Summary
Здесь мы опишем протокол для общего геномирования сайтов интеграции вирусных ретровирусных векторов мышиной лейкемии Moloney в клетках человека.
Abstract
Вирусные ретровирусные векторы вируса мышиной лейкемии Moloney (MLV) преимущественно интегрируются в ацетилированные энхансеры и промоторы. По этой причине сайты интеграции mlV могут использоваться как функциональные маркеры активных регуляторных элементов. Здесь мы представляем ретровирусный сканирующий инструмент, который позволяет идентифицировать клеточные энхансеры и промоторы по всему геному. Вкратце, популяция клеток-мишеней трансдуцирована вектором, полученным из mlV, и геномную ДНК расщепляют часто режущим ферментом рестрикции. После лигирования геномных фрагментов с совместимым ДНК-линкером, линкер-опосредованная полимеразная цепная реакция (LM-PCR) позволяет амплифицировать геномные соединения вирус-хозяин. Массивное секвенирование ампликонов используется для определения профиля интеграции mLV в геноме. Наконец, кластеры рекуррентной интеграции определены для идентификации специфичных к клеткам регуляторных областей, ответственных за активацию программ транскрипции, специфичных для клеточного типа.
например, соматических стволовых клеток), у которых отсутствуют надежные маркеры для предполагаемой изоляции.
Introduction
Идентичность клетки определяется экспрессией определенных наборов генов. Роль цис-регуляторных элементов, таких как промоторы и энхансеры, имеет решающее значение для активации транскрипционных программ клеточного типа. Эти регуляторные области характеризуются специфическими хроматинными особенностями, такими как специфические модификации гистонов, факторы транскрипции и связывание кофакторов, а также доступность хроматина, которые широко используются для их идентификации по всему геному в нескольких типах клеток 1 , 2 , 3 . В частности, широкоформатный профиль ацетилирования гистона Н3-лизина 27 (H3K27ac) обычно используется для определения активных промоторов, энхансеров и суперусилителей 4 , 5 , 6 .
Вирус мышиной лейкемии Молони (MLV) является гамма-ретровирусом, который широко используется для генаПеренос в клетках млекопитающих. После заражения клетки-мишени ретровирусный РНК-геном ретро-транскрибируется в двухцепочечной молекуле ДНК, которая связывает вирусные и клеточные белки, чтобы собрать преинтегрирующий комплекс (PIC). ПИК входит в ядро и связывает хроматин клетки-хозяина. Здесь, вирусная интеграза, ключевой компонент ПОС, опосредует интеграцию провирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Интеграция mLV в геномной ДНК не является случайной, но происходит в активных цис-регуляторных элементах, таких как промоторы и энхансеры, клеточно-специфическим способом 7 , 8 , 9 , 10 . Этот специфический профиль интеграции опосредуется прямым взаимодействием между mLV интегразой и клеточными бромдоменными и внетерминальными доменами (BET) белками 11 , 12 , 13 . BET белки (BRD2, BRD3 иBRD4) действуют как мостик между хроматином хозяина и mLV PIC: через их bromodomains они распознают высокоацетилированные цис-регуляторные области, в то время как внетерминальный домен взаимодействует с mLV интегразой 11 , 12 , 13 .
Здесь мы опишем ретровирусное сканирование, новый инструмент для отображения активных цис-регуляторных областей на основе интеграционных свойств mLV. Вкратце, клетки трансдуцированы с помощью полученного из MLV ретровирусного вектора, экспрессирующего репортерный ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP). После экстракции геномной ДНК соединения между длинным 3'-концевым повтором (LTR) вектора mLV и геномной ДНК амплифицируют с помощью линкер-опосредованной ПЦР (LM-PCR) и последовательно секвенируют. Сайты интеграции mLV отображаются на геном человека, а геномные области с высокой концентрацией митохондрий определяются как кластеры сайтов интеграции mLV.
Ретровирусное сканированиеNing был использован для определения клеточных специфических активных регуляторных элементов в нескольких первичных клетках человека 14 , 15 . MlV кластеров, совместно отображаемых с эпигенетически определенными промоторами и энхансерами, большинство из которых содержат активные гистоновые метки, такие как H3K27ac, и являются клеточно-специфичными. Ретровирусное сканирование позволяет проводить идентификацию регуляторных элементов ДНК в проспективно очищенных клеточных популяциях 7 , 14 , а также в ретроспективно определенных клеточных популяциях, таких как стволовые клетки кератиноцитов, которые не обладают эффективными маркерами для предполагаемой изоляции 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансдукция MLV клеток человека
- Изолируйте клетки-мишени и трансдуцируйте их с помощью ретровирусного вектора, содержащего MLV, несущего репортерный ген eGFP и псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита G (VSV-G) или гликопротеина с амфотропной оболочкой 16 .
- Держите фиктивные трансдуцированные клетки как отрицательный контроль для следующих анализов. Поскольку основанные на млV ретровирусные векторы могут эффективно трансформировать делящиеся клетки, культивировать популяцию клеток-мишеней в условиях, которые стимулируют деление клеток. Условия трансдукции должны быть специально оптимизированы для каждого изучаемого типа клеток. Рост клеток и условия трансдукции для гемопоэтических предшественников человека, Т-клеток и эпидермальных клеток описаны в литературе 7, 14, 15 и 17.
- Через 48 часов после трансдукции ресуспендируют 100000 клеток в 300 мкл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), содержащего 2% фетальную бычью сыворотку, и измеряют экспрессию eGFP с помощью fНизкий цитометрический анализ (лазер возбуждения 488 нм). Используйте ложно-трансдуцированные клетки как отрицательный контроль. Для оптимального поиска сайтов интеграции очистите клетки GFP + с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
- Соберите от 0,5 до 5 миллионов клеток для подготовки геномной ДНК. Более длительный период культивирования (> 7 дней) предпочтителен для разбавления неинтегрированного провируса и необходим при анализе долгосрочного потомства добросовестных стволовых клеток (см. Раздел « Обсуждение» и ссылка 15 ). Осадки клеток можно замораживать и хранить при -80 ° C до использования.
2. Амплификация сайтов интеграции mLV с помощью линкер-опосредованной ПЦР (LM-PCR)
- Получение геномной ДНК (гДНК)
- Экстрагируют gDNA, используя набор для экстракции ДНК на колонке, и следуют протоколу для культивируемых клеток в соответствии с инструкциями производителя.
- Рестрикционный фермент digestiна
- Установите 4 переваривания фермента рестрикции на образец в пробирках по 1,5 мл. Дайджест 0,1-1 мкг гДНК в каждой пробирке добавлением 1 мкл Tru9I (10U) и 1 мкл буфера М в конечном объеме 10 мкл. Инкубируйте реакции при 65 ° С в течение 6 ч или в течение ночи.
- Добавьте к каждой реакции 1 мкл PstI (10U), 1 мкл буфера H и 8 мкл воды. Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 6 ч или в течение ночи. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
- Лигирование линкера
- Подготовьте 100 мкМ основной раствор линкера Tru9I в 1,5-миллилитровой пробирке, смешав линкер плюс нить и линкер минус олигонуклеотиды нитей при концентрации 100 мкМ. Поместите трубку в воду, установленную при температуре 100 ° C, и дайте ей остыть при комнатной температуре. Массовый раствор Tru9I можно хранить при -20 ° C до использования.
- Настроить 8 линкеров лигирования реакций в 1,5 мл пробирки. Для каждой реакции добавьте следующий компонентС до 10 мкл ферментативного расщепления рестриктазой: 1,4 мкл 10X Т4 ДНК-лигазы, буфера реакции, 1 мкл 10 мкМ линкера Tru9I, 1 мкл (2000 ед.) ДНК-лигазы Т4 и 0,6 мкл воды. Инкубируйте при температуре 16 ° C в течение 3-6 часов. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
- Первая ПЦР
- Установите 48 реакций ПЦР (6 реакций из каждой лигирующей трубки) в 0,2 мл пробирки. Для каждой ПЦР добавьте следующие реагенты в 2 мкл реакции лигирования: 5 мкл 10X ПЦР-буфера, 2 мкл 50 мМ сульфата магния, 1 мкл 10 мМ дезоксинуклеотида (dNTP) Mix, 1 мкл 10 мкМ линкерного праймера, 1 Мкл 10 мкМ праймера mLV-3 'LTR, 0,3 мкл (1,5U) Taq ДНК-полимеразы и 37,7 мкл воды. Последовательности праймеров представлены в таблице 1.
- Выполните реакцию ПЦР в термоциклере с нагретой крышкой, как указано ниже: 95 ° С в течение 2 мин; 25 циклов при 95 ° С в течение 15 с, 55 ° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 1 мин; 72 °, C в течение 5 мин; Держите при 4 ° C. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
- Вторая ПЦР
- Настроить 48 реакций ПЦР (по 1 от каждой пробирки «первая ПЦР») в пробирках по 0,2 мл. Для каждой ПЦР добавьте следующие компоненты к 2 мкл первой реакции ПЦР: 5 мкл 10Х ПЦР-буфера, 2 мкл 50 мМ сульфата магния, 1 мкл 10 мМ смеси dNTP, 1 мкл 10 мкМ линкера, вложенного праймера, 1 Мкл 10 мкМ вложенного праймера MLV-3 'LTR, 0,3 мкл Taq ДНК-полимеразы (1,5 U) и 37,7 мкл воды. Используйте вложенные праймеры, разработанные для выбранной стратегии массивного секвенирования: (i) вложенный линкер-линкер и MLV-3 'LTR-вложенный праймер, совместимый с платформой Illumina; (Ii) линкерный вложенный праймер и вложенный праймер mLV-3 'LTR, совместимый с платформой Roche. Последовательности праймеров перечислены в таблице 1 .
- Выполните реакцию ПЦР в термоциклере с нагретой крышкой, как указано ниже: 95 ° С в течение 2 мин; 25Циклов 95 ° С в течение 15 с, 58 ° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 5 мин; Держите при 4 ° C. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
- Объединение 48 вложенных реакций ПЦР в 15 мл пробирке (конечный объем ~ 2,4 мл). Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
- Определить присутствие и размер продуктов LM-PCR электрофорезом в агарозном геле.
- Добавьте 4 мкл загрузочного буфера в 20 мкл продуктов LM-PCR и загрузите образец в 1% агарозный гель вместе с 100 п.о. ДНК-лестницей. Проведите гель при 5 В / см в течение 30-60 мин и визуализируйте продукты ПЦР окрашиванием этидиум-бромидом.
- Выполните реакцию LM-PCR из ложно-трансдуцированного образца как отрицательный контроль.
- Осаждают ампликоны добавлением 0,1 объемов раствора ацетата натрия (3 М, pH 5,2) и 2,5 объемов 100% этанола. Перемешивают и замораживают при -80 ° C в течение 20 мин.
- Спин на фуЛ в стандартной микроцентрифуге при 4 ° С в течение 20 мин. Отбросьте супернатант и вымойте гранулу с 70% этанола. Спин на полной скорости в стандартной микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
- Отбросьте супернатант и высушите осадок на воздухе. Добавьте 200 мкл воды ПЦР-класса и ресуспендируйте ДНК. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
- Добавьте 20 мкл загрузочного буфера в 100 мкл продуктов LM-PCR и загрузите образец в 1% агарозный гель вместе с 100 п.о. ДНК-лестницей.
- Проведите гель при 5 В / см в течение 30-60 мин и вырежьте часть геля, содержащего ампликоны с длительностью от 150 до 500 п.о.
- Очистите продукты LM-PCR с помощью набора для выделения геля на колонке и измерьте концентрацию с помощью УФ-спектрофотометра.
- Используйте 1 мкл библиотеки для оценки длины продуктов LM-PCR с использованием биоанализатора в соответствии с инструкциями производителя.
- Используйте 20 нг очищенных продуктов LM-PCR и клонируйте их в векторе pCR2.1-TOPO в соответствии с инструкциями производителя.
- Выполните последовательности реакций с использованием универсального праймера M13 с последующим геномным картированием полученных последовательностей, чтобы выявить наличие соединений вирусного генома (включая вложенный праймер MLV-3 'LTR) в> 50% клонов для идентификации подходящих образцов Для массивного секвенирования. Пример соединения вирусного генома:
MLV-3 'LTR-вложенный праймер 454 и линкер-вложенный праймер 454 ( таблица 1 ) выделены жирным шрифтом, а 3'-конец вирусного LTR - курсивом. Геномная последовательность человека выделена красным текстом (chr10: 6439408-6439509, hg19).
3. Массивное упорядочивание сайтов интеграции mLV
ПРИМЕЧАНИЕ: LM-PCR prodUcts могут быть секвенированы с использованием коммерческих платформ (выбор подходящей пары вложенных праймеров во второй реакции ПЦР, см. Подраздел 2.5.1). Для секвенирования с помощью пироэффектной платформы Roche GS-FLX обратитесь к предыдущим статьям 7 , 14 , 15 . В этом разделе описывается недавно оптимизированный протокол для платформы секвенирования Illumina.
- Подготовка библиотеки
- Настроить 1 индексацию реакции ПЦР на образец в пробирках по 0,2 мл. Для каждой ПЦР добавьте следующие реагенты в 5 мкл (150-170 нг) очищенного продукта LM-PCR: 5 мкл индексного праймера 1, 5 мкл индексного праймера 2, 25 мкл 2х основного микса и 10 мкл ПЦР- Сорт воды. Используйте разные комбинации индексов для каждого образца.
- Выполните реакции ПЦР в термоциклере с нагретой крышкой, как указано ниже: 95 ° С в течение 3 мин; 8 циклов при 95 ° С в течение 30 с, 55 ° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 30 с; 72 ° C для 5 мв; Держите при 4 ° C.
- Очистите ПЦР-продукты, используя твердофазный обратимый иммобилизационный протокол (SPRI): в новые пробирки объемом 1,5 мл добавьте 56 мкл шариков в каждый образец и следуйте инструкциям производителя. Элюируют в 25 мкл Трис-HCl 10 мМ. Библиотеки могут храниться при температуре -20 ° C до использования.
- Проверка библиотеки
- Используйте 1 мкл образца для оценки размера библиотеки с помощью биоанализатора.
- Используйте 1 мкл образца для количественной оценки молярности библиотеки с использованием флуоресцентного анализа ПЦР в реальном времени в соответствии с инструкциями производителя.
- Разведение и упорядочение библиотек
- Разбавьте библиотеки до 10 нМ, используя Tris-HCl 10 мМ. Для объединения библиотек передайте по 5 мкл каждой разбавленной библиотеки в новую 1,5 мл пробирку, а затем разбавьте пул до 4 нМ в 10 мМ трис-HCl.
- Смешайте 5 мкл разбавленной лунки с 5 мкл 0,2 N NaOH в новом 1,5 мL, кратковременно встряхивают, вращают и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре для денатурации библиотек.
- Помещают пробирки на лед и добавляют 990 мкл предварительно охлажденного гибридизационного буфера (HT1). Алиготе 300 мкл денатурированного пула в новой 1,5-миллилитровой пробирке и добавьте 300 мкл предварительно охлажденного НТ1, чтобы получить 10 мМ пула окончательной библиотеки.
- Параллельно смешивают 2 мкл библиотеки управления PhiX (10 нМ) с 3 мкл 10 мМ Tris-HCl в 1,5 мл пробирке. Добавить 5 мкл NaOH 0,2 N, кратковременно встряхнуть, отжать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре для денатурации разбавленного PhiX. Поместите пробирку на лед и добавьте 990 мкл предварительно охлажденного HT1.
- Алиготе 300 мкл денатурированного PhiX в новой 1,5 мл пробирке и добавьте 300 мкл предварительно охлажденного HT1, чтобы получить конечный PhiX на 10 пМ.
- В новой 1,5-миллилитровой пробирке смешайте 510 мкл денатурированного библиотечного пула с 90 мкл денатурированной библиотеки PhiX, таким образом получив окончательный пул 10 пМ с 15% контроля PhiX.
- Внесите эти 600 мкл образцаОбъема в резервуар для пробной пробы талого картриджа с реагентами и немедленно приступить к выполнению однократного прогона 150 циклов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Критические реагенты и последовательности праймеров, необходимые для этого протокола, перечислены в таблице 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочий процесс процедуры ретровирусного сканирования
Рабочий процесс процедуры ретровирусного сканирования схематизирован на рисунке 1 . Заселенность клеток-мишеней очищают и трансдуцируют с помощью полученного из mlV ретровирусного вектора, экспрессирующего репортерный ген eGFP. Трансген фланкирован двумя идентичными длинными терминальными повторами (5 'и 3' LTR), обеспечивающими синтез, обратную транскрипцию и интеграцию вирусного генома в ДНК хозяина. Эффективность трансдукции оценивают с помощью анализа FACS экспрессии eGFP. Клеточную популяцию, содержащую высокую долю (> 30%) клеток, трансдуцированных mlV, амплифицировали и затем лизировали для экстракции геномной ДНК, содержащей интегрированные вирусные кассеты mLV. Геномную ДНК расщепляют и лигируют с совместимым линкером, а соединения между вирусными 3'-LTR и геном-хозяином амплифицируют с помощью LM-PCR. VirГеномные соединения us-хозяина затем подвергаются массовому секвенированию с использованием платформ Roche или Illumina. Наконец, сайты интеграции mlV сопоставляются с геномом человека для определения геномных кластеров повторных сайтов вставки.
Усиление сайтов интеграции mLV с помощью LM-PCR
Схема LM-PCR схематично представлена на рисунке 2 . Геномную ДНК экстрагируют из клеток, трансдуцированных mlV, и расщепляют рестрикционным ферментом Tru9I, который часто режет геном человека, генерируя фрагменты со средней длиной 70 п.о. Второй рестрикционный фермент (PstI) используют для предотвращения амплификации интегрированных и неинтегрированных внутренних 5'-фрагментов LTR. Затем Tru9I двухцепочечный линкер лигируют с геномными фрагментами, и LM-PCR выполняют с праймерами, специфичными для линкера и 3 'LTR для амплификации геномных соединений вирус-хозяин. Вложенная ПЦР может быть выполнена с использованием priMers совместимы с платформами секвенирования Roche или Illumina.
Анализ ампликунов геномного перехода вирус-хозяин
В эксперименте, представленном на рисунке 3 , мы очистили CD34 - CD13 + миелоидный предшественник / предшественники (MPP) и трансдуцировали их с помощью производного MLV ретровируса, экспрессирующего репортерный ген eGFP. Более 60% клеток MPP экспрессировали eGFP через 48 ч после трансдукции (данные не показаны). Через 15 дней после трансдукции мы собирали клетки, экстрагировали gDNA и амплифицировали соединения генома вируса-хозяина, как описано выше. Аликвоту объединенных продуктов LM-PCR загружали в 1% -ный агарозный гель для проверки присутствия и размера ампликонов. Мы успешно визуализировали мазок ДНК, соответствующий продуктам LM-PCR разных размеров, от 150 до 500 п.н. ( рис. 3А ). Ампликоны были тогдаКонцентрируют путем осаждения ДНК и загружают в 1% -ный агарозный гель. Продукты LM-PCR очищали в геле и выполняли на биоаналитической системе, подтверждая ожидаемые размеры ампликона (между 150 и 500 пар оснований, фиг. 3B ).
Отображение интеграции mlV в активные и клеточно-специфичные регуляторные области
В эксперименте, показанном на фиг. 4 , гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники (HSPC), предшественники эритроидных предшественников (EPP) и миелоидные предшественники / предшественники (MPP) трансдуцировали с помощью ретровирусного вектора, полученного из mLV. Эти результаты были получены для обработки и секвенирования образцов, полученных из разных типов клеток отдельно, чтобы избежать потенциального загрязнения / столкновений 18 , 19 . Чтения необработанных последовательностей, порожденные массивным секвенированием, обрабатывались автоматизированной биоинформатикойТрубопровода для устранения вирусных и линкерных последовательностей. Затем уникальные последовательности по меньшей мере 20 пар оснований были отображены на человеческий геном с использованием Blat 17 . Сырье выравнивания были отфильтрованы, требуя начала матча в течение первых 3 нуклеотидов, однозначных совпадений и минимум 95% идентичности. Кластеры повторных интегрирований mlV определялись путем статистического сравнения с набором данных случайных геномных последовательностей, генерированных случайным образом из геномных позиций из генома человека с рестрикционным мотивом Tru91 на расстоянии, совместимом с платформой секвенирования. Затем контрольные последовательности обрабатывались через один и тот же конвейер фильтрации и фильтрации, используемый для последовательностей интеграции, чтобы генерировать случайный набор уникальных сайтов. Чтобы определить кластеры mLV, мы применили алгоритм кластеризации DBSCAN 19 , сравнив распределение последовательных последовательностей mLV с количеством равных случайных сайтов для идентификации областей с высокой степенью кластеризации, которые определяютСпецифичные для клетки регуляторные элементы 7 , 14 , 15 . Чтобы избежать генерации ложных кластеров, было выполнено многократное извлечение из набора данных случайного управления. Мы сопоставили LM-PCR и пиросеквенирование 32,574, 27,546 и 36,358 mLV сайтов интеграции в HSPC, EPP и MPP, соответственно. Кластеры рекуррентной интеграции mlV совместно отображались с ацетилированными энхансерами и промоторами ( рисунок 4A ). Большинство регуляторных областей, нацеленных на mLV, были специфичными для клеток, такими как: (i) промотор HSPC- специфического гена SPINK2 ( рисунок 4B ); (Ii) Регион управления локусом, содержащий мощные энхансеры эритроидспецифических β-подобных глобных генов ( рисунок 4C ); (Iii) энхансеры, расположенные выше MPP- специфического гена LYZ ( фиг.4D ). Наконец, мы использовали тесты люциферазы для проверкиСубнабора предполагаемых клеточно-специфических энхансеров, стимулированных mlV, в EPP и MPP ( рисунок 4E ).
Рисунок 1: Общая схема процедуры сопоставления сайтов ретровирусной интеграции. Клетки-мишени трансдуцируют с помощью ретровирусного вектора на основе mLV, содержащего кассету eGFP. Геномную ДНК, полученную из трансдуцированных клеток, расщепляли Tru9I и лигировали с совместимым Tru9I двухцепочечным линкером. Сайты интеграции mLV амплифицировали с помощью вложенной LM-PCR, и библиотека геномных соединений вирус-хозяин может быть массово упорядочена с использованием платформ Illumina или Roche. Полученные в результате считывания были отображены на человеческий геном, чтобы определить кластеры повторных интегрирований mlV. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. </ Р>
Рисунок 2: Усиление геномных соединений вирус-хозяин с помощью LM-PCR. Геномную ДНК (gDNA), содержащую интегрированный провируум mLV, расщепляют рестрикционными ферментами Tru9I и PstI и лигируют с совместимым Tru9I-линкером. Вложенная ПЦР выполняется с использованием праймеров, специфичных для LTR и линкера. Указываются сайты рестрикции Tru9I и PstI в вирусных и в геноме человека. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ LM-PCR ампликонов. ( А ) Продукты LM-PCR (дорожка +) обрабатывали на 1% агарозном геле и визуализировалиОкрашиванием этидиумбромидом. Образец без образца служил в качестве образца отрицательного контроля, где визуализировались только праймеры ПЦР (дорожка -). ( B ) После очистки в геле размер продукта LM-PCR контролировали микрокапиллярным электрофорезом. Размер образца (bp) и интенсивность флуоресценции (FU) показаны по осям x и y электроферограммы, соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Отображение интеграции mLV в эпигенетически определенные регуляторные области. ( A ) Мы определили 3498, 2989 и 4103 кластера рекуррентных сайтов интеграции mLV в HSPC, EPP и MPP, соответственно. В каждой популяции клеток> 95% кластеров mLV перекрывались с эпигенетически определенным энхансомЩиков и промоутеров. ( B , C и D ). Целеспецифичные клеточные специфичные для MLV области были высокоацетилированы и ассоциированы с клеточно-специфичной экспрессией целевого гена ( SPINK2 , HBB и LYZ , почти исключительно экспрессированные в HSPC, EPP и MPP, соответственно, как определено С помощью анализа Cap экспрессии гена). Однократная интеграция mlV изображается с небольшими штрихами. TPM указывает метку на миллион. ( E ) Предполагаемые клеточные специфические усилители, стимулированные mlV, в EPP и MPP. Рисунок 4 адаптирован из ссылки 14 . Мы получили разрешение на повторное использование этой цифры в соответствии с лицензией Creative Commons. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали протокол для геномного картирования сайтов интеграции mlV, ретровирус, который нацелен на участки хроматина, эпигенетически обозначенные как активные промоторы и энхансеры. Критические шаги и / или ограничения протокола включают в себя: (i) трансдукцию mlV популяции клеток-мишеней; (Ii) амплификация соединений вируса-хозяина с помощью LM-PCR; (Iii) извлечение высокой доли сайтов интеграции. MLV-ретровирусные векторы эффективно трансдуцируют делящиеся клетки. Низкая эффективность трансдукции не делящихся клеток (например, постмитотических нейронных клеток) является потенциальным ограничением этого метода. Однако его можно преодолеть путем клеточной сортировки трансдуцированной популяции на основе экспрессии репортерного гена ( например, eGFP). Генерация относительно коротких ампликонов с помощью LM-PCR (от 150 до 500 п.о.) является обязательной для создания библиотеки ампликонов, совместимых с используемыми в настоящее время массовыми стратегиями секвенирования, и для создания всеобъемлющего генногоOme-широкий анализ сайтов интеграции mLV. В качестве примера, амплификация продуктов LM-PCR длиной> 500 п.о. может быть результатом либо частичного расщепления геномной ДНК, либо внутрилигирования переработанных Tru9I геномных фрагментов, как было определено путем клонирования дробовиком ампликонов LM-PCR (данные не показаны). В первом случае проблема может быть решена путем дальнейшей оптимизации условий геномного расщепления ДНК, тогда как в последнем случае успешное массовое секвенирование сайтов интеграции mLV может быть достигнуто посредством гель-очистки ампликонов между 150 и 500 п.о. Наконец, использование рестрикционных ферментов для расщепления геномной ДНК может привести к преимущественному усилению и обнаружению сайтов интеграции, которые лежат близко к сайту рестрикции. По оценкам, процент сайтов интеграции, которые может извлекать рестрикционный фермент Tru9I, составляет ~ 50%. Таким образом, этот метод может быть дополнительно оптимизирован для улучшения поиска сайтов интеграции с использованием множества рестрикционных ферментов или выполнения случайных ДНК-шириНг путем обработки ультразвуком 20 , 21 .
Недавно мы оптимизировали последовательность вирусных сайтов интеграции, используя широко используемую платформу Illumina, как подробно описано в этой статье. Такой подход к последовательности позволяет генерировать большее количество операций чтения за один проход по сравнению с платформой Roche, что значительно увеличивает количество сайтов интеграции, полученных из одного эксперимента, что позволяет глобально сократить время и затраты.
Общепринятая для всего генома идентификация специфичных к клеткам регуляторных областей требует отображения от одной до трех модификаций гистонов ChIP-seq 6 (моно- и триметилирование гистона H3-лизина 4 для идентификации энхансеров и промоторов и H3K27ac для различения активного и неактивного Регуляторные элементы) 4 , 5 , 6 и систематическое сравнение различных типов клеток для определенияЦис-действующие элементы, действующие исключительно в определенной популяции клеток. Мы сопоставляли сайты интеграции mlV в перспективных изолированных популяциях клеток-мишеней, таких как мультипотентные гематопоэтические предшественники и их выделенное эритроидное и миелоидное потомство 14 , эмбриональные стволовые клетки, нейроэпителиальные стволовые клетки и дифференцированные кератиноциты 15 . Ретровирусное сканирование позволило провести общесекторальное определение клеточно-специфических регуляторных элементов в каждой популяции клеток, что сделало сравнительные геномные исследования не строго необходимыми. Важно отметить, что этот инструмент может быть использован для идентификации активных регуляторных элементов в популяциях редких клеток ( например, соматических стволовых клеток), которые не имеют надежных маркеров для предполагаемой изоляции и не могут быть проанализированы с помощью анализа гистоновых модификаций на основе ChIP-seq 15 . В этих клеточных популяциях интеграция mlV является постоянным генетическим маркером активных регуляторных областей, позволяя thEir ретроспективной идентификации в более обильном клеточном потомстве in vitro и in vivo. В качестве примера, мы успешно использовали кластеры интеграции mLV в качестве суррогатных маркеров промоторов и энхансеров в ретроспективно идентифицированной популяции стволовых клеток кератиноцитов (KSC). Мы трансдуцировали культуру кератиноцитов раннего отрождения, полученную из плода крайней плоти, содержащую KSC с вектором mLV, затем мы пассировали эти клетки для> 35 удвоений клеток, чтобы обогатить в потомстве KSCs, таким образом определяемую их способностью сохранять культуру для этого числа пассажи. В этом случае интеграция mlV постоянно маркировала регуляторные области, активные в исходной трансдуцированной популяции KSC 15 . Будущие исследования будут нацелены на выявление в клеточно-специфичных регуляторных элементах генома в широком числе редких популяций стволовых клеток человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Европейского исследовательского совета (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), итальянского министерства образования, университетов и исследований (FIRB-Futuro в Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro в Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , Флагманский проект EPIGEN Epigenomics), Министерство здравоохранения Италии (Молодые исследователи Call 2011 GR-2011-02352026) и Фонд Imagine Institute (Париж, Франция).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
