Summary
Här beskriver vi ett protokoll för genomgående kartläggning av integrationsställena för Moloney-murina leukemivirusbaserade retrovirala vektorer i humana celler.
Abstract
Moloney-murina leukemi (MLV) -virusbaserade retrovirala vektorer integreras huvudsakligen i acetylerade förstärkare och promotorer. Av denna anledning kan mLV-integrationsställen användas som funktionella markörer av aktiva regleringselement. Här presenterar vi ett retroviralt avsökningsverktyg, vilket möjliggör genomspännande identifiering av cellspecifika förstärkare och promotorer. Kortfattat transduceras målcellpopulationen med en mlV-härledd vektor och genomiskt DNA digereras med ett ofta skärande restriktionsenzym. Efter ligering av genomfragment med en kompatibel DNA-länkare möjliggör länkmedierad polymeraskedjereaktion (LM-PCR) amplifieringen av virus-värdgenomförbindelserna. Massiv sekventering av amplikonerna används för att definiera mLV-integrationsprofilgenomfattande. Slutligen definieras kluster av återkommande integreringar för att identifiera cellspecifika reglerande regioner, som är ansvariga för aktiveringen av specifika transkriptionsprogram av celltyp.
t.ex. somatiska stamceller) som saknar robusta markörer för framtida isolering.
Introduction
Cellidentitet bestäms av uttrycket av specifika uppsättningar av gener. Rollen av cis-regulatoriska element, såsom promotorer och förstärkare, är avgörande för aktiveringen av specifika transkriptionsprogram av celltyp. Dessa reglerande regioner karakteriseras av specifika kromatinegenskaper, såsom speciella histon-modifikationer, transkriptionsfaktorer och bindning av ko-faktorer, och kromatintillgänglighet, som har använts i stor utsträckning för deras genomomsättning i flera celltyper 1 , 2 , 3 . I synnerhet används den genom-breda profilen för acetylering av histon H3-lysin 27 (H3K27ac) vanligen för att definiera aktiva promotorer, förstärkare och superhöjande medel 4 , 5 , 6 .
Moloney-murin leukemivirus (MLV) är ett gamma-retrovirus som används allmänt för genenÖverföring i däggdjursceller. Efter infektion av en målcell retro-transkriberas det retrovirala RNA-genomet i en dubbelsträngad DNA-molekyl som binder virala och cellulära proteiner för att montera preintegrationskomplexet (PIC). PIC kommer in i kärnan och binder värdcell-kromatinet. Här medierar viral integrasen, en nyckel PIC-komponent, integreringen av det provirala DNA-värdet i värdcellgenomet. MlV-integration i det genomiska DNAet är inte slumpmässigt men förekommer i aktiva cis-regulatoriska element, såsom promotorer och förstärkare, på cellspecifikt sätt 7 , 8 , 9 , 10 . Denna speciella integrationsprofil förmedlas av en direkt växelverkan mellan mlV-integrasen och de cellulära bromodomain- och extraterminala domänen (BET) -proteinerna 11 , 12 , 13 . BET-proteiner (BRD2, BRD3 ochBRD4) fungerar som en bro mellan värdkromatin och mLV PIC: genom sina bromodominer känner de högt acetylerade cis-regulatoriska regioner, medan extraterminal domänen interagerar med mLV integras 11 , 12 , 13 .
Här beskriver vi retroviral scanning, ett nytt verktyg för att kartlägga aktiva cis-regulatoriska regioner baserat på integrationsegenskaperna för mLV. I korthet transduceras celler med mLV-härledd retroviral vektor som uttrycker den förstärkta grön fluorescerande proteinet (eGFP) reportergenen. Efter genomisk DNA-extraktion amplifieras korsningarna mellan 3'-lång terminalrepetitionen (LTR) hos mlV-vektorn och det genomiska DNAet med linkermedierad PCR (LM-PCR) och massivt sekventeras. MLV-integrationsställen är mappade till det humana genomet och genomiska regioner riktade med mLV definieras som kluster av mLV-integrationsställen.
Retroviral avsökningNing användes för att definiera cellspecifika aktiva regulatoriska element i flera humana primära celler 14 , 15 . MLV-klyftor kodade med epigenetiskt definierade promotorer och förstärkare, varav de flesta innehöll aktiva histonmärken, såsom H3K27ac, och var cellspecifika. Retroviral avsökning möjliggör genomspännande identifiering av DNA-reglerande element i prospektivt renade cellpopulationer 7 , 14 såväl som i retrospektivt definierade cellpopulationer, såsom keratinocytstamceller, som saknar effektiva markörer för prospektiv isolering 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MLV-transduktion av humana celler
- Isolera målceller och transducera dem med en mLV-härledd retroviral vektor som hyser eGFP-reportergenen och pseudotypad med Vesicular Stomatitis Virus G (VSV-G) eller det amfotropa kuvertglykoproteinet 16 .
- Håll mock-transducerade celler som en negativ kontroll för följande analyser. Eftersom mLV-baserade retrovirala vektorer kan transducera effektivt delande celler, odlar målcellspopulationen i tillstånd som stimulerar celldelning. Transduktionsförhållandena måste specifikt optimeras för varje celltyp under studien. Celltillväxt och transduktionsbetingelser för humana hematopoetiska progenitorer, T-celler och epidermala celler beskrivs i Referenser 7, 14, 15 och 17.
- 48 h efter transduktion, resuspendera 100 000 celler i 300 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 2% fetalt bovint serum och mäta eGFP-uttryck genom fLåg cytometrisk analys (488 nm excitationslaser). Använd mock-transducerade celler som negativ kontroll. För att optimera integrationsplatshämtning, rena GFP + -celler med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
- Samla upp 0,5 till 5 miljoner celler för genomisk DNA-beredning. En längre odlingsperiod (> 7 dagar) är att föredra att späda ut det ointegrerade proviruset och nödvändigt när man analyserar det långsiktiga avkommet av bona fide stamceller (se Diskussionssektion och referens 15 ). Cellpelletsna kan snäppfrysas och förvaras vid -80 ° C tills användning.
2. Amplifiering av mLV-integrationsställen med linkermedierad PCR (LM-PCR)
- Framställning av genomiskt DNA (gDNA)
- Extrahera gDNA med hjälp av ett kolonnbaserat DNA-extraktionssats och följ protokollet för odlade celler enligt tillverkarens instruktioner.
- Restriktionsenzym digestipå
- Ställ in 4 restriktionsenzym digestioner per prov i 1,5 ml rör. Digestera 0,1 till 1 μg gDNA i varje rör genom tillsats av 1 μl Tru9I (10U) och 1 μl buffert M i en slutlig volym av 10 μl. Inkubera reaktionerna vid 65 ° C i 6 h eller över natten.
- Till varje reaktion tillsättes 1 jil PstI (10 U), 1 jil buffert H och 8 jil vatten. Inkubera reaktionerna vid 37 ° C i 6 h eller över natten. Prov kan lagras vid -20 ° C tills användning.
- Linkerligation
- Förbered en 100 μM Tru9I linker stamlösning i ett 1,5 ml rör genom att blanda linker plus sträng och linker minus strängoligonukleotider vid en 100 μM koncentration. Sätt röret i ett vattentäthet vid 100 ° C och låt det svalna vid rumstemperatur. Tru9I linker stamlösning kan förvaras vid -20 ° C tills användning.
- Ställ in 8 linkerligeringsreaktioner i 1,5 ml rör. För varje reaktion, lägg till följande komponentS till 10 ^ il restriktionsenzym digerering: 1,4 xl 10X T4 DNA-ligasreaktionsbuffert, 1 xl av 10 ^ M linker Tru9I, 1 xL (2000U) T4 DNA-ligas och 0,6 xl vatten. Inkubera vid 16 ° C i 3 till 6 timmar. Prov kan lagras vid -20 ° C tills användning.
- Första PCR
- Ställ in 48 PCR-reaktioner (6 reaktioner från varje ligeringsrör) i 0,2 ml rör. För varje PCR, tillsätt följande reagens till 2 | il ligeringsreaktion: 5 | il 10X PCR-buffert, 2 | il 50 mM magnesiumsulfat, 1 | il 10 mM deoxinukleotid (dNTP) -blandning, 1 | Μl av 10 | iM mlV-3 'LTR-primer, 0,3 | il (1,5U) Taq DNA-polymeras och 37,7 | il vatten. Primersekvenser tillhandahålls i tabell 1.
- Utför PCR-reaktion i en termisk cykler med uppvärmt lock, enligt följande: 95 ° C i 2 minuter; 25 cykler av 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min; 72 °C i 5 min; Håll vid 4 ° C. Prov kan lagras vid -20 ° C tills användning.
- Andra PCR
- Ställ in 48 PCR-reaktioner (1 från varje "första PCR" -rör) i 0,2 ml rör. För varje PCR, tillsätt följande komponenter till 2 μl av den första PCR-reaktionen: 5 | il 10X PCR-buffert, 2 | j, l 50 mM magnesiumsulfat, 1 | j, l 10 mM dNTP-blandning, 1 | j, l av 10 ^ M linker nestad primer, 1 ΜL av 10 | iM mlV-3 'LTR-nästad primer, 0,3 | il Taq DNA-polymeras (1,5 U) och 37,7 | il vatten. Använd nestade primers konstruerade för den specifika massiva sekvenseringsstrategin som valts: (i) linker-nestad primer och mLV-3 'LTR-nestad primer kompatibel med Illumina-plattformen; (Ii) linker-nestad primer och mlV-3 'LTR-nestad primer kompatibel med Roche-plattformen. Primersekvenser är listade i tabell 1 .
- Utför PCR-reaktion i en termisk cykler med uppvärmt lock, enligt följande: 95 ° C i 2 minuter; 25Cykler av 95 ° C under 15 s, 58 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min; 72 ° C under 5 min; Håll vid 4 ° C. Prov kan lagras vid -20 ° C tills användning.
- Pool de 48 nestade PCR-reaktionerna i ett 15 ml rör (slutvolym på 2,4 ml). Prov kan lagras vid -20 ° C tills användning.
- Bestäm närvaron och storleken på LM-PCR-produkterna genom agarosgelelektrofores.
- Tillsätt 4 μL laddningsbuffert till 20 μl LM-PCR-produkter och sätt provet på en 1% agarosgel tillsammans med en 100 bp DNA-stege. Kör gelén vid 5 V / cm i 30 till 60 min och visualisera PCR-produkterna genom etidiumbromidfärgning.
- Kör en LM-PCR-reaktion från det mock-transducerade provet som negativ kontroll.
- Precipitera amplikonerna genom att tillsätta 0,1 volymer natriumacetatlösning (3 M, pH 5,2) och 2,5 volymer 100% etanol. Blanda och frys vid -80 ° C under 20 minuter.
- Spin at fuLl hastighet i en standardmikrocentrifug vid 4 ° C under 20 minuter. Kassera supernatanten och tvätta pelleten med 70% etanol. Snurra vid full hastighet i en standardmikrocentrifug vid 4 ° C i 5 min.
- Kassera supernatanten och lufttorka pelleten. Tillsätt 200 μl vatten av PCR-kvalitet och resuspendera DNA. Prov kan lagras vid -20 ° C tills användning.
- Tillsätt 20 μl laddningsbuffert till 100 μl av LM-PCR-produkterna och sätt provet på en 1% agarosgel tillsammans med en 100 bp DNA-stege.
- Kör gelén vid 5 V / cm i 30 till 60 min och skär den del av gelén som innehåller 150 till 500 bp långa amplikoner.
- Rening av LM-PCR-produkterna med ett kolonnbaserat geluttagssats och mät koncentrationen med en UV-spektrofotometer.
- Använd 1 μL bibliotek för att utvärdera längden på LM-PCR-produkterna med hjälp av ett bioanalysinstrument enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd 20 ng av de renade LM-PCR-produkterna och klon dem i vektorn pCR2.1-TOPO enligt tillverkarens instruktioner.
- Utför sekvenseringsreaktioner med användning av M13 Universal-primeren följt av genomisk kartläggning av de resulterande sekvenserna för att avslöja närvaron av virusgenomförbindelserna (inklusive den mlV-3 'LTR-nestade primeren) i> 50% av klonerna för att identifiera prover som är lämpliga För massiv sekventering. Exempel på ett virusgenomföringspunkt:
MLV-3 'LTR-nestad primer 454 och linker-nästad primer 454 ( tabell 1 ) indikeras med fetstil och 3'-änden av den virala LTR-kursen kursiv. Den mänskliga genomiska sekvensen är markerad i röd text (chr10: 6439408-6439509, hg19).
3. Massiv sekvensering av mLV Integration Sites
OBS: LM-PCR prodUcts kan sekvenseras med användning av kommersiella plattformar (välja det lämpliga nestade primerparet i den andra PCR-reaktionen, se punkt 2.5.1). För sekvensering av Roche GS-FLX pyrosequencingplattform, se tidigare papper 7 , 14 , 15 . I detta avsnitt beskrivs ett nyoptimerat protokoll för Illumina-sekvenseringsplattformen.
- Bibliotekstillverkning
- Ställ in 1 indexerings-PCR-reaktion per prov i 0,2 ml rör. För varje PCR, tillsätt följande reagens till 5 μl (150-170 ng) renad LM-PCR-produkt: 5 | il Index Primer 1, 5 | il Index Primer 2, 25 | il 2X Master Mix och 10 | il PCR- Grade vatten. Använd en annan indexkombination för varje prov.
- Utför PCR-reaktioner i en termisk cykler med uppvärmt lock, enligt följande: 95 ° C i 3 minuter; 8 cykler av 95 ° C under 30 s, 55 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s; 72 ° C i 5 mi; Håll vid 4 ° C.
- Rening av PCR-produkterna med hjälp av ett isolerande protokoll med fast fas reversibel immobilisering (SPRI): i nya 1,5 ml rör tillsätt 56 μL pärlor till varje prov och fortsätt enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 25 | il Tris-HCl 10 mM. Bibliotek kan förvaras vid -20 ° C tills användning.
- Bibliotekskontroll
- Använd 1 μL prov för att bedöma biblioteksstorlek med hjälp av ett bioanalysatorinstrument.
- Använd 1 μL prov för att kvantifiera bibliotekets molaritet med hjälp av en fluorescensbaserad realtids-PCR-analys enligt tillverkarens instruktioner.
- Bibliotekspädning och sekvensering
- Späd biblioteken till 10 nM med användning av Tris-HCl 10 mM. För att samla bibliotek, överför 5 μl av varje utspädd bibliotek till ett nytt 1,5 ml rör och späd sedan poolen till 4 nM i Tris-HCl 10 mM.
- Blanda 5 μl utspädd pool med 5 μL 0,2 N NaOH i en ny 1,5 mL rör, virvel kort, snurra ner och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att denaturera biblioteken.
- Sätt rör på is och tillsätt 990 μL förkyld hybridiseringsbuffert (HT1). Aliquot 300 μL denaturerad pool i ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 300 μL förkyld HT1 för att erhålla en 10 pM slutlig bibliotekspool.
- Parallellt blandas 2 μl PhiX kontrollbibliotek (10 nM) med 3 μl Tris-HCl 10 mM i ett 1,5 ml rör. Tillsätt 5 μL NaOH 0,2 N, virvel kort, snurra ner och inkubera i 5 min vid rumstemperatur för att denaturera den utspädda PhiX. Sätt röret på is och tillsätt 990 μL förkyld HT1.
- Aliquot 300 μL denaturerad PhiX i ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 300 μL förkyld HT1 för att erhålla en 10 pM slutlig PhiX.
- I ett nytt 1,5 ml rör blandas 510 μl denaturerad bibliotekspool med 90 μl detaturerat PhiX-bibliotek, vilket ger en slutlig 10 pM-pool med 15% PhiX-kontroll.
- Pipettera dessa 600 μL provVolymen in i uppsamlingsreservoaren för den upptunna sekvenseringsreagenspatronen och fortsätt omedelbart för att utföra en enläst 150-cykelströmning.
OBS! De kritiska reagens- och primer-sekvenserna som krävs för detta protokoll anges i tabell 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflöde av det retrovirala avsökningsförfarandet
Arbetsflödet för retrovirala avsökningsförfaranden schematiseras i figur 1 . Målcellspopulationen renas och transduceras med en mlV-härledd retroviral vektor som uttrycker en eGFP-reportergen. Transgen flankeras av de två identiska långa terminala upprepningarna (5 'och 3' LTR), vilket säkerställer syntes, omvänt transkription och integration av virusgenomet i värd-DNA. Transduktionseffektiviteten utvärderas genom FACS-analys av eGFP-uttryck. Cellpopulationen som innehåller en hög andel (> 30%) av mLV-transducerade celler amplifieras och lyseras sedan för att extrahera genomiskt DNA innehållande de integrerade mLV virala kassetterna. Genomiskt DNA digereras och ligeras med en kompatibel länkare och korsningarna mellan de virala 3'-LTR och värdgenomet amplifieras med LM-PCR. virGenomgångar av oss-värdgenom sekvenseras sedan massivt med hjälp av Roche- eller Illumina-plattformar. Slutligen kartläggs mlV-integrationsställen till det humana genomet för att definiera genomiska kluster av återkommande insertionsställen.
Amplifiering av mLV-integrationsställen med LM-PCR
LM-PCR är schematiserad i figur 2 . Genomiskt DNA extraheras från mLV-transducerade celler och digereras med Tru9l-restriktionsenzymet, vilket ofta skär det humana genomet, vilket genererar fragment med en median längd av 70 bp. Ett andra restriktionsenzym (PstI) används för att förhindra amplifiering av integrerade och icke-integrerade interna 5'-LTR-fragment. En Tru9I dubbelsträngad linker ligeras därefter till de genomiska fragmenten och LM-PCR utförs med primers specifika för linkern och 3'-LTR för att amplifiera virus-värdgenomförbindelserna. Nested PCR kan utföras med användning av priMer kompatibla med Roche eller Illumina-sekvenseringsplattformar.
Analys av virus-värdgenomförbindningsamplikoner
I försöket representerat i figur 3 renade vi CD34 - CD13 + myeloid progenitor / prekursorer (MPP) och transducerade dem med en mLV-härledd retroviral som uttryckte eGFP-reportergenen. Mer än 60% av MPP-cellerna uttryckte eGFP 48 h efter transduktion (data ej visad). 15 dagar efter transduktion insamlade vi cellerna, extraherade gDNA och amplifierade virus-värdgenomförbindelserna, såsom beskrivits ovan. En alikvot av de sammanslagna LM-PCR-produkterna laddades på en 1% agarosgel för att verifiera närvaron och storleken av amplikonerna. Vi visade framgångsrikt ett DNA-smör som motsvarade LM-PCR-produkterna i olika storlekar, från 150 till 500 bp ( Figur 3A ). Ampliconer var dåKoncentrerad genom DNA-fällning och laddad på en 1% agarosgel. LM-PCR-produkter gelrenades och kördes på ett bioanalysatorsystem, vilket bekräftade de förväntade ampliconstorlekarna (mellan 150 och 500 bp, figur 3B ).
Kartläggning av mLV-integreringar i aktiva och cellspecifika reglerande regioner
I försöket som rapporterats i figur 4 transducerades hematopoietisk stam / stamceller (HSPC), erythroidprogenitor / prekursorer (EPP) och myeloid progenitor / prekursorer (MPP) med en mLV-härledd retroviral vektor. Dessa resultat erhölls bearbetning och sekvenseringsprover som härleddes från olika celltyper separat, för att undvika potentiella föroreningar / kollisioner 18 , 19 . Råsekvensläsningar genererade genom massiv sekvensering behandlades av en automatiserad bioinformatikPipeline för att eliminera virala och linkersekvenser. Därefter kartlades unika sekvenser av minst 20 bp på det humana genomet med användning av Blat 17 . Råinriktningar filtrerades som krävde att matchen skulle börja inom de första 3 nukleotiderna, univokala matchningar och minst 95% identitet. Kluster av återkommande mLV-integreringar definierades genom en statistisk jämförelse med en dataset av slumpmässiga genomiska sekvenser, genererade slumpvis extraherande av genomiska positioner från det humana genomet med ett Tru91-restriktionsmotiv på ett avstånd som är kompatibelt med sekvenseringsplattformen. Kontrollsekvenser bearbetades sedan genom samma kartläggnings- och filtreringsrörledning som användes för integrationssekvenser, för att generera en slumpmässig uppsättning unika platser. För att definiera mLV-kluster tillämpade vi DBSCAN-klustringsalgoritmen 19 , som jämförde fördelningen av konsekutiva mLV-integreringar med det för lika antal slumpmässiga platser för att identifiera regioner med starkt grupperade integreringar, vilka defCellspecifika regleringselement 7 , 14 , 15 . För att undvika generering av falska kluster utfördes flera extraktioner från slumpmässiga kontrolldatasatsen. Vi kartlade genom LM-PCR och pyrosequensering 32,574, 27,546 och 36,358 mlV integrationsställen i HSPC, EPP respektive MPP. Kluster av återkommande mLV-integreringar sam-mappade med acetylerade förstärkare och promotorer ( Figur 4A ). De flesta av de mlV-riktade reglerande regionerna var cellspecifika, såsom: (i) promotorn av HSPC-specifik SPINK2- gen ( Figur 4B ); (Ii) Locus Control Region som innehåller potenta förstärkare av de erytroidspecifika p-liknande globingenerna ( Figur 4C ); (Iii) förstärkare placerade uppströms den MPP-specifika LYZ- genen ( Figur 4D ). Slutligen använde vi luciferasanalyser för att valideraEn delmängd av förmodade celspecifika mLV-riktade enhancers i EPP och MPP ( Figur 4E ).
Figur 1: Ett allmänt schema för mappningsförfarandet för retroviral integrationssiten. Målceller transduceras med en mlV-baserad retroviral vektor innehållande en eGFP-kassett. Genomiskt DNA erhållet från transducerade celler digereras med Tru9I och ligeras med en kompatibel Tru9I dubbelsträngslänkare. MlV-integrationsställen amplifierades genom nestad LM-PCR och biblioteket av virus-värdgenomförbindelser kan massivt sekvenseras med användning av Illumina eller Roche-plattformar. De resulterande läsningarna kartlades till det humana genomet för att definiera kluster av återkommande mLV-integreringar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. </ P>
Figur 2: Förstärkning av virus-värdgenomförbindelser med LM-PCR. Genomiskt DNA (gDNA) innehållande det integrerade mLV-proviruset digereras med Tru9l- och Pstl-restriktionsenzymer och ligeras med en kompatibel Tru9l-länkare. Nested PCR utförs med användning av primers specifika för LTR och linkern. Tru9l- och Pstl-restriktionsställen i virala och i humant genom anges. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Analys av LM-PCR-amplikoner. ( A ) LM-PCR-produkter (lane +) kördes på en 1% agarosgel och visualiseradesGenom etidiumbromidfärgning. Ett inget mallprov fungerade som negativt kontrollprov, där endast PCR-primers visualiserades (lane -). ( B ) Efter gelrening kontrollerades LM-PCR-produktstorlek genom mikrokapillärelektrofores. Provstorlek (bp) och fluorescensintensitet (FU) visas på respektive x-respektive y-axlarna av elektropherogrammet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kartläggning av mLV-integration i epigenetiskt definierade reglerande regioner. ( A ) Vi definierade 3,498, 2,989 och 4,103 kluster av återkommande mLV-integrationsställen i HSPC, EPP respektive MPP. I varje cellpopulation överlappades> 95% mlV-kluster med epigenetiskt definierad förstärkningErs och promotorer. ( B , C och D ) Celspecifika mLV-riktade regioner var högt acetylerade och associerade med cellspecifik expression av den riktade genen ( SPINK2 , HBB och LYZ , nästan uteslutande uttryckt i HSPC, EPP respektive MPP, som bestämdes Genom Cap-analys av genuttryck). MLV-enskilda integreringar är avbildade med små staplar. TPM anger tag per miljon. ( E ) Putativa cellspecifika mLV-riktade enhancers i EPP och MPP. Figur 4 är anpassad från referens 14 . Vi fick tillstånd att återanvända denna figur under Creative Commons-licensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrives ett protokoll för genombildning av integrationsställen för mLV, ett retrovirus som riktar sig mot kromatinregioner, epigenetiskt märkta som aktiva promotorer och förstärkare. Kritiska steg och / eller begränsningar av protokollet innefattar: (i) mLV-transduktion av målcellspopulationen; (Ii) amplifiering av virus-värdkryssningar med LM-PCR; (Iii) hämtning av en stor del av integrationsställen. MLV-baserade retrovirala vektorer transducerar effektivt delande celler. Den låga effektiviteten vid transduktion av icke-delande celler (t.ex. postmittotiska neuronceller) är en potentiell begränsning av denna teknik. Det kan emellertid övervinnas genom cellsortering av den transducerade populationen baserat på uttrycket av reportergenen ( t ex eGFP). Generationen av relativt korta ampliconer med LM-PCR (150 till 500 bp) är obligatorisk för att generera ett bibliotek med amplikoner kompatibla med de för närvarande använda massiva sekvenseringsstrategierna och att möjliggöra en omfattande genAll-vid-analys av mLV-integrationsställen. Som ett exempel kan amplifiering av> 500 bp långa LM-PCR-produkter bero på antingen partiell genomisk DNA-digestion eller intra-ligering av Tru9I-digererade genomfragment, vilket utvärderas genom hagelgevärkloning av LM-PCR-ampliconer (data ej visad). I det första fallet kan problemet lösas genom ytterligare optimering av genomisk DNA-digestionsbetingelser, medan i det senare fallet den framgångsrika massiva sekvenseringen av mLV-integrationsställen kan åstadkommas genom en gelrening av amplikoner mellan 150 och 500 bp. Slutligen kan användningen av restriktionsenzymer för att skära genomiskt DNA leda till preferensförstärkning och detektering av integrationsställen som ligger nära en restriktionsplats. Andelen integrationsställen som Tru9I-restriktionsenzymet kan hämta uppskattas vara ~ 50%. Således kan denna teknik optimeras ytterligare för att förbättra integrationsplatshämtning genom att använda flera restriktionsenzymer eller utföra slumpmässig DNA-sheariNg genom sonication 20 , 21 .
Nyligen har vi optimerat sekvenseringen av virala integrationsställen med hjälp av den mycket använda Illumina-plattformen, som beskrivs i detta dokument. Denna sekvenseringsmetod möjliggör generering av ett högre antal läsningar per körning jämfört med Roche-plattformen, vilket väsentligt ökar antalet integrationsplatser som hämtas från ett enda experiment, vilket globalt minskar tid och kostnader.
Genombredd identifiering av cellspecifika reglerande regioner kräver kartläggning av en till tre histon-modifikationer av ChIP-seq 6 (mono- och trimetylering av histon H3-lysin 4 för identifiering av förstärkare och promotorer och H3K27ac för att skilja mellan aktiva och inaktiva Reglerande element) 4 , 5 , 6 och en systematisk jämförelse av olika celltyper för att definieraCis-verkande element som är aktiva exklusivt i en bestämd cellpopulation. Vi kartlade mLV-integrationsställen i prospektivt isolerade målcellspopulationer, såsom multipotenta hematopoetiska progenitorer och deras engagerade erytroid och myeloid avkomma 14 , embryonala stamceller, neuroepiteliala stamceller och differentierade keratinocyter 15 . Retroviral avsökning möjliggjorde genomfattande definitionen av celspecifika reglerande element i varje cellpopulation, som analyserades, vilket gjorde de jämförande genomsökande studierna inte strängt nödvändiga. Viktigt är att detta verktyg kan användas för identifiering av aktiva regleringselement i sällsynta cellpopulationer ( t.ex. somatiska stamceller), som saknar robusta markörer för potentiell isolering och kan inte analyseras genom ChIP-seq-baserad analys av histon-modifikationer 15 . I dessa cellpopulationer är mlV-integration en permanent genetisk markör för aktiva reglerande regioner, vilket tillåter thEir retrospektiv identifiering i det mer rikliga cellavkommet in vitro och in vivo. Som ett exempel använde vi framgångsrikt mLV-integrationsklyftor som surrogatmarkörer av promotorer och förstärkare i en retrospektivt identifierad keratinocyt stamcells (KSC) population. Vi transducerade en keratinocytkultur med tidig passage, förhuden innehållande KSCs med en mlV-vektor, sedan passerade vi dessa celler för> 35-cell-dubbleringar för att berika i avkomma av KSCs, sålunda definierade av deras förmåga att bibehålla kulturen för detta antal passager. I detta fall markerade mlV-integreringar permanent de regulatoriska regionerna som är aktiva i den ursprungliga transducerade KSC-populationen 15 . Framtida studier kommer att sträva efter att på ett genomgående sätt identifiera cellspecifika regleringselement i ett större antal sällsynta humana stamcellspopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Europeiska forskningsrådet (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), det italienska ministeriet för utbildning, universitet och forskning (FIRB-Futuro i Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro i Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics flaggskeppsprojekt), det italienska hälsovårdsministeriet (unga forskare kallar 2011 GR-2011-02352026) och Imagine Institute Foundation (Paris, Frankrike).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
