Summary
Denne protokol viser en enkel, robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle flow-stretching assay for at studere endimensional (1D) udbredelse af molekyler langs DNA.
Abstract
Vi beskriver en enkel, robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle flow-stretching assay for at studere 1D diffusion af molekyler langs DNA. I denne analyse, er glas coverslips functionalized i en et-trins reaktion med silan-PIND-biotin. Flow celler er opbygget af sandwiching en selvklæbende tape med præ-cut kanaler mellem en functionalized coverslip og en PDMS slab indeholdende indsugnings- og udstødningsporte huller. Flere kanaler er integreret i ét flow celle og strømmen af reagenser til hver kanal kan være fuldt automatiseret, hvilket betydeligt øger assay overførselshastighed og reducerer hands-on tid pr. assay. Inde i hver kanal, biotin-λ-DNAs er immobiliseret på overfladen og en laminar flow er anvendt for at flow-strækning de udpegede nationale myndigheder. DNA-molekyler er strakt til > 80% af deres contour længde og tjene som rumligt udvidet skabeloner for at studere de bindende og transport aktivitet af fluorescently mærket molekyler. Baner af enkelt molekyler spores af time-lapse Total interne Reflection fluorescens (JOHANNAS) billeddannelse. RAW-billeder er analyseret ved hjælp af strømlinede brugerdefinerede enkelt partikel tracking software til automatisk identificere baner af enkelt molekyler spreder langs DNA og vurdere deres 1D diffusion konstanter.
Introduction
En mangeårige problem i biologi er hvordan endogene proteiner, der virker på specifikke steder i genomet kan finde deres DNA mål hurtigt nok for organismen at overleve og reagere effektivt på sine omgivelser. Undersøgelser i de sidste fyrre år har foreslået og i høj grad støtte den hypotese, at kinetik af DNA målrette søgning af et protein kan fremskyndes ved lettet diffusion som proteinet veksler mellem 3D diffusion i bulk og 1D diffusion (herunder glidende og hopping processer) langs DNA1. Det er nu kendt, at mange proteiner involveret i genregulering, nukleinsyre metabolisme og andre processer er i stand til at glide på DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Derudover rapporterede nylige undersøgelser, at selv små peptider kan binde til og glide på DNA, med evnen til at transportere en last; for eksempel, et protein molekyle eller PCR primer, langs DNA10,11,12,13,14.
I de sidste 15 år, har enkelt molekyle flow-stretching assay været udbredt at studere bindende og diffusion af molekyler langs DNA2,15,16. I denne type analyse, biotinylated dobbelt-strenget DNA molekyler er immobiliseret på overfladen og en laminar flow anvendes til flow strække DNA. Den > 80% strakt DNAs tjene som rumligt udvidede skabeloner for at studere bindende og transport aktivitet af molekyler, mærket med fluorophores hvor baner af enkelt molekyler langs DNA spores af time-lapse fluorescens billeddannelse. I vores gennemførelse, optimeret til reproducerbarhed og brugervenlighed, denne analyse består af fem store skridt: forberedelse af biotin-λ-DNA, coverslip functionalization, flow celle konstruktion, fluorescens billedbehandling og analyse af data. I tidligere protokoller17, blev glas coverslips functionalized af første reagerer med (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) og derefter med Amin-reaktiv polyethylenglycol (PEG) reagenser (fx NHS-PIND-biotin) til at danne en PIND lag, der modstår uspecifik adsorption af assay komponenter til coverslip overflade. Kvaliteten af functionalized coverslips afhang i høj grad kvaliteten af PIND reagenser og reaktionsbetingelser på hvert trin. Vores protokol beskriver en forenklet functionalization protokol og multiplex flow celle konstruktion, som kræver ingen flydende lim eller helbredelse tid på dagen flow celler er samlet. Vi beskriver også en strømlinet og robust data analyse procedure11 der fjerner beregningskrævende regression trin ved at anvende en radial symmetri metode for barycentrum lokalisering18 og en Kovarians-baserede diffusion konstant estimator19.
Her rapporterer vi en enkel, robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle flow strækker assay gennemførelse med betydelige forbedringer i coverslip functionalization, flow celle konstruktion og analyse af data. Navnlig, udviklede vi en et-trins coverslip functionalization protokol, hvori rene og tørre coverslips reagere direkte med silan-PIND-biotin. Denne protokol forenkler coverslip forberedelse og forbedrer pålideligheden af kvaliteten af functionalized overflader i forhold til standard totrins reaktion protokol. Vi beskriver brug af så functionalized coverslips med multi-kanal PDMS flow celler, der giver mulighed for robust slanger forbindelser skal foretages uden lim. Disse flow celler yderligere omfatter flere computer-kontrollerede fjorde for kamrene strøm som aktiverer automatiseret reagens flow til at reducere hands-on tid under opsætning og øget assay overførselshastighed.
Protocol
1. forberedelse af biotin-λ-DNA
Bemærk: Biotin-λ-DNA-molekyler er udarbejdet af ligating et biotin-mærket oligonukleotid, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - biotin - 3 ' til Λ-DNA molekyler 20.
- Forbered 0.1 mM biotin mærket oligo i TE buffer.
- Varme 0,5 mg/mL λ-DNA status på 65 ° C i 60 s, og springet ind i våde ice lige væk.
Bemærk: Hurtig dæmpningen køling reducerer λ-DNA concatemerization. - Afpipetteres 100 µL af opløsningen λ-DNA ind i et microcentrifuge rør.
- Tilføje 1 µL af 0,1 mM oligo i 9 µL af TE buffer.
- Tilføje 2 µL af opløsningen oligo til det microcentrifuge rør indeholdende λ-DNA. Blandes grundigt.
Bemærk: Oligo er til stede i ca en 12-fold kindtand overskud over supplerende λ-DNA ende. - Opvarme λ-DNA/oligo blandingen på 65 ° C i 60 s.
- Langsomt afkøles blandingen til stuetemperatur.
Bemærk: Dette trin giver mulighed for oligo at anneal til supplerende λ-DNA slutningen. - Placer blandingen på is. Tilføje 11 µL af T4 DNA ligase reaktion buffer (endelige buffer koncentration 1 x). Bland forsigtigt. Derefter tilsættes 2 µL (800 enheder) af T4 DNA ligase enzym. Bland forsigtigt.
- Ruger blanding i 2 timer ved 16 ° C eller natten over ved 4 ° C.
- Rense den fabrikat benytter centrifugal filter rør med en nominel molekylvægt grænse på 100 kDa. Specifikt, overføre trin 1.9 blandingen til en centrifugal filter rør og centrifugeres ved 14.000 x g i 5 min, vask med 400 µL TE buffer to gange, og indsamle de renset produkt.
Bemærk: De som renset biotin-λ-udpegede nationale myndigheder i TE buffer er stabile ved-20 ° C i op til et år.
2. Coverslip functionalization
NOTE: glas coverslips er functionalized ved at reagere med silan-PIND-biotin. Denne et-trins reaktion protokol er enklere og mere pålidelige i vores erfaring end standard totrins reaktion protokol 20. Coverslip functionalization med silan-PIND-biotin skaber bindingssteder for streptavidin og minimerer uspecifik DNA og protein adsorption til coverslip overflade.
- Sonicate fem no. 1 coverslips 95% ethanol inde en farvning krukke i 10 min. og skyl derefter med ultrarent vand til tre gange.
Bemærk: Den femte coverslip giver et ekstra i tilfælde af brud. - Fyld farvning krukken med 1 M KOH, Læg instrumenterne i ultralydsbad i 10 min. og skyl derefter med ultrarent vand tre gange.
- Gentage 2.1-2.2 cyklus dobbelt.
- Tør coverslips under rene og tørre N 2 gasstrømmen.
- Yderligere rense og tørre coverslips ved anvendelse af plasma luftbehandling på 900 mTorr pres i 5 min.
- Ruger coverslips med 25 mg/mL silan-pind-biotin opløst i 95% ethanol ved stuetemperatur til 2 h. specifikt, sandwich 50 µL silan-pind-biotin løsning mellem to rene og tørre coverslips og inkuberes i coverslip " Smørrebrød " inde i en lukket pipette tip kasse med ca. 10 mL med vand i bunden (ikke i kontakt med coverslips) at minimere opløsningsmiddel fordampning.
- Vaske væk overskydende PIND molekyler med ultrarent vand og tør PIND belagt coverslips under rene tørre N 2 gasstrømmen.
Bemærk: De functionalized coverslips kan gemmes til tre dage omgivende betingelser.
3. Flow celle konstruktion
Bemærk: Flow celler er opbygget af sandwiching en dobbelt-klæbende tape med præ-cut kanaler mellem en PIND functionalized coverslip og en PDMS slab indeholdende indsugnings- og udstødningsporte huller. Flere kanaler er integreret pr. flow celle.
- Design flow kanaler i en CAD software og skære kanaler (bredde, dybde og længde af hver kanaler er 1, 0,13 og 12 mm, henholdsvis) på en dobbelt-klæbende tape ved hjælp af en tape cutter (typisk otte kanaler er integreret pr. flow celle). Fjern tape residualer for at danne flow kanaler.
- At gøre PDMS plader, blandes grundigt 45 g PDMS med 5 g crosslinking reagens (nok til at gøre tolv 5-mm tykke PMDS plader som kan gemmes på ubestemt tid under normale forhold) bruger en mixer, hæld blandingen i to petriskåle med 10 cm, og forlade den retter inde i en vakuumkammer indtil det væsentlige alle luft bobler er væk (manuelt fjerne luftbobler hvis nogen fortsat når retterne er fjernet fra den vakuumkammer). Derefter overføre retterne i ovn 80 ° C indtil PDMS størkner (ca 2 h).
- Skære en PDMS slab, der svarer til størrelsen af den dobbelt-klæbende tape med præ-cut-kanaler. Skræl en beskyttelsesfilm ud dobbelt-klæbende tape og overholde filmen en flat face af PDMS slab. Punch luftindtag og -udtag hullerne på PDMS slab bruger en biopsi hul-puncher med en 23 Gauge kanyle.
- Skræl den anden beskyttelsesfilm fra dobbelt-klæbende tape og overholde PDMS-tape forsamlingen at functionalized overfladen af coverslip (Sørg for at coverslip er flade. Se et billede af en færdigsamlet flow celle i figur 1a).
4. JOHANNAS Imaging
Bemærk: Biotin-λ-DNAs er bundet til en flow-kanal overflade og laminar flow anvendes til flow strække DNA molekyler ( figur 1b). Den > 80% strakt DNA molekyler tjene som rumligt udvidede skabeloner for iagttage den bindende og transport aktivitet af fluorescently mærket molekyler. Baner af enkelt molekyler spores af time-lapse JOHANNAS imaging ( figur 1 c & e).
- Fix cellen flow på et mikroskop fase og belastning pre afgassede Tom buffer (10 mM natriumfosfat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM ethanol, 5% (v/v) glycerol, 0,01% Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL streptavidin løsning, 1 mg / mL bovint serumalbumin (BSA) løsning og 100 pM biotin-λ-DNA løsning i fire reservoirer, hver har en Tygon slange tilsluttet en magnetventil værdi og en anden Tygon slange tilsluttet en PEEK slanger af sleeving Tygon slanger over mindre PEEK slanger ( forhindrer tilbageløb af reagenser). Degas små mængder af buffer af overnight eksponering at støvsuge eller kortere eksponering for vakuum med omrøring (indtil boblerne er ikke længere synlig).
- Indsætte PEEK slangen af Tom buffer reservoir i et indløb hul af cellen flow. Prime kanalen af flydende i tom buffer, og indsætte tre andre PEEK slanger i inlet huller lufttrykket drevet flow af hver reagens er kontrolleret af magnetventiler og fuldt automatiseret via en computer script. Vær omhyggelig med ikke at fremkalde luft boble dannelse i kanalen.
- Tilslut et Tygon rør med et kort kig slangen fra outlet-hul til en spildbakken. Kort kig slangen ved afgangen hjælper undertrykke luft boble dannelse under infusion af opretholde overtryk inde i kanalen.
- Tøjring biotin-λ-DNA molekyler til en flow-kanal overflade.
- Flow i 0,2 mg/mL streptavidin løsning, inkuberes i 5 min og derefter flow i tom buffer til at vaske ud den ubundne streptavidin.
- Flow i 1 mg/mL BSA løsning, inkuberes i 1 min og derefter flow i tom buffer til at vaske ud den ubundne BSA.
Bemærk: BSA yderligere undertrykker DNA og prøve adsorption på overfladen. - Flow i 100 pM biotin-λ-DNA løsning, inkuberes i 10 min og derefter flow i tom buffer til at vaske ud de ubundne DNAs.
Bemærk: Efter DNA er bundet til overfladen, undgå hurtige strømme for at undgå skader på tøjret DNA-molekyler.
- Til at kontrollere kvaliteten af de functionalized coverslip, flow i DNA farvning farvestof såsom Sytox orange betingelser analysen skal anvendes (Læs 4.6 nedenfor), og starte fluorescens imaging under 532 nm laser belysningsstyrke.
Bemærk: Kvaliteten af den functionalized coverslip er typisk godt og tætheden af flow strakt DNA molekyler bliver høj. Det er vigtigt at have en tilstrækkelig høj tæthed af flow strakt DNA molekyler, så DNA bindende og glidende / 1D diffusion begivenheder kan observeres. - Fine tune JOHANNAS vinkel at opnå bedste signal støjforhold af billeder af strakte DNA molekyler ( fig. 1 d).
- At optage baner af enkelt molekyler bevæger sig langs DNA, Gentag trin 4.2-4.4 inde i en ny kanal (uden DNA farvning farvestof), derefter indgyde pre afgassede sub-nanomolar fluorophore mærket molekyler på en høj nok gennemstrømning ved hjælp af en sprøjte pumpe og indsamle time-lapse fluorescens billeder med en billedhastighed på 100 Hz.
Bemærk: En flow-hastighed svarende til en Weissenberg nummer (trådløs: dimensionsløs produktet af den længste polymer afslapning tid - ca 0,2 s for λ-DNA- og shear rate - ændringen i strømningshastighed med afstand fra coverslip overfladen) 500 inde den kanal anbefales til enkelt molekyle imaging med en billedhastighed på 100 Hz 21.- Indsamle 10.000 rammer i en Field Of View (FOV) til at producere en film, og indsamle lignende film fra flere (typisk ti) FOVs pr. sample.
Bemærk: Tætheden af én partikler i en FOV skal være hverken for højt - som vil komplicere dataanalyse ved at gøre objektet tildeling på tværs af rammer tvetydige, heller ikke for lav - som kan føre til lav forekomst af enkelt molekyle begivenheder på DNA. - Optimere belysning intensitet, så molekyler er bundet til coverslip overfladen er hurtigt foto-bleget at undertrykke baggrund, mens molekyler spreder på DNA ikke er bleget for hurtigt, således at det længere baner.
Bemærk: Vi bruger typisk 200-800 W/cm 2 effekttæthed i FOV.
- Indsamle 10.000 rammer i en Field Of View (FOV) til at producere en film, og indsamle lignende film fra flere (typisk ti) FOVs pr. sample.
- i slutningen af trin 4.6, indgyde DNA farvning farvestof for at bekræfte, at DNA molekyler stadig kan være strøm-strakt.
- Køre både positive og negative kontrolprøver.
Bemærk: En god positiv kontrol er et tetrapeptid, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR er koblet til den N-terminale Amin) som har en gennemsnitlig 1D udbredelse konstant af 10,5 ± 0,7 (standardfejl) M (bp 2/s) på neutral pH 11. En god negative kontrol er at måle mærket prøver af interesse i analysebuffer i en kanal, der har ingen DNA tøjret, hvor ingen på DNA diffusion aktivitet bør påvises.
5. Dataanalyse:
NOTE: en brugerdefineret enkelt partikel tracking software bruges til at identificere baner af enkelt molekyler spreder langs DNA og anslå diffusion konstanter. Denne software bestemmer først barycentrum positioner af én partikler med høj nøjagtighed, identificerer partikler, der sidder fast på coverslip overflade, og derefter forbinder partikler i forskellige rammer til at danne time-lapse baner. Fra disse baner, 1D diffusion konstanter er anslået.
- At starte dataanalyse, åbne en scripting software (se tabel over materialer) og gå til mappen af enkelt partikel tracking software. Åbne script opkaldt " largedataprocess3.m ". En vigtig parameter til defineres er tærskelværdien for enkelt partikel påvisning.
- Til at bestemme den optimale tærskelværdi, køre den " Determine_threshold_value.m " script. Dette script vil angive, hvordan værdien for tærskel påvirker enkelt partikel påvisning. Efter bestemmelse af de optimale tærskelværdi, køre den " largedataprocess3.m " scriptet
- Efter afslutningen af enkelt partikel tracking analyse, filtrere de rå baner ved at køre den " Trajectory_filtering.m " script. En grafisk User Interface (GUI) er bygget at visualisere filtreringsprocessen.
- På GUI panel, angive minimal forskydning langs DNA, MinXDisp, til 2 pixel sat den maksimale forskydning tværgående til DNA, MaxYDisp, til 2 pixel angive det minimale antal rammer, minFrames, til 10; angive det minimale antal stater af triplet, minTriplets, 10; angive minimal diffusion konstant langs DNA, D_par, til 0; angive maksimal anslået udbredelse konstant tværgående til DNA, D_trans, til 10 M (bp 2) S -1; indstille minimal statistik parameter, Chi 2 _stat, til -5; angive minimal forholdet mellem forskydning langs DNA til at tværgående til DNA, MinX/Y, 2.
Bemærk: Alle rå baner, der passerer disse filtrering parametre er angivet i tabel 1, og dem, der ikke er angivet i tabel 3. - Klik på en bane nummer i tabel 1, bane vil blive fordrevet i grafik 1 & 2. Klik på den " spille " knappen for at spille rå fluorescens billeder. Klik på den " Add_to_Table2 " til at identificere bane som et enkelt molekyle glidende bane. I sidste ende alle baner tilføjet til Tabel2 gemmes, når du lukker GUI.
- Til at beregne de gennemsnitlige diffusion konstanter, køres scriptet " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Den gennemsnitlige diffusion konstant anslås fra sæt af baner, der har bestået alle filtrering trin og føjet til tabel 2.
Representative Results
Figur 2a viser de fundne baner af pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B er konjugeret med cystein restkoncentrationer) molekyler spreder på DNA i 2 mM NaCl buffer til pH 6,5. Udbredelsen af pVIc er bi-directional og drevet af omgivende termisk energi. Fra disse baner, 1D diffusion konstanter (D1 værdier) er anslået til hver bane (Se histogram i figur 2b). Gennemsnitlige D1 værdien af denne pVIc konjugat beregnes for at være 22,2 ± 0,9 (standard fejl) M (bp2/s) af gennemsnit hver D1 værdi på tværs af baner vægtet efter antallet af triplet træk position opkald indeholdt i hver bane.
Figur 1 : Apparat til sporing af bevægelse af enkelt molekyler langs DNA.
a) en otte-kanals PDMS mikrofluid chip levet op til en functionalized coverslip som DNA kan bindes (med USA kvartal mønt for skala); b) flow celle zoom skematisk viser flow-strakt λ-DNA molekyler; c) skematisk JOHANNAS mikroskop og flow system for stretching DNA; d) JOHANNAS billede af en flow-strakt λ-DNA; e) JOHANNAS billede af pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B er konjugeret med cystein restkoncentrationer) molekyler er bundet til en flow-strakt λ-DNA. Dette tal er blevet ændret med tilladelse2,12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Endimensional diffusion af pVIc (GVQSLKRRRCF) langs DNA.
a). udbredelse af pVIc langs flow strakt λ-DNAs (137 baner) i 2 mM NaCl buffer til pH 6,5. x(t) og y(t) er forskydninger langs og tværgående λ-DNA, henholdsvis. Stiplede streger indikere manglende point skyldes farvestoffet blinker. b). Histogram af konstanten diffusion, D1 til pVIc spreder langs λ-DNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Når du skifter fra traditionelle to-trins coverslip functionalization reaktion protokol til en et-trins reaktion protokol, bemærket vi, at pålideligheden af coverslip functionalization er væsentligt forbedret. Da den samlede hands-on tid for coverslip forberedelse er mindre end 30 min, anbefaler vi forbereder friske coverslips hver dag enkelt molekyle imaging er planlagt. For at minimere forværring af silan-PIND-biotin, skal reagenset aliquoted og opbevares under tørre N2 gas ved-20 ° C ved modtagelsen. Her bruger vi ikke PIND molekyler, der producerer -COO- eller -CH3 terminal grupper, der har været brugt i de sidste20. De negative afgifter -COO- grupper og de hydrofobe -CH3 grupper blev udnyttet til at forhindre uspecifik adsorption af DNA-molekyler og specifikke protein prøver til overfladen, henholdsvis. Vi observerer meget lav overflade adsorption af lille peptid prøver på den fuldt biotin-afsluttet PLØK overflade, mens silan-PIND-COOH og/eller silan-PIND-CH3 kan være nyttige for assays af visse protein prøver eller Hvornår assay betingelser (såsom pH < 7,5) fremme DNA-overflade interaktioner.
Skift fra glas dias flow celler til PDMS flow celler hastigheder op flow celle konstruktion og giver mulighed for nem integration af flere kanaler. Vi ingeniør ofte otte kanaler pr. flow celle aktivere otte uafhængige forsøg pr. functionalized coverslip. For at øge gennemløb pr. coverslip, kunne endnu større antal mikro-fabrikeret kanaler bruges.
Det er tilrådeligt at undgå luft boble dannelse inde kanalen på ethvert tidspunkt efter indledende påfyldning. Normalt, luftbobler ikke forårsager tab af tøjret DNAs (selv om dette er muligt), men snarere afbryde strømmen og muligvis forårsage DNAs at holde sig til coverslip. Buffer afgasning og tilsætning af små overfladeaktivt mængder er typisk effektive til at forebygge boble dannelse inden for slanger og flow-kanal. I tilfælde hvor luftbobler er introduceret til slangen, forsøge at skylle boblerne ud under en langsom flow og sørg for, at de ikke flyder gennem regionen hvor DNAs er tøjret.
En strømlinet og effektiv data analyse software er kritisk, på grund af den enorme mængde af data, der genereres. Vi indsamler normalt 700.000 højopløsningsbilleder fra målinger på en flow-celle, som kan behandles ved hjælp af vores tilpassede enkelt partikel tracking software inden for en dag på en stationær computer med en quad-core processor og 32 Gb hukommelse. Den falske positive sats af afsløre 1 D diffusion baner af softwaren (trin 5.5) er udsnit afhængige og kan være ganske lav da: 1) tætheden af én partikler i FOV er lav nok, så der er lidt uklarhed forbinder partikler på tværs af frames ( protein prøver generelt er mere tilbøjelige til uspecifikke adsorption til coverslip end peptid prøver, og således bufferen og effekttæthed for hvert protein prøve skal optimeres); 2) signalet støjforhold af én partikler er høj nok, så sandsynligheden for falske-identifikation af partikler er lav. Stadig, softwaren kan gøre lejlighedsvis fejl, og vi anbefaler manuel kontrol af data, der anvender den medfølgende GUI til at evaluere software ydeevne. I et program, der er særligt følsomme over for falsk-positive bane påvisning, kan procesparametre herunder tærskelværdi, minFrames, minTriplets og Chi2_stat indstilles mere stringent på bekostning af lavere følsomhed for sande bindende begivenheder og potentielt større statistiske bias i bane identifikation. Vi her deler og beskrive vores enkelt partikel tracking software med håb om at hjælpe standardisere data analysemetoder og stimulere diskussionen om bedste praksis.
I vores protokol, som kræver kontinuerlig flow under imaging for at opretholde den strakte tilstand af DNA skabelon molekyler, kunne den flydende flow skævhed transport af nogle proteiner langs DNA skabeloner, hvis de diffuse af en hopping mekanisme, eller hvis den hydrodynamiske radius af mærket fluorophore er store22,23. Mens sådanne bias kan måles og korrigeret i de fleste datasæt, transport af proteiner markeret med et lille fluorophore og spreder af en glidende mekanisme er ikke typisk forudindtaget påviselige omfang af flow2,4, 24. Især er virkningen af strømningshastighed på transport af proteiner langs DNA blevet brugt til at studere mekanismerne af protein spreder langs DNA23. A tæt relaterede alternativ tilgang, der giver mulighed for målinger i mangel af flow udnytter DNA skabeloner med biotin på både termini, forbigående strakte sig i flow og tøjret ved begge ender til coverslip sådan at DNA molekylerne forbliver i en udvidet konfiguration når strømmen er slukket25,26,27,28. Dobbelt-tether fremgangsmåde har fordelen, at flow-gratis transport eksperimenter men kræver ændring af begge ender af DNA skabelon molekyler, omhyggelig flow-styring under tethering, og kendetegner afstande mellem de to tøjrede sites. Derudover vurderes virkningen af heterogene spændinger og DNA konformationelle dynamikker på tværs af DNA molekyler på enkelt-molekyle assay.
Helt, ud over at studere 1 D diffusion af molekyler langs DNA, som rapporterede enkelt molekyle assay kan gavne mange i vitro biokemiske og biofysiske undersøgelser på enkelt-molekyle niveau herunder DNA målrette søgeprocesser af proteiner, enzymaktiviteter på DNA, og meget mere.
Fejlfinding
Problem 1: Flow-kanaler lække.
Løsning: Først, sørge for, at udformningen af flow kanaler giver mindst 1,5 mm margen for forsegling omkring og mellem kanaler; og derefter, under montagen af cellen flow, Sørg for at støtteflade mellem coverslip, dobbelt-klæbende tape og PDMS slab er flad, tør og fri for snavs, at pression for at danne en forsegling er ensartet, og at handlingen forsegling er udføres ved stuetemperatur.
Problem 2: Tætheden af tøjret DNAs er for lavt.
Løsning: Dette problem opstår, når PIND functionalization effektivitet er lav eller DNA-molekyler er ikke functionalized med biotin. Fra vores erfaring, tætheden af tøjret DNA bør være høje for > 90% af coverslips fremstillet af friske eller opbevares korrekt silan-PIND-biotin reagens. I tilfælde når massefylden af tøjret DNA er lav med en dokumenteret batch af biotin-λ-DNA, prøv øge koncentrationer af silan-PIND-biotin under PIND functionalization og koncentrationer af streptavidin og biotin-λ-DNA under DNA tethering. Hvis dette mislykkes, erstatte PIND og streptavidin reagenserne.
Opgave 3: DNAs holde sig til coverslip end kan ikke strækkes ved flow.
Løsning: Dette problem kan også opstå, når PIND functionalization effektivitet er lav, og forværres af lav assay pH. Prøv flyder i flere BSA eller hæve pH (fx til 8,0) for at hjælpe undertrykke DNA adsorption på overfladen (trin 4.3.2). Hvis DNA adsorption er et vedvarende problem under en bestemt assay tilstand, prøve, herunder op til 90% silan-PIND-COOH under PIND functionalization.
DATA ANALYSENOTER:
Vi bruger brugerdefinerede enkelt partikel tracking software til at identificere baner af enkelt molekyler spreder langs DNA, fra som deres 1D diffusion konstanter, D1 anslås. For at forbedre dataanalyse, gennemført vi radial symmetri algoritme18 for lokalisering af partikler og Kovarians-baserede estimator19 til estimering 1 D diffusion konstanter, som dramatisk drønede op dataanalyse uden at gå på kompromis nøjagtighed. Vi tidligere har valideret den brugerdefinerede software ved at analysere simulerede data11. De vigtigste trin er beskrevet nedenfor.
Partikel identifikation:
Dette trin er for at opdage og segmentering af partikler - diffraktion-begrænset steder - fra baggrunden. Først, rumligt sporgruppe-pass filter billederne for at forbedre signal af partikler i 3-5 pixel området (hvilket svarer til størrelsen af punkt-opslag funktionen på vores system) og derefter tærskel baseret på intensitet (Se script: spt2_SD_sandbox.m).
Barycentrum tildeling
Segmentering billedet kun lokaliserer molekyler til pixel-niveau rumlige opløsning. For at lokalisere molekyler til meget højere præcision, ansætte Radial symmetri super opløsning algoritme18 billeder filtreret som ovenfor. (Denne metode er baseret på en analytisk beregning og dermed langt reducerer beregningsmæssige byrde sammenlignet med andre populære high-præcision metoder såsom 2D Gaussisk montering (Se script: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikel sporing:
For at spore banen af en partikel gennem tiden, skal vi igen identificere de samme partikler, når de bevæger sig mellem rammer. Vi anser de indledning, blinker og opsigelse stadier at være komponenter af en bane. Vi begrænse sammenkædning af partikler i nuværende rammer dem vises i tidligere rammer ved den maksimale forskydning tilladt pr. ramme. I tilfælde, hvor flere forbindelser er muligt, Jonker-Volgenant algoritme bruges til at give globalt optimal kobling sæt (Se script: traceTraj4_kx.3.m).
D1 skøn:
Du skal vurdere D1 værdier fra baner, bruger vi Kovarians-baserede Estimator (CVE)19. Baseret på en analytisk beregning, denne metode er mere beregningsmæssigt effektiv og statistisk streng end andre almindeligt anvendte metoder såsom regression af gennemsnitlig kvadrerede forskydninger (Se script: runspt5_SD.m).
Bane filtrering:
Nogle baner indeholder artefakter såsom kobling til overfladen-bundne molekyler og skal fjernes. Vi implementeret flere funktioner såsom minimal forskydning parallel til DNA, maksimal forskydning tværgående til DNA, minimale længde af bane, minimalt antal triplet træk opdaget positioner og mindste sandsynlighed score (Se Xiong et al11 definition) der kan være filtreret til at isolere et minimalt forudindtaget sæt af baner tilbøjelige til at repræsentere molekyler spreder på DNA (Se script: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Bred Institut kan vælge at fil patentansøgninger, der omfatter aspekter af det arbejde, der præsenteres her.
Acknowledgments
Vi takker Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick og Evangelos Gatzogiannis for assistance med indledende instrumentation opsætning og afprøvning. Vi takker yderligere Tony Kulesa for betydelig hjælp skriftligt og evaluere den tilpassede enkelt partikel tracking software. Dette arbejde blev støttet af startup finansiering og en karriere Award på den videnskabelige Interface (til PCB) fra Burroughs Wellcome Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
