Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la cartographie génomique des sites d'intégration des vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney dans les cellules humaines.
Abstract
Les vecteurs rétroviraux à base de virus de la leucémie murine Moloney (MLV) s'intègrent principalement dans les agents améliorant et promoteurs acétylés. Pour cette raison, les sites d'intégration mLV peuvent être utilisés comme marqueurs fonctionnels des éléments réglementaires actifs. Ici, nous présentons un outil de balayage rétroviral, qui permet l'identification du génome des amplificateurs et des promoteurs spécifiques de cellules. En bref, la population de cellules cibles est transduit avec un vecteur dérivé de mLV et l'ADN génomique est digéré avec une enzyme de restriction souvent coupante. Après ligature de fragments génomiques avec un lieur d'ADN compatible, la réaction en chaîne par polymérase (LM-PCR) médiée par un lieur permet l'amplification des jonctions génome virus-hôte. Un séquençage massif des amplicons est utilisé pour définir le profil d'intégration de mLV en fonction du génome. Enfin, des grappes d'intégrations récurrentes sont définies pour identifier les régions réglementaires spécifiques aux cellules, responsables de l'activation des programmes de transcription spécifiques aux cellules.
p. Ex. Cellules souches somatiques) qui manquent de marqueurs robustes pour l'isolement prospectif.
Introduction
L'identité cellulaire est déterminée par l'expression d'ensembles spécifiques de gènes. Le rôle des éléments cis-régulateurs, tels que les promoteurs et les amplificateurs, est crucial pour l'activation de programmes de transcription spécifiques au type cellulaire. Ces régions réglementaires sont caractérisées par des caractéristiques spécifiques de la chromatine, telles que les modifications particulières des histones, les facteurs de transcription et la liaison des co-facteurs, et l'accessibilité à la chromatine, qui ont été largement utilisés pour leur identification à l'échelle du génome dans plusieurs types de cellules 1 , 2 , 3 . En particulier, le profil génomique de l'acétylation de l'histone H3 lysine 27 (H3K27ac) est couramment utilisé pour définir des promoteurs actifs, des amplificateurs et des super-amplificateurs 4 , 5 , 6 .
Le virus de la leucémie murine Moloney (MLV) est un retrovirus gamma largement utilisé pour le gèneTransfert dans des cellules de mammifères. Après avoir infecté une cellule cible, le génome d'ARN rétroviral est rétro-transcrit dans une molécule d'ADN double brin qui se lie aux protéines virales et cellulaires pour assembler le complexe de pré-intégration (PIC). La PIC entre dans le noyau et lie la chromatine de la cellule hôte. Ici, l'intégrase virale, un composant clé PIC, sert à faciliter l'intégration de l'ADN proviral dans le génome de la cellule hôte. L'intégration de mLV dans l'ADN génomique n'est pas aléatoire, mais se produit dans des éléments actifs régulateurs cis, tels que des promoteurs et des amplificateurs, de manière spécifique aux cellules 7 , 8 , 9 , 10 . Ce profil d'intégration particulier est médié par une interaction directe entre l'intégrase de mLV et les protéines de domaine de bromodomane cellulaire et de domaine extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . Les protéines BET (BRD2, BRD3 etBRD4) agissent comme un pont entre la chromatine de l'hôte et la PIC de mLV: à travers leurs bromodomains, ils reconnaissent des régions régulatrices cis cisées, fortement acceptées, tandis que le domaine extraterminal interagit avec l'intégrase de mLV 11 , 12 , 13 .
Ici, nous décrivons le balayage rétroviral, un nouvel outil pour mapper les régions actives cis-régulatrices en fonction des propriétés d'intégration de mLV. Brièvement, les cellules sont transduites avec un vecteur rétroviral dérivé de mLV exprimant le gène rapporteur de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). Après l'extraction de l'ADN génomique, les jonctions entre la répétition terminale de 3 '(LTR) du vecteur mLV et l'ADN génomique sont amplifiées par une PCR médiatisée (LM-PCR) et séquencées massivement. Les sites d'intégration mLV sont mappés au génome humain et les régions génomiques hautement ciblées par mLV sont définies comme des grappes de sites d'intégration mLV.
Analyse rétroviraleA été utilisé pour définir des éléments régulateurs actifs spécifiques de cellules dans plusieurs cellules primaires humaines 14 , 15 . Les grappes de mLV ont été co-mappées avec des promoteurs et des amplificateurs définis de manière épigénétique, dont la plupart abritaient des marques d'histones actives, telles que H3K27ac, et étaient spécifiques de cellules. Le balayage rétroviral permet l'identification à l'échelle du génome des éléments de régulation de l'ADN dans les populations de cellules prospectivement purifiées 7 , 14 ainsi que dans les populations de cellules rétrospectivement définies, telles que les cellules souches de kératinocytes, qui ne présentent pas de marqueurs efficaces pour l'isolement prospectif 15 .
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Protocol
1. Transduction MLV des cellules humaines
- Isoler les cellules cibles et les transduire avec un vecteur retroviral dérivé de mLV hébergeant le gène rapporteur eGFP et pseudotypé avec le virus de la stomatite vésiculaire G (VSV-G) ou la glycoprotéine de l'enveloppe amphotrope 16 .
- Gardez les cellules transduites par défaut comme un contrôle négatif pour les analyses suivantes. Puisque les vecteurs rétroviraux à base de mLV peuvent transduire efficacement les cellules en division, culturez la population de cellules cibles dans des conditions qui stimulent la division cellulaire. Les conditions de transduction doivent être spécifiquement optimisées pour chaque type de cellule étudié. La croissance cellulaire et les conditions de transduction pour les progéniteurs hématopoïétiques humains, les lymphocytes T et les cellules épidermiques sont décrites dans les références 7, 14, 15 et 17.
- 48 h après la transduction, ré-endiguer 100 000 cellules dans 300 μL de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2% de sérum bovin fœtal et mesurer l'expression de l'eGFP par fFaible analyse cytométrique (laser d'excitation de 488 nm). Utiliser des cellules transduites simulées comme témoins négatifs. Pour une récupération optimale du site d'intégration, purifiez les cellules GFP + par le tri de cellules activées par fluorescence (FACS).
- Recueillir 0,5 à 5 millions de cellules pour la préparation d'ADN génomique. Une période de culture plus longue (> 7 jours) est préférée pour diluer le provirus non intégré et nécessaire lors de l'analyse de la descendance à long terme de cellules souches de bonne foi (voir la section de discussion et la référence 15 ). Les granulés cellulaires peuvent être congelés instantanément et stockés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.
2. Amplification des sites d'intégration mLV par PCR par médiateur (LM-PCR)
- Préparation de l'ADN génomique (ADN gDNA)
- Extraire gDNA en utilisant un kit d'extraction d'ADN à base de colonne et suivre le protocole pour les cellules cultivées, selon les instructions du fabricant.
- Digestion enzymatique de restrictionsur
- Mettre en place 4 digestion par enzyme de restriction par échantillon dans des tubes de 1,5 mL. Digérer 0,1 à 1 μg d'ADNg dans chaque tube en ajoutant 1 μL de Tru9I (10U) et 1 μL de tampon M dans un volume final de 10 μL. Incuber les réactions à 65 ° C pendant 6 h ou pendant la nuit.
- Ajouter à chaque réaction 1 μl de PstI (10U), 1 μL de tampon H et 8 μL d'eau. Incuber les réactions à 37 ° C pendant 6 h ou pendant la nuit. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Ligature des ligands
- Préparer une solution mère linker Tru9I à 100 μM dans un tube de 1,5 ml en mélangeant les oligonucleotides de brin plus de fil et linker moins à une concentration de 100 μM. Mettez le tube dans une eau réglée à 100 ° C et laissez-le refroidir à température ambiante. La solution mère linker Tru9I peut être stockée à -20 ° C jusqu'à son utilisation.
- Mettre en place 8 réactions de ligature de linker dans des tubes de 1,5 mL. Pour chaque réaction, ajoutez le composant suivantS à 10 μL de digestion enzymatique de restriction: 1,4 μL de 10X T4 DNA Ligase Reaction buffer, 1 μL de 10 μM de liaison Tru9I, 1 μL (2 000 U) d'ADN ligase T4 et 0,6 μL d'eau. Incuber à 16 ° C pendant 3 à 6 h. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Première PCR
- Mettre en place 48 réactions PCR (6 réactions de chaque tube de ligature) dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les réactifs suivants à 2 μL de réaction de ligature: 5 μL de tampon de PCR 10X, 2 μL de sulfate de magnésium 50 mM, 1 μL de mélange de désoxynucléotide 10 mM (dNTP), 1 μL d'amorce de liaison 10 μM 1 ΜL d'amorce LTR 10 μM mLV-3 ', 0,3 μL (1,5 U) de Taq DNA Polymerase et 37,7 μl d'eau. Les séquences d'amorces sont fournies dans le tableau 1.
- Effectuer la réaction de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 2 min; 25 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 °; C pendant 5 min; Maintenez à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Deuxième PCR
- Mettre en place 48 réactions PCR (1 de chaque tube "première PCR") dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les composants suivants à 2 μl de la première réaction de PCR: 5 μL de tampon de PCR 10X, 2 μL de sulfate de magnésium 50 mM, 1 μl de mélange de dNTP 10 mM, 1 μL d'amorce imbriquée liant 10 μM, 1 ΜL d'amorce imbriquée LTR de 10 μM mLV-3 ', 0,3 μl de Taq DNA Polymerase (1,5 U) et 37,7 μL d'eau. Utilisez des amorces imbriquées conçues pour la stratégie de séquençage massif spécifique choisie: (i) amorce imbriquée et amorce imbriquée LTR de mLV-3 compatible avec la plate-forme Illumina; (Ii) l'amorce imbriquée et l'amorce imbriquée LTR de mLV-3 'compatible avec la plate-forme Roche. Les séquences d'amorces sont listées dans le tableau 1 .
- Effectuer la réaction de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 2 min; 25Cycles de 95 ° C pendant 15 s, 58 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 ° C pendant 5 min; Maintenez à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Associez les 48 réactions de PCR imbriquées dans un tube de 15 mL (volume final de ~ 2,4 mL). Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Déterminer la présence et la taille des produits LM-PCR par électrophorèse sur gel d'agarose.
- Ajouter 4 μL de tampon de chargement à 20 μL de produits LM-PCR et charger l'échantillon sur un gel d'agarose à 1%, avec une échelle d'ADN de 100 pb. Faire fonctionner le gel à 5 V / cm pendant 30 à 60 min et visualiser les produits de PCR par coloration au bromure d'éthidium.
- Effectuer une réaction LM-PCR à partir de l'échantillon transduit comme un contrôle négatif.
- Précipiter les amplicons en ajoutant 0,1 volume de solution d'acétate de sodium (3 M, pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol à 100%. Mélanger et congeler à -80 ° C pendant 20 min.
- Rotation à fuVitesse dans une microcentrifugeuse standard à 4 ° C pendant 20 min. Jeter le surnageant et laver la pastille à 70% d'éthanol. Faire tourner à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse standard à 4 ° C pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et sécher à l'air la pastille. Ajouter 200 μl d'eau de qualité PCR et ré-endiguer l'ADN. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
- Ajouter 20 μL de tampon de chargement à 100 μL des produits LM-PCR et charger l'échantillon sur un gel d'agarose à 1%, conjointement avec une échelle d'ADN de 100 pb.
- Faire fonctionner le gel à 5 V / cm pendant 30 à 60 min et couper la partie du gel contenant des amplicons de 150 à 500 pb.
- Purifier les produits LM-PCR avec un kit d'extraction de gel à base de colonne et mesurer la concentration en utilisant un spectrophotomètre UV.
- Utilisez 1 μL de bibliothèque pour évaluer la longueur des produits LM-PCR à l'aide d'un instrument de bioanalyseur, selon les instructions du fabricant.
- Utiliser 20 ng des produits de LM-PCR purifiés et les cloner dans le vecteur pCR2.1-TOPO, conformément aux instructions du fabricant.
- Effectuer des réactions de séquençage à l'aide de l'amorce M13 Universal, suivie d'une cartographie génomique des séquences résultantes, pour révéler la présence des jonctions virales-génomes (y compris l'amorce imbriquée LTR de mLV-3) dans> 50% des clones pour identifier les échantillons appropriés Pour un séquençage massif. Exemple de jonction du génome viral:
L'amorçage imbriqué LTR MLV-3 '454 et l'amorce imbriquée lieur 454 ( tableau 1 ) sont indiqués en gras et l'extrémité 3' de la LTR virale en italique. La séquence génomique humaine est mise en évidence en texte rouge (chr10: 6439408-6439509, hg19).
3. Séquençage massif des sites d'intégration mLV
REMARQUE: produit LM-PCRLes ucts peuvent être séquencés à l'aide de plates-formes commerciales (en choisissant la paire d'amorces imbriquées appropriée dans la deuxième réaction de PCR, voir la sous-section 2.5.1). Pour le séquençage par la plate-forme pyrosequencing Roche GS-FLX, reportez-vous aux documents précédents 7 , 14 , 15 . Dans cette section, un protocole nouvellement optimisé pour la plate-forme de séquençage Illumina est décrit.
- Préparation de la bibliothèque
- Mettre en place 1 réaction de PCR d'indexation par échantillon dans des tubes de 0,2 ml. Pour chaque PCR, ajouter les réactifs suivants à 5 μL (150-170 ng) de produit LM-PCR purifié: 5 μL d'Primer Index 1, 5 μL d'Index Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix et 10 μL de PCR- Eau de qualité. Utilisez une combinaison d'index différente pour chaque échantillon.
- Effectuer des réactions de PCR dans un thermocycleur avec couvercle chauffé, comme suit: 95 ° C pendant 3 min; 8 cycles de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s; 72 ° C pendant 5 mdans; Maintenez à 4 ° C.
- Purifier les produits de PCR en utilisant un protocole d'isolement de perles réversibles en phase solide (SPRI): dans de nouveaux tubes de 1,5 mL, ajouter 56 μL de perles à chaque échantillon et procéder conformément aux instructions du fabricant. Eluir dans 25 μL de Tris-HCl 10 mM. Les bibliothèques peuvent être stockées à -20 ° C jusqu'à leur utilisation.
- Vérification de la bibliothèque
- Utilisez 1 μl d'échantillon pour évaluer la taille de la bibliothèque en utilisant un instrument de bioanalyseur.
- Utiliser 1 μl d'échantillon pour quantifier la molarité de la bibliothèque en utilisant un test de PCR en temps réel à base de fluorescence, conformément aux instructions du fabricant.
- Dilution et séquençage de la bibliothèque
- Diluer les bibliothèques à 10 nM en utilisant Tris-HCl 10 mM. Pour regrouper des bibliothèques, transférez 5 μL de chaque banque diluée dans un nouveau tube de 1,5 ml puis diluez le bassin à 4 nM dans du Tris-HCl 10 mM.
- Mélanger 5 μL de pool dilué avec 5 μL de NaOH 0,2 N dans un nouveau 1,5 mL, vortex brièvement, centrifuger et incuber pendant 5 min à température ambiante pour dénaturer les bibliothèques.
- Mettez des tubes sur de la glace et ajoutez 990 μl de tampon d'hybridation pré-refroidi (HT1). Aliquoter 300 μL de pool dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 300 μL de HT1 pré-refroidi pour obtenir un pool de bibliothèque finale de 10 pM.
- En parallèle, mélanger 2 μL de la banque de contrôle PhiX (10 nM) avec 3 μL de Tris-HCl 10 mM dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 5 μL de NaOH 0,2 N, vortex brièvement, centrifuger et incuber pendant 5 min à température ambiante pour dénaturer le PhiX dilué. Mettre le tube sur de la glace et ajouter 990 μl de HT1 pré-refroidi.
- Aliquoter 300 μL de PhiX dénaturé dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 300 μL de HT1 pré-refroidi pour obtenir un PhiX final de 10 pM.
- Dans un nouveau tube de 1,5 ml, mélanger 510 μL de pool de bibliothèque dénaturé avec 90 μL de bibliothèque PhiX dénaturée, obtenant ainsi un pool final de 10 pM avec 15% de contrôle PhiX.
- Pipeter ces 600 μl d'échantillonVolume dans le réservoir Load Sample de la cartouche de réactif de séquençage décongelée et procédez immédiatement pour effectuer une exécution de 150 cycles à lecture unique.
REMARQUE: Les réactifs critiques et les séquences d'amorces requises pour ce protocole sont listées dans le tableau 1 .
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Representative Results
Flux de travail de la procédure de balayage rétroviral
Le flux de travail de la procédure de balayage rétroviral est schématisé à la figure 1 . La population de cellules cibles est purifiée et transduit avec un vecteur rétroviral dérivé de mLV exprimant un gène rapporteur d'eGFP. Le transgène est flanqué par les deux répétitions terminales longues identiques (LTR 5 'et 3'), assurant la synthèse, la transcription inverse et l'intégration du génome viral dans l'ADN hôte. L'efficacité de la transduction est évaluée par l'analyse FACS de l'expression eGFP. La population de cellules contenant une proportion élevée (> 30%) de cellules transduites par mLV est amplifiée et ensuite lysée pour extraire l'ADN génomique contenant les cassettes virales mlV intégrées. L'ADN génomique est digéré et ligaturé avec un liant compatible et les jonctions entre les LTR virales 3 'et le génome hôte sont amplifiées par LM-PCR. VirLes jonctions génomiques us-host sont ensuite séquencées massivement à l'aide des plates-formes Roche ou Illumina. Enfin, les sites d'intégration mLV sont mappés au génome humain pour définir des grappes génomiques de sites d'insertion récurrents.
Amplification des sites d'intégration mLV par LM-PCR
La LM-PCR est schématisée à la figure 2 . L'ADN génomique est extrait de cellules transduites par mLV et digéré avec l'enzyme de restriction Tru9I, qui coupe fréquemment le génome humain, générant des fragments d'une longueur médiane de 70 pb. Une deuxième enzyme de restriction (PstI) est utilisée pour empêcher l'amplification de fragments de LTR internes 5 'intégrés et non intégrés. Le lieur à double brin Tru9I est ensuite ligaturé aux fragments génomiques et la LM-PCR est réalisée avec des amorces spécifiques au lieur et La LTR 3 'pour amplifier les jonctions du génome du virus et de l'hôte. La PCR ancrée peut être effectuée en utilisant priCompatibles avec les plates-formes de séquençage Roche ou Illumina.
Analyse des amplicons de jonction du génome du virus et de l'hôte
Dans l'expérience représentée à la figure 3 , nous avons purifié les progéniteurs / précurseurs myéloïdes CD34 - CD13 + (MPP) et les transduisons avec un rétroviral dérivé de mLV exprimant le gène rapporteur d'eGFP. Plus de 60% des cellules MPP ont exprimé eGFP 48 h après la transduction (données non présentées). 15 jours après la transduction, nous avons recueilli les cellules, extrait l'ADNc et amplifié les jonctions génome virus-hôte, comme décrit ci-dessus. Une aliquote des produits de LM-PCR groupés a été chargée sur un gel d'agarose à 1% pour vérifier la présence et la taille des amplicons. Nous avons visualisé avec succès un frottis d'ADN correspondant aux produits LM-PCR de différentes tailles, allant de 150 à 500 pb ( figure 3A ). Les amplicons étaient alorsConcentré par précipitation d'ADN et chargé sur un gel d'agarose à 1%. Les produits LM-PCR ont été purifiés par gel et fonctionnent sur un système de bioanalyseur, confirmant les tailles d'amplicon attendues (entre 150 et 500 pb, figure 3B ).
Cartographie des intégrations de mLV dans des régions réglementaires actives et spécifiques aux cellules
Dans l'expérience rapportée à la figure 4 , les cellules souches / progénitrices hématopoïétiques (HSPC), les progéniteurs / précurseurs érythroïdes (EPP) et les progéniteurs / précurseurs myéloïdes (MPP) ont été transduites avec un vecteur retroviral dérivé de mLV. Ces résultats ont été obtenus en procédant et en séquençant des échantillons dérivés séparément de différents types de cellules, afin d'éviter toute contamination potentielle / collisions 18 , 19 . Les lectures de séquences brutes générées par un séquençage massif ont été traitées par une bioinformatique automatiséePipeline pour éliminer les séquences virales et de liaison. Ensuite, des séquences uniques d'au moins 20 pb ont été cartographiées sur le génome humain en utilisant Blat 17 . Les alignements bruts ont été filtrés, ce qui exige que le match commence dans les 3 premiers nucléotides, les correspondances univocales et un minimum de 95% d'identité. Les grappes d'intégrations récurrentes de mLV ont été définies par une comparaison statistique avec un ensemble de données de séquences génomiques aléatoires, générées par extraction aléatoire de positions génomiques du génome humain avec un motif de restriction Tru91 à une distance compatible avec la plate-forme de séquençage. Les séquences de contrôle ont ensuite été traitées par le même pipeline de mappage et de filtrage utilisé pour les séquences d'intégration, pour générer un ensemble aléatoire de sites uniques. Pour définir les grappes de mLV, nous avons appliqué l'algorithme de regroupement DBSCAN 19 , en comparant la distribution des intégrations de mLV consécutives à celle d'un nombre égal de sites aléatoires pour identifier des régions d'intégrations fortement clusterisées,Éléments réglementaires spécifiques aux cellules 7 , 14 , 15 . Afin d'éviter la génération de fausses grappes, des extractions multiples de l'ensemble de données de contrôle aléatoire ont été effectuées. Nous avons cartographié par LM-PCR et pyrosequencing 32.574, 27.546 et 36.358 mLV sites d'intégration dans HSPC, EPP et MPP, respectivement. Des grappes d'intégrations de mLV récurrentes co-cartographiées avec des amplificateurs et des promoteurs acétylés ( Figure 4A ). La plupart des régions régulatrices visées par mLV étaient spécifiques aux cellules, telles que: (i) le promoteur du gène SPINK2 spécifique de HSPC ( figure 4B ); (Ii) la région de contrôle Locus contenant des amplificateurs puissants des gènes de globine ß-like spécifiques à l'érythroid ( figure 4C ); (Iii) les amplificateurs situés en amont du gène LYZ spécifique au MPP ( Figure 4D ). Enfin, nous avons utilisé des tests de luciférase pour validerUn sous-ensemble d'amplificateurs potentiels ciblés par cellules particulaires spécifiques aux cellules dans EPP et MPP ( figure 4E ).
Figure 1: Un schéma général de la procédure de cartographie du site d'intégration rétrovirale. Les cellules cibles sont transduites avec un vecteur rétroviral à base de mLV contenant une cassette eGFP. L'ADN génomique obtenu à partir de cellules transduites est digéré avec Tru9I et ligaturé avec un liant à double brin Tru9I compatible. Les sites d'intégration mLV ont été amplifiés par LM-PCR imbriquée et la bibliothèque de jonctions génome virus-hôte peut être séquentiellement séquentiellement en utilisant des plates-formes Illumina ou Roche. Les lectures résultantes ont été mappées au génome humain pour définir des grappes d'intégrations récurrentes de mLV. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. </ P>
Figure 2: Amplification des jonctions du génome virus-hôte par LM-PCR. L'ADN génomique (gDNA) contenant le provirus mLV intégré est digéré avec des enzymes de restriction Tru9I et PstI et ligaturé avec un liant Tru9I compatible. La PCR ancrée est réalisée à l'aide d'amorces spécifiques à la LTR et au linker. Les sites de restriction Tru9I et PstI dans le génome viral et dans le génome humain sont indiqués. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Analyse des amplicons LM-PCR. ( A ) Les produits LM-PCR (lane +) ont été soumis à un gel d'agarose à 1% et ont été visualisésPar coloration au bromure d'éthidium. Un échantillon sans modèle a servi d'échantillon de contrôle négatif, où seules les amorces de PCR ont été visualisées (voie -). ( B ) Après la purification du gel, la taille du produit LM-PCR a été vérifiée par électrophorèse microcapillaire. La taille de l'échantillon (bp) et l'intensité de fluorescence (FU) sont indiquées respectivement sur les axes x et y de l'électrophérogramme. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Cartographie de l'intégration de mLV dans des régions régulatrices définies épigénétiquement. ( A ) Nous avons défini 3 488, 2 989 et 4 103 clusters de sites d'intégration récurrents mLV dans HSPC, EPP et MPP, respectivement. Dans chaque population cellulaire,> 95% des grappes de mLV se chevauchent avec une amélioration définie par voie épigénétiqueLes promoteurs et les promoteurs. ( B , C et D ) Les régions ciblées par mlV spécifiques de cellules étaient fortement acétylées et associées à une expression spécifique de cellules du gène ciblé ( SPINK2 , HBB et LYZ , exprimées presque exclusivement dans HSPC, EPP et MPP, respectivement, comme déterminé Par analyse Cap de l'expression génétique). Les intégrations uniques de mLV sont représentées par de petites barres. TPM indique Tag Per Million. ( E ) Des amplificateurs ciblés potentiellement spécifiques de cellules spécifiques de cellules dans EPP et MPP. La figure 4 est adaptée à partir de la référence 14 . Nous avons reçu l'autorisation de réutiliser ce chiffre sous la licence creative commons. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole pour la cartographie génomique des sites d'intégration de mLV, un rétrovirus qui cible les régions de chromatine, marquées épigénétiquement en tant que promoteurs et amplificateurs actifs. Les étapes critiques et / ou les limitations du protocole comprennent: (i) la transduction de mLV de la population de cellules cibles; (Ii) l'amplification des jonctions virus-hôte par LM-PCR; (Iii) récupération d'une fraction élevée des sites d'intégration. Les vecteurs rétroviraux à base de mLV transforment efficacement les cellules séparatrices. La faible efficacité de la transduction de cellules non divisantes (p. Ex. Cellules neuronales post-mitotiques) est une limitation potentielle de cette technique. Cependant, il peut être surmonté par le tri cellulaire de la population transdutée en fonction de l'expression du gène rapporteur ( p. Ex . EGFP). La génération d'amplicons relativement courts par LM-PCR (150 à 500 pb) est obligatoire pour générer une bibliothèque d'amplicons compatible avec les stratégies de séquençage massif actuellement utilisées et pour permettre une génération complèteUne analyse globale des sites d'intégration mLV. À titre d'exemple, l'amplification de produits de LM-PCR de plus de 500 pb peut résulter soit d'une digestion partielle en ADN génomique, soit d'une ligature intra-ligature de fragments génomiques digérés par Tru9I, comme l'ont évalué le clonage de fusée de cames d'amplicons LM-PCR (données non représentées). Dans le premier cas, le problème peut être résolu en optimisant davantage les conditions de digestion de l'ADN génomique, alors que, dans ce dernier cas, le séquençage massif réussi des sites d'intégration mLV peut être réalisé grâce à une purification par gel des amplicons entre 150 et 500 pb. Enfin, l'utilisation d'enzymes de restriction pour couper l'ADN génomique peut conduire à l'amplification et à la détection préférentielles des sites d'intégration qui se situent à proximité d'un site de restriction. Le pourcentage de sites d'intégration que l'enzyme de restriction Tru9I peut récupérer est estimé à ~ 50%. Ainsi, cette technique peut être encore optimisée pour améliorer la récupération du site d'intégration en utilisant des enzymes de restriction multiples ou en effectuant une analyse de l'ADN aléatoireNg par sonication 20 , 21 .
Récemment, nous avons optimisé le séquençage des sites d'intégration virale en utilisant la plate-forme Illumina largement utilisée, tel que détaillé dans cet article. Cette approche de séquençage permet de générer un nombre plus élevé de lectures par exécution par rapport à la plate-forme Roche, augmentant considérablement le nombre de sites d'intégration récupérés à partir d'une seule expérience, réduisant ainsi globalement le temps et les coûts.
L'identification génomique des régions régulatrices spécifiques des cellules nécessite la cartographie de une à trois modifications d'histones par ChIP-seq 6 (mono- et tri-méthylation de l'histone H3 lysine 4 pour identifier les amplificateurs et les promoteurs et H3K27ac pour distinguer entre actif et inactif Éléments réglementaires) 4 , 5 , 6 et une comparaison systématique de différents types de cellules pour définirÉléments à effet cis actifs exclusivement dans une population cellulaire déterminée. Nous avons cartographié les sites d'intégration de mLV dans des populations de cellules cibles prospectivement isolées, telles que des progéniteurs hématopoïétiques multipotents et leur descendance érythroïde et myéloïde confirmée 14 , des cellules souches embryonnaires, des cellules souches neuroépithéliales et des kératinocytes différenciés 15 . Le balayage rétroviral a permis la définition du génome des éléments réglementaires propres aux cellules dans chaque population cellulaire analysée, ce qui rend les études comparatives du génome à l'échelle générale, pas strictement nécessaires. Il est important de noter que cet outil peut être utilisé pour l'identification d'éléments régulateurs actifs dans des populations de cellules rares ( p. Ex. Cellules souches somatiques), qui ne présentent pas de marqueurs robustes pour l'isolement prospectif et ne peuvent être analysés par l'analyse par ChIP-seq des modifications des histones 15 . Dans ces populations cellulaires, l'intégration de mLV est un marqueur génétique permanent des régions réglementaires actives, ce qui permetUne identification rétrospective dans la descendance cellulaire plus abondante in vitro et in vivo. À titre d'exemple, nous avons utilisé avec succès des grappes d'intégration mLV comme marqueurs de substitution de promoteurs et d'amplificateurs dans une population de cellules souches de kératinocytes rétrospectivement identifiées (KSC). Nous avons transgressé une culture de kératinocytes dérivée de prépuce contenant des KSC avec un vecteur mLV, puis on a passé ces cellules pour des doublages de 35 cellules pour enrichir la descendance de KSC, ainsi définies par leur capacité à maintenir la culture pour ce nombre de Passages. Dans ce cas, les intégrations de mLV ont définitivement marqué les régions réglementaires actives dans la population KSC transductrice originale 15 . Les études futures viseront à identifier de manière générale des éléments régulateurs spécifiques à la cellule dans un plus grand nombre de populations de cellules souches humaines.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), du Ministère italien de l'éducation, des universités et de la recherche (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), le ministère italien de la Santé (Jeunes chercheurs appelle 2011 GR-2011-02352026) et la Fondation Imagine Institute (Paris, France).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
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