    Merk: Platederivert volumet kreves for dette eksperimentet er beregnet basert på størrelsen på flyt kammeret, ønsket skjær stress og lengden på eksperimentet (trinn 6.5). Denne protokollen kan justeres som forholdene endres slik at det er nok volum for Bente Blom.
  14. Bruk vasket blodplater innen 2 t isolasjon.

6. flyt apparater montering

  1. Knytte et 70 cm stykke sterilt silikon rør (innvendig diameter på 1,6 mm) til en mannlig albue Luer connecter i den ene enden og en kvinnelig Luer lås adapter på den andre.
  2. Koble den kvinnelige Luer lås adapteren koblet til slangen til en 20 mL sprøyte.
  3. Gjenta 6.1 og 6.2 å generere tre identiske sprøyte-rør tilkoblinger.
  4. Bruk en Sprøytepumpe for å generere væskestrøm. Angi følgende innstillinger i sprøytepumpen: indre diameter på sprøyten og flow rate.
    Merk: En 20 mL sprøyte har en indre diameter på 19.55 mm. Infusjonshastigheten beregnes basert på ønsket skjær rate/skjæring stress og dimensjoner på flyt kammeret. Flyt kammeret brukes i denne studien, for å oppnå 1 dyn/cm2 (observert i lav venøs skjær), kreves en strømningshastighet på 9.37 µL/min. På grunn av bevis knytter histones til venøs trombose, velges en moderat venøs skjær med/4,45 dyn/cm2 . Dette er også basert på antagelsen om at bufferen har en lignende viskositet vann. Infusjonshastigheten er da lik 41.7 µL/min. ligningene som brukes til å beregne infusjonshastigheten for ulike flow chamber dimensjoner kan finnes på:
    1. Angi pumpen å trekke væske knappen enten sprøytepumpen.
  5. Last tre sprøyter knyttet til rør på sprøytepumpen og sikre tett hakeparenteser rundt sprøyter og stempler.
  6. Knytte en mannlig albue Luer til begge ender av et andre 20 cm sterilt silikon rør.
  7. Koble ett albuen Luer til en avstumpet 18-gauge nål.
  8. Gjenta to ganger, opprette tre identiske luftinntak systems for tre kjørefelt av flow chamber.
    Merk: Den silisium rør og Luers kan vaskes med 10% blekemiddel etterfulgt av destillert vann før gjenbruk. Det anbefales ikke å bruke flyt kamrene.

7. mikroskop innstillinger

  1. Bruk spinning disk mikroskop utstyrt med en helautomatisk scene. Utføre belysning med laser lanseringen som gir 405, 458, 491, 543 og 633 nm laser linjer. Fange alle bilder med et 20 X mål. Justere alle parametere med analyseprogramvare (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. Velg kanalene innstillingene (utslipp filter: 520/35), med eksitasjon på 491 nm, for oppkjøpet. Angi elektronet multiplisere kostnad - sammen enhet til et elektron-multiplisere gevinst på 150, med en eksponeringstid på 200 ms, for å få full dynamisk dataområdet.
    Merk: Blodplater er merket med en grønn fluorescerende farge, DiOC6, med bølgelengde maxima (eksitasjon, 482 nm, utslipp, 504 nm).
  3. Justere 491 nm laser makt til 20%.
  4. Markere sentrum av alle tre kjørefelt og velg 1 μm z utvalg og 0,5 μm for steg størrelse. Velg antall tidspunkt (dvs. varighet) og tiden mellom bilder (dvs. intervall) du fange hver 10 s; Velg "60 tid poeng" per lysbilde. Satt mikroskop for å ta bilder fra de tre banene og lagre dem til en bestemt eksperiment mappe.
    Merk: Ettersom flyt kammeret har tre kjørefelt, må mikroskopet å veksle mellom tre posisjoner for å fange opp bilder.

8. VWF-Platederivert streng formasjon

  1. Fjerne kultur medium fra flyt kammer (fra trinn 4) bruke den samme teknikken som i trinn 4.4.
  2. Legge til 100 µL av enten histamine (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK eller HR (alle på 25 µg/mL) fortynnet i serum-free medium (som trinn 1.4) for å stimulere BOEC monolayer i 15 min ved romtemperatur og ambient O2/CO2.
    Merk: Selv om ikke nødvendig for VWF utgivelse, utføre denne Stimuleringen på 37 ° C vil forbedre VWF exocytosis27.
  3. Sikre at en av tre separate felt av flow chamber forblir ubehandlet som en eksperimentell kontroll.
  4. Fjern mediet bruker en 1 mL sprøyte og erstatte den med 100-200 µL av PBS å vaske secretagogues av endotelial monolayer.
  5. Montere flyt kammer på et lysbilde stativ bruke vaskulær hefte for å sikre kammeret i stedet.
  6. Knytte tilgjengelige mannlige Luer kontakten på slutten av 70 cm slangen (koblet til sprøyten) til reservoaret av flow chamber. Gjenta for de to andre flow chamber banene.
  7. Starte sprøytepumpen å fjerne PBS vask. Pipetter ekstra PBS i motstridende flow chamber reservoaret slik at banene ikke Kjør tørr.
  8. Observere flyt systemet for tilsvarende flyt over alle tre baner og deretter pause sprøytepumpen.
  9. Velg et område å ta bilder på om midten av hver lane, i omtrent samme område mellom eksperimenter.
    Merk: Person opererer mikroskopet kan være blinde for eksperimentelle forhold. Dette trinnet sikrer at mikroskopet er fokusert før Platederivert flyt (se trinn 7).
  10. Knytte en kvinnelig luer coupler en 5 mL sprøyte og deretter gratis mannlige luer kontakten (trinn 6.8) og senke avstumpet nålen i 1,5 mL microcentrifuge røret som inneholder vasket Platederivert løsningen (trinn 5.13). Sakte trekke Platederivert løsningen gjennom slangen å sikre at ingen luftbobler i systemet.
  11. Fjerne 5 mL sprøyte og fest den mannlige Luer til åpne reservoaret av flow chamber. Gjenta for tre kjørefelt.
  12. Start sprøytepumpen og ta bilder under Platederivert flyt ved hjelp av mikroskop og protokollen innstillingene fra steg 7 til 10 min i mørket.
  13. Etter 10 min, koble Luer fra inntak slangen i flow chamber reservoaret og fyll tanken med PBS å opprettholde flyten over endothelial monolayer.

9. VWF-Platederivert streng kvantifisering

Merk: Kontinuerlig flyten av PBS er forpliktet til VWF-Platederivert streng forlengelse for bildeanalyser. Opphør av flyt vil resultere i VWF bli globular og vil svekke VWF-Platederivert streng kvantifisering. Det er viktig å fylle opp hver reservoar med PBS under bildeoppløsning. HBSS kan erstatte PBS hvis cellen krymping eller avdeling er observert i dette trinnet.

  1. Fra og med første kjørefelt, ta 10 bilder per lysbilde uten overlapping med en 20 X linsen rundt midt på lysbildet. Gjenta dette for hver bane.
    Merk: Området rundt reservoarene bør unngås på grunn av turbulente skjæring stress.
  2. Bruke bildebehandling, justere lysstyrken ved å klikke "Bilde", "Juster", og "Lysstyrke/kontrast." Dra rullefeltet til adhered blodplater kan vises godt nok for kvantifisering.
  3. Registrere en VWF-Platederivert streng når tre eller flere justert blodplater er observert i bildet. Telle alle VWF-Platederivert strenger i et bilde. Gjenta for alle 10 bilder og gjennomsnittlig for eksperimentet.
    Merk: Personen som utfører kvantifiseringen kan være blinde for eksperimentelle forhold. Det er ikke nødvendig å co flekken for VWF, som dette er bekreftet av uavhengige studier8,28,29.
  4. Gjenta eksperimentet minst tre ganger for å vurdere hver secretagogue.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å direkte vurdere effekten av histones på VWF utgivelse fra endotelceller, utsatt vi confluent BOECs serum-fri medium som inneholder PMA (positiv kontroll), UH, HR og HK for 2T. Vi viste at HK indusert en 2-fold økning i VWF protein (VWF:Ag) i medium av behandlet endotelceller (figur 1). Interessant, da BOECs ble stimulert UH og HR, var det mindre VWF:Ag oppdaget i medium enn ubehandlet tilstanden. Vi hypotese at fordi histones kan bindes direkte til VWF30, kan de ulikt forstyrre VWF:Ag gjenkjenning i kultur medium. For å evaluere histone binding til VWF, brukte vi en solid-fase bindende analysen. Vi viste at UH og HR bundet sterkere til VWF enn HK (figur 2), støtter gjenkjenning forstyrrelser demonstrert i figur 1.

Ekstracellulære histones vist seg å aktivere blodplater i vitro19, og våre data tyder på at histones megle VWF utgivelse fra endotelceller. Betegner effekten av histones på VWF-Platederivert interaksjoner, brukte vi en flyt kammer modell VWF-Platederivert streng formasjonen der merket blodplater var parfyme på stimulert endotelceller. Representant bildene ble tatt etter flyt, og antall VWF-Platederivert strenger kvantifisert.

Vi observerte at følgende initiering av strømningsforhold, ubehandlet cellene hadde svært få VWF-Platederivert strenger (< 1 streng gjennomgang feltet), mens histamin og PMA-behandlet celler hadde et gjennomsnitt på 2,10 og 3,10 strenger, henholdsvis. Betydelig flere VWF-Platederivert strenger ble dannet når celler ble behandlet med HK (3.52 strenger, P = 0.019), HR (6.00 strenger, P = 0.004), og UH (5.51 strenger, P = 0.012). En grafisk representasjon av VWF-Platederivert streng opptellingen vises i Figur 3 g. Sanntids VWF-Platederivert streng formasjon svar på UH sammenlignet med ubehandlet celler vises i videoer 1A og B.

Disse studier, sammen med undersøkelser av andre grupper, viser at histones28 og andre proinflammatory stoffer som histamin5 og cytokiner31 stimulere VWF sekret fra endotelceller, formidling påfølgende blodplater fange i vitro. Vi viste at statisk stimulering av endotelceller ikke var tilstrekkelig til å belyse VWF utgivelsen skyldes evnen til histones å binde og beslaglegge VWF. Utformingen av en flyt kammer modell av VWF utgivelse og blodplater vedheft var derfor nødvendig å mer fullstendig karakterisere og modell i vivo samspillet mellom endotelet, VWF og blodplater.

Figure 1
Figur 1: lysin-rike Histones induserer VWF utgivelse fra kulturperler endotelceller. BOECs ble stimulert med unfractionated histone (UH), lysin-rik (HK) og arginin-rik (HR) histone fraksjoner. HK stimulert VWF utgivelse til kultur medium. UH og HR behandling redusert gjenkjenning av VWF:Ag i endothelial celle medium i forhold til kontrollen ubehandlet (Untr). N ≥3 personlige eksperimenter ble utført. Dataene vises som mener verdier ± SE. *P < 0,05, **P < 0,01, og ***P < 0,001 Angi betydningen i forhold til ubehandlet tilstanden. Dette tallet er endret fra Michels et al15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: VWF-histone Binding forstyrrer VWF Detection In Vitro. Plasma-avledet VWF binder sterkere HR og UH i en doseavhengig måte sammenlignet lysin-rik (HK) histones i en solid-fase bindende analysen. Dataene vises i mean verdier ± SE. N≥3 personlige eksperimenter ble utført. Dette tallet er endret fra Michels et al15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Histones megle VWF-Platederivert streng formasjonen. Endotelceller seeded på flow chamber lysbilder ble behandlet med unfractionated histone (UH), lysin-rik (HK), eller arginine-rik (HR) histone brøker eller histamin/PMA (positiv kontroller) og var parfyme på en skjæring stress med/4,45 dyn/cm2 i 10 min med vasket, fluorescently merket blodplater. Representant bildene ble oppnådd etter Platederivert flyt fra ubehandlet kontroll (A) og cellene behandlet med histamin (B) Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (C), HK (D), HR (E) og UH (F). PMA behandlingen resulterte i gjennomsnitt 3,1 strenger per synsfelt, sammenlignes med histamin. VWF-Platederivert strenger kvantifisert fra 10 sammenhengende gjennomgang felt og gjennomsnitt for n≥3 personlige eksperimenter (G). Dataene vises som mener verdier ± SE. * P < 0,05 og ** P < 0.01 angir betydning i forhold til ubehandlet tilstanden. Dette tallet er endret fra Michels et al15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra videoer. VWF-Platederivert streng formasjon som svar på Unfractionated Histone (2) forhold til ingen behandling (1): denne videoen er endret fra Michels et al15. Klikk her for å laste ned disse videoene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens fysiologiske relevansen av VWF-Platederivert strenger fortsatt kontroversiell på grunn av deres raske oppløsningen i nærvær av den VWF-spalte protease ADAMTS13, tjener de som kvantifiserbare i vitro modell av blodplater rekruttering av VWF til et område på som en blodpropp kan danne i nærvær av lokalisert øker i histone nivå5. Videre i patologi mangler ADAMTS13 aktivitet, slik som trombotiske thrombocytopenic purpura (TTP) - eller inflammatorisk microenvironments - hvor ADAMTS13 aktivitet er hemmet-VWF-Platederivert strenger kan observeres i vivo32 og kan bidra til blodplater microaggregation og leukocytt bloduttredelse, knytte funksjonene hemostatic og proinflammatory VWF33. Til slutt, det har vært en teori om at VWF-Platederivert streng formasjon kan være initiering hendelse i venøs og/eller arteriell trombose, danner nidus rundt som en patologisk blodpropp er bygget.

VWF-Platederivert streng formasjonen i flow chamber systemet kan brukes til å studere WPB exocytosis ADAMTS13 cleavage og blodplater bindende kapasiteten til VWF. Det er flere viktige trinn til vellykket gjennomføring av disse eksperimentene. Imidlertid avhengig av anvendelsen av modellen, kan modifikasjoner gjøres for protokollen.

Endotelceller fra bestemte vaskulær senger er heterogene i sitt svar på mekaniske og biokjemiske signaler34. Det kan derfor være nyttig å velge en celle type egnet for anvendelsen av denne metoden. BOECs ble brukt i denne studien fordi de proliferativ potensielt; vedlikehold av fenotypen over flere (10 +) passasjer; og robust VWF uttrykk, tilrettelegge kvantifisering av VWF exocytosis. Andre etterforskere har brukt menneskelige umbilical blodåre endothelial celler (HUVECs)5,8,28 og ikke-endotelceller (menneskelige embryonale 293 nyreceller) transfekterte med VWF cDNAs uttrykke VWD mutasjoner35 . Det har vist at VWF uttrykk varierer betydelig mellom vev og fartøy fysiologi36. Kultivert endotelceller som oppstår fra forskjellige mikro- og macrovasculature har observerbare forskjeller i VWF protein basale sekresjon37, og det er bevis for at kalsium kanal forskjellene mellom endothelial celle undergrupper påvirke WPB exocytosis svar på secretagogues38.

Histones ble brukt i denne studien som en roman secretagogue. De ble sammenlignet med kontrollen positiv, histamin, en ofte beskrevet fysiologiske stimulerende VWF utgivelse. En VWF:Ag-ELISA ble brukt til å kontrollere VWF utgivelse fra endotelceller under statisk forhold. Det finnes to intracellulær mekanismer som utløse utgivelsen av VWF: høyden av intracellulær kalsium39 eller pf syklisk AMP nivåer40. Differensial aktivering av disse kan være forårsaket av secretagogues som trombin/histamin eller adrenalin/vasopressin (eller relevant for VWD, desmopressin), henholdsvis, og det kan være interessant å sammenligne disse to baner ved hjelp av denne flyten kammer modell VWF-Platederivert streng formasjonen. I forbindelse med thrombo-inflammatorisk sykdom, er videre utviklingen av inflammatoriske biomarkers, som cytokiner41 eller skade/patogen-forbundet molekylær mønster (DAMPS/PAMPS), og deres roller i VWF-Platederivert streng formasjon oppmuntret.

Flytende skjæring stress er viktig når globular VWF utfolder seg for å avsløre området A1 domene bindende for glykoprotein Ib på blodplater11. Det har blitt demonstrert at minimum flytende skjær vekt av ca 0.73 dyn/cm2 kreves for Platederivert binding til VWF strenger42. Videre disse strengene skjemaet endotelceller på relativt lav skjær påkjenninger (2,5 dyn/cm2) men kan kobles på skjær påkjenninger av 20 dyn/cm2 eller over8. Gjeldende etterforskningen valgte vi en venøs skjæring stress (/ 4,45 dyn/cm2) som er tillatt for interaksjoner mellom endotelet, VWF og blodplater mens bevaring perfusjon bufferen for en 10 min eksperiment.

Bruke dette flow chamber systemet for å evaluere ADAMTS13 spalting av VWF-Platederivert strenger krever en økning i fluidic skjær belastninger over de som brukes i dette eksperimentet. Maksimal ADAMTS13 spalting av VWF-Platederivert strenger oppstår mellom 10 og 30 dyn/cm212, et område som omfatter høy venøs til moderat arteriell skjæring stress43. Endre skjær hastigheten i dette systemet kan være nyttig for å sammenligne VWF-Platederivert streng dannelse og oppløsning, medvirkende faktorer i utviklingen av venøs, arteriell eller mikrovaskulær trombose.

Ytterligere endringer av denne teknikken kan gjøres til perfusjon materialet og flow chamber. Secretagogues kan administreres under strømningsforhold å likne i vivo miljøer. Grunning blodplater med agonister evaluere deres reaktivitet eller inkludert leukocytter populasjoner er utvidelser av denne teknikken. Videre kan inkludert terapeutiske agenter målretting VWF multimer lengde, blodplater innbindingen behandlingskapasitet eller blodplater reaktivitet belyse viktige mekanismer som regulerer initiering av blodpropp utvikling. Andre etterforskere har brukt enten internt44 eller kjøpt glass dekkglassvæske flyt kamre45, i motsetning til polymer-baserte lysbildene brukt i denne studien, og synes å oppnå sammenlignbare resultater.

En kritisk vurdering i VWF-Platederivert streng protokollen er utarbeidelsen av vasket blodplater. Det anbefales ikke å bruke fullblod i denne protokollen av ADAMTS13. Agenter hindre Platederivert aktivisering, for eksempel prostasyklin eller apyrase, bør unngås, som dette kan senere negativt påvirke Platederivert vedheft til VWF. At bufferne er brakt til romtemperatur før Platederivert isolasjon og bruke forsiktig pipette teknikker (dvs. unngå bobler og harde skjær påkjenninger) er nøkkelen til å opprettholde blodplater i inaktiv tilstand. Videre er merking blodplater med en mitokondrie flekken, for eksempel DIOC6 eller rhodamine 6 G, foretrukket over forstyrrer ekstracellulære domener som kan være viktige for VWF binding. Men som DIOC6 er en membran-permeable fargestoff, kan det også tas i små mengder av endotelceller i løpet av eksperimentet. I fravær av et fluorescerende mikroskop, har andre studier observert VWF-Platederivert strenger å bruke lyse-feltet mikroskopi46.

Avslutningsvis gir denne flyten kammer metodikken VWF-Platederivert streng formasjonen mekanistisk, sanntids data for å støtte i vivo observasjoner i patogenesen trombose. Eksponering for skråstille sterkt påvirker patofysiologiske rollen som VWF spiller i thrombo-inflammatorisk sykdom, er flow chamber modellen et viktig undersøkende verktøy for alle lab interessert i å forstå endothelial celle-Platederivert interaksjoner i dette kontekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Alison Michels er en mottaker av Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate stipend fra Canadian institutter for helse forskning (CIHR). Laura L. Swystun er mottakeren en CIHR fellesskap. David Lillicrap er mottakeren av en Canada forskning stol i molekylær hemostasen. Denne studien ble finansiert delvis av en CIHR opererer grant (MOPP-97849).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Medisin problemet 126 von Willebrand faktor blodplater endotelceller flyt kammer histones Weibel-Palade organer skjæring stress blodpropp.
Undersøker von Willebrand faktor Patofysiologien ved hjelp av en Flow Chamber modell av von Willebrand faktor-Platederivert streng formasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michels, A., Swystun, L. L.,More

Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter