Summary
在这里，我们描述了人类细胞中基于Moloney小鼠白血病病毒的逆转录病毒载体的整合位点全基因组图谱的方案。
Abstract
莫洛尼鼠白血病（MLV）病毒的逆转录病毒载体主要集中在乙酰化增强子和启动子中。因此，mLV整合位点可用作活性调节元件的功能标记。在这里，我们提出了一种逆转录病毒扫描工具，可以在全基因组范围内鉴定细胞特异性增强子和启动子。简言之，用mLV衍生的载体转导靶细胞群，并用经常切割的限制酶消化基因组DNA。在用相容的DNA接头连接基因组片段后，连接子介导的聚合酶链反应（LM-PCR）允许扩增病毒宿主基因组连接。扩增子的大规模测序用于在全基因组范围内定义mLV整合谱。最后，定义了复发整合的集群，以确定细胞特异性调节区域，负责细胞型特异性转录程序的激活。
例如体细胞干细胞）的工具技术，其缺乏用于预期分离的鲁棒标记物。
Introduction
细胞同一性由特定基因组的表达决定。顺式调节元件（如启动子和增强子）的作用对于细胞型特异性转录程序的激活至关重要。这些调节区域的特征在于特定的染色质特征，例如特异性组蛋白修饰，转录因子和辅因子结合以及染色质可及性，其已被广泛用于在几种细胞类型1,2,3中的全基因组鉴定。特别地，组蛋白H3赖氨酸27（H3K27ac）的乙酰化的全基因组谱通常用于定义活性启动子，增强子和超增强子4,5,6 。
莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）是广泛用于基因的γ-逆转录病毒转移哺乳动物细胞。感染靶细胞后，逆转录病毒RNA基因组被逆转录在双链DNA分子中，其结合病毒和细胞蛋白以组装前整合复合物（PIC）。 PIC进入核并结合宿主细胞染色质。在这里，病毒整合酶，一个关键的PIC组件，介导前病毒DNA整合到宿主细胞基因组。基因组DNA中的mLV整合不是随机的，而是发生在活性顺式调节元件（如启动子和增强子）中，细胞特异性方式为7,8,9,10 。这种特异的整合特征是通过mLV整合酶和细胞溴结构域和外切域（BET）蛋白质11,12,13之间的直接相互作用来介导的。 BET蛋白（BRD2，BRD3，BRD4）作为宿主染色质和mLV PIC之间的桥梁：通过它们的溴结构域，它们识别高度乙酰化的顺式调节区，而外发区与mLV整合酶11,12,13相互作用。
在这里，我们描述了逆转录病毒扫描，一种基于mLV的整合性质绘制活性顺式调节区的新工具。简言之，用表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP）报道基因的来自mLV的逆转录病毒载体转导细胞。在基因组DNA提取后，通过连接物介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV载体的3'末端重复序列（LTR）和基因组DNA之间的连接并进行大规模测序。 mLV整合位点被映射到人类基因组，并且由mLV高度靶向的基因组区域被定义为mLV整合位点的簇。
逆转录病毒扫描ning用于在几个人类原代细胞14,15 中定义细胞特异性活性调节元件。 mLV簇与表观遗传学定义的启动子和增强子共同定位，其中大部分含有活性组蛋白标记，如H3K27ac，并且是细胞特异性的。逆转录病毒扫描允许在前瞻性纯化的细胞群体中的DNA调节元件的全基因组鉴定7,14以及缺乏有效标记物的回顾性定义的细胞群（例如角质形成细胞干细胞） 15 。
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Protocol
人类细胞的MLV转导
- 分离靶细胞并用携带eGFP报告基因的mLV衍生的逆转录病毒载体转导它们，并用水泡性口炎病毒G（VSV-G）或单调性包膜糖蛋白16假型。
- 将模拟转导细胞作为阴性对照进行以下分析。由于基于mLV的逆转录病毒载体可以转导有效分裂的细胞，在刺激细胞分裂的条件下培养靶细胞群体。需要针对研究中的每种细胞类型，特异性优化转导条件。人造血祖细胞，T细胞和表皮细胞的细胞生长和转导条件描述于参考文献7,14,15和17中。
- 转导后48 h，在300μL含有2％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重悬10 000个细胞，并用f低细胞分析（488nm激发激光）。使用模拟转导的细胞作为阴性对照。为了优化整合位点检索，通过荧光活化细胞分选（FACS）纯化GFP +细胞。
- 收集0.5-5百万个细胞用于基因组DNA制备。在分析真正干细胞的长期后代时，较长的培养期（> 7天）优先稀释未整合的原病毒并且是必需的（参见讨论部分和参考文献15 ）。细胞颗粒可以快速冷冻并储存在-80°C直到使用。
2.通过接头介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV整合位点
- 基因组DNA（gDNA）的制备
- 使用基于柱的DNA提取试剂盒提取gDNA，并按照制造商的说明遵循培养细胞的方案。
- 限制酶消化上
- 在1.5 mL管中每个样品设置4个限制酶消化。通过加入1μLTru9I（10U）和1μL缓冲液M，最终体积为10μL，每个管中消化0.1至1μggDNA。将反应在65℃下孵育6小时或过夜。
- 向每个反应物中加入1μlPstI（10U），1μL缓冲液H和8μL水。将反应在37℃孵育6小时或过夜。样品可以保存在-20°C直到使用。
- 连接器结扎
- 通过以100μM的浓度混合连接体加链和接头负链寡核苷酸，在1.5mL管中制备100μMTru9I连接体储备溶液。将管置于100°C的水中，并在室温下冷却。 Tru9I接头储液可以在-20°C储存，直到使用。
- 在1.5 mL管中设置8个接头连接反应。对于每个反应，添加以下组分s至10μL限制酶消化：1.4μL10X T4 DNA连接酶反应缓冲液，1μL10μM接头Tru9I，1μL（2,000U）T4DNA连接酶和0.6μL水。在16℃下孵育3至6小时。样品可以保存在-20°C直到使用。
- 第一次PCR
- 在0.2mL管中设置48个PCR反应（来自每个连接管的6个反应）。对于每个PCR，将以下试剂加入2μL连接反应：5μL10X PCR缓冲液，2μL50mM硫酸镁，1μL10mM脱氧核苷酸（dNTP）Mix，1μL10μM接头引物1 μL10μMmLV-3'LTR引物，0.3μL（1.5U）Taq DNA聚合酶和37.7μL水。引物序列在表1中提供。
- 在具有加热盖的热循环仪中进行PCR反应，如下：95℃2分钟; 25个循环，95℃15秒，55℃30秒，72℃1分钟; 72°; C为5分钟;保持在4°C。样品可以保存在-20°C直到使用。
- 第二次PCR
- 在0.2 mL管中设置48个PCR反应（每个“第一PCR”管1个）。对于每个PCR，将以下组分添加到2μL第一次PCR反应中：5μL10X PCR缓冲液，2μL50mM硫酸镁，1μL10mM dNTP Mix，1μL10μM接头嵌套引物，1 μL10μMmLV-3'LTR嵌套引物，0.3μLTaq DNA聚合酶（1.5U）和37.7μL水。使用针对特定大规模测序策略设计的嵌套引物：（i）与Illumina平台兼容的接头嵌套引物和mLV-3'LTR嵌套引物; （ii）接头嵌套引物和与Roche平台兼容的mLV-3'LTR嵌套引物。引物序列列于表1 。
- 在具有加热盖的热循环仪中进行PCR反应，如下：95℃2分钟; 25循环95℃15秒，58℃30秒，72℃1分钟; 72℃5分钟;保持在4°C。样品可以保存在-20°C直到使用。
- 将48个巢式PCR反应置于15 mL试管（最终体积〜2.4 mL）中。样品可以保存在-20°C直到使用。
- 通过琼脂糖凝胶电泳确定LM-PCR产物的存在和大小。
- 加入4μL载体缓冲液至20μLLM-PCR产物，并将样品加载到1％琼脂糖凝胶上，并连同100 bp DNA梯。以5 V / cm的速度运行凝胶30至60分钟，并通过溴化乙锭染色观察PCR产物。
- 从模拟转导的样品中进行LM-PCR反应作为阴性对照。
- 通过加入0.1体积的乙酸钠溶液（3M; pH5.2）和2.5体积的100％乙醇沉淀扩增子。在-80℃下混合并冷冻20分钟。
- 旋转在福在4℃下在标准微量离心机中速度20分钟。弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀。在标准微量离心机中以4℃全速旋转5分钟。
- 弃上清，空气干燥沉淀。加入200μLPCR级水，并重悬DNA。样品可以保存在-20°C直到使用。
- 向100μLLM-PCR产物中加入20μL载体缓冲液，并将样品加载到1％琼脂糖凝胶上，并连同100 bp DNA梯。
- 以5V / cm的速度运行凝胶30至60分钟，并切割含有150至500bp长的扩增子的部分凝胶。
- 使用柱式凝胶提取试剂盒纯化LM-PCR产物，并使用紫外分光光度计测定浓度。
- 根据制造商的说明，使用1μL的文库来评估使用生物分析仪器的LM-PCR产品的长度。
- 使用20 ng纯化的LM-PCR产物，并按照制造商的说明将其克隆到pCR2.1-TOPO载体中。
- 使用M13通用引物进行测序反应，随后对所得序列进行基因组测绘，以显示> 50％克隆中病毒 - 基因组连接（包括mLV-3'LTR嵌套引物）的存在，以鉴定合适的样品用于大规模测序。病毒 - 基因组连接的实例：
MLV-3'LTR嵌套引物454和接头嵌套引物454（ 表1 ）以粗体表示，病毒LTR的3'末端以斜体表示。人类基因组序列以红色文本（chr10：6439408-6439509，hg19）突出显示。
mLV集成位点的大规模测序
注意：LM-PCR产品可以使用商业平台（在第二次PCR反应中选择适当的嵌套引物对，参见小节2.5.1）进行测序。对于罗氏GS-FLX焦磷酸测序平台的测序，请参考以前的论文7,14,15。在本节中，描述了用于Illumina测序平台的新优化协议。
- 图书馆准备
- 每个样品在0.2 mL管中设置1个分选PCR反应。对于每个PCR，向5μL（150-170 ng）纯化的LM-PCR产物中加入以下试剂：5μLIndex Primer 1，5μLIndex Primer 2，25μL2X Master Mix和10μLPCR-等级水。对每个样本使用不同的索引组合。
- 在具有加热盖的热循环仪中进行PCR反应，如下：95℃3分钟; 95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的8个循环; 72°C 5 m在;保持在4°C。
- 使用固相可逆固定（SPRI）珠分离方法纯化PCR产物：在新的1.5 mL管中，向每个样品加入56μL珠，并按照制造商的说明进行操作。在25μLTris-HCl 10mM中洗脱。库可以保存在-20°C直到使用。
- 图书馆检查
- 使用1μL样品，使用生物分析仪器来评估文库大小。
- 根据制造商的说明，使用1μL样品，使用基于荧光的实时PCR检测来定量文库的摩尔浓度。
- 图书馆稀释和测序
- 使用Tris-HCl 10mM将文库稀释至10nM。对于汇集文库，将5μL每个稀释的文库转移到新的1.5mL管中，然后在10mM Tris-HCl中将池稀释至4nM。
- 将5μL稀释池与5μL0.2 N NaOH混合，加入1.5 mL管，短暂涡旋，旋转并在室温下孵育5分钟以使文库变性。
- 将管放在冰上，加入990μL预冷的杂交缓冲液（HT1）。将等分试样在新的1.5 mL管中加入300μL变性池，加入300μL预冷HT1，获得10 pM的最终文库池。
- 同时，在1.5 mL管中混合2μLPhiX对照文库（10 nM）和3μLTris-HCl 10 mM。加入5μLNaOH 0.2 N，短暂旋转，旋转下来，室温孵育5 min，使稀释的PhiX变性。将管放在冰上，加入990μL预冷HT1。
- 在新的1.5 mL管中分装300μL变性PhiX，并加入300μL预冷HT1，以获得10 pM的最终PhiX。
- 在新的1.5 mL管中，将510μL变性库文库与90μL变性PhiX文库混合，从而获得最终10 pM池，其中15％为PhiX对照。
- 移取600μL样品体积进入解冻的测序试剂盒的Load Sample储存器，并立即执行单次读取150循环运行。
注意：本协议所需的关键试剂和引物序列见表1 。
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Representative Results
逆转录病毒扫描程序的工作流程
逆转录病毒扫描程序的工作流程如图1所示 。用表达eGFP报告基因的mLV衍生的逆转录病毒载体纯化并转导靶细胞群。转基因侧翼是两个相同的长末端重复序列（5'和3'LTR），确保病毒基因组合成，逆转录和整合到宿主DNA中。通过FACS分析eGFP表达来评估转导效率。扩增含有高比例（> 30％）mLV-转导的细胞的细胞群，随后裂解以提取含有集成的mLV病毒盒的基因组DNA。将基因组DNA消化并与相容的接头连接，通过LM-PCR扩增病毒3'LTR和宿主基因组之间的连接。 VIR然后使用Roche或Illumina平台对us-host基因组连接进行大规模测序。最后，将mLV整合位点映射到人类基因组以定义复发插入位点的基因组。
通过LM-PCR扩增mLV整合位点
LM-PCR在图2中示意图 。从mLV转导的细胞中提取基因组DNA，并用Tru9I限制酶消化，经常切割人类基因组，产生中位数为70bp的片段。第二个限制酶（PstI）用于阻止整合和非整合的内部5'LTR片段的扩增。然后将Tru9I双链接头连接到基因组片段，并使用针对接头的引物进行LM-PCR， 3'LTR扩增病毒宿主基因组结。嵌套PCR可以使用pri进行与Roche或Illumina测序平台兼容。
病毒宿主基因组连接扩增子的分析
在图3所示的实验中 ，我们纯化CD34 - CD13 +骨髓祖细胞（MPP），并用表达eGFP报道基因的mLV衍生的逆转录病毒转导它们。超过60％的MPP细胞在转导后48小时表达eGFP（数据未显示）。转导后15天，我们收集细胞，提取gDNA并扩增病毒宿主基因组结，如上所述。将合并的LM-PCR产物的等分试样装载在1％琼脂糖凝胶上以验证扩增子的存在和大小。我们成功地显示了对应于不同大小的LM-PCR产物的DNA涂片，范围从150到500 bp（ 图3A ）。然后是Amplicons通过DNA沉淀浓缩并加载在1％琼脂糖凝胶上。将LM-PCR产物凝胶纯化并在生物分析仪系统上运行，证实预期的扩增子大小（150-500bp; 图3B ）。
将mLV整合映射到活性和细胞特异性调节区
在图4中报道的实验中，用mLV衍生的逆转录病毒载体转导造血干/祖细胞（HSPC），红细胞祖细胞/前体（EPP）和骨髓祖细胞/前体（MPP）。获得这些结果分别来自不同细胞类型的处理和测序样品，以避免潜在的污染/碰撞18,19 。通过大规模测序产生的原始序列读数由自动化生物信息学处理管道以消除病毒和接头序列。然后，使用Blat 17在人类基因组上绘制至少20bp的独特序列。过滤原始比对，需要匹配以在前3个核苷酸，单一匹配和至少95％的同一性开始。通过与随机基因组序列的数据集的统计比较来定义复发性mLV整合的群集，其在与测序平台兼容的距离处以Tru91限制性基序从人类基因组随机提取基因组位置。然后通过用于集成序列的相同的映射和过滤管道处理控制序列，以生成一组随机的唯一站点。为了定义mLV簇，我们应用DBSCAN聚类算法19 ，将连续的mLV积分的分布与相等数量的随机位点的分布进行比较，以识别高度聚集的积分区域细胞特异性调节元件7,14,15。为了避免产生假簇，进行了随机控制数据集的多次提取。我们通过LM-PCR和磷酸测序分别在HSPC，EPP和MPP中测序了32,574,27,546和36,358 mLV整合位点。与乙酰化增强子和启动子共定位的复发性mLV整合的簇（ 图4A ）。大多数mLV靶向的调节区域是细胞特异性的，例如：（i）HSPC特异性SPINK2基因的启动子（ 图4B ）; （ii）含有红细胞特异性β样球蛋白基因的有效增强子的位点控制区（ 图4C ）; （iii）位于MPP特异性LYZ基因上游的增强子（ 图4D ）。最后，我们使用荧光素酶测定来验证EPP和MPP中推定的细胞特异性mLV靶向增强子的一个子集（ 图4E ）。
图1：逆转录病毒整合位点绘图程序的一般方案。用含有eGFP盒的基于mLV的逆转录病毒载体转导靶细胞。从转导的细胞获得的基因组DNA用Tru9I消化，并与相容的Tru9I双链接头连接。通过嵌套LM-PCR扩增mLV整合位点，并且可以使用Illumina或Roche平台对病毒宿主基因组连接库进行大规模测序。将所得的读数映射到人类基因组以定义复发性mLV整合的簇。 请点击此处查看此图的较大版本。 </ P>
图2：通过LM-PCR扩增病毒宿主基因组连接。含有整合的mLV前病毒的基因组DNA（gDNA）用Tru9I和PstI限制酶消化，并与相容的Tru9I接头连接。使用对LTR和接头特异的引物进行巢式PCR。显示病毒和人类基因组中的Tru9I和PstI限制性位点。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：LM-PCR扩增子的分析。 （ A ）LM-PCR产物（泳道+）在1％琼脂糖凝胶上运行并可视化通过溴化乙锭染色。没有模板样品作为阴性对照样品，只有PCR引物可视化（泳道 - ）。 （ B ）凝胶纯化后，通过微毛细管电泳检查LM-PCR产物大小。样品大小（bp）和荧光强度（FU）分别显示在电泳图的x轴和y轴上。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：将mLV整合到表观遗传学定义的调节区中的映射。 （ A ）我们分别在HSPC，EPP和MPP中定义了3,498,2,989和4,103个复发性mLV整合位点簇。在每个细胞群体中，> 95％的mLV簇与表观遗传上限定的增强子重叠发起人和发起人。 （ B ， C和D ）细胞特异性mLV靶向区域被高度乙酰化，并与目标基因（ SPINK2 ， HBB和LYZ ）的细胞特异性表达分别与HSPC，EPP和MPP分别表达，如所确定通过基因表达的Cap分析）。 mLV单一积分用小棒描绘。 TPM表示每百万个标签。 （ E ）EPP和MPP中推定的细胞特异性mLV靶向增强子。图4改编自参考文献14 。我们收到了根据创意公证许可重新使用这个数字的许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了一个针对染色质区域的逆转录病毒mLV的整合位点的全基因组映射方案，表观遗传标记为活性启动子和增强子。方案的关键步骤和/或限制包括：（i）目标细胞群的mLV转导; （ii）通过LM-PCR扩增病毒宿主结; （iii）检索高比例的整合站点。基于mLV的逆转录病毒载体有效转导分裂细胞。非分裂细胞（例如有丝分裂后神经元细胞）的转导效率低是该技术的潜在限制。然而，可以通过基于报告基因（ 例如 eGFP）的表达的转导群体的细胞分选来克服。通过LM-PCR（150至500bp）产生相对较短的扩增子是强制性的，以产生与目前使用的大规模测序策略相容的扩增子文库，并允许综合基因对mLV整合位点进行了全面的分析。例如，如通过LM-PCR扩增子的霰弹枪克隆（数据未显示）所评估的，通过部分基因组DNA消化或Tru9I消化的基因组片段的连接，可以产生> 500bp长的LM-PCR产物的扩增。在第一种情况下，可以通过进一步优化基因组DNA消化条件来解决问题，而在后一种情况下，可以通过凝胶纯化150至500 bp的扩增子来完成mLV整合位点的成功大规模测序。最后，使用限制性酶切割基因组DNA可以导致靠近限制性位点的整合位点的优先扩增和检测。 Tru9I限制酶可以检索的整合位点的百分比估计为〜50％。因此，可以进一步优化该技术，以通过使用多个限制酶或进行随机DNA剪切来改进整合位点检索通过超声处理20,21 。
最近，我们已经使用广泛使用的Illumina平台优化了病毒集成站点的顺序，如本文所详述。这种排序方法允许与Roche平台相比，每次运行生成更多的读数，从而大大增加了从单个实验中检索的集成站点的数量，从而在全球范围内减少了时间和成本。
细胞特异性调节区域的全基因组鉴定需要通过ChIP-seq 6 （组蛋白H3赖氨酸4的单甲基化和三甲基化鉴定增强子和启动子）和H3K27ac区分活性和非活性调节元素）4,5,6和不同细胞类型的系统比较来定义顺势作用元件仅在确定的细胞群体中有活性。我们在前瞻性分离的靶细胞群体中绘制了mLV整合位点，例如多能造血祖细胞及其致死的红细胞和骨髓后代14 ，胚胎干细胞，神经上皮样干细胞和分化的角质形成细胞。逆转录病毒扫描允许所分析的每个细胞群中的细胞特异性调节元件的全基因组定义，使得比较全基因组学研究不是严格必要的。重要的是，该工具可用于鉴定罕见细胞群体（ 例如体细胞干细胞）中的活性调节元件，其缺乏用于预期分离的强大标志物，并且不能通过基于组蛋白修饰的ChIP-seq分析来分析15 。在这些细胞群中，mLV整合是活性调节区的永久遗传标记，在体外和体内更丰富的细胞后代的eir回溯鉴定。例如，我们成功地将mLV整合簇用作追溯鉴定的角质形成细胞干细胞（KSC）群体中的启动子和增强子的替代标记物。我们用含有KVs载体的早期传代的包皮衍生角化细胞培养物转染，然后我们将这些细胞传代> 35个细胞倍增，以丰富KSCs的后代，从而通过维持这一数量的培养物的能力来定义通道。在这种情况下，mLV积分永久标记在原始转导的KSC群体中活跃的调节区域15 。未来的研究将旨在在全基因组范围内鉴定更多数量的罕见人类干细胞群体中的细胞特异性调节元件。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作由欧洲研究委员会（ERC-2010-AdG，GT-SKIN），意大利教育，大学和研究部（2010年Ricerca的FIRB-Futuro-RBFR10OS4G，2012年Ricerca的FIRB-Futuro-RBFR126B8I_003）的赠款支持，EPIGEN Epigenomics旗舰项目），意大利卫生部（Young Research Call 2011 GR-2011-02352026）和Imagine研究所基金会（法国巴黎）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
