Summary
Ce protocole montre un test de débit-stretching seule molécule simple, robuste et haut débit pour l’étude unidimensionnelle diffusion (1D) de molécules le long de l’ADN.
Abstract
Nous décrivons un test de débit-stretching seule molécule simple, robuste et haut débit pour l’étude de diffusion 1D des molécules le long de l’ADN. Dans ce test, les lamelles de verre sont fonctionnalisés dans une réaction en une seule étape avec silane-PEG-biotine. Cellules d’écoulement sont construits en intercalant une bande adhésive prédécoupée voies entre une lamelle fonctionnalisée et une dalle PDMS contenant des trous d’entrée et de sortie. Plusieurs canaux sont intégrés dans la cellule un flux et le flux des réactifs dans chacun des canaux peut être entièrement automatisé, significativement, qui augmente le débit de dosage et réduit le temps de pratique par test. À l’intérieur de chaque canal, biotine-λ-ADN est immobilisées sur la surface et un écoulement laminaire est appliqué pour les ADN-tronçon. Les molécules d’ADN sont étirées à > 80 % de leur longueur contour et servir aussi dans l’espace étendu des modèles pour l’étude de l’activité de transport et de liaison des molécules fluorescent étiquetés. Les trajectoires des molécules simples sont suivies par imagerie de Fluorescence de la réflexion interne totale (FRBR) Time-lapse. Les images RAW sont analysées à l’aide simplifiée personnalisée seule particule dépistant le logiciel pour identifier les trajectoires des molécules simples diffusant le long de l’ADN et estimer leurs constantes de diffusion 1D automatiquement.
Introduction
Un problème de longue date en biologie est comment endogènes protéines qui agissent au spécifiques sites dans le génome peuvent localiser les cibles d’ADN suffisamment vite pour l’organisme de survivre et de répondre efficacement à son environnement. Études au cours des quarante dernières années proposé et en grande partie prise en charge, l’hypothèse que la cinétique de l’ADN cible recherche par une protéine peut être accéléré par diffusion dans lequel la protéine alterne entre diffusion 3D dans la masse et la diffusion de 1D (y compris facilitée coulissants et processus de saut) le long de l' ADN1. On sait maintenant que plusieurs protéines impliquées dans la régulation des gènes, métabolisme des acides nucléiques et d’autres processus sont capables de glissement sur ADN2,3,4,5,6,7 ,8,9. De plus, des études récentes ont déclaré que même les petits peptides peuvent lier à et glissez sur l’ADN, avec la capacité de transporter une cargaison ; par exemple, une molécule de protéine ou amorce PCR, le long de l’ADN10,11,12,13,14.
Au cours des 15 dernières années, le test de débit-stretching seule molécule a été largement utilisé pour étudier la liaison et la diffusion des molécules le long de l’ADN de15,2,16. Dans ce type de test, des molécules d’ADN double-brin biotinylés sont immobilisés à la surface et un écoulement laminaire est appliqué au débit s’étendent de l’ADN. Le > 80 % s’étendait DNAs servir comme modèles spatialement étendues pour l’étude de l’activité de transport et de liaison des molécules marquées avec des fluorophores où les trajectoires des molécules uniques le long de l’ADN sont suivies par imagerie de fluorescence Time-lapse. Dans notre implémentation, optimisée pour la reproductibilité et la facilité d’utilisation, ce test se compose de cinq grandes étapes : préparation de biotine-λ-ADN, fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet, construction de cellule de flux, analyse de données et imagerie de fluorescence. Dans les précédents protocoles17, lamelles de verre ont été fonctionnalisés par première réaction avec (3-Aminopropyl) triéthoxysilane (APTES), puis avec amine-réactif de polyéthylèneglycol (PEG) réactifs (p. ex., NHS-PEG-biotine) pour former une couche PEG qui résiste à la adsorption non spécifique des éléments d’analyse à la surface de la lamelle couvre-objet. La qualité des lamelles fonctionnalisés dépendait en grande partie la qualité des réactifs de PEG et conditions de la réaction à chaque étape. Notre protocole décrit un protocole simplifié de fonctionnalisation et la construction de cellule de flux multiplex qui nécessite aucun adhésif liquide ou le temps de durcissement sur les cellules de circulation de jour sont assemblés. Nous décrivons également une données simplifiée et robuste analyse procédure11 qui élimine les étapes de la régression par le calcul intensif en appliquant une méthode de symétrie radiale pour centroïde localisation18 et une diffusion axée sur la covariance estimateur constant19.
Ici, nous présentons un simple, robuste et seule molécule à haut débit débit étirement mise en œuvre de dosage avec des améliorations significatives dans la fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet, construction de cellule de flux et l’analyse des données. En particulier, nous avons développé un protocole de fonctionnalisation de lamelle couvre-objet en une seule étape, dans lequel les lamelles couvre-objet propre et sec réagit directement avec silane-PEG-biotine. Ce protocole simplifie la préparation de la lamelle couvre-objet et améliore la fiabilité de la qualité des surfaces fonctionnalisées par rapport au protocole de réaction standard en deux étapes. Les auteurs décrivent l’utilisation de lamelles ainsi fonctionnalisés avec des cellules de flux PDMS multicanaux permettant des raccords de conduite robuste sans colle. Ces cellules de flux supplémentaires comprennent plusieurs entrées commandés par ordinateur pour chaque chambre à flux qui permettent l’écoulement réactif automatisé réduire le temps de pratique au cours de la configuration et des débits de dosage accrue.
Protocol
1. préparation de l’ADN-λ-biotine
Remarque : biotine-λ-DNA molecules sont préparés en ligaturant un oligonucléotide marqué biotine, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - biotine - 3 ' à Λ-ADN molécules 20.
- Prepare 0,1 mM biotine étiquetés oligo en tampon TE.
- Chaleur 0,5 mg/mL λ-ADN stock à 65 ° C pendant 60 s et plonger dans la glace mouillée tout de suite.
Remarque : Une trempe rapide refroidissement réduit λ-ADN concatemerization. - Pipette 100 µL de la solution de λ-ADN dans un tube de microcentrifuge.
- Ajouter 1 µL de l’oligo de 0,1 mM en 9 µL de tampon TE.
- Ajouter 2 µL de la solution d’oligo dans le tube de microcentrifuge contenant l’ADN de λ. Mélanger soigneusement.
NOTE : Oligo est présent dans environ un excès molaire 12-fold au-dessus de l’extrémité de λ-ADN complémentaire. - Chauffer le mélange de λ-ADN/oligo à 65 ° C pendant 60 s.
- Refroidir lentement le mélange à température ambiante.
Remarque : Cette étape permet les oligo de recuire à la fin de λ-ADN complémentaire. - Placer le mélange sur la glace. Ajouter 11 µL de tampon de réaction T4 DNA ligase (concentration finale tampon 1 x). Mélanger doucement. Puis ajoutez 2 µL (800 unités) de l’enzyme de T4 DNA ligase. Mélanger doucement.
- Incuber le mélange pendant 2 h à 16 ° C ou une nuit à 4 ° C.
- Purifier le produit à l’aide de tubes filtre centrifuge avec une limite de poids moléculaire nominal de 100 kDa. Plus précisément, transvaser le mélange étape 1.9 dans un tuyau filtre centrifuge et centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min, laver deux fois avec 400 µL de tampon de TE et recueillir le produit purifié.
Remarque : Les purifiés comme biotine-λ-ADN dans un tampon TE sont stables à-20 ° C jusqu'à un an.
2. Fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet
Remarque : lamelles de verre sont fonctionnalisés en réagissant avec le silane-PEG-biotine. Ce protocole de réaction en une seule étape est plus simple et plus fiable dans notre expérience que le standard en deux étapes réaction protocole 20. Fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet avec silane-PEG-biotine crée des sites de liaison pour la Streptavidine et minimise l’ADN non spécifique et adsorption de protéine à la surface de la lamelle couvre-objet.
- Sonicat cinq lamelles de n ° 1 dans l’éthanol à 95 % à l’intérieur d’une coloration jar pendant 10 min et puis rincez avec de l’eau ultrapure pour trois fois.
Remarque : La lamelle cinquième offre une pièce de rechange en cas de bris. - Remplissez le bol coloration avec 1 M KOH, laisser agir pendant 10 min et puis rincez avec de l’eau ultrapure triple.
- Répéter deux fois le cycle de 2.1-2.2.
- Sécher les lamelles couvre-objet en écoulement de gaz sec et pur N 2.
- De plus, nettoyer et sécher les lamelles couvre-objet en appliquant le traitement plasma air à pression mTorr 900 pendant 5 min.
- Incuber des lamelles couvre-objet avec 25 mg/mL silane-peg-biotine dissous dans l’éthanol à 95 % à température ambiante pendant 2 h. plus précisément, "sandwich" de 50 µL de solution de silane-peg-biotine entre deux lamelles couvre-objet propre et sec et incuber la lamelle " sandwichs " à l’intérieur d’une boîte de pointe de pipette fermée avec environ 10 mL d’eau en bas (pas en contact avec les lamelles) pour minimiser l’évaporation des solvants.
- Laver les excès PEG molécules avec de l’eau ultrapure et sécher la cheville enduite lamelles sous propre sec débit de gaz 2 N.
Remarque : Les lamelles fonctionnalisés peuvent être conservés jusqu'à trois jours dans des conditions ambiantes.
3. Construction de cellule de flux
Remarque : cellules d’écoulement sont construites en intercalant un double-adhésif prédécoupé voies entre une cheville fonctionnalisés lamelle couvre-objet et une dalle PDMS contenant des trous d’entrée et de sortie. Plusieurs canaux sont intégrés par la cellule d’écoulement.
- Concevoir des canaux d’écoulement dans un logiciel de CAO et de couper les canaux (la largeur, la profondeur et la longueur de chaque canaux sont 1, 0,13 et 12 mm, respectivement) sur un ruban adhésif double face à l’aide d’un coupe-ruban (généralement huit canaux est intégrés par la cellule d’écoulement). Enlever les résidus de ruban pour former les canaux d’écoulement.
- Pour faire des galettes PDMS, bien mélanger 45 g de PDMS avec 5 g de réactif de réticulation (assez pour faire douze 5 mm épais PMDS dalles qui peuvent être conservés indéfiniment dans des conditions ambiantes) à l’aide d’un mixeur, versez le mélange dans deux plats de Pétri de 10 cm et laisser le plats à l’intérieur d’une chambre à vide jusqu'à ce qu’essentiellement toutes les bulles d’air ont disparu (manuellement enlever les bulles d’air si tout reste lorsque les plats sont retirés de la chambre à vide). Puis placer les boîtes dans une étuve à 80 ° C jusqu'à ce que le PDMS se solidifie (environ 2 h).
- Découper une dalle PDMS qui correspond à la taille du ruban adhésif double face avec chaînes pré découpés. Peel protection un film hors du ruban adhésif double face et respecte le film à une face plane de la dalle PDMS. Percer les trous de sortie et d’entrée sur la dalle PDMS utilisant un biopsie-perforateur avec une aiguille de calibre 23.
- Pelez le second film de protection sur le ruban adhésif double face et adhérer à l’Assemblée de PDMS-ruban à la surface fonctionnalisée de la lamelle (s’assurer que la lamelle est plate. Voir une photo d’une cellule de flux entièrement assemblé dans la Figure 1 a).
4. FRBR Imaging
Remarque : biotine-λ-ADN est attachés à une surface de canal d’écoulement et flux laminaire est appliquée aux flux étirer les molécules d’ADN ( Figure 1 b). Le > 80 % s’étendait serve de molécules de l’ADN en tant que modèles spatialement étendus pour observer l’activité de transport et de liaison des molécules fluorescent étiquetés. Les trajectoires des molécules simples sont suivies par l’imagerie FRBR Time-lapse ( Figure 1C & e).
- Fix la cellule de flux sur un microscope stade et charge préalablement dégazé sous vide tampon (phosphate de sodium 10 mM, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, éthanol de 20 mM, 5 % (v/v) de glycérol, 0,01 % de Tween-20, 1 % (v/v) de β-mercaptoéthanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL de solution de streptavidine, 1 mg / mL de solution d’albumine sérique Bovine (BSA) et solution de biotine-λ-ADN 100 pM dans quatre réservoirs que chacun un tuyau Tygon connectées à une valeur de solénoïde et un autre Tygon tube relié à un tube PEEK par gaine tuyau Tygon sur le plus petit (de tube PEEK empêche les reflux de réactifs). Dégazer petits volumes de mémoire tampon par exposition au jour le jour de passer l’aspirateur ou plus court à vide avec agitateurs (jusqu'à ce que les bulles ne sont plus visibles).
- Insérer le tube PEEK du réservoir tampon vide dans le trou d’une entrée de la cellule de flux. Amorcer le canal en s’écoulant dans un tampon vide, puis insérez trois autres tubes de PEEK dans des trous d’entrée la pression de l’air axé sur le débit de chaque réactif est contrôlée par des électrovannes et entièrement automatisée via un script ordinateur. Veillez à ne pas induire la formation de bulles d’air dans le canal.
- Connecter un tuyau Tygon avec un court tube PEEK de l’orifice de sortie d’un conteneur à déchets. Le tube court de PEEK à la sortie permet de supprimer la formation de bulles d’air lors d’une perfusion en maintenant une pression positive à l’intérieur du canal.
- Biotine-λ-ADN molécules pour une surface de canal d’écoulement de tethering.
- Débit de 0,2 mg/mL de solution de streptavidine, incuber pendant 5 min et puis couler dans un tampon vide laver par la Streptavidine unbound.
- Flux en solution de 1 mg/mL de BSA, incuber pendant 1 min et puis couler dans un tampon vide laver par la BSA unbound.
Remarque : Outre les BSA supprime ADN et échantillon d’adsorption à la surface. - Flux en solution de biotine-λ-ADN 100 pM, incuber pendant 10 min et puis couler dans un tampon vide de laver les ADN indépendants.
Remarque : Après que l’ADN est lié à la surface, éviter les flux rapides pour ne pas endommager les molécules d’ADN captifs.
- Pour vérifier la qualité de la lamelle fonctionnalisée, coulent dans ADN coloration teinture comme Sytox orange dans les conditions de test à utiliser (lire 4.6 ci-dessous) et commencer à fluorescence imaging éclairage de laser moins 532 nm.
NOTE : La qualité de la lamelle fonctionnalisée est généralement bonne et la densité des molécules d’ADN de flux tendu sera élevée. Il est essentiel d’avoir une densité assez élevée des molécules d’ADN de flux tendu afin que la fixation à l’ADN et les événements de glissement/1D diffusion peuvent être observés. - Fine tune l’angle de la FRBR pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit d’images étirées des molécules d’ADN ( Figure 1D).
- Pour enregistrer les trajectoires des molécules simples se déplaçant le long de l’ADN, répétez les étapes 4.2-4.4 à l’intérieur d’un nouveau canal (sans ADN coloration teinture), puis laisser infuser préalablement dégazé sub-nanomolaires fluorophore étiqueté de molécules à un débit assez élevé à l’aide d’un pousse-seringue et recueillir des images de fluorescence Time-lapse avec une cadence de 100 Hz.
Remarque : Un débit équivalent à un certain nombre de Weissenberg (Wi : le produit sans dimension de la plus longue période de relaxation polymère - environ 0,2 s pour λ-ADN - et la vitesse de cisaillement - le changement de vitesse d’écoulement avec la distance de la surface de la lamelle couvre-objet) de 500 à l’intérieur de la canal est recommandé pour l’imagerie de la molécule unique avec une cadence de 100 Hz 21.- Recueillir 10 000 images dans un champ de vision (FOV) pour produire un film et recueillir les films similaires de multiples FOVs (généralement dix) par exemple.
Remarque : La densité des particules unique dans un champ de vision doit être ni trop haut - qui va compliquer l’analyse des données en effectuant l’assignation d’objet sur trames ambigus, ni trop faibles - qui pourrait conduire à faible occurrence des événements de la molécule ADN. - Optimiser l’intensité de l’éclairage de sorte que les molécules liés la surface de la lamelle couvre-objet sont photo-blanchis rapidement pour supprimer l’arrière-plan tandis que les molécules diffusant sur l’ADN sont blanchis pas trop vite pour que des trajectoires plus longues peuvent être détectées.
Remarque : Nous utilisons généralement densité de puissance de 200-800 W/cm 2 dans la FOV.
- Recueillir 10 000 images dans un champ de vision (FOV) pour produire un film et recueillir les films similaires de multiples FOVs (généralement dix) par exemple.
- à la fin de l’étape 4.6, infuser coloration teinture de l’ADN pour confirmer que les molécules d’ADN peuvent encore être flux-tendu.
- Exécuter les deux échantillons témoins positifs et négatifs.
Remarque : Un bon contrôle positif est un tétrapeptide, tétraméthylrhodamine (TMR)-KRRR (TMR est couplé à l’aminé N-terminal) qui a une constante de diffusion D 1 moyenne de 10,5 ± 0,7 (erreur standard) M (bp 2/s) à pH neutre, 11. Un bon contrôle négatif est de mesurer des échantillons étiquetés d’intérêt dans du tampon dans un canal qui n’a aucun ADN attaché, où aucune activité de diffusion sur ADN devrait être détectée.
5. Analyse des données :
Remarque : une seule particule personnalisée dépistant le logiciel est utilisée pour identifier les trajectoires des molécules simples diffusant le long de l’ADN et estimer les constantes de diffusion. Ce logiciel détermine d’abord les positions du centre de gravité des particules unique avec une grande précision, identifie les particules qui sont collées sur la surface de la lamelle couvre-objet et puis lie les particules dans des cadres différents pour former des trajectoires Time-lapse. De ces trajectoires, les constantes de diffusion 1D sont estimées.
- Pour démarrer l’analyse des données, ouvrez un logiciel de script (voir table des matières) et allez dans le répertoire de la particule unique logiciel de suivi. Ouvrez le script nommé " largedataprocess3.m ". Un paramètre important à définir est la valeur seuil de détection de la particule. Exécutez
- pour déterminer la valeur de seuil optimal, le " Determine_threshold_value.m " script. Ce script vous indiquera comment la valeur de seuil affecte la détection de particules unique. Après avoir déterminé la valeur de seuil optimale, exécutez le " largedataprocess3.m " script
- à l’issue d’une seule particule suivi analyse, filtrer les trajectoires brutes en exécutant le " Trajectory_filtering.m " script. Une Interface d’utilisateur graphique (GUI) est intégré à visualiser l’étape de filtrage. Panneau de
- sur l’interface graphique, affectez le déplacement minimal le long de l’ADN, MinXDisp, 2 pixels affectez le déplacement maximal transversal à l’ADN, MaxYDisp, 2 pixels ; la valeur le nombre minimal d’images, minFrames, 10 ; le nombre minimal d’États de triplet, minTriplets, la valeur 10 ; la valeur de la constante de diffusion minimale le long de l’ADN, D_par, 0 ; définir la constante de diffusion estimée maximal transversal à l’ADN, D_trans, à 10 M (bp 2) S -1 ; la valeur du paramètre statistique minimal, Chi 2 _stat, -5 ; Fixez le ratio minimal des déplacements le long de l’ADN à cette transversale à l’ADN, MinX/Y, 2.
Remarque : Toutes les trajectoires brutes qui passent ces paramètres de filtrage sont répertoriés dans le tableau 1, et ceux qui ne sont pas répertoriés dans le tableau 3. - Clic sur une trajectoire numéro dans le tableau 1, la trajectoire sera déplacée dans les graphiques 1 & 2. Cliquez sur le " Play " bouton pour lire les images brutes de fluorescence. Cliquez sur le " Add_to_Table2 " pour identifier la trajectoire comme une seule molécule coulissant de trajectoire. En fin de compte, toutes les trajectoires ajoutés à Table2 seront enregistrées lors de la fermeture de l’interface GUI.
- Pour calculer les constantes de diffusion moyenne, exécutez le script " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". La constante de diffusion moyenne est estimée à partir de l’ensemble des trajectoires qui ont passé toutes les étapes de filtrage et été ajoutées au tableau 2.
Representative Results
Figure 2 a montre les trajectoires détectés des pVIc-Cy3B (pVIc : GVQSLKRRRCF ; Cy3B est conjugué au résidu cystéine) molécules diffusant sur l’ADN en 2 mM NaCl tampon à pH 6,5. La diffusion de pVIc est bidirectionnel et mue par l’énergie thermique ambiante. De ces trajectoires, les constantes de diffusion 1D (valeurs D1) sont estimés pour chaque trajectoire (Voir l’histogramme dans la Figure 2 b). La valeur D1 de ce conjugué pVIc moyenne est fixée à 22,2 ± 0,9 (erreur standard) M (bp2/s) par une moyenne de chaque valeur de D1 à travers des trajectoires pondérés par le nombre d’appels de position consécutive de triplet contenues dans chaque trajectoire.
Figure 1 : Appareil pour le suivi des mouvements des molécules uniques le long de l’ADN.
un) un PDMS de huit canaux puce microfluidique ont adhéré à une lamelle fonctionnalisée auquel l’ADN peut être attaché (avec pièce de quart USA pour l’échelle) ; b) débit schéma de zoom de cellules montrant des molécules d’ADN λ-flux-tendu ; c) schéma de FRBR microscope et débit système d’Etirement ADN ; d) image de la FRBR d’un λ de flux-tendu-ADN ; e) image FRBR de pVIc-Cy3B (pVIc : GVQSLKRRRCF ; Cy3B est conjugué au résidu cystéine) molécules lié à un flux-tendu λ-ADN. Ce chiffre a été modifié avec la permission de2,12. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diffusion unidimensionnelle de pVIc (GVQSLKRRRCF) le long de l’ADN.
a). Diffusion de pVIc le long du flux tendu λ-ADN (137 trajectoires) dans un tampon NaCl 2 mM à pH 6,5. x et y sont les déplacements le long et transversal à λ-ADN, respectivement. Lignes horizontales en pointillé indiquent les points manquants résultant de colorant clignotant. b). histogramme de la constante de diffusion, D1 pour pVIc diffusant le long de λ-ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Lors du passage du protocole traditionnel en deux étapes lamelle fonctionnalisation réaction à un protocole de réaction en une seule étape, nous avons remarqué que la fiabilité de fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet est nettement améliorée. Comme le temps total de pratique pour la préparation de la lamelle couvre-objet est moins de trente minutes, nous vous conseillons de préparer des lamelles fraîches l’imagerie seule molécule de chaque jour est prévue. Pour prévenir la détérioration du silane-PEG-biotine, le réactif doit être aliquotés et stockées sous gaz sec de2 N à-20 ° C dès réception. Ici, nous n’utilisons pas les molécules de PEG qui produisent la COO -– ou les groupes de terminal -CH3 qui ont été utilisés dans les dernières20. Les charges négatives des groupes de COO -– et les groupes de3 -CH hydrophobes ont été utilisées pour empêcher l’adsorption de molécules d’ADN et d’échantillons de protéines spécifiques à la surface, respectivement. Nous observons très faible adsorption en surface par des échantillons de petit peptide sur la surface de PEG entièrement terminée par le caractère biotine, tandis que le silane-PEG-COOH ou silane-PEG-CH3 pourrait être utile pour des analyses de certains échantillons de protéines ou lorsque des conditions de dosage (tels que le pH < 7,5) favoriser les interactions ADN-surface.
Le passage de cellules de verre lame flux au PDMS débit accélère la construction de cellule de flux des cellules et permet l’intégration facile des canaux multiples. Nous concevons souvent huit canaux par cellule de flux pour permettre à huit expériences indépendantes par lamelle fonctionnalisé. Pour augmenter encore le débit par lamelle couvre-objet, même de plus grands nombres de canaux fabriqués en micro peut être utilisé.
Il est conseillé de prévenir la formation de bulles d’air à l’intérieur du canal à tout moment après le remplissage initial. Habituellement, bulles d’air ne provoquent pas de perte d’ADN captif (même si cela est possible), mais plutôt perturber les flux et éventuellement provoquer DNAs s’en tenir à la lamelle. Dégazage de la mémoire tampon et l’addition de surfactant petites quantités sont généralement efficaces pour prévenir la formation de bulles dans le chenal de la tubulure et le débit. Dans les cas où les bulles d’air sont introduits dans le tube, tenter de débusquer les bulles sous un débit lent et s’assurer qu’ils ne proviennent pas de la région où l’ADN est attachés.
Un logiciel d’analyse de données simple et efficace est essentiel, en raison de l’énorme quantité de données générées. Nous recueillons habituellement 700 000 images à haute résolution des mesures sur la cellule d’un écoulement, qui peut être traitée à l’aide de notre seule particule personnalisée, logiciel de suivi dans la journée sur un ordinateur de bureau avec un quad-core processeur et 32 Go de mémoire. Le taux de faux positifs de détecter les trajectoires de diffusion 1D par le logiciel (étape 5.5) est échantillon dépendant et peut être très faible étant donné que : 1) la densité des particules unique dans le champ de vision est assez basses pour qu’il y a ambiguïté peu reliant les particules de cadres ( échantillons de protéines en général sont plus sujettes à l’adsorption de la lamelle couvre-objet que les échantillons de peptide, et ainsi, le tampon et la densité de puissance pour chaque protéine l’échantillon doit être optimisé) ; 2) le rapport signal sur bruit de particules unique est suffisamment élevé pour que la probabilité de faux-identification des particules est faible. Pourtant, le logiciel peut faire des erreurs occasionnelles, et nous recommandons une inspection manuelle des données à l’aide de l’interface graphique fournie pour évaluer les performances du logiciel. Dans une application particulièrement sensible pour la détection de faux positifs trajectoire, paramètres de processus dont la valeur de seuil, minFrames, minTriplets et _stat2Chi peuvent être définies plus strictement au prix d’une sensibilité plus faible pour la liaison de vrai Evenements et potentiellement plus biais statistique dans l’identification de la trajectoire. Nous avons ici partager et décrire notre seule particule dépistant le logiciel avec l’espoir d’aider à normaliser les méthodes d’analyse de données et de stimuler la discussion sur les meilleures pratiques.
Dans notre protocole, ce qui nécessite un flux continu au cours de l’imagerie pour maintenir l’état étiré les modèle des molécules d’ADN, l’écoulement du fluide pourrait biaiser le transport de certaines protéines le long des gabarits d’ADN s’ils diffusent par un mécanisme de saut ou si l’hydrodynamique rayon du fluorophore étiqueté est grand22,23. Alors que cette partialité peut être mesurée et corrigée dans la plupart des groupes de données, le transport des protéines marquées avec un fluorophore petit et diffusant par un mécanisme coulissant n’est pas généralement biaisée de façon détectable par flux2,4, 24. Notamment, l’impact de la vitesse d’écoulement sur le transport des protéines le long de l’ADN a été utilisé pour étudier les mécanismes de la protéine diffusant le long de l’ADN,23. A étroitement liées approche alternative qui permet des mesures en l’absence de flux utilise des matrices d’ADN avec la biotine dans les deux terminus, qui sont étirées transitoirement en flux et attaché par les deux extrémités de la lamelle couvre-objet tel que les molécules d’ADN demeurent dans un configuration étendue lorsque le débit est coupé en25,26,27,28. L’approche double sangles a l’avantage de permettre des expériences sans flux de transport, mais nécessite la modification de deux extrémités les modèle des molécules d’ADN, le mousseur prudent pendant attachant et qui caractérisent les distances entre les deux sites captifs. En outre, l’impact des tensions hétérogènes et dynamique conformationnelle ADN dans l’ensemble des molécules d’ADN pour le dosage de la molécule unique doit être évalué.
Au total, en plus d’étudier la diffusion 1D des molécules le long de l’ADN, le test signalés comme seule molécule peut profiter de nombreux in vitro biochimiques et études de biophysiques à l’échelle de la molécule unique dont l’ADN ciblent des processus de recherche de protéines, activités enzymatiques sur l’ADN et plus encore.
Dépannage
Problème 1 : Les canaux d’écoulement de fuite.
Solution : Tout d’abord, assurez-vous que la conception des canaux d’écoulement permet au moins 1,5 marge mm étanchéité autour et entre les canaux ; puis, lors du montage de la cellule de flux, assurez-vous que les surfaces de contact entre la lamelle, le ruban adhésif double face et la dalle PDMS sont plats, secs et exempts de débris, que la pression exercée pour former le joint est uniforme, et que l’opération de soudage est effectuée à la température ambiante.
Problème 2 : La densité des ADN captif est trop faible.
Solution : Ce problème se pose lorsque l’efficacité de fonctionnalisation de PEG est faible ou les molécules d’ADN ne sont pas fonctionnalisés avec de la biotine. D’après notre expérience, la densité de l’ADN captif doit être élevée pour > 90 % les lamelles préparés à partir de frais ou entreposé silane-PEG-biotine réactif. Dans les cas quand la densité de l’ADN captif est faible avec un lot éprouvé de biotine-λ-ADN, essayez stimuler des concentrations de silane-PEG-biotine pendant la fonctionnalisation de PEG et concentrations de streptavidine et biotine-λ-ADN au cours de l’attache d’ADN. Si cela ne fonctionne pas, remplacez les réactifs PEG et streptavidine.
Problème 3 : DNAs s’en tenir à la lamelle und ne peut pas être étiré par flux.
Solution : Ce problème peut également survenir lorsque l’efficacité de fonctionnalisation de PEG est faible et est aggravée par un pH faible dosage. Try qui coule plus BSA ou élévation du pH (par exemple à 8,0) pour aider à supprimer l’adsorption de l’ADN à la surface (étape 4.3.2). Si l’adsorption de l’ADN est un problème persistant sous une condition de test particulière, essayez y compris jusqu'à 90 % du silane-PEG-COOH durant la fonctionnalisation de PEG.
NOTES d’analyse de données:
Nous utilisons particule personnalisée, logiciel de suivi pour identifier les trajectoires des molécules simples diffusant le long de l’ADN, de leurs constantes de diffusion 1D, D1 estimés. Afin d’améliorer l’analyse des données, nous avons implémenté l' algorithme de symétrie radiale18 pour localiser les particules et l' estimateur axée sur la covariance19 pour estimer les constantes de diffusion 1D, qui a considérablement accélèrent l’analyse des données sans compromettre précision. Précédemment, nous avons validé le logiciel personnalisé en analysant les données simulées11. Les principales étapes sont décrites ci-dessous.
Identification de particules:
Cette étape est pour la détection et la segmentation des particules - taches de diffraction-limited - de fond. Tout d’abord, dans l’espace passe-bande filtrer les images à améliorer le signal de particules dans les 3-5 plage de pixel (ce qui correspond à la taille de la fonction de point-propagation sur notre système), puis seuil fondé sur l’intensité (voir le texte : spt2_SD_sandbox.m).
Affectation de centroïde
Segmentation de l’image seulement localise au niveau des pixels résolution spatiale des molécules. Pour localiser les molécules au degré de précision plus élevé, emploient la symétrie radiale Super-résolution algorithme18 images filtrées comme ci-dessus. (Cette méthode est basée sur un calcul analytique et réduit donc considérablement calcul charge par rapport aux autres méthodes populaires de haute précision comme raccord gaussien 2D (voir le texte : spt2_SD_sandbox.m).)
Suivi de particules :
Pour suivre la trajectoire d’une particule à travers le temps, nous devons ré-identifier les particules mêmes lorsqu’elles se déplacent entre les cadres. Nous considérons les stades initiation, clignotant et de la terminaison les composants d’une trajectoire. Nous contraignent la liaison des particules dans des cadres actuels à ceux apparaissant dans les images précédentes par le déplacement maximal autorisé par image. Dans le cas où les liens multiples sont possibles, l’algorithme de Jonker-Volgenant est utilisé pour produire des ensembles de liaison optimale à l’échelle mondiale (voir le texte : traceTraj4_kx.3.m).
Estimation de D1 :
Pour estimer les valeurs D1 de trajectoires, nous utilisons l' estimateur axée sur la Covariance (CVE)19. Basé sur un calcul analytique, cette méthode est efficace plus mathématiquement et statistiquement rigoureux que les autres méthodes comme la régression des déplacements au carré moyens couramment utilisées (voir le texte : runspt5_SD.m).
Trajectoire de filtrage :
Certaines trajectoires contiennent des artefacts tels que des liens à des molécules de surface-bondissent et doivent être enlevés. Nous avons implémenté plusieurs fonctions telles que déplacement minimum parallèle à l’ADN, le déplacement maximal transversal à l’ADN, une longueur minimale de trajectoire, le nombre minimal de postes de triplets consécutifs détecté et score de probabilité minimale (voir Xiong et al11 pour la définition) qui peuvent être filtrés pour isoler un ensemble très peu biaisé des trajectoires susceptibles de représenter des molécules diffusant sur l’ADN (voir le texte : sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Du Broad Institute peut choisir de déposer des demandes brevets qui comportent des aspects du travail présenté ici.
Acknowledgments
Nous remercions Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick et Evangelos Gatzogiannis d’assistance avec une configuration initiale instrumentation et essais. Nous remercions encore Tony Kulesa pour une aide importante d’écriture et évaluer la logiciel de suivi personnalisés une seule particule. Ce travail a été soutenu par le financement de démarrage et une bourse de carrière à l’Interface scientifiques (de PCB) de la Burroughs Wellcome Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
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