Summary
ويبين هذا البروتوكول مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية لدراسة نشرها (1-د) أحادي الأبعاد للجزيئات على طول الحمض النووي.
Abstract
يصف لنا مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية لدراسة نشرها د 1 من الجزيئات على طول الحمض النووي. في هذا التحليل، هي فونكتيوناليزيد كوفيرسليبس الزجاج في رد فعل خطوة واحدة مع سيلاني-شماعة-البيوتين. تدفق الخلايا هي التي شيدت قبل ساندويتشينج شريط لاصق مع القنوات قبل قطع بين ساترة فونكتيوناليزيد ولوح PDMS التي تحتوي على فتحات مدخل ومخرج. قنوات متعددة تتكامل في خلية واحدة تدفق وتدفق المواد الكاشفة إلى كل قناة يمكن أن تكون مؤتمتة بالكامل، الذي إلى حد كبير يزيد الإنتاجية المقايسة ويقلل من الوقت للتدريب العملي على كل المقايسة. داخل كل قناة، البيوتين-λ-السلطات الوطنية المعينة هي معطلة على السطح ويتم تطبيق تدفق رقائقي تدفق تمتد السلطات الوطنية المعينة. وتستنفد جزيئات الحمض النووي > 80% من طول كفاف وتخدم مدد مكانياً قوالب لدراسة النشاط ملزمة والنقل من الجزيئات المسماة فلوريسسينتلي. يتم تعقب مسارات الجزيئات واحدة من الوقت الفاصل بين التصوير بمجموع الأسفار التأمل الداخلي (TIRF). ويتم تحليل صور raw استخدام مبسطة الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرامج لتحديد مسارات الجزيئات واحدة نشرها على طول الحمض النووي وتقدير تلك الثوابت نشرها د 1 تلقائياً.
Introduction
مشكلة طويلة الأمد في مجال البيولوجيا هو البروتينات الذاتية كيف أن يتصرف في محدد مواقع في الجينوم يمكن تحديد أهدافها الحمض النووي بسرعة كافية للكائنات الحية البقاء على قيد الحياة، والاستجابة بفعالية لبيئتها. اقترحت دراسات على مدى السنوات الأربعين الماضية، وسهلت إلى حد كبير دعم الفرضية القائلة بأن الحركية من الحمض النووي تستهدف البحث بروتين يمكن التعجيل بنشر فيه بدائل البروتين وبين نشر ثلاثية الأبعاد في معظم نشر د 1 (بما في ذلك انزلاق والتنقل بين العمليات) على طول الحمض النووي1. ومن المعروف الآن أن العديد من البروتينات المشاركة في تنظيم الجينات والحمض النووي الأيض والعمليات الأخرى قادرون على انزلاق على الحمض النووي2،3،،من45،6،7 ،،من89. وعلاوة على ذلك، أفادت الدراسات الحديثة أن الببتيدات الصغيرة حتى يمكن ربط والشرائح على الحمض النووي، مع القدرة على تحمل شحنة؛ على سبيل المثال، جزيء البروتين أو التمهيدي بكر، على طول الحمض النووي10،،من1112،،من1314.
على مدى السنوات ال 15 الماضية، مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد يستخدم على نطاق واسع لدراسة الربط ونشرها للجزيئات على طول الحمض النووي2،،من1516. في هذا النوع من التحليل، هي المعطل تداولها جزيئات الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بيوتينيلاتيد على السطح ويطبق تدفق رقائقي تدفق تمتد الحمض النووي. > 80% امتدت خدمة السلطات الوطنية المعينة كقوالب مكانياً الموسعة لدراسة النشاط ملزمة والنقل من الجزيئات المسماة مع fluorophores مسارات الجزيئات واحدة على طول الحمض النووي حيث يتم تعقبها بواسطة fluorescence الوقت الفاصل بين التصوير. في التنفيذ، الأمثل لسهولة الاستخدام، وإمكانية تكرار نتائج هذا التحليل يتكون من خمس خطوات رئيسية: إعداد البيوتين-λ-الحمض النووي، الروغان ساترة، وتدفق الخلية البناء وتصوير الأسفار وتحليل البيانات. في البروتوكولات السابقة17، كانت فونكتيوناليزيد كوفيرسليبس الزجاج بأول رد فعل مع (3-أمينوبروبيل) تريثوكسيسيلاني (أبتيس)، ومن ثم مع أمين المتفاعلة البولي إثيلين غليكول (شماعة) الكواشف (مثلاً، دائرة الصحة الوطنية--شماعة-البيوتين) تشكل طبقة ربط التي تقاوم غير محدد من الامتزاز مقايسة المكونات للسطح ساترة. نوعية كوفيرسليبس فونكتيوناليزيد إلى حد كبير يتوقف على نوعية شماعة الكواشف وشروط الرد في كل خطوة. ويصف لدينا بروتوكول بروتوكول الروغان مبسطة والتدفق متعدد الخلية البناء الذي يتطلب لا لاصق السائلة أو علاج الوقت على الخلايا تدفق اليوم يتم تجميعها. ونحن أيضا وصف بيانات مبسطة وقوية تحليل الداخلي11 أن يلغي خطوات الانحدار مكثفة حسابياً عن طريق تطبيق أسلوب تماثل شعاعي ل التعريب centroid18 و نشرها على أساس التباين المشترك مقيم دائم في19.
هنا، نحن تقارير بسيطة وقوية وعالية الإنتاجية جزيء واحد تدفق تمتد مقايسة التنفيذ مع تحسينات هامة في الروغان ساترة وتشييد الخلية تدفق وتحليل البيانات. على وجه الخصوص، قمنا بتطوير بروتوكول الروغان ساترة خطوة واحدة، التي كوفيرسليبس نظيفة جافة تتفاعل مباشرة مع سيلاني-شماعة-البيوتين. هذا البروتوكول يبسط إعداد ساترة، ويعمل على تحسين وثوقية نوعية الأسطح فونكتيوناليزيد مقارنة ببروتوكول رد فعل خطوتين القياسية. يصف لنا استخدام كوفيرسليبس فونكتيوناليزيد حتى مع الخلايا تدفق PDMS متعدد القنوات التي تتيح اتصالات أنابيب قوية دون الغراء. وتشمل هذه الخلايا تدفق مزيد متعددة الكمبيوتر التي تسيطر عليها مداخل لكل دائرة التدفق التي تتيح تدفق الكاشف الآلي لتقليل وقت التدريب العملي أثناء الإعداد والتحليل زيادة الإنتاجية.
Protocol
1. إعداد البيوتين-λ-الحمض النووي
ملاحظة: تعد جزيئات البيوتين-λ-الحمض النووي قبل ligating اليغنوكليوتيد المسمى البيوتين، 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20-البيوتين-3 ' إلى جزيئات الحمض النووي λ 20-
- تحضير 0.1 ملم البيوتين المسمى اليغو في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات-
- الحرارة 0.5 ملغ/مل λ-الحمض النووي الأسهم عند 65 درجة مئوية ل 60 ثانية، ويغرق في الجليد الرطب الحق بعيداً.
ملاحظة: كبح سرعة التبريد يقلل من الحمض النووي λ كونكاتيميريزيشن- - ماصة 100 ميليلتر من الحل λ-الحمض النووي في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- إضافة 1 ميليلتر من اليغو 0.1 مم إلى 9 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات-
- إضافة 2 ميليلتر من حل اليغو أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على الحمض النووي-λ. مزيج دقيق.
ملاحظة: اليغو موجود في ما يقرب فائض مولى عرض على نهاية λ الحمض النووي التكميلية. - تسخين المخلوط λ-الحمض النووي/اليغو عند 65 درجة مئوية مقابل 60 س.
- ببطء تبريد الخليط في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: هذه الخطوة يسمح اليغو يصلب نهاية λ الحمض النووي التكميلية. - وضع الخليط على الجليد. إضافة 11 ميليلتر من الحمض النووي T4 ليجاسى رد فعل المخزن المؤقت (تركيز العازلة النهائية 1 x). المزيج بلطف. قم بإضافة 2 ميليلتر (800 وحدة) إنزيم ليجاسى T4 الحمض النووي. المزيج بلطف.
- احتضان المخلوط ح 2 في 16 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 ° C.
- تنقية المنتج باستخدام أنابيب الطرد المركزي تصفية مع حد وزن الجزيئي اسمي كاتشين 100. على وجه التحديد، نقل الخليط خطوة 1.9 إلى أنبوب تصفية الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 5 دقائق وتغسل مع العازلة TE ميليلتر 400 مرتين، وجمع المنتج المنقي.
ملاحظة: وصفه تنقية البيوتين-λ-السلطات الوطنية المعينة في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات مستقرة عند-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
2. الروغان ساترة
ملاحظة: هي فونكتيوناليزيد كوفيرسليبس الزجاج نتيجة للتفاعل مع سيلاني-شماعة-البيوتين. هذا البروتوكول خطوة واحدة رد فعل أبسط وأكثر موثوقية في تجربتنا من 20 من البروتوكول رد فعل خطوتين القياسية. الروغان ساترة مع سيلاني-شماعة-البيوتين يخلق مواقع الربط ستريبتافيدين ويقلل غير محدد الحمض النووي والبروتين الامتزاز على السطح ساترة.
كوفيرسليبس رقم 1- سنكيت خمسة في الإيثانول 95% داخل تلطيخ جرة لمدة 10 دقائق وثم أشطف بالماء عالي النقاوة لثلاث مرات-
ملاحظة: ساترة الخامسة ينص قطع غيار في حالة الكسر. - ملء الجرة المصبوغة مع 1 م كوه و sonicate لمدة 10 دقائق ثم أشطف بالماء عالي النقاوة ثلاث مرات-
- تكرار دورة 2.1-2.2 مرتين.
- الجاف كوفيرسليبس تحت نظيفة جافة تدفق الغاز 2 ن.
- كذلك نظيفة وجافة كوفيرسليبس بتطبيق المعالجة بالبلازما الهواء عند ضغط متورر 900 للحد الأدنى 5
- احتضان كوفيرسليبس مع 25 ملغ/مل سيلاني-شماعة-البيوتين الذائبة في الإيثانول 95% في درجة حرارة الغرفة حاء 2 على وجه التحديد، وساندويتش 50 ميليلتر سيلاني-شماعة-البيوتين حل بين اثنين كوفيرسليبس نظيفة جافة واحتضانها ساترة " السندويشات " داخل مربع تلميح ماصة مغلقة مع حوالي 10 مل من المياه في الجزء السفلي (ليس على اتصال كوفيرسليبس) للتقليل من تبخر المذيبات.
- يغسل الزائد شماعة الجزيئات مع الماء عالي النقاوة وجاف شماعة المغلفة كوفيرسليبس تحت نظيفة جافة تدفق الغاز 2 ن.
ملاحظة: يمكن تخزين كوفيرسليبس فونكتيوناليزيد إلى ثلاثة أيام في ظل الظروف المحيطة.
3. تدفق بناء خلية
ملاحظة: تدفق الخلايا هي التي شيدت بشريط لاصق مزدوج مع القنوات قبل قطع بين ساندويتشينج شماعة فونكتيوناليزيد ساترة ولوح PDMS التي تحتوي على فتحات مدخل ومخرج. قنوات متعددة تتكامل كل خلية تدفق.
تصميم قنوات تدفق في برمجيات كندي- وقطع القنوات (العرض والعمق وطول كل القنوات هي 1 و 0.13 و 12 ملم، على التوالي) على شريط لاصق مزدوج باستخدام قاطع شريط (عادة ثماني قنوات تتكامل كل خلية تدفق). إزالة المخلفات من الشريط لتشكيل قنوات تدفق.
- لجعل PDMS ألواح، مزيج دقيق ز 45 من PDMS مع 5 غ كاشف كروسلينكينج (تكفي لصنع 12 5 مم سميكة تطويره ألواح التي يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى في ظل الظروف المحيطة) باستخدام خلاط، صب الخليط في أطباق بتري 10 سم اثنين، وترك أطباق داخل فراغ غرفة حتى أساسا كل الهواء فقاعات ولت (يدوياً إزالة فقاعات الهواء إذا تبقى أي عندما تتم إزالة الأطباق من فراغ الغرفة). ثم نقل الأطباق في فرن 80 درجة مئوية حتى يتصلب PDMS (حوالي 2 ح)-
- قطع لوح PDMS الذي يتطابق مع حجم الشريط اللاصق المزدوج مع القنوات قبل قطع. الفيلم حماية واحد قشر قبالة الشريط اللاصق المزدوج وتتقيد الفيلم لوجه مسطح البلاطة PDMS. لكمه ثقوب المآخذ ومدخل على لوح PDMS استخدام خزعة هول-تثقيب بإبرة قياس 23-
- قشر الفيلم حماية الثانية قبالة الشريط اللاصق المزدوج وتلتزم الجمعية PDMS الشريط على سطح فونكتيوناليزيد ساترة (تأكد من أن شقة ساترة. مشاهدة صورة لخلية تدفق مجمع بشكل كامل في الشكل 1a).
4. TIRF التصوير
ملاحظة: البيوتين-λ-السلطات الوطنية المعينة هي المربوطة إلى سطح قناة تدفق وتدفق رقائقي يطبق على تدفق تمدد جزيئات الحمض النووي ( الشكل 1b). > 80% امتدت خدمة جزيئات الحمض النووي كقوالب مكانياً موسعة لمراقبة نشاط الجزيئات فلوريسسينتلي المسمى ملزم والنقل. يتم تعقب مسارات الجزيئات واحدة من الوقت الفاصل بين TIRF تصوير ( الشكل 1 ج & ه).
- فيكس تدفق الخلية في مجهر المرحلة والتحميل قبل ديجاسيد فارغة المخزن مؤقت (فوسفات الصوديوم 10 مم، 2 مم كلوريد الصوديوم، 50 ميكرومتر يدتا، الإيثانول 20 مم، والغليسيرول 5% (v/v)، 0.01 ٪ توين-20، 1% (v/v) β-mercaptoethanol، الأس الهيدروجيني 7.4)، 0.2 مغ/مل الحل streptavidin، 1 ملغ/ مل ألبومين المصل البقري (BSA) الحل والحل البيوتين-λ-الحمض النووي م 100 في الخزانات الأربعة أن كل منهما متصلة أنابيب تيجون إلى قيمة لولبي وآخر تيجون الأنابيب متصلة بأنابيب نظرة خاطفة طريق سليفينج الأنابيب تيجون على (نظرة خاطفة على أنابيب أصغر يمنع الدفق كواشف). ديغا كميات صغيرة من المخزن المؤقت بالتعرض بين عشية وضحاها فراغ أو التعرض أقصر للفراغ مع التحريك (حتى فقاعات لم تعد مرئية)-
- إدراج الأنبوب نظرة خاطفة في خزان المخزن المؤقت فارغاً في حفرة مدخل واحد من الخلية تدفق. رئيس القناة التي تتدفق في المخزن المؤقت فارغاً، وإدراج ثلاثة أنابيب أخرى نظرة خاطفة فتحات مدخل يسيطر عليها الملف اللولبي صمامات الضغط الجوي مدفوعة تدفق من كل كاشف ومؤتمته بالكامل عبر برنامج نصي لكمبيوتر. كن حذراً لا للحث على تشكيل فقاعة هواء في القناة-
- الاتصال أنابيب تيجون مع أنابيب نظرة خاطفة قصيرة من ثقب مأخذ التيار إلى حاوية نفايات. أنابيب خاطفة قصيرة عند المخرج يساعد على قمع تشكيل فقاعة هواء خلال التسريب بالمحافظة على الضغط الإيجابي داخل القناة-
- الربط جزيئات البيوتين-λ-الحمض النووي إلى سطح قناة تدفق.
- التدفق في 0.2 مغ/مل ستريبتافيدين الحل، احتضان لمدة 5 دقائق وثم تتدفق في المخزن المؤقت فارغاً تغسل streptavidin غير منضم.
- التدفق في حل 1 ملغ/مل جيش صرب البوسنة، واحتضان لمدة 1 دقيقة، وتدفق ثم في المخزن المؤقت فارغاً يغسل بها جيش صرب البوسنة غير منضم.
ملاحظة: يمنع جيش صرب البوسنة أيضا الحمض النووي وعينه الامتزاز على السطح- - التدفق في 100 م حل البيوتين-λ-الحمض النووي، احتضان لمدة 10 دقائق وثم تتدفق في المخزن المؤقت فارغاً تغسل المعينة غير منضم.
ملاحظة: بعد الحمض النووي منضماً إلى السطح، تجنب تدفقات سريعة لمنع الأضرار بجزيئات الحمض النووي المربوطة.
- للتحقق من جودة ساترة فونكتيوناليزيد، تتدفق في الحمض النووي تلطيخ صبغ مثل سيتو البرتقالي ظروف المقايسة لاستخدامها (قراءة 4.6 أدناه)، وبدء التصوير تحت 532 نانومتر الليزر الإضاءة الفلورية.
ملاحظة: نوعية ساترة فونكتيوناليزيد عادة جيدة وكثافة التدفق تمدد جزيئات الحمض النووي ستكون عالية. من الضروري أن يكون بكثافة عالية بما يكفي من جزيئات الحمض النووي تدفق امتدت حتى يمكن ملاحظة ربط الحمض النووي وأحداث نشر انزلاق/1 د. - غرامة ضبط زاوية TIRF لتحقيق أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء الصور امتدت من جزيئات الحامض النووي ( الشكل 1 د)-
- لتسجيل مسارات الجزيئات واحدة تتحرك على طول الحمض النووي، كرر الخطوات من 4.2 4.4 داخل قناة جديدة (بدون تلطيخ صبغ الحمض النووي)، ثم لبث fluorophore nanomolar الفرعية قبل يطرد المسمى الجزيئات بمعدل تدفق عالية بما يكفي باستخدام مضخة الحقن و جمع الأسفار الوقت الفاصل بين الصور مع إطار بمعدل 100 هرتز-
ملاحظة: معدل تدفق ما يعادل عدد ويسينبيرج (أي: المنتج هو من أطول البوليمر الاسترخاء وقت-حوالي 0.2 s λ-الحمض النووي-ومعدل القص-التغيير في سرعة تدفق مع المسافة من السطح ساترة) 500 داخل ويوصي بالقناة لتصوير جزيء واحد بمعدل 100 هرتز 21 إطار.- 10,000 جمع الإطارات في الحقل لعرض واحد (FOV) لإنتاج فيلم، وجمع أفلام مشابهة من FOVs (عادة عشر) متعددة كل عينة.
ملاحظة: كثافة الجزيئات واحدة في فوف واحد ينبغي أن لا عالية جداً--التي سوف تؤدي إلى تعقيد تحليل البيانات بجعل تعيين الكائن عبر الإطارات غامضة ولا منخفضة جداً--التي قد تؤدي إلى حدوث انخفاض الأحداث جزيء واحد على الحمض النووي- - تحسين كثافة الإضاءة حيث تكون جزيئات منضمة إلى السطح ساترة بسرعة صور مقصور على قمع الخلفية بينما جزيئات نشرها على الحمض النووي ليس مقصور بسرعة كبيرة جداً حتى أنه يمكن الكشف عن مسارات أطول.
ملاحظة: نحن عادة استخدام 200-800 واط/سم 2 كثافة الطاقة في فوف.
- 10,000 جمع الإطارات في الحقل لعرض واحد (FOV) لإنتاج فيلم، وجمع أفلام مشابهة من FOVs (عادة عشر) متعددة كل عينة.
- في نهاية الخطوة 4.6، لبث الحمض النووي تلطيخ صبغة للتأكد من أن جزيئات الحمض النووي لا يزال يمكن أن تمتد تدفق.
- تشغيل عينات مراقبة إيجابية وسلبية على حد سواء-
ملاحظة: عنصر تحكم إيجابية جيدة تيترابيبتيدي، تيتراميثيلرهوداميني (ترانسنيستريا)-كرر (جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية يقترن إلى أمين الطرفي ن) مما قد يعني ثابت نشر 1 د 10.5 ± 0.7 (الخطأ المعياري) M (بي 2/s) في الأس الهيدروجيني المحايدة 11. عنصر تحكم سلبي جيدة هو لقياس عينات مسماة من الفائدة في المخزن المؤقت للتحليل في قناة يحتوي على الحمض النووي لا المربوطة، حيث ينبغي أن يتم الكشف عن أي نشاط نشر على الحمض النووي-
5. تحليل البيانات:
ملاحظة: جسيم واحد مخصص تتبع البرمجيات يستخدم لتحديد مسارات الجزيئات واحدة نشرها على طول الحمض النووي، وتقدير ثوابت نشرها. ويحدد هذا البرنامج أولاً مواقف centroid جزيئات مفردة بدقة عالية، ويحدد جسيمات عالقة على سطح ساترة، وثم تربط الجسيمات في أطر مختلفة لتشكيل المسارات الوقت الفاصل بين. من هذه المسارات، تقدر الثوابت نشرها 1 د.
- للبدء في تحليل البيانات، وفتح برامج نصية (انظر الجدول للمواد)، وانتقل إلى الدليل للجسيمات واحدة تتبع البرمجيات. فتح البرنامج النصي المسمى " largedataprocess3.m ". هو معلمة واحدة هامة تعريف قيمة العتبة للكشف عن الجسيمات واحد. تشغيل
- لتحديد قيمة العتبة المثلى، " Determine_threshold_value.m " البرنامج النصي. هذا البرنامج النصي سوف تبين كيف يؤثر على قيمة عتبة الكشف عن الجسيمات مفردة. بعد تحديد قيمة العتبة المثلى، تشغيل " largedataprocess3.m " النصي
- بعد انتهاء جسيمات واحدة تتبع التحليل، تصفية المسارات الخام عن طريق تشغيل " Trajectory_filtering.m " البرنامج النصي. بنيت في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لتصور الخطوة التصفية. لوحة
- "في واجهة المستخدم الرسومية"، تعيين التشريد أدنى طول الحمض النووي، مينكسديسب، إلى 2 بكسل؛ تعيين تشريد القصوى عرضية للحمض النووي، ماكسيديسب، إلى 2 بكسل؛ تعيين الحد الأدنى لعدد الإطارات، مينفراميس، إلى 10؛ تعيين أقل عدد ممكن من الدول من الثلاثي، مينتريبليتس، إلى 10؛ تعيين ثابت نشر الحد الأدنى على طول الحمض النووي، D_par، 0؛ تعيين ثابت نشر المقدرة القصوى عرضية للحمض النووي، D_trans، على مسافة 10 أمتار (بي 2) S -1؛ تعيين معلمة إحصاء الحد الأدنى، وتشي _stat 2،-5؛ تعيين نسبة الحد الأدنى من التشرد على طول الحمض النووي لأن عرضية للحمض النووي، المينكس/Y، إلى 2-
ملاحظة: يتم سرد كافة المسارات الخام التي تمرر هذه تصفية المعلمات في الجدول 1، وتلك التي لا ترد في الجدول 3- - انقر على مسار الرقم في الجدول 1، سيتم تشريد المسار في الرسومات 1 & 2. انقر فوق " اللعب " الزر لتشغيل الصور الفلورية الخام. انقر فوق " Add_to_Table2 " لتحديد المسار كجزيء واحد ينزلق مساره. وفي النهاية، سيتم حفظ كافة المسارات إضافة إلى Table2 عند إغلاق واجهة المستخدم الرسومية-
- لحساب الثوابت يعني نشر، تشغيل البرنامج النصي " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". ثابت يعني نشر يقدر من مجموعة المسارات التي مرت جميع خطوات التصفية، وأضيفت إلى الجدول 2-
Representative Results
ويبين الشكل 2 ألف الكشف عن مسارات بفيك-Cy3B (بفيك: جفقسلكرركف؛ هو مترافق Cy3B إلى بقايا السيستين) جزيئات نشرها على الحمض النووي في 2 مم كلوريد الصوديوم المخزن المؤقت على درجة الحموضة 6.5. يتم نشر بفيك ثنائي الاتجاه ومدفوعة بالطاقة الحرارية المحيطة. وتقدر من هذه المسارات، الثوابت نشرها د 1 (D1 القيم) لكل مسار (انظر الرسم البياني في الشكل 2). ويحسب متوسط قيمة D1 المتقارن بفيك هذا إلى 22.2 ± 0.9 (الخطأ المعياري) M (بي2/ق) بحساب متوسط كل قيمة D1 عبر مسارات مرجحة بعدد المكالمات على التوالي موقف الثلاثي الوارد في كل مسار.
الشكل 1 : جهاز لتعقب حركة الجزيئات واحدة على طول الحمض النووي-
أ) PDMS ثماني قنوات رقاقة موائع جزيئية التمسك ساترة فونكتيوناليزيد التي يمكن أن تكون مربوطة الحمض النووي (مع الولايات المتحدة الأمريكية عمله الربع لمقياس)؛ ب) تدفق التخطيطي تكبير الخلية تظهر جزيئات الحمض النووي λ امتدت التدفق؛ ج) التخطيطي TIRF نظام المجهر وتدفق لتمتد الحمض النووي؛ د) TIRF صورة تدفق امتدت λ الحمض النووي؛ ه) صورة TIRF بفيك-Cy3B (بفيك: جفقسلكرركف؛ هو مترافق Cy3B إلى بقايا السيستين) ترتبط جزيئات دنا λ امتدت تدفق. وقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن2،12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نشر بفيك (جفقسلكرركف) على طول الحمض النووي أحادي الأبعاد.
أ)-نشر بفيك على طول تدفق امتدت λ-السلطات الوطنية المعينة (مسارات 137) في المخزن المؤقت لكلوريد الصوديوم 2 مم في درجة الحموضة 6.5. x(t) و y(t) من عمليات النزوح على طول وعرضية إلى λ-الحمض النووي، على التوالي. خطوط منقطة أفقية تشير إلى النقاط المفقودة الناتجة عن صبغ وامض. ب)-المدرج التكراري الثابت نشرها، D1 بفيك نشرها على طول λ-السلطات الوطنية المعينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
عند التبديل من خطوتين التقليدية ساترة الروغان رد الفعل بروتوكول إلى بروتوكول رد فعل خطوة واحدة، فقد لاحظنا أن موثوقية الروغان ساترة هو تحسن كبير. ما مجموع وقت التدريب العملي على إعداد ساترة أقل من ثلاثين دقيقة، نوصي بإعداد كوفيرسليبس جديدة تصوير جزيء واحد كل يوم ومن المعتزم. للحد من تدهور سيلاني-شماعة-البيوتين، ينبغي أن يكون الكاشف الكوتيد والمخزنة تحت ن2 الغاز الجاف في-20 درجة مئوية عند استلام. هنا نحن لا نستخدم شماعة الجزيئات التي تنتج-سجع– أو3 مجموعات المحطة الطرفية التي تم استخدامها في الماضي20-CH. واستخدمت الرسوم السلبية-سجع– الجماعات والمجموعات3 -CH مسعور لمنع الامتزاز غير محدد من جزيئات الحمض النووي والبروتين محددة عينات إلى السطح، على التوالي. نلاحظ الامتزاز السطحي منخفضا جداً بعينات الببتيد الصغيرة على السطح شماعة البيوتين منتهية بالكامل، بينما قد تكون مفيدة لفحوصات لبعض عينات البروتين سيلاني-شماعة-COOH و/أو سيلاني-شماعة-CH3 أو الاعتداء عندما الظروف (مثل درجة الحموضة < 7.5) تعزيز التفاعلات الحمض النووي من السطح.
التحول من الزجاج الشريحة تدفق الخلايا إلى تدفق PDMS الخلايا يسرع بناء خلية تدفق ويتيح التكامل السهل لقنوات متعددة. ونحن كثيرا ما مهندس ثماني قنوات كل خلية تدفق لتمكين ثماني تجارب مستقلة كل ساترة فونكتيوناليزيد. يمكن أن تستخدم لزيادة إنتاجية كل ساترة، إعداد أكبر من القنوات مايكرو ملفق.
فمن المستحسن لمنع تشكيل فقاعة هواء داخل القناة في أي نقطة بعد الملء الأولية. عادة، لا تسبب فقاعات الهواء خسارة المربوطة السلطات الوطنية المعينة (على الرغم من أن هذا أمر ممكن)، ولكن بدلاً من عرقلة تدفق وربما تسبب السلطات الوطنية المعينة على التمسك ساترة. المخزن المؤقت ولﻵﻻت وإضافة كميات صغيرة من السطح عادة فعالة في منع تشكيل فقاعة داخل الأنابيب وتدفق القناة. وفي الحالات التي أدخلت فيها فقاعات الهواء إلى الأنبوب، في محاولة لطرد الفقاعات تحت تدفق بطيء، والتأكد من أن أنها لا تتدفق من خلال المنطقة حيث يتم المربوطة السلطات الوطنية المعينة.
برنامج تحليل بيانات مبسطة وفعالة أمر بالغ الأهمية، نظراً لكمية ضخمة من البيانات التي تم إنشاؤها. عادة ما نجمع 700,000 الصور ذات الدقة العالية من قياسات تدفق واحد الخلية، التي يمكن معالجتها باستخدام لدينا الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرمجيات خلال يوم واحد على جهاز كمبيوتر سطح مكتب مع ذاكرة سعة 32 جيجابايت ومعالج رباعي. هو نموذج يعتمد معدل الإيجابية الكاذبة للكشف عن مسارات نشر د 1 من البرنامج (الخطوة 5، 5) ويمكن أن تكون منخفضة للغاية بالنظر إلى أن: 1) كثافة الجزيئات واحدة في فوف منخفضة بما يكفي حتى أن هناك القليل من الغموض ربط الجزيئات عبر الإطارات ( عينات البروتين بشكل عام أكثر عرضه الامتزاز غير محدد ساترة من عينات الببتيد، وهكذا، المخزن المؤقت وكثافة الطاقة لكل بروتين العينة يحتاج إلى أن يكون الأمثل)؛ 2) إشارة إلى نسبة الضوضاء من جزيئات مفردة عالية بما يكفي حتى يكون احتمال وقوع خطأ-تحديد جزيئات منخفضة. لا يزال، البرنامج يمكن أن يخطئ أحياناً، ونوصي بالتفتيش اليدوي للبيانات باستخدام واجهة المستخدم الرسومية المتوفرة لتقييم أداء البرامج. في أحد تطبيقات حساسة بشكل خاص للكشف عن مسار إيجابية كاذبة، عملية بما في ذلك قيمة العتبة، مينفراميس، مينتريبليتس، وتشي2_stat يمكن إعداد المعلمات أكثر صرامة على حساب أقل حساسية لربط صحيح الأحداث، ويحتمل أن تكون أكبر من التحيز الإحصائية في تحديد مسار. ونحن هنا مشاركة وتصف الجسيمات واحدة لدينا تتبع البرمجيات على أمل المساعدة في توحيد أساليب تحليل البيانات، وحفز النقاش حول أفضل الممارسات.
لدينا بروتوكول، الأمر الذي يتطلب استمرار تدفق أثناء التصوير للحفاظ على الدولة امتدت من جزيئات الحمض النووي قالب، يمكن أن التحيز تدفق السائل بنقل بعض البروتينات على طول قوالب الحمض النووي إذا كانوا منتشر بالتنقل إليه أو هيدرودينامية دائرة نصف قطرها فلوروفوري المسمى هو كبير22،23. في حين يمكن قياس مثل هذا التحيز وتصحيحها في معظم مجموعات البيانات، نقل البروتينات المسمى مع فلوروفوري صغيرة ونشرها باستخدام إليه انزلاق لا عادة متحيزة إلى حد لا يمكن اكتشافها بتدفق2،4، 24. جدير بالذكر أن تأثير سرعة تدفق على نقل البروتينات على طول الحمض النووي قد استخدمت لدراسة آليات البروتين نشرها على طول الحمض النووي23. أ عن كثب المتصلة بالنهج البديلة التي تمكن القياسات في الغياب تدفق تستخدم قوالب الحمض النووي مع البيوتين في كلا تيرميني عابر وتستنفد في تدفق والمربوطة بطرفي إلى ساترة مثل بقاء جزيئات الحمض النووي في التكوين الموسع عند إيقاف التدفق25،26،،من2728. نهج مزدوج-حبل في الاستفادة من السماح للتجارب الحرة تدفق النقل ولكن يتطلب تعديل طرفي من جزيئات الحمض النووي القالب، التحكم بالانسياب الدقيق أثناء الربط، وتميز المسافات بين موقعين المربوطة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تقييم أثر التوترات غير متجانسة وديناميات conformational الحمض النووي عبر جزيئات الحمض النووي في فحص جزيء واحد.
بالإجمال، بالإضافة إلى دراسة نشرها د 1 من الجزيئات على طول الحمض النووي، يمكن أن تستفيد الإنزيم جزيء واحد كما ذكرت كثيرة في المختبر الكيمياء الحيوية والدراسات الفيزيائية-الحيوية على مستوى جزيء واحد بما في ذلك الحمض النووي تستهدف عمليات البحث التي الأنشطة الانزيمية على الحمض النووي والبروتينات، وأكثر.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
المشكلة 1: قنوات تدفق تسرب.
الحل: أولاً، تأكد من أن يسمح تصميم قنوات تدفق مالا يقل عن 1.5 مم الهامش لختم حولها وبين القنوات؛ ومن ثم، أثناء الجمعية العامة للخلية تدفق، تأكد من أن الاتصال السطوح بين ساترة والشريط اللاصق المزدوج ولوح PDMS مسطحة وجافة وخالية من الحطام، وأن الضغوط التي مورست لتشكيل الختم موحدة، وأن عملية التشميع المنجز في درجة حرارة الغرفة.
المشكلة 2: كثافة المعينة المربوطة منخفضة جداً.
الحل: هذه المشكلة تنشأ عندما كفاءة الروغان شماعة منخفض أو لا يتم فونكتيوناليزيد جزيئات الحمض النووي مع البيوتين. من خلال تجربتنا، ينبغي أن تكون كثافة الحمض النووي المربوطة مرتفعة بالنسبة > 90% كوفيرسليبس إعداد من الطازجة أو المخزنة بشكل صحيح كاشف سيلاني-شماعة-البيوتين. في الحالات عندما ينخفض كثافة الحمض النووي المربوطة بدفعه ثبت من البيوتين-λ-الحمض النووي، حاول زيادة تركيزات سيلاني-شماعة-البيوتين خلال شماعة الروغان وتركيزات streptavidin والبيوتين-λ-الحمض النووي أثناء الربط الحمض النووي. إذا فشل ذلك، استبدال الكواشف شماعة وستريبتافيدين.
مشكلة 3: السلطات الوطنية المعينة التمسك ساترةلا يمكن أن تمتد د بالتدفق.
الحل: يمكن أن تنشأ هذه المشكلة أيضا عند كفاءة الروغان شماعة منخفض، ويتفاقم بمقايسة انخفاض الأس الهيدروجيني. حاول تتدفق في أكثر جيش صرب البوسنة أو رفع درجة الحموضة (على سبيل المثال إلى 8.0) للمساعدة في قمع الدنا بالامتزاز على السطح (الخطوة 4.3.2). إذا كان الدنا بالامتزاز مشكلة مستمرة تحت شرط فحص خاصة، حاول بما في ذلك تصل إلى 90% سيلاني-شماعة-COOH خلال الروغان الوتد.
و يلاحظ من تحليل البيانات:
نحن نستخدم الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرامج لتحديد مسارات الجزيئات واحدة نشرها على طول الحمض النووي، ومن الذي يقدر على ثوابت نشر د 1، D1. من أجل تحسين تحليل البيانات، قمنا بتنفيذ خوارزمية التماثل شعاعي18 لإضفاء الطابع المحلي على الجسيمات و مقدر على أساس التباين19 د 1 نشر الثوابت، التي سرعت هائلا في تحليل البيانات دون المساس بتقدير دقة. سابقا يمكننا التحقق من صحة برامج مخصصة بتحليل بيانات المحاكاة11. فيما يلي الخطوات الرئيسية.
تحديد الجسيمات:
هذه الخطوة لكشف وتجزئة الجسيمات-البقع حيود محدودة-من الخلفية. أولاً، مكانياً الفرقة-تمرير تصفية الصور لتعزيز إشارات الجسيمات في 3-5 بكسل النطاق (والذي يتوافق مع حجم انتشار نقطة مهمة في نظامنا) ثم عتبة استناداً إلى كثافة (انظر البرنامج النصي: spt2_SD_sandbox.m).
تعيين centroid
تجزئة الصورة فقط يموضع الجزيئات على مستوى بكسل القرار المكانية. إلى ترجمة الجزيئات بكثير من الدقة أعلى، توظيف التماثل شعاعي القرار سوبر خوارزمية18 للصور التي تمت تصفيتها كما ذكر أعلاه. (هذا الأسلوب يستند حساب تحليلي وهكذا يقلل إلى حد كبير عبء الحسابية مقارنة مع أساليب أخرى عالية الدقة شعبية مثل تركيب غاوسي 2D (انظر البرنامج النصي: spt2_SD_sandbox.m).)
الجسيمات التي تتبع:
لتتبع مسار الجسيمات عبر الزمن، أننا يجب إعادة تعريف الجسيمات نفسها أنها تتحرك بين الإطارات. ونحن نعتبر مراحل بدء وتطرف، وإنهاء لتكون مكونات مسار. نحن تحد من الربط بين الجزيئات في الأطر الحالية لتلك التي تظهر في الإطارات السابقة بتشريد الحد الأقصى المسموح به لكل إطار. في الحالات التي تكون فيها الروابط متعددة ممكنة، يتم استخدام الخوارزمية جونكر-فولجينانت أن تسفر عن مجموعات الربط الأمثل على الصعيد العالمي (انظر البرنامج النصي: traceTraj4_kx.3.m).
تقدير D1:
لتقدير القيم D1 من المسارات، فإننا نستخدم مقدر على أساس التباين المشترك (CVE)19. يستند حساب تحليلي، هذا الأسلوب حسابياً أكثر كفاءة ودقيق إحصائيا أكثر من أخرى يشيع استخدام أساليب مثل انحدار تشريد التربيعية يعني (انظر البرنامج النصي: runspt5_SD.m).
مسار تصفية:
بعض المسارات تحتوي على القطع الأثرية مثل الارتباط بجزيئات السطح زمنياً ويجب إزالته. قمنا بتنفيذ العديد من الميزات مثل التشريد أدنى موازية للحمض النووي، والحد الأقصى التشرد عرضية للحمض النووي، والحد الأدنى من طول المسار، وأقل عدد ممكن من الثلاثي على التوالي الكشف عن المواقف، ودرجة احتمال الحد الأدنى (انظر شيونغ et al11 للتعريف) التي يمكن تصفيتها لعزل مجموعة الحد الأدنى متحيزة من المسارات المحتمل لتمثيل الجزيئات نشرها على الحمض النووي (انظر البرنامج النصي: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
قد يختار المعهد واسع ملف طلبات براءات الاختراع التي تشمل جوانب العمل المقدمة هنا.
Acknowledgments
ونشكر توني كليسا وروبن كيركباتريك ايفانجيلوس جاتزوجيانيس للمساعدة في إعداد الأجهزة الأولية واختبار. ونشكر كذلك توني كوليسا لمساعدة هامة كتابة وتقييم الجسيمات واحدة مخصصة تتبع البرمجيات. هذا العمل كان يدعمها تمويل بدء التشغيل و "جائزة المهنة" في "الواجهة العلمية" (لثنائي الفينيل متعدد الكلور) من مؤسسة ويلكوم بوروز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
