Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio's te definiëren

Published: May 28, 2017 doi: 10.3791/55919

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.

Abstract

Moloney muizen leukemie (MLV) -virus gebaseerde retrovirale vectoren integreren overwegend in geacyleerde versterkers en promoters. Om deze reden kunnen mLV-integratieplaatsen worden gebruikt als functionele markers van actieve regulerende elementen. Hier presenteren wij een retrovirale scan tool, waarmee de genoom-breed identificatie van celspecifieke enhancers en promotors mogelijk is. In het kort wordt de doelcellenpopulatie getransduceerd met een mLV-afgeleide vector en genomisch DNA wordt verteerd met een frequent snijbeperkingsenzym. Na ligatie van genomische fragmenten met een compatibele DNA-linker maakt linker-gemedieerde polymerase kettingreactie (LM-PCR) de amplificatie van de virus-gastheer-genoomverbindingen mogelijk. Massieve sequentiebepaling van de ampliconen wordt gebruikt om het mLV integratieprofiel genoom breed te definiëren. Tenslotte worden clusters van terugkerende integraties gedefinieerd om celspecifieke regulerende gebieden te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma's van de celtype.

bijv. Somatische stamcellen) die robuuste markers voor toekomstige isolatie hebben.

Introduction

Celidentiteit wordt bepaald door de expressie van specifieke sets genen. De rol van cis-regulerende elementen, zoals promotors en enhancers, is van cruciaal belang voor de activatie van specifieke transcriptieprogramma's van de celtype. Deze regulerende gebieden worden gekenmerkt door specifieke chromatinfuncties, zoals eigenaardige histon-modificaties, transcriptiefactoren en co-factoren binding, en chromatin toegankelijkheid, die veel gebruikt zijn voor hun genoom-brede identificatie in verscheidene celtypes 1 , 2 , 3 . In het bijzonder wordt het genoom-breed profiel van acetylering van histon H3-lysine 27 (H3K27ac) algemeen gebruikt om actieve promoters, versterkers en superversterkers 4 , 5 , 6 te definiëren.

Moloney muizen leukemie virus (MLV) is een gamma-retrovirus dat algemeen gebruikt wordt voor genenOverdracht in zoogdiercellen. Na het infecteren van een doelcel, wordt het retrovirale RNA-genoom getranscribeerd in een dubbelstrengs DNA-molecuul dat virale en cellulaire eiwitten bindt om het pre-integratiecomplex (PIC) te assembleren. De PIC komt in de kern en bindt de gastheercelchromatine. Hier bemiddelt de virale integrase, een belangrijke PIC component, de integratie van het provirale DNA in het gastheer-genoom. MLV-integratie in het genomische DNA is niet willekeurig, maar komt in actieve cis-regulerende elementen, zoals promoters en versterkers, op een celspecifieke wijze 7 , 8 , 9 , 10 voor . Dit eigenaardige integratieprofiel wordt gemedieerd door een directe interactie tussen de mLV integrase en de cellulaire bromodomain en extraterminale domein (BET) eiwitten 11 , 12 , 13 . BET eiwitten (BRD2, BRD3 enBRD4) fungeren als een brug tussen gastheerchromatine en mLV PIC: door hun bromomaten herkennen zij sterk geacyleerde cis-regulerende gebieden, terwijl het extraterminale domein interactieert met de mLV integrase 11 , 12 , 13 .

Hier beschrijven we het retrovirale scannen, een nieuw gereedschap om actieve cis-regulerende gebieden te lokaliseren op basis van de integratie eigenschappen van mLV. In het kort worden cellen getransduceerd met mLV-afgeleide retrovirale vector die het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) reportergen tot expressie brengt. Na de genomische DNA-extractie worden de kruisingen tussen de 3'-lange terminale herhaling (LTR) van de mlV-vector en het genomische DNA geamplificeerd door linker gemedieerde PCR (LM-PCR) en massief opeenvolgend. MLV-integratieplaatsen worden toegewezen aan het menselijk genoom en genomische gebieden die sterk gerangschikt zijn door mLV worden gedefinieerd als clusters van mLV-integratieplaatsen.

Retrovirale scanNing werd gebruikt om celspecifieke actieve regulerende elementen in verschillende menselijke primaire cellen 14 , 15 te definiëren. MLV clusters co-mapped met epigenetisch gedefinieerde promoters en enhancers, waarvan de meeste actieve histonenmerken, zoals H3K27ac, bevatten en cellspecifiek waren. Retrovirale scanning laat de genoombrede identificatie van DNA regulatorische elementen toe in prospectief gezuiverde celpopulaties 7 , 14 , evenals in retrospectief gedefinieerde celpopulaties, zoals keratinocytstamcellen, die geen effectieve markers voor toekomstige isolatie hebben 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. MLV-transductie van menselijke cellen

  1. Isolatie doelcellen en transduceer ze met een mLV-afgeleide retrovirale vector die het eGFP reportergen bevat en pseudotypeert met Vesicular Stomatitis Virus G (VSV-G) of het amphotropische envelopglycoproteïne 16 .
    1. Bewaar mock-transduced cellen als negatieve controle voor de volgende analyses. Aangezien mLV-gebaseerde retrovirale vectoren effectieve verdeling van cellen kunnen transduceren, kweek de doelcellenpopulatie in omstandigheden die celverdeling stimuleren. Transductie condities moeten specifiek worden geoptimaliseerd voor elk celtype dat onderzocht wordt. Celgroei en transductietoestanden voor humane hematopoietische stamcellen, T-cellen en epidermale cellen zijn beschreven in Referenties 7, 14, 15 en 17.
  2. 48 uur na transductie, 100.000 cellen resuspenderen in 300 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 2% foetaal runder serum bevat en eGFP expressie meten fLage cytometrische analyse (488 nm excitatie laser). Gebruik mock-transduced cellen als negatieve controle. Voor optimale integratie site retrieval, zuiver GFP + cellen door Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).
  3. Verzamel 0,5 tot 5 miljoen cellen voor genomische DNA-bereiding. Een langere cultuurperiode (> 7 dagen) heeft de voorkeur om het niet geïntegreerde provirus te verdunnen en noodzakelijk bij het analyseren van de langetermijn nakomelingen van bona fide stamcellen (zie discussie sectie en referentie 15 ). De celpellets kunnen worden gesneden en opgeslagen bij -80 ° C tot aan het gebruik.

2. Versterking van mLV-integratieplaatsen door linker-gemedieerde PCR (LM-PCR)

  1. Bereiding van genomisch DNA (gDNA)
    1. Extract gDNA met behulp van een kolom gebaseerde DNA extractie kit en volg het protocol voor gekweekte cellen, volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Restrictie enzym digestiop
    1. Stel 4 restrictie-enzymverdichten per monster in 1,5 ml buizen op. Digest 0,1 tot 1 μg gDNA in elke buis door 1 μL Tru9I (10U) en 1 μl buffer M in een eindvolume van 10 μl toe te voegen. Incubeer de reacties bij 65 ° C gedurende 6 uur of 's nachts.
    2. Voeg bij elke reactie 1 μL PstI (10U), 1 μl buffer H en 8 μl water toe. Incubeer de reacties bij 37 ° C gedurende 6 uur of 's nachts. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  3. Linker ligatie
    1. Bereid een 100 μM Tru9I linker voorraadoplossing in een 1,5 ml buis door de linker plus streng en linker minus strand oligonucleotiden bij een 100 μM concentratie te mengen. Zet de buis in een water ingesteld op 100 ° C en laat het afkoelen bij kamertemperatuur. Tru9I linker voorraadoplossing kan bij -20 ° C tot gebruik worden opgeslagen.
    2. Stel 8 linkerligatie reacties op in 1,5 ml buizen. Voeg bij elke reactie het volgende bestanddeel toeS tot 10 μL restrictie-enzymvertering: 1,4 μl 10X T4 DNA-ligase-reactiebuffer, 1 μl 10 μM linker Tru9I, 1 μL (2000U) T4 DNA-ligase en 0,6 μl water. Incubeer bij 16 ° C gedurende 3 tot 6 uur. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  4. Eerste PCR
    1. Stel 48 PCR reacties op (6 reacties van elke ligatiebuis) in 0,2 ml buizen. Voor elke PCR voeg de volgende reagentia toe aan 2 μl ligeringsreactie: 5 μl 10X PCR buffer, 2 μl 50 mM magnesiumsulfaat, 1 μl 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μl 10 μM linker primer, 1 ΜL 10 μM mLV-3 'LTR primer, 0,3 μL (1,5U) Taq DNA Polymerase en 37,7 μl water. Primersequenties worden weergegeven in Tabel 1.
    2. Voer PCR-reactie uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 2 minuten; 25 cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 °; C voor 5 minuten; Vasthouden bij 4 ° C. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  5. Tweede PCR
    1. Stel 48 PCR reacties (1 uit elke "eerste PCR" buis) in 0,2 ml buizen op. Voor elke PCR, voeg de volgende componenten toe aan 2 μL van de eerste PCR-reactie: 5 μl 10X PCR buffer, 2 μL 50 mM magnesiumsulfaat, 1 μl 10 mM dNTP Mix, 1 μl 10 μM linker geneste primer, 1 ΜL 10 μM mLV-3 'LTR geneste primer, 0,3 μl Taq DNA Polymerase (1,5 U) en 37,7 μl water. Gebruik geneste primers die zijn ontworpen voor de specifieke massieve sequencing strategie gekozen: (i) linker geneste primer en mLV-3 'LTR geneste primer compatibel met Illumina platform; (Ii) linker geneste primer en mLV-3 'LTR geneste primer compatibel met Roche platform. Primersequenties staan ​​vermeld in Tabel 1 .
    2. Voer PCR-reactie uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 2 minuten; 25Cycli van 95 ° C gedurende 15 s, 58 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 5 minuten; Vasthouden bij 4 ° C. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
    3. Pool de 48 geneste PCR-reacties in een 15 ml buis (eindvolume van 2,4 ml). Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  6. Bepaal de aanwezigheid en de grootte van de LM-PCR producten door agarosegel elektroforese.
    1. Voeg 4 μL Loadbuffer toe aan 20 μL LM-PCR producten en laad het monster op een 1% agarosegel, samen met een 100 bp DNA ladder. Loop de gel bij 5 V / cm gedurende 30 tot 60 minuten en visualiseer de PCR-producten door ethidiumbromide-kleuring.
    2. Voer een LM-PCR-reactie uit van het mock-getransduceerde monster als negatieve controle.
  7. Precipiteer de ampliconen door 0,1 volumes natriumacetaatoplossing (3 M, pH 5,2) en 2,5 volumes 100% ethanol toe te voegen. Meng en vries bij -80 ° C gedurende 20 minuten.
    1. Spin at fuLl gedurende 20 minuten in een standaard microcentrifuge bij 4 ° C versnellen. Gooi de supernatant weg en doe de pellet met 70% ethanol. Spin bij volle snelheid in een standaard microcentrifuge bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
    2. Gooi de supernatant weg en laat de pellet drogen. Voeg 200 μl water van PCR-gehalte toe en vul het DNA opnieuw op. Monsters kunnen bij -20 ° C opgeslagen worden tot het gebruik.
  8. Voeg 20 μL laadbuffer toe aan 100 μl van de LM-PCR producten en laad het monster op een 1% agarosegel, samen met een 100 bp DNA ladder.
    1. Loop de gel bij 5 V / cm gedurende 30 tot 60 minuten en snijd het gedeelte van de gel met 150 tot 500 bp-lange ampliconen.
    2. Reinig de LM-PCR producten met een kolom gebaseerde gel extractie kit en meet de concentratie met behulp van een UV spectrofotometer.
  9. Gebruik 1 μL bibliotheek om de lengte van de LM-PCR producten te evalueren met behulp van een bioanalysator, volgens de instructies van de fabrikant.
  10. Gebruik 20 ng van de gezuiverde LM-PCR-producten en kloneer ze in de pCR2.1-TOPO-vector volgens de instructies van de fabrikant.
  11. Volg sequentieringsreacties met behulp van de M13 Universal Primer, gevolgd door genomische mapping van de resulterende sequenties, om de aanwezigheid van de virale-genoomverbindingen (inclusief de mLV-3 'LTR geneste primer) in> 50% van de klonen te onthullen om passende monsters te identificeren Voor massale sequencing. Voorbeeld van een virale-genoomverbinding:
    Knooppunt
    MLV-3 'LTR geneste primer 454 en linker geneste primer 454 ( tabel 1 ) zijn vetgedrukt en het 3'-uiteinde van de virale LTR cursief. De menselijke genomische sequentie is gemarkeerd in rode tekst (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. Massieve sequencing van mLV Integration Sites

OPMERKING: LM-PCR prodUcts kunnen op basis van commerciele platforms worden gesorteerd (het juiste geneste primerpaar selecteren in de tweede PCR-reactie, zie paragraaf 2.5.1). Voor sequencing door Roche GS-FLX pyrosequencing platform, verwijzen wij u naar de vorige documenten 7 , 14 , 15 . In dit gedeelte wordt een nieuw geoptimaliseerd protocol voor Illumina sequencing platform beschreven.

  1. Bibliotheekvoorbereiding
    1. Stel 1 indexering PCR-reactie per monster in 0,2 ml buizen op. Voor elke PCR, voeg de volgende reagentia toe aan 5 μL (150-170 ng) gezuiverd LM-PCR product: 5 μL Index Primer 1, 5 μL Index Primer 2, 25 μL 2X Master Mix en 10 μl PCR- Kwaliteit water. Gebruik een andere indexcombinatie voor elk monster.
    2. Voer PCR-reacties uit in een thermische cyclus met verwarmd deksel, als volgt: 95 ° C gedurende 3 minuten; 8 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s; 72 ° C gedurende 5 min; Vasthouden bij 4 ° C.
    3. De PCR-producten zuiveren met behulp van een solid-phase reversibel immobilisatie (SPRI) kraalisolatieprotocol: Voeg in nieuwe 1,5 ml buizen 56 μL kralen aan elk monster toe en volg de instructies van de fabrikant. Oplossen in 25 μl Tris-HCl 10 mM. Bibliotheken kunnen bij -20 ° C worden opgeslagen tot aan het gebruik.
  2. Bibliotheekcontrole
    1. Gebruik 1 μL monster om de bibliotheekgrootte te beoordelen met behulp van een bioanalysator.
    2. Gebruik 1 μL monster om de bibliotheekmolariteit te kwantificeren met behulp van een fluorescentie gebaseerde Real-Time PCR-analyse volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Bibliotheekverdunning en sequencing
    1. Verdun bibliotheken naar 10 nM met behulp van Tris-HCl 10 mM. Voor het bundelen van bibliotheken overbrengt 5 μL van elke verdunde bibliotheek naar een nieuwe 1,5 ml buis en verdund het pool vervolgens tot 4 nM in Tris-HCl 10 mM.
    2. Meng 5 μl verdund zwembad met 5 μL 0,2 N NaOH in een nieuwe 1,5 mL buis, vortex kort, draai-down en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de bibliotheken te denatureren.
    3. Zet buizen op ijs en voeg 990 μL voorgekoelde hybridisatiebuffer (HT1) toe. Aliquot 300 μL gedenatureerde pool in een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 300 μl voorafgekoelde HT1 toe om een ​​10 pM eindbibliotheek zwembad te verkrijgen.
    4. Gelijktijdig meng 2 μL PhiX controle bibliotheek (10 nM) met 3 μl Tris-HCl 10 mM in een 1,5 ml buis. Voeg 5 μL NaOH 0,2 N, vortex kort, spin-down en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de verdunde PhiX te denatureren. Doe de buis op ijs en voeg 990 μL voorgekoelde HT1 toe.
    5. Aliquot 300 μL gedenatureerde PhiX in een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 300 μl voorafgekoelde HT1 toe om een ​​10 pM uiteindelijke PhiX te verkrijgen.
    6. In een nieuwe 1,5 ml buis mengen 510 μL gedenatureerde bibliotheekpool met 90 μl gedenatureerde PhiX-bibliotheek, waardoor een laatste 10 pM pool met 15% PhiX-controle wordt verkregen.
    7. Pipetteer deze 600 μL monsterVolume in het laadproefreservoir van de ontdooide sequentie-reagentcartridge en ga onmiddellijk door om een ​​lopende 150-cyclus uit te voeren.
      OPMERKING: De kritische reagentia en primersequenties die nodig zijn voor dit protocol zijn vermeld in tabel 1 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Werkstroom van de retrovirale scanprocedure

De werkstroom van retrovirale scanprocedure is in figuur 1 geschetst. De doelcellenpopulatie wordt gezuiverd en getransduceerd met een mLV-afgeleide retrovirale vector die een eGFP-reportergen uitmaakt. Het transgen wordt geflankeerd door de twee identieke lange terminale herhalingen (5 'en 3' LTR), waardoor synthese, omgekeerde transcriptie en integratie van het virale genoom in gastheer DNA wordt gewaarborgd. De transductie-efficiëntie wordt beoordeeld door FACS analyse van eGFP expressie. De celpopulatie die een hoog percentage (> 30%) mLV-getransduceerde cellen bevat, wordt geamplificeerd en vervolgens gelicht om genomisch DNA te extraheren dat de geïntegreerde mLV virale cassettes bevat. Genomisch DNA wordt verteerd en geligeerd met een compatibele linker en de kruisingen tussen de virale 3 'LTR's en het gastheergenoom worden geamplificeerd door LM-PCR. virGenome-kruispunten van ons-gastheer worden vervolgens massaal opgevolgd met behulp van Roche of Illumina platforms. Tenslotte worden mLV-integratieplaatsen genoteerd aan het menselijk genoom om genomische clusters van terugkerende insertieplaatsen te definiëren.

Versterking van mLV-integratieplaatsen door LM-PCR

De LM-PCR is geschetst in figuur 2 . Genomisch DNA wordt geëxtraheerd uit mLV-getransduceerde cellen en verteerd met het Tru9I-restrictie-enzym, dat vaak het menselijke genoom snijdt, waardoor fragmenten met een gemiddelde lengte van 70 bp worden genereerd. Een tweede restrictie-enzym (PstI) wordt gebruikt om amplificatie van geïntegreerde en niet-geïntegreerde interne 5'-LTR fragmenten te voorkomen. Een Tru9I dubbelstrengige linker wordt dan geligeerd aan de genomische fragmenten en LM-PCR wordt uitgevoerd met primers die specifiek zijn voor de linker en De 3 'LTR om de virus-host genoom kruispunten te versterken. Geneste PCR kan uitgevoerd worden met priMers compatibel met Roche of Illumina sequencing platforms.

Analyse van virus-gastheer-genoom-verbindings ampliconen

In het experiment weergegeven in Figuur 3 , zuiveren we CD34 - CD13 + myeloïde stamvader / precursoren (MPP) en transduceerden ze met een mLV-afgeleide retrovirale expressie van het eGFP reportergen. Meer dan 60% MPP-cellen uitgedrukt eGFP 48 uur na transductie (data niet getoond). 15 dagen na transductie verzamelden we de cellen, gDNA geëxtraheerd en de virus-gastheer-genoomverbindingen geamplificeerd, zoals hierboven beschreven. Een aliquot van de gepoolde LM-PCR producten werd geladen op een 1% agarosegel om de aanwezigheid en de grootte van de ampliconen te verifiëren. We hebben met succes een DNA-smear weergegeven die overeenstemt met de LM-PCR producten van verschillende maten, variërend van 150 tot 500 bp ( Figuur 3A ). Ampliconen waren toenGeconcentreerd door DNA-precipitatie en geladen op een 1% agarosegel. LM-PCR-producten werden gelgezuiverd en runnen op een bioanalysatorsysteem, waarbij de verwachte amplicongroottes (tussen 150 en 500 bp, figuur 3B ) werden bevestigd.

Mapping van mLV-integraties in actieve en celspecifieke regulerende gebieden

In het in figuur 4 getoonde experiment werden hematopoietische stam- / stamcellen (HSPC), erytroïd-stamvader / voorgangers (EPP) en myeloïde stamvader / voorgangers (MPP) getransduceerd met een mLV-afgeleide retrovirale vector. Deze resultaten werden verkregen verwerking en sequentiebepaling van monsters afgeleid van verschillende cel typen afzonderlijk, om de potentiële verontreiniging / botsingen 18 , 19 te vermijden. Ruwe sequentie lezingen gegenereerd door massale sequencing werden verwerkt door een geautomatiseerde bioinformaticaPijpleiding om virale en linker sequenties te elimineren. Vervolgens werden unieke sequenties van ten minste 20 bp toegewezen op het menselijk genoom onder gebruikmaking van Blat 17 . Ruwe uitlijningen werden gefilterd waardoor de wedstrijd moet beginnen binnen de eerste 3 nucleotiden, univocal wedstrijden en een minimum van 95% identiteit. Clusters van terugkerende mLV-integraties werden gedefinieerd door een statistische vergelijking met een dataset van willekeurige genomische sequenties, die willekeurig door middel van willekeurige afwijking van de genomische posities van het menselijk genoom met een Tru91-restrictiemotief op een afstand verenigbaar met het sequentieplatform werden geëxtraheerd. Beheerssequenties werden vervolgens verwerkt via dezelfde mapping- en filterpijplijn gebruikt voor integratiesequenties, om een ​​willekeurige reeks unieke sites te genereren. Om mLV clusters te definiëren, hebben we het DBSCAN clustering algoritme 19 toegepast, waarbij de verdeling van opeenvolgende mLV integraties wordt vergeleken met die van een even aantal willekeurige sites om gebieden van sterk geclusterde integraties te identificeren, welke defIne celspecifieke regulerende elementen 7 , 14 , 15 . Om de generatie van valse clusters te voorkomen, werden meerdere extracties uit de random control dataset uitgevoerd. We mappen door LM-PCR en pyrosequencing 32.574, 27.546 en 36.358 mLV integratieplaatsen in respectievelijk HSPC, EPP en MPP. Clusters van terugkerende mLV integraties co-mapped met geacyleerde versterkers en promoters ( Figuur 4A ). De meeste van de mlV-gerichte regulerende gebieden waren celspecifieke, zoals: (i) de promoter van HSPC- specifiek SPINK2- gen ( Figuur 4B ); (Ii) het Locus Control Region met krachtige versterkers van de erythroid-specifieke β-achtige globinegenen ( Figuur 4C ); (Iii) versterkers gelegen stroomopwaarts van het MPP- specifieke LYZ- gen ( Figuur 4D ). Tenslotte hebben we luciferase analyses gebruikt om te validerenEen subset van vermoedelijke celspecifieke mLV-gerichte enhancers in EPP en MPP ( Figuur 4E ).

Figuur 1
Figuur 1: Een algemene schema van de mapping procedure voor retrovirale integratieplaats. Doelcellen worden getransduceerd met een mLV-gebaseerde retrovirale vector die een eGFP-cassette bevat. Genomisch DNA verkregen uit getransduceerde cellen wordt verteerd met Tru9I en geligeerd met een compatibele Tru9I dubbelstrengschakelaar. MLV-integratieplaatsen werden geamplificeerd door geneste LM-PCR en de bibliotheek van virus-gastheer-genoomverbindingen kan massaal opvolgen met behulp van Illumina of Roche-platforms. De resulterende lezingen werden toegewezen aan het menselijk genoom om clusters van terugkerende mLV integraties te definiëren. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. </ P>

Figuur 2
Figuur 2: Versterking van virus-gastheer-genoomverbindingen door LM-PCR. Genomisch DNA (gDNA) dat het geïntegreerde mLV-provirus bevat, wordt verteerd met Tru9I- en PstI-restrictie-enzymen, en geligeerd met een compatibele Tru9I-linker. Nested PCR wordt uitgevoerd met behulp van primers specifiek voor de LTR en de linker. Tru9I- en PstI-restrictieplaatsen in het virale en in het menselijk genoom zijn aangegeven. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Analyse van LM-PCR ampliconen. ( A ) LM-PCR producten (laan +) werden uitgevoerd op een 1% agarosegel en visualiseerdDoor ethidiumbromide kleuring. Een geen sjabloonmonster diende als negatief controlemonster, waarbij alleen PCR-primers werden zichtbaar (baan -). ( B ) Na gelzuivering werd LM-PCR productgrootte gecontroleerd door microcapillaire elektroforese. Voorbeeldgrootte (bp) en fluorescentie-intensiteit (FU) worden weergegeven op respectievelijk x en y-axes van het elektropherogram. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Mapping van mLV integratie in epigenetisch gedefinieerde regulerende gebieden. ( A ) We definieerden 3,498, 2,989 en 4,103 clusters van terugkerende mLV integratieplaatsen in respectievelijk HSPC, EPP en MPP. In elke celpopulatie overlappen> 95% van de mlV clusters met epigenetisch gedefinieerde versterkingErs en promotors. ( B , C en D ) Celspecifieke mLV-gerichte gebieden werden sterk geacyleerde en geassocieerd met celspecifieke expressie van het geteikende gen ( SPINK2 , HBB en LYZ , bijna uitsluitend uitgedrukt in respectievelijk HSPC, EPP en MPP, zoals bepaald Door Cap analyse van Gene Expression). MLV enkele integraties worden afgebeeld met kleine staven. TPM geeft tag per miljoen aan. ( E ) Putatieve celspecifieke mLV-gerichte enhancers in EPP en MPP. Figuur 4 is aangepast uit referentie 14 . We hebben de toestemming gekregen om dit cijfer opnieuw te gebruiken onder de licentie Creative Commons. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier hebben we een protocol beschreven voor genoom-wide mapping van de integratie sites van mLV, een retrovirus dat zich richt op chromatinegebieden, epigenetisch gemarkeerd als actieve promotors en enhancers. Kritieke stappen en / of beperkingen van het protocol omvatten: (i) mLV transductie van de doelcellenpopulatie; (Ii) amplificatie van virus-gastheer kruisingen door LM-PCR; (Iii) het ophalen van een hoge fractie integratieplaatsen. MLV-gebaseerde retrovirale vectoren transduceren delende cellen efficiënt. De lage efficiëntie van transductie van niet-verdeelde cellen (bijv. Postmittotische neuronale cellen) is een potentiële beperking van deze techniek. Het kan echter overwonnen worden door celsortering van de getransduceerde populatie op basis van de expressie van het reportergen (bijvoorbeeld eGFP). De generatie van relatief korte ampliconen door LM-PCR (150 tot 500 bp) is verplicht om een ​​bibliotheek van ampliconen te genereren die verenigbaar zijn met de momenteel gebruikte massieve sequencing strategieën en een uitgebreid genOme-wide analyse van mLV integratie sites. Als voorbeeld kan amplificatie van> 500 bp lange LM-PCR producten resulteren uit hetzij gedeeltelijke genomische DNA-vertering of intra-ligatie van Tru9I-verteerde genomische fragmenten, zoals geëvalueerd door shotgun kloning van LM-PCR amplicons (data niet getoond). In het eerste geval kan het probleem worden opgelost door verdere optimalisatie van genomische DNA-verteringsomstandigheden, terwijl in het laatste geval de succesvolle massale sequentiebepaling van mLV-integratieplaatsen kan worden bereikt door middel van een gelzuivering van ampliconen tussen 150 en 500 bp. Tenslotte kan het gebruik van restrictie-enzymen om het genomische DNA te snijden leiden tot de preferentiële versterking en detectie van integratieplaatsen die dicht bij een restrictieplaats liggen. Het percentage integratieplaatsen dat het Tru9I-restrictie-enzym kan ophalen wordt geschat op ~ 50%. Zo kan deze techniek verder worden geoptimaliseerd om de terugwinning van de integratieplaats te verbeteren door gebruik te maken van meerdere restrictie-enzymen of het uitvoeren van willekeurige DNA-sheariNg door sonication 20 , 21 .

Onlangs hebben we de sequencing van virale integratie sites geoptimaliseerd met behulp van het veel gebruikte Illumina platform, zoals gedetailleerd in dit artikel. Deze sequentieringsbenadering maakt het mogelijk om een ​​hoger aantal les per run te genereren in vergelijking met het Roche-platform, waardoor het aantal integratiesites dat uit een enkel experiment is opgehaald, aanzienlijk vergroot, waardoor de tijd en kosten wereldwijd worden verminderd.

Genoom-breedte identificatie van celspecifieke regulerende gebieden vereist de mapping van een tot drie histon-modificaties door ChIP-seq 6 (mono- en trimethylering van histone H3-lysine 4 om versterkers en promotors te identificeren en H3K27ac om te onderscheiden tussen actieve en inactieve Regulerende elementen) 4 , 5 , 6 en een systematische vergelijking van verschillende celtypes om te definiërenCis-werkende elementen die uitsluitend actief zijn in een bepaalde celpopulatie. We hebben mlV-integratieplaatsen gemarkeerd in prospectief geïsoleerde doelcelpopulaties, zoals multipotente hematopoietische stamvaders en hun toegewijde erythroid en myeloïde nakomelingen 14 , embryonale stamcellen, neuroepitheliale stamcellen en gedifferentieerde keratinocyten 15 . Retrovirale scanning liet de genoom-brede definitie van celspecifieke regulerende elementen toe in elke celpopulatie geanalyseerd, waardoor de vergelijkende genoombrede studies niet strikt noodzakelijk waren. Belangrijk is dat dit instrument kan worden gebruikt voor het identificeren van actieve regulerende elementen in zeldzame celpopulaties ( bijv. Somatische stamcellen), die geen robuuste markers hebben voor toekomstige isolatie en niet kunnen worden geanalyseerd door Chip-seq-gebaseerde analyse van histon-modificaties 15 . In deze celpopulaties is mLV-integratie een permanente genetische marker van actieve regulerende gebieden, waardoor thEir retrospectieve identificatie in de meer overvloedige cel nakomelingen in vitro en in vivo. Als voorbeeld hebben we succesvolle mlV-integratieclusters gebruikt als surrogaatmarkers van promoters en versterkers in een retrospectief geïdentificeerde populatie van keratinocyt stamcellen (KSC). We transduced een vroege doorgang, voorhuid afgeleide keratinocyte cultuur die KSCs bevat met een mLV vector, dan passeerden we deze cellen voor> 35-cel verdubbeling om te verrijken in de nakomelingen van KSCs, aldus gedefinieerd door hun vermogen om de cultuur te handhaven voor dit aantal passages. In dit geval gemerkt mLV integraties permanent de regulerende regio's die actief zijn in de oorspronkelijke getransduceerde KSC-populatie 15 . Toekomstige studies zullen erop gericht zijn om op een genoombreedte celspecifieke regulerende elementen te identificeren in een groter aantal zeldzame menselijke stamcellenpopulaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteiten en Onderzoek (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid (Young Researchers Call 2011 GR-2011-02352026) en de Stichting Imagine Institute (Parijs, Frankrijk).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS, pH 7.4 ThermoScientific 10010031 or equivalent
Fetal Bovine Serum ThermoScientific 16000044 or equivalent
0.2 ml tubes general lab supplier
1.5 ml tubes general lab supplier
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit  QIAGEN 51306 or equivalent
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202T
T4 DNA Ligase Reaction buffer New England BioLabs M0202T
Linker Plus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’  (Purification grade: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotide general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE)
Tru9I Roche-Sigma-Aldrich 11464825001
SuRE/Cut Buffer M Roche-Sigma-Aldrich 11417983001
PstI  Roche-Sigma-Aldrich 10798991001
SuRE/Cut Buffer H Roche-Sigma-Aldrich 11417991001
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity  Invitrogen 11304011
10 mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 or equivalent
PCR grade water general lab supplier
96-well thermal cycler (with heated lid) general lab supplier
linker primer general lab supplier 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade)
MLV-3’ LTR primer general lab supplier 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade)
linker nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer 454 general lab supplier 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
linker nested primer Illumina general lab supplier 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE)
MLV-3’ LTR nested primer Illumina general lab supplier 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE)
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 general lab supplier
Ethanol (absolute) for molecular biology Sigma-Aldrich E7023 or equivalent
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) Invitrogen K4500-01
QIAquick Gel Extraction kit QIAGEN 28704
Agarose Sigma-Aldrich A9539 or equivalent
Ethidium bromide  Sigma-Aldrich E1510 or equivalent
100 bp DNA ladder Invitrogen 15628019 or equivalent
6x Loading Buffer ThermoScientific R0611 or equivalent
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer ThermoScientific ND-2000
Nextera XT Index kit Illumina FC-131-1001 or FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix  KAPA Biosystems KK2601
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes Invitrogen 12321D or equivalent
Agencourt AMPure XP 60 ml kit Beckman Coulter Genomics A63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 general lab supplier
Agilent 2200 TapeStation system Agilent Technologies G2964AA or equivalent
D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5582 or equivalent
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583 or equivalent
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) KAPA Biosystems KK4835
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4329003
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade general lab supplier
HT1 (Hybridization Buffer) Illumina  Provided in the MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) Illumina MS-102-3001
MiSeq System Illumina SY-410-1003
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

Tags

Genetica Moloney leukemie virus Integratie sites Virus-gastheer interactie Cis-regulerende elementen Epigenetische regulering Celidentiteit Retrovirale scan Massieve sequencing
Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romano, O., Cifola, I., Poletti, V., More

Romano, O., Cifola, I., Poletti, V., Severgnini, M., Peano, C., De Bellis, G., Mavilio, F., Miccio, A. Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions. J. Vis. Exp. (123), e55919, doi:10.3791/55919 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter