Summary
هنا، نحن تصف بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم من مواقع التكامل من مولوني الفئران فيروس اللوكيميا النواقل الفيروسية القائمة على فيروس في الخلايا البشرية.
Abstract
مولوني الفئران اللوكيميا (ملف) الفيروسات الفيروسية القائمة على الفيروس تتكامل في الغالب في المحسنات أسيتيلاتد والمروجين. لهذا السبب، يمكن استخدام مواقع التكامل مف كعلامات وظيفية من العناصر التنظيمية النشطة. هنا، نقدم أداة مسح الفيروسات الرجعية، والذي يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من المعززات خلية محددة والمروجين. باختصار، يتم ترانزدوسد السكان الخلية المستهدفة مع ناقلات المشتقة ملف ويتم هضم الحمض النووي الجيني مع انزيم تقييد القطع في كثير من الأحيان. بعد ربط الشظايا الجينومية مع رابط الحمض النووي متوافق، وتفاعل سلسلة البلمرة ربط بوساطة (لم-ير) يسمح التضخيم من تقاطع الجينوم الفيروس المضيف. ويستخدم تسلسل هائل من أمبليكونس لتحديد ملف التكامل التكامل الجينوم واسعة. وأخيرا، يتم تعريف مجموعات من التكامل المتكررة لتحديد المناطق التنظيمية محددة الخلية، المسؤولة عن تفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة.
= "jove_content"> تسمح أداة المسح الضوئي للفيروسات الرجعية بتحديد الجينوم على نطاق واسع للمروجين والمحسنات الخاصة بالخلية في مجموعات الخلايا المستهدفة معزولة مستقبلا. ومن الجدير بالذكر أن المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يمثل تقنية فعالة للتعرف بأثر رجعي على السكان النادرين ( مثل الخلايا الجذعية الجسدية) التي تفتقر إلى علامات قوية للعزلة المرتقبة.
Introduction
يتم تحديد هوية الخلية عن طريق التعبير عن مجموعات محددة من الجينات. دور العناصر التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززة، أمر بالغ الأهمية لتفعيل الخلايا من نوع برامج النسخي محددة. وتتميز هذه المناطق التنظيمية بميزات لونين محددة، مثل تعديلات هيستون غريبة، وعوامل النسخ والعوامل المشتركة الملزمة، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين، والتي استخدمت على نطاق واسع لتحديدها على نطاق الجينوم في عدة أنواع من الخلايا 1 ، 2 ، 3 . على وجه الخصوص، يستخدم على نطاق واسع الجينوم على نطاق واسع من أستيليون هيستون H3 ليسين 27 (H3K27ac) لتحديد المروجين النشطة، والمحسنات وعظم المعززات 4 ، 5 ، 6 .
مولوني الفئران فيروس سرطان الدم (مف) هو فيروس غاما ريتروفيروس الذي يستخدم على نطاق واسع للجيناتنقل في خلايا الثدييات. بعد إصابة الخلية المستهدفة، يتم إعادة نسخ جينوم الحمض النووي الريبي ريتروفيرال في جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الذي يربط البروتينات الفيروسية والخلوية لتجميع مجمع ما قبل التكامل (بيك). بيك يدخل نواة ويربط لونين الخلية المضيفة. هنا، إنتغراس الفيروسية، عنصر بيك الرئيسية، يتوسط دمج الحمض النووي بروفيرال في الجينوم الخلية المضيفة. والتكامل ملف في الحمض النووي الجيني ليس عشوائيا، ولكن يحدث في العناصر النشطة التنظيمية سيس، مثل المروجين والمعززين، بطريقة محددة خلية 7 ، 8 ، 9 ، 10 . يتم التوسط هذا الملف التكامل غريبة عن طريق التفاعل المباشر بين إنتغراس مف والبرومودومين الخلوية والنطاق إكستراترمينال (بيت) البروتينات 11 ، 12 ، 13 . البروتينات بيت (BRD2، BRD3، وBRD4) بمثابة جسر بين الكروماتين المضيف و بيك الموافقة المسبقة عن علم: من خلال برومودومينز أنها تعترف للغاية أسيتيلاتد المناطق التنظيمية رابطة الدول المستقلة، في حين أن المجال إكستراترمينال يتفاعل مع مف إنتغراس 11 ، 12 ، 13 .
هنا، نحن تصف المسح الضوئي للفيروسات الرجعية، أداة جديدة لتعيين المناطق النشط- سيس التنظيمية على أساس خصائص التكامل من مف. باختصار، يتم ترانسدوسد الخلايا مع ناقلات فيروس النسخ الاحتياطي المستمدة مف لفب التعبير عن تعزيز البروتين الأخضر الفلورسنت (إغف) مراسل الجينات. بعد استخراج الحمض النووي الجيني، يتم تضخيم تقاطعات بين 3 'تكرار محطة طويلة (لتر) من ناقلات مف والحمض النووي الجيني من قبل ربط بوساطة ير (لم-ير) وتسلسل بشكل واسع. يتم تعيين مواقع التكامل ملف إلى الجينوم البشري والمناطق الجينومية المستهدفة للغاية من قبل ملف تعرف بأنها مجموعات من مواقع التكامل ملف.
المسح الضوئي للفيروسات الرجعيةتم استخدام نينغ لتحديد العناصر التنظيمية النشطة الخلية محددة في العديد من الخلايا الأولية الإنسان 14 ، 15 . مف التي تم تحديدها بشكل مشترك مع المروجين والمعززين المعرفة إبيجينيتيكالي، ومعظمها تأوي علامات هيستون النشطة، مثل H3K27ac، وكانت محددة الخلية. المسح الضوئي للفيروسات الرجعية يسمح لتحديد الجينوم على نطاق واسع من العناصر التنظيمية الحمض النووي في مستقبلي تنقيته السكان الخلية 7 ، 14 ، وكذلك في السكان خلية محددة بأثر رجعي، مثل الخلايا الجذعية الخلايا الكيراتينية، التي تفتقر إلى علامات فعالة لعزلة المحتملين 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ملف تناسل الخلايا البشرية
- عزل الخلايا المستهدفة و ترانزدوس لهم مع ناقلات فيروس الورم الرجعي المستمدة مف التي تؤوي الجين مراسل إغف و بسيودوتيبد مع الحويصلي فيروس الفم G (فسف-G) أو بروتين سكري مغلف أمفوتروبيك 16 .
- إبقاء الخلايا وهمية ترانسدوسد كسيطرة سلبية للتحليلات التالية. وبما أن ناقلات الفيروسات القهقرية المستندة إلى مف يمكن أن تنقل الخلايا التي تقسم بكفاءة، فإن ثقافة سكان الخلية المستهدفة في ظروف تحفز انقسام الخلايا. تحتاج ظروف التحول إلى أن يكون الأمثل على وجه التحديد لكل نوع من الخلايا قيد الدراسة. يتم وصف نمو الخلايا وظروف تنبيغ للأسلاف المكونة للدم البشرية، والخلايا التائية وخلايا البشرة في المراجع 7 و 14 و 15 و 17.
- 48 ساعة بعد تنبيغ، ريسوسبيند 100،000 الخلايا في 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (بس) تحتوي على 2٪ مصل بقري الجنين وقياس إغف التعبير عن طريق وتحليل سايتوميتريك منخفضة (488 نانومتر الإثارة الليزر). استخدام الخلايا وهمية ترانزدوسد كما السيطرة السلبية. لاستعادة موقع التكامل الأمثل، وتنقية الخلايا + غفب بواسطة مضان تنشيط الخلايا فرز (فاكس).
- جمع 0.5 إلى 5 ملايين خلية لإعداد الحمض النووي الجيني. يفضل فترة أطول من الثقافة (> 7 أيام) لتخفيف البروفيروس غير المتضمنة وضرورية عند تحليل سلالة الخلايا الجذعية النائية على المدى الطويل (انظر قسم المناقشة والمرجع 15 ). الكريات الخلية يمكن أن تكون المفاجئة المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. التضخيم من مواقع التكامل مف بواسطة رابط بوساطة ير (لم-ير)
- إعداد الحمض النووي الجيني (غنا)
- استخراج غنا باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المستندة إلى عمود واتبع بروتوكول للخلايا مثقف، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تقييد انزيم الهضمعلى
- إعداد 4 تقييد انزيمات الهضم لكل عينة في أنابيب 1.5 مل. هضم 0.1 إلى 1 ميكروغرام غنا في كل أنبوب بإضافة 1 ميكرولتر من Tru9I (10U) و 1 ميكرولتر من العازلة M في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر. احتضان ردود الفعل في 65 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو بين عشية وضحاها.
- إضافة إلى كل رد فعل 1 ميكرولتر من بستي (10U)، 1 ميكرولتر من العازلة H و 8 ميكرولتر من الماء. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو بين عشية وضحاها. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ربط رابط
- إعداد 100 ميكرومتر Tru9I رابط حل الأسهم في أنبوب 1.5 مل عن طريق خلط رابط زائد حبلا وربط ناقص أوليغونوكليوتيدس حبلا في تركيز 100 ميكرومتر. وضع أنبوب في مجموعة المياه في 100 درجة مئوية والسماح لها يبرد في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين Tru9I رابط حل المخزون في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد 8 ربط ربط ردود الفعل في 1.5 مل أنابيب. لكل رد فعل، قم بإضافة المكون التاليثانية إلى 10 ميكرولتر من تقييد انزيم الهضم: 1.4 ميكرولتر من 10X T4 الحمض النووي ليغاس رد فعل العازلة، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر رابط Tru9I، 1 ميكرولتر (2000U) من ليغاز T4 دنا و 0.6 ميكرولتر من الماء. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 3 إلى 6 ساعات. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- أول ير
- إعداد 48 ردود الفعل ير (6 ردود فعل من كل أنبوب ربط) في 0.2 مل أنابيب. لكل ير، إضافة الكواشف التالية إلى 2 ميكرولتر من رد فعل ربط: 5 ميكرولتر من العازلة 10X ير، 2 ميكرولتر من 50 ملي سلفات المغنيسيوم، 1 ميكرولتر من 10 ملي ديوكسينوكليوتيد (دنتب) مزيج، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر رابط التمهيدي، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر مل-3 "لتر التمهيدي، 0.3 ميكرولتر (1.5U) من البلمرة دنا طق و 37.7 ميكرولتر من الماء. وترد تسلسل التمهيدي في الجدول 1.
- أداء تفاعل ير في سيكلر الحرارية مع غطاء ساخن، على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 25 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة؛ C لمدة 5 دقائق. عقد في 4 درجات مئوية. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ير الثاني
- إعداد 48 ردود الفعل ير (1 من كل "أول ير" أنبوب) في 0.2 مل أنابيب. لكل ير، إضافة المكونات التالية إلى 2 ميكرولتر من تفاعل ير الأول: 5 ميكرولتر من العازلة ير 10X، 2 ميكرولتر من 50 ملي مغنيسيوم كبريتات، 1 ميكرولتر من 10 ملي دنتب ميكس، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر رابط التمهيدي متداخلة، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر مل-3 "لتر متداخلة متداخلة، 0.3 ميكرولتر من طاق دنا البلمرة (1.5 U) و 37.7 ميكرولتر من الماء. استخدام الاشعال المتداخلة مصممة لاستراتيجية التسلسل ضخمة محددة اختيار: (ط) رابط متداخلة متداخلة و مف-3 'لتر متداخلة متداخلة متوافقة مع منصة إلومينا. (إي) رابط متداخلة متداخلة و مف-3 'لتر متداخلة متداخلة متوافقة مع منصة روش. وترد تسلسل التمهيدي في الجدول 1 .
- أداء تفاعل ير في سيكلر الحرارية مع غطاء ساخن، على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 25دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. عقد في 4 درجات مئوية. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تجمع ردود الفعل ير متداخلة 48 في أنبوب 15 مل (الحجم النهائي من ~ 2.4 مل). يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تحديد وجود وحجم المنتجات لم-ير من قبل الاغاروز الكهربائي هلام.
- إضافة 4 ميكرولتر من تحميل العازلة إلى 20 ميكرولتر من المنتجات لم-ير وتحميل العينة على هلام الاغاروز 1٪، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي 100 بب. تشغيل هلام في 5 V / سم لمدة 30 إلى 60 دقيقة وتصور المنتجات ير من قبل تلطيخ إيثيديوم بروميد.
- تشغيل رد فعل لم-ير من عينة وهمية ترانزدوسد كما السيطرة السلبية.
- يعجل أمبليكونس بإضافة 0.1 مجلدات من محلول خلات الصوديوم (3 M؛ ودرجة الحموضة 5.2) و 2.5 مجلدات من الايثانول بنسبة 100٪. مزيج وتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تدور في فوليرة لبنانية السرعة في ميكروسنتريفوج القياسية في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تجاهل طاف وغسل بيليه مع الايثانول 70٪. تدور بأقصى سرعة في ميكروسنتريفوج القياسية في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- تجاهل طاف والهواء الجاف بيليه. إضافة 200 ميكرولتر من المياه ير الصف و ريسوسبيند الحمض النووي. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إضافة 20 ميكرولتر من تحميل العازلة إلى 100 ميكرولتر من المنتجات لم-ير وتحميل العينة على هلام الاغاروز 1٪، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي 100 بب.
- تشغيل هلام في 5 V / سم لمدة 30 إلى 60 دقيقة وقطع جزء من هلام تحتوي على 150 إلى 500 أمبليكونس بب طويلة.
- تنقية المنتجات لم-ير مع العمود القائم على استخراج هلام عدة وقياس التركيز باستخدام طيف الأشعة فوق البنفسجية.
- استخدام 1 ميكرولتر من المكتبة لتقييم طول المنتجات لم-ير باستخدام أداة بيواناليزر، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخدام 20 نانوغرام من المنتجات لم-ير المنقى واستنساخ لهم في ناقلات pCR2.1-توبو، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- أداء التفاعلات التسلسل باستخدام M13 العالمي التمهيدي، تليها رسم الخرائط الجينومية من تسلسل الناتجة، للكشف عن وجود تقاطعات الجينوم الفيروسي (بما في ذلك التمهيدي مت-3 "لتر متداخلة) في> 50٪ من الحيوانات المستنسخة لتحديد العينات المناسبة لتسلسل هائل. مثال على تقاطع الجينوم الفيروسي:
ملف-3 'لتر متداخلة التمهيدي 454 والربط متداخلة التمهيدي 454 ( الجدول 1 ) يشار إلى جريئة و 3' نهاية لتر الفيروسية في مائل. يتم تسلسل تسلسل الجينوم البشري في النص الأحمر (chr10: 6439408-6439509، hg19).
3. تسلسل هائل من مواقع التكامل مف
ملاحظة: لم-ير برودأوكتس يمكن أن تتسلسل باستخدام المنصات التجارية (اختيار الزوج التمهيدي الصحيح متداخلة في تفاعل ير الثاني، انظر القسم الفرعي 2.5.1). للتسلسل من قبل منصة روش غس-فلك بايروسكنسينغ، الرجوع إلى الأوراق السابقة 7 ، 14 ، 15 . في هذا القسم، يتم وصف بروتوكول الأمثل حديثا لمنصة التسلسل إلومينا.
- إعداد المكتبة
- إعداد 1 فهرسة تفاعل ير لكل عينة في 0.2 مل أنابيب. لكل ير، إضافة الكواشف التالية إلى 5 ميكرولتر (150-170 نانوغرام) من المنقى المنتج لم-ير: 5 ميكرولتر من مؤشر التمهيدي 1، 5 ميكرولتر من مؤشر التمهيدي 2، 25 ميكرولتر من 2X ماستر ميكس و 10 ميكرولتر من PCR- المياه الصف. استخدم تركيبة فهرس مختلفة لكل عينة.
- أداء تفاعلات ير في سيكلر الحرارية مع غطاء ساخنة، على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 8 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. 72 درجة مئوية لمدة 5 مفي؛ عقد في 4 درجات مئوية.
- تنقية المنتجات ير باستخدام الصلبة المرحلة عكسها الشلل بروتوكول (سبري) العزلة حبة: في جديد 1.5 مل أنابيب، إضافة 56 ميكرولتر من الخرز لكل عينة والمضي قدما بعد تعليمات الشركة الصانعة. أزل في 25 ميكرولتر من تريس-حمض الهيدروكلوريك 10 ملم. يمكن تخزين المكتبات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- مكتبة الاختيار
- استخدام 1 ميكرولتر من العينة لتقييم حجم المكتبة باستخدام أداة بيواناليزر.
- استخدام 1 ميكرولتر من العينة لتحديد مولاريتي المكتبة باستخدام القائم على مضان الوقت الحقيقي ير فحص، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- مكتبة التخفيف والتسلسل
- تمييع المكتبات إلى 10 نانومتر باستخدام تريس-هكل 10 ملم. لتجميع المكتبات، ونقل 5 ميكرولتر من كل مكتبة المخفف إلى أنبوب 1.5 مل جديد ومن ثم تمييع حمام السباحة إلى 4 نانومتر في تريس-حمض الهيدروكلوريك 10 ملم.
- مزيج 5 ميكرولتر من تجمع المخفف مع 5 ميكرولتر من 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم في 1.5 متر جديدL أنبوب، دوامة لفترة وجيزة، تدور إلى أسفل واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى ديفيراتيون المكتبات.
- وضع أنابيب على الجليد وإضافة 990 ميكرولتر من العازلة التهجين قبل المبردة (HT1). قسامة 300 ميكرولتر من تجمع التشويه والتحريف في أنبوب 1.5 مل جديد وإضافة 300 ميكرولتر من HT1 قبل المبردة للحصول على 10 بم بركة المكتبة النهائية.
- في موازاة ذلك، مزيج 2 ميكرولتر من مكتبة مراقبة فيكس (10 نانومتر) مع 3 ميكرولتر من تريس-هكل 10 ملم في أنبوب 1.5 مل. إضافة 5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.2 N، دوامة لفترة وجيزة، تدور إلى أسفل واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة إلى ديناتور فيكس المخفف. وضع أنبوب على الجليد وإضافة 990 ميكرولتر من HT1 قبل المبردة.
- قسامة 300 ميكرولتر من فيكس التشويه والتحريف في أنبوب 1.5 مل جديد وإضافة 300 ميكرولتر من HT1 قبل المبردة للحصول على 10 بم النهائي فيكس.
- في أنبوب 1.5 مل جديد، مزيج 510 ميكرولتر من تجمع مكتبة التشويه والتحريف مع 90 ميكرولتر من مكتبة فيكس التشويه والتحريف، وبالتالي الحصول على النهائي 10 بم تجمع مع 15٪ من السيطرة فيكس.
- ماصة هذه 600 ميكرولتر من العينةالحجم في خزان عينة تحميل من خرطوشة كاشف تسلسل ذوبان ومتابعة على الفور لأداء قراءة واحدة 150 دورة تشغيل.
ملاحظة: يتم سرد الكواشف الحرجة وتسلسل التمهيدي المطلوبة لهذا البروتوكول في الجدول 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سير عمل إجراء المسح الضوئي للفيروسات الرجعية
يتم تخطي تدفق العمل من إجراء المسح الضوئي فيروسات في الشكل 1 . يتم تنقية السكان الخلية المستهدفة و ترانسدوسد مع ناقلات فيروس النسخ الاحتياطي المستمدة ملف معبرا عن الجينات مراسل إغف. ويحيط التحوير من قبل اثنين من تكرار محطة متطابقة متطابقة (5 'و 3' لتر)، وضمان التخليق، النسخ العكسي وتكامل الجينوم الفيروسي في الحمض النووي المضيف. يتم تقييم كفاءة التنبيب عن طريق تحليل فاكس للتعبير إغف. يتم تضخيم عدد السكان الخلية التي تحتوي على نسبة عالية (> 30٪) من الخلايا التي تنتقل عن طريق ملف، ثم ليسد لاستخراج الحمض النووي الجيني تحتوي على أشرطة ملف الفيروسية المتكاملة. يتم هضم الحمض النووي الجيني و ليغاتد مع رابط متوافق ويتم تضخيم تقاطعات بين 3 'لتر الفيروسية والجينوم المضيف من قبل لم-ير. فيرومن ثم تسلسل الجينوم المضيف المضيف يتم تسلسل بشكل كبير باستخدام منصات روش أو إلومينا. وأخيرا، يتم تعيين مواقع التكامل ملف إلى الجينوم البشري لتحديد مجموعات الجينومية من مواقع الإدراج المتكررة.
التضخيم من مواقع التكامل مف بواسطة لم-ير
يتم تخطيط لم-ير في الشكل 2 . يتم استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا المليئة بالترانسفد، وهضمها مع انزيم تقييد Tru9I، الذي يقلل كثيرا من الجينوم البشري، وتوليد شظايا مع طول وسيط من 70 نقطة أساس. يتم استخدام انزيم تقييد الثاني (بستي) لمنع التضخيم من المتكاملة وغير المتكاملة الداخلية 5 'شظايا لتر.ويصل ثم Tru9I رابط مزدوج تقطعت بهم السبل إلى شظايا الجينومية ويتم تنفيذ لم-ير مع الاشعال محددة للرابط و و 3 'لتر لتضخيم تقاطع الجينوم المضيف الفيروس. يمكن تنفيذ ير المتداخلة باستخدام بريمرس متوافق مع منصات روش أو إلومينا التسلسل.
تحليل أمبليكونس تقاطع الجينوم المضاد للفيروسات
في التجربة ممثلة في الشكل 3 ، ونحن تنقيته CD34 - CD13 + السلف النخاعي / السلائف (مب) و ترانسدوسد لهم مع الفيروس المنقولة المستمدة من اللف المنقولة التعبير عن الجينات مراسل إغف. أكثر من 60٪ من الخلايا مب أعرب إغف 48 ساعة بعد تنبيغ (لا تظهر البيانات). بعد 15 يوما من التنبيغ، وجمعنا الخلايا، واستخراج غنا وتضخيم تقاطع الجينوم الفيروس المضيف، كما هو موضح أعلاه. تم تحميل قسامة من المنتجات المجمعة لم-ير على هلام الاغاروز 1٪ للتحقق من وجود وحجم أمبليكونس. نحن تصور بنجاح تشويه الحمض النووي المقابلة للمنتجات لم-ير من أحجام مختلفة، تتراوح بين 150 إلى 500 نقطة أساس ( الشكل 3A ). كانت أمبليكونس ثمتتركز من قبل الحمض النووي الأمطار وتحميلها على هلام الاغاروز 1٪. وكانت منتجات لم-ير هلام المنقى وتشغيلها على نظام بيواناليزر، مما يؤكد على الأحجام أمبليكون المتوقع (بين 150 و 500 نقطة أساس، الشكل 3B ).
رسم خرائط التكامل ملف في المناطق التنظيمية النشطة والخلية محددة
في التجربة المبلغ عنها في الشكل 4 ، تم ترانسدوسد الخلايا الجذعية / السلف المكونة للدم (هسك)، السلف الحمر / السلائف (إيب) والنخاعي النخاعي / السلائف مع ناقلات المريء الفيروسي المستمدة من ملف. تم الحصول على هذه النتائج معالجة وتسلسل العينات المستمدة من أنواع مختلفة من الخلايا بشكل منفصل، لتجنب التلوث المحتملة / الاصطدامات 18 ، 19 . تم معالجة قراءة تسلسل الخام الناتجة عن التسلسل الهائل من خلال المعلوماتية الآليةخط أنابيب للقضاء على تسلسل الفيروسية والارتباط. ثم، تم تعيين تسلسل فريد من 20 بب على الأقل على الجينوم البشري باستخدام بلات 17 . تمت تصفية المحاذاة الخام التي تتطلب المباراة لتبدأ في أول 3 النوكليوتيدات، مباريات ونيفوكال والحد الأدنى من 95٪ الهوية. تم تعريف مجموعات من تكامل ملف المتكررة من خلال مقارنة إحصائية مع مجموعة بيانات تسلسل الجينومية العشوائية، ولدت عشوائيا استخراج الجينوم المواقف من الجينوم البشري مع عزر تقييد Tru91 على مسافة متوافقة مع منصة التسلسل. ثم تمت معالجة تسلسل التحكم من خلال نفس خط أنابيب التصفية والتصفية المستخدمة لتسلسل التكامل، لإنشاء مجموعة عشوائية من المواقع الفريدة. لتحديد مجموعات مف، طبقنا خوارزمية تجميع دبسان 19 ، مقارنة توزيع التتابع ملف متتالية مع عدد متساو من المواقع العشوائية لتحديد المناطق من تكامل متفاوتة للغاية، والتي ديففي العناصر التنظيمية الخاصة بالخلية 7 ، 14 ، 15 . من أجل تجنب توليد مجموعات كاذبة، تم إجراء عمليات استخراج متعددة من مجموعة بيانات التحكم العشوائي. قمنا بتعيين من قبل لم-ير و بايروسكنسينغ 32،574، 27،546 و 36،358 ملف مواقع التكامل في هسك، إيب و مب، على التوالي. مجموعات من المتكررة مف التكامل شارك في تعيين مع معززات أسيتيلاتد والمروجين ( الشكل 4A ). وكانت معظم المناطق التنظيمية المستهدفة ملف محددة الخلية، مثل: (1) المروج للجين SPINK2 هسك محددة ( الشكل 4B ). (2) المنطقة السيطرة المنطقة تحتوي على معززات قوية من الجينات غلوبين β مثل th الحمراء ( الشكل 4C ). (3) المعززات تقع المنبع من الجينات ليز محددة مب ( الشكل 4D ). وأخيرا، استخدمنا فحوصات لوسيفيراس للتحقق من صحةمجموعة فرعية من المعززة محددة الخلايا محددة الخلايا المستهدفة في إيب و مب ( الشكل 4E ).
الشكل 1: مخطط عام لإجراءات رسم خرائط موقع التكامل للفيروسات الرجعية. يتم ترانزدوسد الخلايا المستهدفة مع ناقلات فيروس النسخ الاحتياطي القائم على ملف تحتوي على كاسيت إغف. يتم هضم الحمض النووي الجيني التي تم الحصول عليها من الخلايا ترانزدوسد مع Tru9I و ليغاتد مع TRO9I متوافق مزدوج حبلا رابط. تم تضخيم مواقع التكامل ملف المتداخلة لم-ير ومكتبة من تقاطع الجينوم المضيف الفيروس يمكن أن تتسلسل على نطاق واسع باستخدام منصات إلومينا أو روش. تم تعيين القراءات الناتجة إلى الجينوم البشري لتحديد مجموعات من التكامل ملف المتكررة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ P>
الشكل 2: التضخيم من تقاطع الجينوم المضيف الفيروس عن طريق لم-ير. يتم هضم الحمض النووي الجيني (غنا) التي تحتوي على بروفيروس مدمج متكامل مع Tru9I و بستي تقييد الإنزيمات، و ليغاتد مع وصلة Tru9I متوافقة. يتم تنفيذ ير المتداخلة باستخدام الاشعال محددة ل لتر والرابط. و Tru9I و بستي مواقع تقييد في الفيروسية و في الجينوم البشري المشار إليها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل أمبليكونس لم-ير. ( أ ) تم تشغيل المنتجات لم-ير (حارة +) على هلام الاغاروز 1٪ وتصوربواسطة تلطيخ بروميد إيثيديوم. لم يتم استخدام عينة نموذجية كعينة تحكم سلبية، حيث تم تصور فقط الاشعال ير (حارة -). ( B ) بعد تنقية هلام، تم فحص لم-ير حجم المنتج من قبل الكهربائي ميكروكابيلاري. يظهر حجم العينة (بي بي) وكثافة مضان (فو) على محاور x و y من إليكتروفيروغرام، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4): رسم خرائط دمج م.ف.ف في المناطق التنظيمية المحددة إبيجينيتيكالي. ( A ) حددنا 3،498، 2،989 و 4،103 مجموعات من مواقع التكامل ملف المتكررة في هسك، إيب و مب، على التوالي. في كل خلية السكان،> 95٪ من التجمعات ملف تتداخل مع تعزيز معرف إبيجينتيكاليإرس والمروجين. ( B و C و D ) كانت المناطق المستهدفة بالخلية ذات الموجات المحرضية (لف) محددة بشكل خاص، وهي مرتبطة بالتعبير الخاص بالخلية للجين المستهدف ( SPINK2 و هب و ليز ، والتي تم التعبير عنها حصريا تقريبا في هسك و إيب و مب على التوالي، على النحو المحدد تحليل كاب من التعبير الجيني). تم تصوير مل واحدة تكامل مع الحانات الصغيرة. تبم يشير إلى علامة لكل مليون. ( E ) المعززة خلية محددة مف-مستهدفة في إيب و مب. ويتم تكييف الشكل 4 من المرجع 14 . لقد تلقينا الإذن لإعادة استخدام هذا الرقم بموجب ترخيص المشاع الإبداعي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، وصفنا بروتوكول لرسم الخرائط على نطاق الجينوم على مواقع التكامل من مف، وهو فيروس ريتروفيروس الذي يستهدف مناطق الكروماتين، علامة إبيجينيتيكالي كما المروجين النشطة والمحسنات. الخطوات الحاسمة و / أو القيود على البروتوكول ما يلي: (ط) تنبيغ مف السكان الخلية المستهدفة. (2) تضخيم الوصلات المضيفة للفيروسات بواسطة لم-ير؛ (3) استرجاع جزء كبير من مواقع التكامل. ناقلات فيروس العوز المناعي القائم على ملف تنتقل بكفاءة الخلايا المقسمة. انخفاض كفاءة تنبيغ الخلايا غير تقسيم (مثل الخلايا العصبية بعد الانقسامية) هو الحد المحتمل لهذه التقنية. ومع ذلك، فإنه يمكن التغلب عليها من خلال فرز الخلايا من السكان ترانزدوسد على أساس التعبير عن الجين مراسل (على سبيل المثال إغف). توليد أمبليكونس قصيرة نسبيا من قبل لم-ير (150 إلى 500 نقطة أساس) إلزامي لإنشاء مكتبة من أمبليكونس متوافقة مع استراتيجيات التسلسل الهائل المستخدمة حاليا والسماح للجين شاملتحليل على نطاق واسع من مواقع التكامل مف. على سبيل المثال، تضخيم> 500 بي بي سي طويلة لم-ير المنتجات يمكن أن تنتج من إما جزئي الجينوم الحمض النووي الهضم أو ربط داخل Tru9I الهضم الجينوم شظايا، كما تقييمها من قبل استنساخ بندقية من أمبليكونس لم-ير (لا تظهر البيانات). في الحالة الأولى، يمكن حل هذه القضية عن طريق زيادة تحسين ظروف الهضم الحمض النووي الجيني، في حين أنه في الحالة الأخيرة، يمكن أن يتم بنجاح تسلسل ضخمة من مواقع التكامل ملف من خلال تنقية هلام أمبليكونس بين 150 و 500 نقطة أساس. وأخيرا، فإن استخدام الإنزيمات تقييد لخفض الحمض النووي الجيني يمكن أن يؤدي إلى التضخيم تفضيلية والكشف عن مواقع التكامل التي تقع بالقرب من موقع تقييد. وتقدر النسبة المئوية لمواقع التكامل التي يمكن انزيم تقييد Tru9I أن تكون ~ 50٪. وبالتالي، فإن هذه التقنية يمكن أن يكون الأمثل إلى أقصى حد لتحسين استرجاع موقع التكامل باستخدام الإنزيمات تقييد متعددة أو أداء عشوائي الحمض النووي شيرينغ بواسطة سونيكاتيون 20 ، 21 .
مؤخرا، قمنا بتحسين تسلسل مواقع التكامل الفيروسي باستخدام منصة إلومينا المستخدمة على نطاق واسع، كما هو مفصل في هذه الورقة. يسمح هذا النهج التسلسل توليد عدد أكبر من يقرأ في المدى بالمقارنة مع منصة روش، وزيادة كبيرة في عدد مواقع التكامل استرجاعها من تجربة واحدة، وبالتالي تقليل الوقت والتكاليف على الصعيد العالمي.
تحديد الجينوم على نطاق واسع من المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية يتطلب رسم خرائط من ثلاثة إلى ثلاثة تعديلات هيستون عن طريق تشيب-سيق 6 (أحادية وثلاثية مثيلة هيستون H3 يسين 4 لتحديد المعززات والمروجين، و H3K27ac للتمييز بين النشطة وغير النشطة العناصر التنظيمية) 4 و 5 و 6 ومقارنة منهجية لمختلف أنواع الخلايا لتحديدالعناصر الممثلة للکائنات الممرضة المکثفة (سيس) التي تنشط بشکل حصري في سکان الخلية المحددة. قمنا بتعيين مواقع التكامل ملف في السكان الخلايا المستهدفة معزولة مستقبلا، مثل الأسلاف المكونة للدم متعددة وملتزمة إريثرويد والنسل النخاعي 14 ، والخلايا الجذعية الجنينية، والخلايا الجذعية العصبية مثل الخلايا الجذعية متمايزة 15 . وقد سمح المسح الضوئي للفيروسات الرجعية بتعريف العناصر التنظيمية الخاصة بالخلية على نطاق الجينوم في كل خلية من السكان، مما جعل الدراسات المقارنة على نطاق الجينوم غير ضرورية تماما. الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذه الأداة لتحديد العناصر التنظيمية النشطة في السكان الخلايا النادرة (على سبيل المثال الخلايا الجذعية الجسدية)، التي تفتقر إلى علامات قوية للعزلة المحتملين، ولا يمكن تحليلها من خلال تحليل القائم على رقاقة القائم على التعديلات هيستون 15 . في هذه الخلايا السكان ملف التكامل هو علامة وراثية دائمة من المناطق التنظيمية النشطة، والسماح لإير تحديد بأثر رجعي في سلالة الخلية أكثر وفرة في المختبر وفي الجسم الحي. وكمثال على ذلك، استخدمنا بنجاح مجموعات التكامل مف كعلامات بديلة من المروجين والمعززات في الخلايا الجذعية الخلايا الكيراتينية (كسك) بأثر رجعي. نحن ترانزدوسد في وقت مبكر مرور، القلفة المستمدة من الخلايا الكيراتينية المحتوية على كسك مع ناقلات مف، ثم مررنا هذه الخلايا لأكثر من 35 خلية دوبلينغز لإثراء في ذرية كسكس، وبالتالي معرفة قدرتها على الحفاظ على ثقافة لهذا العدد من الممرات. في هذه الحالة، تميزت التراكيب ملف بشكل دائم المناطق التنظيمية النشطة في السكان الأصليين ترانزدوسد كسك 15 . وستهدف الدراسات المستقبلية إلى تحديد العناصر التنظيمية الخاصة بالخلية على نطاق الجينوم في عدد أكبر من السكان النادرين من الخلايا الجذعية البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بمنح مقدمة من مجلس البحوث الأوروبي (إرك-2010-أدغ، غ-سكين)، ووزارة التعليم الإيطالية والجامعات والبحوث (فيرب-فوتورو في ريسركا 2010-RBFR10OS4G، فيرب-فوتورو في ريسركا 2012-RBFR126B8I_003 ، ومشروع إبيجن إبيجينوميكس الرائد)، ووزارة الصحة الإيطالية (باحثون شباب دعوة 2011 غر-2011-02352026) ومؤسسة معهد إيماجين (باريس، فرنسا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
